Libro de resúmenes del XII Congreso de la SEBC

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Libro
de Resúmenes
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Las fotografías de portada han sido realizadas por Zuberoa Marcos Uztárroz
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Estimados colegas:
Cuando escribo estas palabras quedan ya pocas semanas para que podamos daros nuestra más cordial bienvenida a Pamplona a todos los participantes en esta duodécima edición del Congreso de la Sociedad Española
de Biología Celular.
Han sido meses de intenso trabajo de los miembros de los Comités Científico y Organizador para intentar ofreceros un programa atractivo, con ponentes de gran prestigio y temas de actualidad, que os animara a asistir y a
presentar vuestras contribuciones. El Programa ha quedado finalmente estructurado en 10 Sesiones en las que contaremos con 23 ponencias invitadas, 54 comunicaciones orales y 56 pósters. Además, se ha organizado una
Mesa sobre Política Científica en la que contaremos con ponentes de alto
nivel. Estamos contentos porque la participación ha sido elevada, y también
porque se ha conseguido uno de los objetivos importantes de nuestra Sociedad, que participen en el congreso muchos jóvenes investigadores, tanto
en las actividades científicas como en las sociales, que constituyen un momento más de comunicación e intercambio de ideas.
Quiero expresar mi agradecimiento a todas las Entidades Colaboradoras
por sus aportaciones al desarrollo de este congreso, a la Universidad de Navarra por su apoyo institucional y, muy especialmente, a todos los miembros
de la comunidad universitaria que han facilitado nuestra labor organizativa.
Os deseo que este congreso sea fructífero científicamente, tanto en lo
que recibáis como en el éxito de vuestra propia aportación. Y, por supuesto,
espero además que podáis disfrutar de la ciudad de Pamplona en estos días
en los que se respira ya el especial ambiente previo a sus fiestas de San
Fermín.
Mª Ángela Burrell Bustos
Presidenta del Comité Organizador
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COMITÉ DE HONOR
Presidente
Su Majestad El Rey
Miembros
Excmo. Sr. D. Miguel Sanz Sesma
(Presidente del Gobierno de Navarra)
Sra. Dña. Elena Salgado Méndez
(Ministra de Sanidad y Consumo)
Sr. D. Ángel José Gómez Montoro
(Rector Magnífico de la Universidad de Navarra)
Sr. D. Julio Lafuente López
(Rector Magnífico de la Universidad de Pública de Navarra)
Excma. Sra. Dña. Yolanda Barcina Angulo
(Alcaldesa de Pamplona)
Excmo. Sr. D. Luis Campoy Zueco
(Consejero de Educación del Gobierno de Navarra)
Excma. Sra. Dña. María Kutz Peironcely
(Consejera de Salud del Gobierno de Navarra)
Sr. D. Jaime Martínez-Lage Álvarez
(Delegado del Colegio Oficial de Biólogos en Aragón, La Rioja y Navarra)
Sr. D. Gabriel Delgado Bona
(Presidente del Colegio Oficial de Médicos de Navarra)
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COMITÉ ORGANIZADOR
Presidenta del Congreso
Mª Ángela Burrell Bustos
Miembros
María Elena Bodegas Frías
Alfonso Calvo González
Luis M. Montuenga Badía
Pilar Sesma Egozcue
Ana Cristina Villaro Gumpert
Comité Local
Carmen García Corchón
Javier García Guerrero
David García Ros
Blanca Irigoyen Moriones
MªJosé Sánchez de Miguel
Ainhoa Urbiola Casales
Íker Antón Ibáñez
Raúl Catena Felipe
Oscar González Moreno
Izaskun Imbuluzqueta Iturburua
Marta Irigoyen Goñi
Marta Larrayoz Ilundain
Erik W. Oliemuller García
Secretaría Técnica
Marisol Ripa Górriz
Paloma Cía Alcalá
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COMITÉ CIENTÍFICO
Mª Carmen Risueño. CIB-CSIC, Madrid
José Becerra Ratia. Universidad de Málaga
Mª del Mar Malagón. Universidad de Córdoba
Jaime Renau. Centro de Investigación Hospital La Fe, U. Valencia
Miguel Lafarga. Universidad de Cantabria
Gustavo Egea. Universidad de Barcelona
Eduardo Angulo. Universidad del Pais Vasco
Alberto Álvarez Barrientos. CNIC, Madrid
José G. Castaño. UAM, Madrid
Isabel Fabregat. IDIBELL-IRO, Barcelona
Gregorio García Herdugo. Universidad de Sevilla
Erwin Knecht. CIPF, Valencia
José Mª López-Cepero. Universidad de Cádiz
Ignacio Melero. CIMA-Universidad de Navarra
Luis M. Montuenga. CIMA-Universidad de Navarra
Alberto Muñoz. CSIC-UAM, Madrid
Isabel Pérez-Otaño. CIMA-Universidad de Navarra
Felipe Prósper. CIMA-Universidad de Navarra
Francisco Wandosell. CBM-CSIC-UAM, Madrid
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PROGRAMA RESUMIDO
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LUNES 2 DE JULIO
Edificio de Biblioteca de Ciencias
De 12h 00 a 14h 00 ACREDITACIÓN Y RECEPCIÓN DE DOCUMENTACIÓN
Aula A
16h 00 APERTURA DEL CONGRESO
16h 15 CONFERENCIA INAUGURAL
A dynamic view of cellular interactions in mammary development and cancer
Zena Werb (U. de California, USA)
17h 15 Pausa café
17h 45 PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER (PARTE 1)
Coordinadores: Alberto Muñoz (CSIC-UAM, Madrid) y Luis Montuenga (CIMA-U. de Navarra)
17h 45 Ponencia:
Regulación transcripcional y diferenciación celular en el páncreas exocrino
Francisco Real (IMIM-URBCM, Barcelona)
Comunicaciones:
18h 15 M.D. Boyano.
Expresión de ATM, p53, p21 y MDM-2 en diferentes líneas de melanoma humano y melanocitos normales
18h 30 P. Ordóñez-Morán.
La acción pro-diferenciadora y anti-proliferativa de la vitamina D en células de cáncer de colon está
mediada por Ca2+ y la vía RhoA-ROCK
18h 45 L. Caja.
La inhibición de las ERKs sensibiliza a la muerte por TGF-B en células de carcinoma hepatocelular
humano
19h 00 F.J. Nicolás.
Efecto de Reverastrol sobre la parada en ciclo inducida por TGFbeta. Consecuencias para la cascada
de señalización de TGFß
19h 15 P. Castro-Garcia.
Separación magnética y análisis de la población de células madre tumorales
19h 30 A. Peralta-Leal.
Disminución de la capacidad angiogénica de las células endoteliales mediante la inhibición de la PoliADP-Ribosa-Polimerasa-1
19h 45 J.P. Castaño.
Papel de los receptores de somatostatina truncados sst5b y sst5c en tumores de mama y en la línea
celular MCF7
20h 00 CONCIERTO Y APERITIVO
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MARTES 3 DE JULIO
Aula A
9h 00 NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Coordinadores: Miguel Lafarga (U. de Cantabria) e Isabel Pérez-Otaño (CIMA-U. de Navarra)
9h 00 Ponencia:
Regulación de los receptores glutamatérgicos de kainato
Juan Lerma (IN, CSIC-UMH, Alicante)
Comunicaciones:
9h 30 A. Franco.
Papel de WIP en neuritogénesis y segmentación cerebelar
9h 45 A.M. Santos.
Distribución de las celulas microgliales durante el desarrollo embrionario y postnatal de la retina de
ratón
10h 00 N. Fradejas.
La activación de la caspasa-11 en respuesta a isquemia o a estrés del retículo endoplasmático produce muerte celular en cultivos primarios de astrocitos de rata.
10h 15 I. Casafont.
Variaciones de la actividad transcripcional de las neuronas del ganglio del trigémino en respuesta a
la lesión del DNA inducida por radiaciones ionizantes
10h 30 A. Llobet.
Estudio de los depósitos de vesículas sinápticas en microcultivos de neuronas colinérgicas
10h 45 S. Camacho Romero.
Células cripta en embriones de esturión Acipenser naccarii
11h 00 Pausa café
11h 30 Ponencia:
Mantenimiento estructural y funcional de la sinapsis
Rafael Fernández-Chacón (U. de Sevilla)
12h 30 PROTEASOMAS
Coordinadores: Erwin Knecht (CIPF, Valencia) y José G. Castaño (UAM, Madrid)
12h 30 Ponencia:
Nuevos niveles de regulación del proteasoma: el remodelado de las cadenas de ubicuitina
Bernat Crosas (Institut de Biologia Molecular, Barcelona)
15h 30 PONENCIA PLENARIA
Mechanisms of retrograde transport from endosomes to the TGN
Juan S. Bonifacino (NICHD, National Institutes of Health, Bethesda, USA)
16h 30 Pausa café
17h 00 CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Coordinadores: Gustavo Egea (U. de Barcelona) y Francisco Wandosell (CSIC-UAM, Madrid)
17h 00 Ponencia:
Transporte polarizado de proteínas de superficie en células epiteliales y linfocitos T
Miguel Angel Alonso (CSIC-UAM, Madrid)
Comunicaciones:
17h 30 M. Tomás.
La incubación de las células HeLa a 15 ºC induce la formación de estructuras tubulares dinámicas en
el compartimento intermedio
17h 45 I. Fernández-Ulibarri.
El diacilglicerol es necesario para la formación de vesículas tipo COPI en el transporte de proteínas del
aparato de Golgi al retículo endoplásmico
18h 00 A. Fraile-Ramos.
El citomegalovirus humano y la maquinaria celular para el transporte de proteínas a los cuerpos multivesiculares
18h 15 R. Vázquez-Martínez.
Caracterización de un nuevo marcador intracelular de tumores hipofisarios
18h 30 J. Selva.
El ácido lisofosfatídico restablece los niveles de RhoA activado y de fosfoinositoles en astrocitos expuestos al etanol
18h 45 F. Lázaro-Diéguez.
Asociacion entre la regulacion homeostatica intra-Golgi y los filamentos de actina en el mantenimiento morfo-funcional del aparato de Golgi
19h 00 ASAMBLEA DE LA SEBC
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Aula B
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9h 30 PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Coordinadores: Jaime Renau (Centro de Investigación Hospital La Fe, U. Valencia) y José Mª LópezCepero (U. de Cádiz)
9h 30 Ponencia:
Proliferación, maduración y supervivencia celular en el hipocampo adulto. Efectos de drogas estimulantes y posibles consecuencias funcionales
Juan José Canales (Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biologia Evolutiva, U. de Valencia)
Comunicaciones:
10h 00 V. Andreu.
Identificación molecular in situ de la ω3 desaturasa FAD7 de soja: evidencia de localización en la
membrana tilacoidal
10h 15 E. Corredor.
Aplicación de nanopartículas in planta como herramienta para dirigir sustancias con fines fitosanitarios: visualización in situ en tejidos vegetales
10h 30 P. Gómez-Ramos.
Alteraciones mitocondriales, mitofagia y posible mitoptosis en un modelo transgénico condicional
de enfermedad de Huntington
10h 45 M. Irigoyen.
Influencia de la hipoxia en el endotelio linfático: estudio transcripcional y funcional
11h 00 Pausa café
11h 30 INMUNOBIOLOGÍA
Coordinador: Ignacio Melero (CIMA-U. de Navarra)
Ponencias:
11h 30 Utilización de mutantes del pez cebra para el análisis del sistema linfo-hematopoiético de
los vertebrados
Agustín Zapata (UCM, Madrid)
12h 00 Moléculas de adhesión en migración leucocitaria e interacciones inmunes. Papel en inflamación
Francisco Sánchez Madrid (HUP, Madrid)
Comunicaciones:
12h 30 P. Castillo-Briceño.
El colágeno es un potente activador de los fagocitos de peces
12h 45 S. Liarte.
Los granulocitos acidófilos de dorada infiltran el testículo en la etapa de involución testicular
13h 00 M. A. López-Muñoz.
Estudio de la actividad biológica de los INFs en el pez cebra
13h 15 I. Mulero.
Los mastocitos de los peces evolutivamente más avanzados contienen histamina
13h 30 F.J. Roca.
Nuevos avances sobre la actividad biológica del TNFα de peces
13h 45 M.P. Sepulcre.
Evolución de la respuesta inmunitaria innata en vertebrados: el TLR4 de peces no está implicado en
el reconocimiento del LPS
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MIÉRCOLES 4 DE JULIO
Aula A
9h 30 NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Coordinadores: Mª Carmen Risueño (CIB-CSIC, Madrid) y Miguel Lafarga (U. de Cantabria)
9h 30 Ponencia:
Nucleolar assembly and dynamics
Danièle Hernandez-Verdun (Institut Jacques Monod,Paris)
Comunicaciones:
10h 00 M.P. Marín.
La exposición crónica al etanol afecta el transporte nucleocitoplásmico en astrocitos
10h 15 M.J. Coronado.
Reorganización de la arquitectura nuclear durante la muerte celular programada inducida por estrés
en células vegetales
10h 30 R. Bengoechea.
Agregación nuclear de la proteína PABPN1 (“Poly(A)-binding protein nuclear 1”) en células UR61
10h 45 F.J. Medina.
Un mutante de Arabidopsis para el gen principal de la nucleolina revela su papel funcional en la síntesis de rRNA y en la organización del nucleolo
11h 00 Pausa café
11h 30 Ponencia:
Epigenética, expresión génica y estructura nuclear
Manel Esteller (CNIO, Madrid)
Comunicaciones:
12h 00 O. Tapia.
Relocalización nucleolar de la coilina y alteración de los cuerpos de Cajal inducida por radiaciones ionizantes en células MF-7
12h 15 C. Vicente.
Los SNP arrays y el perfil de expresión de miRNAs podrían permitir una mejor clasificación de pacientes con leucemia mieloide aguda y cariotipo normal
12h 30 M. Gómez-Benito.
Caracterización de nuevas alteraciones genéticas en leucemia linfática crónica y expresión diferencial de microRNAs
12h 45 A. Chinchilla.
Análisis del papel tejido específico de Pitx2 durante la cardiogénesis
13h 00 Á. De la Rosa.
Cambios en la expresión de los canales de sodio durante la cardiogénesis en un modelo de ratón
transgénico de síndrome de QT largo
17h 00 NUEVAS TECNOLOGÍAS
Coordinadores: Alberto Álvarez Barrientos (CNIC, Madrid) y Mª Carmen Risueño (CIB-CSIC, Madrid)
17h 00 Parte I: Nuevas herramientas en imagen para el análisis celular
Tecnologías que permiten el análisis celular de alto contenido mediante imagen
Alberto Álvarez Barrientos (CNIC, Madrid)
La imagen como herramienta para el estudio de la función de la proteína 4.1
Isabel Correas (CBM, Madrid)
Nuevas técnicas de obtención y análisis de imagen celular y molecular
Carlos Ortiz de Solórzano (CIMA-U. de Navarra)
18h 00 Parte II: Visualización espacial de la célula mediante criotomografía electrónica
Cryo-immunogold electron microscopy and 3D cryo-electron tomography; our methodology
to embark on an expedition towards a pseudoatomic atlas
Peter J. Peters (Netherlands Cancer Institute, Amsterdam)
La vitrificación, clave de la Tomografía y la Biología Estructural Celular
Carmen López-Iglesias (SCT-PCB U.de Barcelona)
State of the art in electron tomography: from the electron microscopy to the 3D-reconstruction
Sergio Marco (Institut Curie, Paris)
19h 00 Parte III: Mesa Redonda
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Aula B
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9h 00 PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER (PARTE 2)
Coordinadores: Alberto Muñoz (CSIC-UAM, Madrid) y Luis Montuenga (CIMA-U. de Navarra)
9h 00 Ponencia:
Proteasas, envejecimiento y supresión tumoral: conexiones desde la lámina nuclear
Carlos López Otín (U. de Oviedo)
Comunicaciones:
9h 30: E.M. García.
Búsqueda de nuevas proteínas que interaccionan con Smad 2 utilizando el sistema doble híbrido
Cyto-Trap
9h 45 I. Durán.
Las actinotriquias tienen un origen mixto, ectodérmico y mesenquimático, en el desarrollo y regeneración de la aleta de Danio rerio
10h 00 L. Jiménez.
Epiprofina/SP6, un factor de transcripción fundamental para el desarrollo de tejidos ectodérmicos
10h 15 E. Beltrán-Frutos.
Cambios en el tejido conjuntivo de la dermis de rata debidos a la acción de radiofrecuencia a baja potencia
10h 30 U. Silván.
Estudio de la vascularización de un modelo del tumor testicular de las células germinales
10h 45 B. Zaldibar.
Proliferación celular en la glándula digestiva del mejillón: variabilidad natural e implicaciones en la evaluación de la salud del medio ambiente
11h 00 Pausa café
11h 30 SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Coordinadora: Isabel Fabregat (IDIBELL-IRO, Barcelona)
Comunicaciones:
11h 30 F. Nicolau-Galmés.
La terfenadina induce genotoxicidad y apoptosis a través de la activación de tirosinquinasas y la modulación del Ca2+ intracelular
11h 45 Y. Sánchez.
La isoflavona genisteína potencia selectivamente la inducción de apoptosis por la droga antileucémica trióxido de arsénico mediante generación de estrés oxidativo
12h 00 S. Rello-Varona.
Catástrofe mitótica en células HeLa sometidas a terapia fotodinámica con ftalocianina de zinc
12h 15 I. Sánchez.
Mecanismos intracelulares que participan en la inducción del gen de somatostatina por BDNF en células cerebrocorticales de embriones de rata
12h 30 G. del Castillo.
Papel de c-met en la regulación de apoptosis en células progenitoras hepáticas
12h 45 C. Martínez-Salgado.
La GTPasa RAS, ERK y AKt modulan la síntesis de matriz extracelular y la proliferación inducidas por
el factor de crecimiento transformante-ß1
13h 00 Ponencia:
Un nuevo activador transcripcional regulado por p38 MAPK que estimula la respuesta apoptótica
mediada por p53
Ángel Nebreda (CNIO, Madrid)
15h 30 DISCUSIÓN DE PÓSTERS (Edificio de Biblioteca de Ciencias - Con café)
21h 00 CENA DE CLAUSURA
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JUEVES 5 DE JULIO
Aula A
9h 00 CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Coordinadores: José Becerra (U. de Málaga) y Felipe Prósper (CIMA-U. de Navarra)
(Sesión patrocinada por la Rama Española de la ETCS)
Ponencias:
9h 00 Adult stem cell-based therapies for osteochondral defects
Luis A. Solchaga (Case Western Reserve University, Cleveland, USA)
9h 30 Potencial vascular de las células madre adultas
Felipe Prósper (CIMA-U. de Navarra)
10h 00 Comunicaciones:
J. A. Andrades.
Efecto del colágeno tipo I en la diferenciación osteocondrogénica in vivo de células estromáticas derivadas de grasa visceral de rata
S. Claros.
Capacitación condro-osteogénica de células madre mesenquimáticas procedentes de médula ósea
de rata con rhBMP-2
A. Bonora-Centelles.
Nuevas alternativas al trasplante de órgano entero: diferenciación de células madre mesenquimales
adultas hacia linaje hepático
N. Gago.
Aislamiento y caracterización de precursores neurales a partir de piel humana adulta
I. Cárcamo Orive.
La autorenovación y diferenciación de células madre mesenquimales está regulada por la MAP kinasa ERK2
11h 00 Pausa café
11h 30 MESA SOBRE POLÍTICA CIENTÍFICA
Coordinador: Gregorio García Herdugo (U. de Sevilla)
Ponentes:
Francisco Gracia Navarro (Director del Instituto de Salud Carlos III)
Pilar Santisteban (Gestora del Programa de Biología Molecular y Celular del MEC)
José Luis Martínez Peña (Subdirector General de Proyectos de Investigación del MEC)
13h 00 CONFERENCIA DE CLAUSURA
Mechanisms of intracellular transport: from biology...to physics
Bruno Goud (UMR CNRS/Institut Curie, Paris)
14h 00 DESPEDIDA DEL CONGRESO
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RESÚMENES
DE LAS PONENCIAS
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CONFERENCIA INAUGURAL
A DYNAMIC VIEW OF CELLULAR INTERACTIONS IN
MAMMARY DEVELOPMENT AND CANCER
Zena Werb, Andrew J. Ewald, Mikala Egeblad, Department of Anatomy,
Unversity of California, San Francisco CA 9414300452, USA. Tel. (415) 4764622. zena.werb@ucsf.edu
Collective cell movements are required to build and remodel vertebrate
epithelial organs, and are used for tumor invasion, yet little is known about
how cells move and rearrange while remaining part of an epithelial sheet. We
have focused on the cell behaviors underlying extension and bifurcation of
during mammary ductal morphogenesis and during mammary tumor
progression. We have taken a combined imaging, cell biological, and
pharmacological approach to determine the tissue transformations underlying
branching morphogenesis and neoplastic progression, then determine the
cell behaviors and adhesive interactions underlying these tissue movements,
and finally to dissect the molecular regulation of these cell behaviors and
adhesive interactions. We have defined and characterized a quiescent
epithelial state, and activated epithelial state and a persistently activated state
using dynamic 3D confocal microscopy imaging and marker analysis in vivo
and in culture. Invasion Extension from a multi-cellular front in which cells are
vigorously rearranging. We have foud that matrix metalloproteinases, Rac1,
ROCK1, and myosin light chain kinase play roles in the cellular and molecular
mechanisms underlying this novel collective cell behavior.
We have also used genetic and in vivo imaging techniques to study the
interaction between leukocytes and epithelial cancer cells during tumor
progression. Our data support the hypothesis that that inflammatory cells both
enhance tumor growth or inhibit tumor progression. The challenge is to
determine which cellular interactions are pro-tumor, and thus should be
inhibited, and which ones inhibit tumors and should be enhanced.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Ponencia invitada
REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL Y DIFERENCIACIÓN
CELULAR EN EL PÁNCREAS EXOCRINO
Francisco X. Real, U. Biologia Cel.lular i Molecular, IMIM, Universitat
Pompeu Fabra, Barcelona. preal@imim.es
Las células acinares y ductales constituyen los principales elementos del
páncreas exocrino y contribuyen de forma importante a la patología exocrina.
El programa de diferenciación de las primeras ha sido extensamente
estudiado mientras que es poco lo que se conoce del de las células ductales.
Existen evidencias genéticas de que ambos tipos celulares pueden activar el
programa transcripcional alternativo en determinadas situaciones fisiológicas
y patológicas. Concretamente, la transdiferenciación acinar-ductal constituye
la base celular de la pancreatitis crónica y representa un estado
preneoplásico asociado a un aumento del riesgo de desarrollar cáncer de
páncreas.
Recientemente, hemos utilizado SAGE y microarrays para analizar el
transcriptoma ductal humano con el objetivo de caracterizar mejor el
programa de diferenciación celular. De estos estudios se desprende que los
genes expresados por las células ductales tienen un patrón de expresión a
nivel tisular mucho más amplio que el de las células acinares. Por otra parte,
hemos utilizado el doble híbrido en levadura e identificado ICAT – un
regulador negativo de la vía de Wnt - como una proteína que interacciona con
p48/Ptf1a, un factor de transcripción específico de las células acinares. La
expresión ectópica de ICAT modula la actividad de los promotores de células
acinares in vitro.
Finalmente, nuestro grupo está diseccionando el papel de las vías de
señalización de MAPK y PI3K en la transdiferenciación acinar-ductal in vitro
como una estrategia para la mejor comprensión de los mecanismos
moleculares implicados en el desarrollo y/o progresión de la patología
pancreática crónica.
En conjunto, estos estudios contribuirán a desarrollar nuevas estrategias
para revertir los fenómenos de transdiferenciación celular implicados en
dicha patología.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Ponencia invitada
PROTEASAS, ENVEJECIMIENTO Y SUPRESIÓN TUMORAL:
CONEXIONES DESDE LA LÁMINA NUCLEAR
A.P. Ugalde, I. Varela, J. Espada, J.P. Freije y C. López-Otín*. Departamento
de Bioquímica-IUOPA. Universidad de Oviedo. Oviedo (Asturias) Tfno.: (985)
104201. *clo@uniovi.es.
La metaloproteasa FACE-1/Zmpste24 lleva a cabo la maduración
proteolítica de la lamina A, un componente fundamental de la envuelta
nuclear. Ratones deficientes en esta proteasa acumulan prelamina A en la
lámina nuclear, desencadenando alteraciones que conducen a un fenotipo de
senescencia celular y envejecimiento acelerado asociado con la
sobreexpresión de dianas del supresor tumoral p53. En consonancia con
estos resultados, se han encontrado mutaciones en el sistema FACE1/lamina A en síndromes de envejecimiento prematuro como la progeria de
Hutchinson-Gilford. Dado que el envejecimiento puede estar asociado con
alteraciones en la biología de las células madre, hemos realizado
experimentos encaminados a investigar la funcionalidad de estas células en
ratones Face1-/-. Estos experimentos revelaron que la ausencia de la
proteasa FACE-1 provoca defectos en la proliferación de las células madre
epidérmicas que son revertidos al reducir los niveles de prelamina A. Estos
resultados demuestran una relación causal entre la acumulación de este
precursor tóxico y los defectos observados en las células madre y sugieren
la posibilidad de utilizar los ratones Face1-/- como modelo animal para
ensayar terapias celulares para el tratamiento de síndromes progeroides.
Asimismo, hemos utilizado diversas aproximaciones farmacológicas y
genéticas encaminadas a disminuir los niveles de prelamina A farnesilada,
como posibles terapias antiprogeroides en este modelo animal. Los
resultados de este trabajo pueden facilitar el desarrollo de tratamientos frente
a estas dramáticas enfermedades de envejecimiento acelerado y revelar
algunas claves del envejecimiento normal.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Ponencia invitada
REGULACIÓN DE LOS RECEPTORES
GLUTAMATÉRGICOS DE KAINATO
Juan Lerma, Instituto de Neurociencia de Alicante, CSIC-UMH,
San Juan de Alicante. Tfno.: 965919239. jlerma@umh.es.
Los receptores de de kainato (KARs) poseen un doble sistema de
señalización. Por un lado, forman canaes iónicos cuya activación conlleva la
despolarización de la membrana neuronal; por otro, activan una proteína G que
estimula la fosfolipasa C y la PKC (señalización no-canónica (1)). La forma en que
un receptor con estructura molecular de canal iónico interacciona y/o activa un
proteína G es desconocida. Una de los actuales intereses del laboratorio es la de
identificar interactores de los receptores que puedan explicar esta vía no canónica.
Otra radica en la valoración del impacto que esta vía puede tener en la función y
la excitabilidad neuronal. Con el fin redeterminar si la activación de de una vía de
señalización pude modular la otra, hemos realizado experimentos en neuronas
DRG cultivadas utilizando técnicas electrofisiológicas de parche perforado y
perfusión rápida. La activación repetida (1’) de los KARs provoca un declive de la
respuesta ionotrópica que es mediada por activación de PKC, pues se abole con
inhibidores de esta enzima. Este declive no se observa si el receptor es activado
a mayores intervalos (5’), indicando la existencia de una recuperación, que parece
depender de la actividad de Calcineurina. La concentración intracelular de Ca2+ es
determinante para este fenómeno, ejerciendo una acción bidireccional en la
modulación de estos receptores. Experimentos en líneas celulares con distintas
subunidades del receptor de kainato, indicaron que la subunidad GluR52b explica
la mayor parte de este fenómeno. Experimentos bioquímicos en los que se analizó
la internalización de los receptores en diversas condiciones demostraron que la
activación de GluR52b estimula –dependiendo de proteína G- la PKC, que
mediante la fosforilación de esta subunidad en S879 y S885, induce la rápida
internalización de los KARs de la membrana. Estos resultados indican que la doble
capacidad de señalización de los KARs los dota de un mecanismo de valoración
de la actividad aferente que limita su disponibilidad en la membrana, pudiendo,
representar un mecanismo de seguridad contra la excitotoxicidad.
Bibliografía
Rozas et al., Neuron 39:543-53, 2003
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Ponencia invitada
FUNCTIONAL MAINTENANCE OF NERVE TERMINALS IN THE
ABSENCE OF CYSTEINE STRING PROTEIN-ALPHA
(CSP-ALPHA)
P. García-Junco-Clemente, P. Linares-Clemente, G. Cantero-Nieto, J.L.
Rozas y R. Fernández-Chacón*. Departmento de Fisiología Médica y
Biofísica, Facultad de Medicina, Universidad de Sevilla, Avda. SánchezPizjuán 4, 41009-Sevilla Tfno.: (954) 556103. *rfchacon@us.es.
Nerve terminals continuously maintain the synaptic vesicle cycle.
Unknown mechanisms overcome the use-dependent damage of proteins.
Cysteine String Protein-alpha (CSP-alpha) is a synaptic vesicle protein that
prevents presynaptic neurodegeneration (Neuron 42:237-51,2004). In mice
lacking CSP-alpha, we have studied hippocampal neurons in culture. Low
density autaptic cultures display a robust synaptic transmission and, after two
weeks, a subtle decrease in EPSC size. Higher density cultures where
synaptic contacts form between multiple neurons, display several alterations:
(i) smaller size of the recycling vesicle pool (FM4-64), (ii) a progressive
decrease in the density of synaptic punctae and (iii) a strikingly reduction in
the size of spontaneous AMPA-mEPSCs after 30 days in culture. Our results
indicate that, in conventional cultures, the absence of CSP-alpha leads to a
progressive neurodegenerative phenotype similar to the “in vivo” phenotype
in mice. That phenotype in culture is ideally suited to investigate the protective
role of CSP-alpha against synaptic activity overloads. We are also pursuing
the identification of synaptic vesicle cycle alterations that precede
morphological degeneration. We have generated Thy-1 transgenic mice that,
lack CSP-alpha and express synaptopHluorin, a pH-sensitive GFP that
reports fluorescence changes due to exo- and endocytosis. This approach is
turning out to be sensitive enough to uncover alterations in synaptic vesicle
exo- and endocytosis at the neuromuscular junction that only appear after
the second week of life.
Support: HFSP and Spanish Ministries of Education and Science and
Health (BFU2005-08130, Juan de la Cierva, FPU and BEFI).
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PROTEASOMAS
Ponencia invitada
NUEVOS NIVELES DE REGULACIÓN DEL PROTEASOMA:
EL REMODELADO DE LAS CADENAS DE UBICUITINA
B. Crosas*. Departamento de Biología Molecular y Celular, Institut de
Biologia Molecular de Barcelona, CSIC.
Tfno: 93 400 6100 ext. 338 - 285 *bcnbmc@cid.csic.es
En un trabajo anterior identificamos Hul5, una ubicuitina ligasa, como un
componente asociado al proteasoma (Leggett, 2002). Hemos observado que
Hul5 proporciona al proteasoma la capacidad de extender las cadenas de
ubicuitina de las proteínas sustrato unidas al proteasoma (Crosas, 2006).
Los mutantes de hul5 degradan más lentamente sustratos del proteasoma in
vivo, hecho que sugiere que la señal de poliubicuitilación amplificada en el
proteasoma por Hul5 es productiva. Sin embargo, los productos de
conjugación de Hul5 son recortados por Ubp6, un enzima de desubicuitilación unido al proteasoma (Hanna, 2006). El mutante nulo de hul5 es
supresor de ubp6Δ, hecho que sugiere que para su correcto funcionamiento,
el proteasoma necesita un equilibrio entre las actividades de extensión y
recorte de las cadenas de ubicuitina. Proponemos que, mediante un activo
remodelado de las cadenas de ubiquitina, el proteasoma regula la
degradación de proteínas.
Bibliografía
Crosas et al., Cell 127, 1401-1413, 2006
Hanna et al., Cell 127, 99-111, 2006
Leggett et al., Mol. Cell 10, 495-507, 2002
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PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Ponencia invitada
PROLIFERACIÓN, MADURACIÓN Y SUPERVIVENCIA CELULAR
EN EL HIPOCAMPO ADULTO. EFECTOS DE DROGAS
ESTIMULANTES Y POSIBLES CONSECUENCIAS
FUNCIONALES
J.J. Canales. Biopsicología y Neurociencia Comparada. Instituto Cavanilles.
Universidad de Valencia. Tfno 96 354 3768
juan.canales@uv.es
El giro dentado del hipocampo es una de las áreas neurogénicas en el
cerebro adulto. Las células progenitoras de la capa subgranular del giro
dentado proliferan continuamente, dando lugar a nuevas neuronas que se
integran funcionalmente en los circuitos preexistentes. Los procesos de
proliferación, supervivencia y maduración de las nuevas neuronas están
regulados por múltiples variables, tanto endógenas como exógenas. La
evidencia neurotoxicológica acumulada en los últimos años indica que
diversas sustancias adictivas, tales como la cocaína, el éxtasis, el alcohol y
los opiáceos alteran uno o varios de los procesos neurogénicos que
contribuyen a la repoblación del giro dentado hipocámpico adulto. Se
presentará evidencia de que la administración crónica de cocaína disminuye
la tasa de proliferación celular en el giro dentado, y de que la administración
repetida de éxtasis reduce significativamente las posibilidades de
supervivencia de las nuevas células generadas. El abuso de sustancias
psicoestimulantes parece asociarse de forma consistente con la aparición
de alteraciones y disfunciones de la función hipocámpica en humanos.
Específicamente, estas sustancias pueden afectar las funciones
mnemónicas. En base a la evidencia presentada, cabe especular con la
posibilidad de que estas disfunciones en el procesamiento de información
puedan estar relacionadas con los efectos deletéreos que los estimulantes
y otras drogas psicodélicas inducen sobre la neurogénesis hipocámpica.
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INMUNOBIOLOGÍA
Ponencia invitada
UTILIZACIÓN DE MUTANTES DEL PEZ CEBRA PARA
EL ANÁLISIS DEL SISTEMA LINFO-HEMATOPOIÉTICO
DE LOS VERTEBRADOS
Agustín G. Zapata y Alfonso Cortés. Departamento de Biología Celular.
Facultad de Biología. Universidad Complutense. 28047 Madrid. Tfno.: (91)
394 4979. zapata@bio.ucm.es.
En los últimos años el pez cebra, Danio rerio, se ha convertido en un
excelente modelo experimental para analizar la base celular y molecular de
numerosos procesos biológicos. En la presente comunicación se revisan las
características que han hecho ideal este modelo para la investigación del
sistema linfo-hematopoiético de los vertebrados. Se revisan en primer lugar
los loci hematopoiéticos tempranos y el desarrollo de los órganos linfoides
primarios y secundarios, para formular, después, algunos de los problemas
existentes en cuanto a la diferenciación linfoide y la información obtenida al
respecto con los estudios en el pez cebra. La presentación finaliza revisando
el fenotipo de varios mutantes de pez cebra con defectos en el desarrollo
hematopoiético, linfoide y/o del timo, el órgano donde se generan los
linfocitos T en todos los vertebrados.
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INMUNOBIOLOGÍA
Ponencia invitada
DYNAMICS OF ENDOTHELIAL ADHESIVE PLATFORMS, BASED
ON TETRASPANIN MICRODOMAINS, IN PRIMARY LIVING
CELLS DURING LEUKOCYTE ADHESION AND MIGRATION
Francisco Sánchez-Madrid. Servicio de Inmunología. Hospital Universitario de la Princesa. Universidad Autónoma de Madrid. Madrid. Tfno.: (91)
3092115. fsanchez.hlpr@madrid.org
Tetraspanins are small proteins that laterally associates with a plethora
of receptors and signalling molecules organizing a sort of microdomains at the
plasma membrane based on specific protein-protein interactions. Up to date,
most of the experiments that have addressed the existence of this tetraspanin
web were biochemical analyses. We have made extensive use of different
complementary and innovative analytical microscopy techniques to demonstrate the existence of tetraspanin microdomains at the apical membrane of
primary human living endothelial cells. Since the analyzed microdomains contain several adhesion receptors involved in different steps of the extravasation process, we have termed them as endothelial adhesive platforms. On
the other hand, we have also analyzed the regulatory role of endothelial
tetraspanin microdomains in the context of leukocyte-endothelium interactions and in the modulation of MT1-MMP enzymatic activity.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Ponencia invitada
MECHANISMS OF RETROGRADE TRANSPORT FROM
ENDOSOMES TO THE TGN
R. Rojas, F.J. Pérez-Victoria, N. Murthy, Y. Prabhu, J. Hurley and J.S.
Bonifacino*. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA. Tel: 1301-496-6368. *juan@helix.nih.gov.
Some intracellular transmembrane proteins, such as acid hydrolase
receptors, processing peptidases and SNAREs, undergo “retrograde”
transport from endosomes to the trans-Golgi network (TGN) as part of their
normal trafficking. This retrograde transport pathway is also exploited by a
subset of bacterial and plant protein toxins to reach the endoplasmic reticulum
and eventually the cytosol.
Recent studies have begun to unravel the molecular machinery that is
involved in this transport. Acid-hydrolase receptors such as the Saccharomyces
cerevisiae vacuolar protein sorting 10 (Vps10) protein and the mammalian
mannose 6-phosphate receptors (MPRs) are selected for retrograde transport
by a five-subunit complex named “retromer “. This complex has also been
shown to regulate the production of amyloid-beta peptide and the generation of
long-range Wnt gradients during development, both processes that require
retrograde traffic. In mammalian cells, retromer is mainly associated with tubules
that emanate from vacuolar, early-late transitional endosomes. This highlights
the existence of an extensive tubular endosomal network (TEN) that both sorts
and recycles cargoes to various destinations, including different domains of the
plasma membrane, the limiting membrane of lysosomes and lysosome-related
organelles and specialized storage vesicles, in addition to the TGN.
Once sequestered into the TEN by the action of retromer, the MPRs are
delivered to the TGN via tubular carriers. The merging of these carriers with
the TGN requires the function of another multi-subunit complex named
“GARP”. Depletion of either retromer or GARP by RNA interference blocks
retrograde transport of the MPRs, leading to missorting of acid hydrolases to
the extracellular medium. Thus, retromer and GARP are components of the
molecular machinery that mediates retrograde transport from endosomes to
the TGN.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Ponencia invitada
TRANSPORTE POLARIZADO DE PROTEÍNAS DE SUPERFICIE
EN CÉLULAS EPITELIALES Y LINFOCITOS T
A. Batista, O. Antón, J.F. Aranda, L. Andrés, M.C. de Marco, A. Jiménez, R.
Madrid y M.A. Alonso*. Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”, CSICUAM, Universidad Autónoma de Madrid. Tfno.: (91) 4978037.
*maalonso@cbm.uam.es.
La capacidad de adquirir un fenotipo polarizado es una propiedad de la
mayoría de las células eucarióticas. Las células epiteliales MDCK, que tienen
su membrana plasmática dividida en un subdominio apical y otro basolateral,
han sido sin duda el modelo celular más utilizado para investigar los
mecanismos responsables de la polaridad celular.
El modelo más vigente en la actualidad para explicar el transporte a la
superficie apical se basa en la existencia de microdominios de membrana
especializados denominados balsas lipídicas (rafts) que, junto con la participación
de una maquinaria proteica especializada, actuarían como plataformas para la
formación de las vesículas con destino apical. La proteína MAL ha sido
caracterizada por nuestro grupo como un componente esencial de la maquinaria
para el transporte apical en las células MDCK. Nuestras observaciones nos han
llevado a proponer un modelo según el cual, MAL actuaría organizando las balsas
lipídicas para hacerlas competentes en la captación de moléculas de la carga y
en propio el proceso de formación de las vesículas de transporte apical.
En contraste con la célula epitelial, el linfocito T en reposo no presenta
una polaridad aparente. Sin embargo, cuando se produce el reconocimiento
de un antígeno apropiado presentado por una célula presentadora, el linfocito
T se polariza de forma muy rápida segregando en la zona de contacto un
subdominio denominado sinapsis inmunológica. Nuestros trabajos más
recientes indican que la proteína MAL es necesaria para el transporte de la
proteína Lck a la membrana plasmática, la formación completa de la sinapsis
inmunológica y el desencadenamiento del proceso de señalización celular.
Nuestros datos indican, por lo tanto, un papel central para la proteína
MAL en las rutas de transporte especializado de las células epiteliales y de
los linfocitos T.
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Ponencia invitada
NUCLEOLAR ASSEMBLY AND DYNAMICS
D. Hernandez-Verdun. Nuclei and cell cycle, Institut Jacques Monod, 2 place
Jussieu, 75251 Paris Cedex 05, France.
E-mail : dhernand@ccr.jussieu.fr
One of the fundamental features of nuclear organization is that many
components of the RNA synthesis and processing machineries are organized
in compartments. This implies that the recruitment of dedicated machineries
and formation of discrete nuclear domains are crucial events at the beginning
of interphase.
The nucleolus is the first active domain to be assembled after mitosis. Its
functions depend on recruitment of the nucleolar machineries involved in
processing of ribosomal RNAs (rRNA) as well as rDNA transcription
activation.
During mitosis, the RNA polymerase I transcription machinery is
assembled on ribosomal genes and repressed by the CDK1-cyclin B
pathway. The proteins involved in rRNA processing are distributed around
the chromosomes.
New results concerning the translocation of processing machinery on
transcription sites will be presented. We examined the pathway of the rRNA
processing machinery in living cells, and the role of the prenucleolar bodies
(PNBs), on the migration of the machinery from the chromosome periphery
to sites of rDNA transcription. Protein interactions along the recruitment
pathway were investigated by time-lapse analysis of fluorescence resonance
energy transfer (FRET). Interestingly interactions between processing
proteins occurred first in PNBs before being recruited in nucleoli. The
dynamics of these interactions suggests that PNBs are pre-assembly
platforms for rRNA processing complexes.
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Ponencia invitada
EPIGENÉTICA, EXPRESIÓN GÉNICA
Y ESTRUCTURA NUCLEAR
Manel Esteller. Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas
mesteller@cnio.es
The cell nucleus is a highly structured compartment where nuclear
components are thought to localize in non-random positions. Correct
positioning of large chromatin domains may have a direct impact on the
localization of other nuclear components, and can therefore influence the
global functionality of the nuclear compartment. DNA methylation of cytosine
residues in CpG dinucleotides is a prominent epigenetic modification of the
chromatin fiber. DNA methylation, in conjunction with the biochemical
modification pattern of histone tails, is known to lock chromatin in a close and
transcriptionally inactive conformation. The relationship between DNA
methylation and large-scale organization of nuclear architecture, however, is
poorly understood. I will briefly summarize present concepts of nuclear
architecture and current data supporting a link between DNA methylation and
the maintenance of large-scale nuclear organization.
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Ponencia invitada
UN NUEVO ACTIVADOR TRANSCRIPCIONAL REGULADO POR
p38 MAPK QUE ESTIMULA LA RESPUESTA APOPTÓTICA
MEDIADA POR p53
Ana Cuadrado, Vanesa Lafarga, Ignacio Dolado y Angel R. Nebreda. Centro
Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Melchor Fernández
Almagro 3, 28029 Madrid. anebreda@cnio.es
La proteína-quinasa p38 MAPK juega un papel muy importante en la
elaboración de las respuestas celulares a señales de estrés, que incluyen
desde la parada del ciclo celular a la inducción de apoptosis.
En este trabajo hemos caracterizado un nuevo sustrato de p38 MAPK al que
hemos denominado p18Hamlet. Esta proteína se acumula en respuesta a ciertos
agentes genotóxicos tales como el cisplatino y la radiación UV. La acumulación de
p18Hamlet no implica cambios en los niveles de su mRNA y requiere la activación
de p38 MAPK. Hemos identificado 4 residuos en p18Hamlet cuya fosforilación
interfiere con su degradación in vivo y que son fosforilados por p38 MAPK in vitro.
Experimentos con siRNA indican que la expresión de p18Hamlet es
necesaria para la inducción de apoptosis en respuesta a agentes que
inducen daño en el ADN. Hemos observado que p18Hamlet interacciona con
el supresor tumoral p53 y estimula la transcripción de genes pro-apoptóticos
como PUMA Y NOXA, que son regulados por p53. Además, la sobreexpresión de p18Hamlet es suficiente para inducir apoptosis específicamente
en células que expresan p53 y es capaz de aumentar los niveles de p53
unido a determinados promotores de genes pro-apoptóticos. La activación
transcripcional inducida por p18Hamlet en genes regulados por p53 se
correlaciona con su reclutamiento a los promotores correspondientes. La
expresión de p18Hamlet se mantiene normalmente a niveles bajos en células
que proliferan y uno de los mecanismos responsables de esta regulación
implica probablemente un “feed-back loop” negativo mediado por la ciclina
G1, que a su vez es regulada por p53.
En resumen, nuestros resultados indican que p18Hamlet es un nuevo
efector de la ruta de p38 MAPK, que contribuye a la inducción de apoptosis
mediada por p53 en la respuesta celular a agentes genotóxicos.
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NUEVAS TECNOLOGÍAS
Ponencia invitada
TECNOLOGÍAS QUE PERMITEN EL ANÁLISIS CELULAR DE
ALTO CONTENIDO MEDIANTE IMAGEN
Alberto Álvarez Barrientos, Unidad de Citometría, Fundación Centro
Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Tfno.: 91 4531214.
aalvarezb@cnic.es.
El análisis celular de alto contenido se refiere a la adquisición de
imágenes usando microscopios de fluorescencia robotizados con una gran
capacidad de análisis. Esta capacidad de análisis permite adquirir varios
parámetros por imagen aumentando los niveles de información. Se ha
convertido en una herramienta esencial en los programas de descubrimiento
de fármacos y de estudios de biología celular a gran escala. Precisamente
la escala es la que diferencia este tipo de análisis del convencional estudio
de 2 o 3 fluorescencia mediante microscopía confocal o fluorescente. Se
trata de analizar miles de muestras en un espacio pequeño obteniendo el
resultado en un espacio de tiempo pequeño. De esta forma se pueden
analizar el complejo fenotipo resultante de la inhibición de un gen (Knock-out)
o del silenciamiento génico (RNAi), sin perder de vista el plano celular o las
interacciones celulares.
Las técnicas utilizadas en el análisis celular de alto contenido, van desde
microscopios de fluorescencia de alta velocidad, a microscopios confocales
equipados con varios láseres, que permiten adquirir hasta ocho parámetros
simultáneamente. Como siempre hay una pega y, en este caso, reside en la
gran cantidad de información que se genera y en la relativa pequeña
capacidad de análisis que tienen los equipos en la actualidad.
Por otro lado, veremos los últimos desarrollos que permiten aunar los
dos sistemas más eficaces de obtención de información de alto contenido
que son la citometría de flujo y la Microscopía espectral.
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NUEVAS TECNOLOGÍAS
Ponencia invitada
LA IMAGEN COMO HERRAMIENTA PARA EL ESTUDIO
DE LA FUNCIÓN DE LA PROTEÍNA 4.1
E. Lospitao, A. Ruiz-Sáenz, A. Gosálbez, C. Pacios-Bra, C.M. Pérez-Ferreiro
y I. Correas*. Departamento de Biología Molecular. Centro de Biología
Molecular ‘Severo Ochoa’. UAM-CSIC. Madrid. Tfno.: (91) 4978044.
*icorreas@cbm.uam.es.
En los últimos años, las técnicas de imagen de Biología Celular están
contribuyendo de manera muy importante al estudio del comportamiento in
vivo de las proteínas en distintos sistemas celulares. La proteína 4.1 (4.1R)
fue originalmente descrita como un componente de 78-80 kDa del
citoesqueleto del eritrocito humano. La función de 4.1 en el eritrocito ha sido
ampliamente analizada y se conocen las proteínas con las que interacciona,
los dominios a través de los que se establecen dichas interacciones y su
papel clave como nexo de unión entre el citoesqueleto de actina y la
membrana plasmática. Un fallo en la cantidad de 4.1, o en su interacción con
alguna de las proteínas con las que se asocia, se ha correlacionado con
cambios en la forma y en la resistencia mecánica de la célula, de manera que
el eritrocito se rompe con facilidad y los pacientes que los poseen sufren
anemias hemolíticas hereditarias.
En las células nucleadas de mamífero, el patrón de expresión de 4.1 es
muy complejo y se debe, principalmente, al procesamiento alternativo del
pre-mRNA de 4.1 que es dependiente del tipo celular y del estadio del
desarrollo. Uno de los principales objetivos de nuestro grupo de trabajo es
conocer los mecanismos por los que se genera la diversidad de isoformas de
4.1 y determinar las funciones que las distintas proteínas 4.1 están
desempeñando en las células no eritroides. Mediante diversas técnicas
bioquímicas, de biología molecular y de biología celular hemos determinado
que 4.1 es un componente del nucleoesqueleto celular, que se asocia
también al citoesqueleto de tubulina, que es un componente del centrosoma
que puede servir de nexo de unión entre los microtúbulos y el centrosoma,
etc. La utilización de técnicas de video-microscopía nos está permitiendo
analizar la participación de 4.1 en el proceso de la división celular. Este tipo
de análisis pone de manifiesto la multifuncionalidad de la proteína 4.1 y la
utilidad de las técnicas de imagen para el estudio de su función.
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NUEVAS TECNOLOGÍAS
Ponencia invitada
NUEVAS TÉCNICAS DE OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE IMAGEN
CELULAR Y MOLECULAR
C. Ortiz de Solórzano*. Laboratorio de Imagen del Cáncer. Centro de
Investigación Médica Aplicada. Universidad de Navarra. Pamplona. Tfno.:
(948) 194700. *codesolorzano@unav.es.
Las técnicas de análisis cuantitativo de imagen microscópica celular
permiten el estudio in situ de procesos biológicos que hasta la fecha sólo
podían ser estudiados mediante técnicas bioquímicas convencionales. Las
técnicas de imagen consiguen una mayor de especificidad y respetan la
heterogeneidad propia de cualquier proceso biológico que ocurre en una
célula, tejido u órgano. De entre todas las tecnologías y aplicaciones
posibles, se presentan dos ejemplos que utilizan microscopía tridimensional
confocal y microscopía tridimensional basada en seccionamiento y
reconstrucción a partir de secciones.
La primera aplicación, que utiliza microscopía confocal consiste en un
estudio in situ correlativo de la inestabilidad genética y la longitud de los
telómeros en el contexto histológico de la evolución del cáncer de mama. El
tipo de análisis realizado permite localizar el momento del incremento de
inestabilidad y confirmar el papel de la crisis telomérica en ese incremento
de inestabilidad.
La segunda aplicación, que emplea microscopía tridimensional a partir
de seccionamiento y reconstrucción es un estudio cuantitativo de la
presencia y distribución de células madre adultas en la glándula mamaria.
Las técnicas de análisis de imagen utilizadas nos permitieron determinar la
presencia de una zona de enriquecimiento preferente localizada en las áreas
proximales de la glándula.
Como conclusión, se pretende mostrar con estos ejemplos el importante
papel que las nuevas tecnologías de análisis de imagen pueden tener como
complemento a técnicas bioquímicas tradicionales.
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NUEVAS TECNOLOGÍAS
Ponencia invitada
CRYO-IMMUNOGOLD ELECTRON MICROSCOPY AND 3D CRYOELECTRON TOMOGRAPHY; OUR METHODOLOGY TO EMBARK
ON AN EXPEDITION TOWARDS A PSEUDOATOMIC ATLAS
Peter Peters, Jason Pierson and Erik Bos. Netherlands Cancer Institute Antoni van Leeuwenhoek Hospital, Plesmanlaan 121-H4,
1066CX
Amsterdam, The Netherlands.
Telephone: +31 20 512 2031
On a scale of a few nanometers the cell with very dynamic massive
supramolecular assemblies is largely an uncharted territory. Just as highresolution 3D structures of macromolecules provide valuable insights into
their working, a better understanding of cellular functions will arise from the
ability to visualize supramolecular architecture in an unperturbed cellular
context. Our ultimate goal is to interpret the structure and dynamics of the
molecular networks. We are now working on new methods to provide 3D
maps of cellular components at molecular resolution. There is currently
immense excitement among us and our collaborators, since ongoing
advances in cryo-sectioning of native material at ultra low temperature as
well as cryo-EM instrumentation and computational methods may ultimately
make it possible to obtain resolutions in the range of 3 nm, i.e. potentially
high enough to locate individual proteins in a cell. To arrive at this technology,
we are participating in an international group of collaborators that include
Helmut Gnaegi (Diatome, Biel Switzerland), Felix de Haas (FEI electron
optics, Eindhoven), Nico Sommerdijk (University of Eindhoven), Henny
Zandbergen (University of Delft), Peter Frederik (University Maastricht) and
Bram Koster (University Leiden)
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPTitle/isbn-0471241083,descCd-video.html
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NUEVAS TECNOLOGÍAS
Ponencia invitada
LA VITRIFICACIÓN, CLAVE DE LA TOMOGRAFÍA
Y LA BIOLOGÍA ESTRUCTURAL CELULAR
C. López-Iglesias*, S. Ruíz, G. Martínez y E. Coll. Servicios Científicotécnicos, Parque Científico de Barcelona. Universidad de Barcelona. Tfno.:
(93) 4034658. *carmenli@sct.ub.es.
La vitrificación o congelación ultrarápida inmoviliza todas las moléculas de la célula
en milisegundos. Por ello, es muy recomendable en Biología Celular Estructural,
porque permite la fijación instantánea de todas las moléculas en su posición correcta
y con una duración tal, que los pasos siguientes en el procesado de las células no
alteran la arquitectura celular. De esta manera obtenemos un verdadero “snapshot” de
la célula en el momento de la congelación. Es una crio-inmovilización. Hay varias
maneras de congelar células, pero todas tienen en común el objetivo de eliminar calor
en una tasa tan rápida que las moléculas de agua formarán un hielo amorfo, no
cristalino; llevando a las células a un estado congelado-hidratado o vitrificado.
La elección del método de congelación depende de la muestra elegida. Uno de
los métodos mejores es la proyección de la muestra contra un bloque de metal
enfríado para células o tejidos; y para suspensiones de moléculas o células pequeñas,
la inmersión en propano o etano líquidos. Pero estos métodos sólo vitrifican la
estructura nativa unas cuantas micras de profundidad, por lo cual el método elegido
cuando se trata de muestras más gruesas es la HPF (High pressure freezing), con
el que se consigue congelar, sin daño visible de cristales de hielo, hasta 200 µm.
En nuestro laboratorio intentamos utilizar estos métodos como rutinarios
para fijar moléculas, células o tejidos para Microscopía Electrónica. Ya lo
hemos conseguido con un buen número de muestras diferentes; bacterias,
cianobacterias, células animales y vegetales, suspensiones de moléculas y
orgánulos… que preparamos mediante congelación ultrarápida seguida de
criosustitución, criofractura o criosecado.
Actualmente trabajamos en la puesta a punto de las secciones vítreas a
partir de material congelado para ser observadas en un crioTEM (CEMOVIS)
y comenzaremos con la Tomografía Electrónica (EM tomography) cuya base
es la vitrificación seguida de la criosustitución o en el mejor de los casos la
vitrificación seguida de criosecciones (CETOVIS).
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NUEVAS TECNOLOGÍAS
Ponencia invitada
STATE OF THE ART IN ELECTRON TOMOGRAPHY:
FROM THE ELECTRON MICROSCOPY TO THE
3D-RECONSTRUCTION
S. Marco*. Institut Curie – INSERM U759. Orsay (France)
Tfno.: +33 6 67 07 42 14. *sergio.marco@curie.fr
Transmission electron tomography (ET) can be defined as a method to
get 3D reconstructions of single objects from their projections recorded, at
different tilt angles, on a transmission electron microscope (TEM). TET
provides unprecedent insight into the supramolecular organization of the cell,
by cellular tomography, allowing also the analysis of large irregular
complexes, by molecular tomography, not accessible to X-ray crystallography
or to NMR. Electron tomography is not only complementary to these two highresolution methods but also to light microscopy that gives insight into the cell
but with a restricted resolution. Moreover, advances in microscope
automation as well as improvements in computer sciences have made
possible the study of the spatial distribution of several chemical components
in cells by energy filter transmission electron tomography (EFTET).
The theoretical bases, applications and new approaches in 3D electron
microscopy will be presented. This will be illustrated by examples on 3D
reconstructions of soluble and membrane proteins, sub-cellular organelles
(such as centrioles) and 3D chemical mapping of iron within bacteria. In
addition, combination of X-ray data and TEM, to solve macromolecular
complexes structures, will be given.
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Ponencia invitada
ADULT STEM CELL-BASED THERAPIES FOR
OSTEOCHONDRAL DEFECTS
L.A. Solchaga. Case Comprehensive Cancer Center, Case Western
Reserve University. Cleveland, Ohio, USA.
Tfno.: 1 (216) 368-6287. *las29@case.edu.
Articular cartilage degeneration in osteoarthritis is a major cause of
disability which affects more than 43 million lives in the US alone; these
numbers are expected to rise as the age of the population increases.
Once damaged, cartilage, an avascular tissue, does not heal
spontaneously. Efforts to promote cartilage self-repair have met with limited
success and are palliative at best. Thus, there remains a need for an effective
strategy to repair these defects and avoid surgical joint replacement.
Cartilage tissue engineering based on mesenchymal stem cell (MSC)
technology offers the promise of manufacturable tissue-replacement implants
of arbitrary size and shape, using autologous cells derived from a bone
marrow biopsy. It thus has the potential of making a significant contribution to
solving this critical public health problem and its serious social implications.
Our laboratory has focused on the design of cartilage repair implants that
contain both progenitor cells and a carrier matrix or matrices that promote
the differentiation of progenitor cells and integration of repair tissue into native
cartilage and bone.
The natural environment of the MSCs is highly vascular, and the cells are
shielded from mechanical stress by the surrounding bone structure. In
contrast, the natural environment of the chondrocyte is avascular, and
mechanically demanding. For MSC-based cartilage tissue engineering to
succeed, the MSCs must adapt to an environment where transport of
nutrients, growth factors and waste products is diffusion-limited, differentiate
along the chondrogenic pathway, and elaborate a matrix with the required
mechanical properties.
Our experimental approach to optimize the components of the cell-carrier
constructs and the constructs themselves including cell pre-conditioning,
construct assembly and use of bioreactors will be discussed.
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Ponencia invitada
POTENCIAL VASCULAR DE LAS CÉLULAS MADRE ADULTAS
Felipe
Prósper*.CIMA.
Universidad
Tfno.:948194700. fprosper@unav.es.
de
Navarra.
Pamplona.
La potenciación del crecimiento de las arterias –no de las venas- es la
meta de toda terapia de regeneración vascular en isquemias. El objetivo de
este trabajo es determinar el potencial arterial y venoso de las células
endoteliales obtenidas a partir de células madre AC133 y Multipotent Adult
Progenitor Cells (MAPC). A partir de ambas poblaciones celulares pueden
obtenerse células endoteliales mediante la adición de VEGF165. Las células
AC133 dan lugar a un endotelio con propiedades de microvasculatura y de
vena, mientras que las células MAPC dan lugar a un endotelio con
características de macrovasculatura de arteria y vena. Esta diferencia en el
tipo de endotelio que dan puede ser debida a que las MAPC expresan
significativamente más sonic hedgehoh (Shh) y sus receptores, así como
Notch1 y 3 y algunos de sus ligandos. La adición de Dll-4, ligando de Notch,
y Shh junto al VEGF-165 a las MAPC aumenta el potencial arterial de las
células, no solo in vitro sino también in vivo. Por lo tanto, las MAPC son una
importante fuente de células madre para el tratamiento de isquemias en
pacientes, debido a su potencial arterial tanto in vitro como in vivo.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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CONFERENCIA DE CLAUSURA
MOLECULAR MECHANISMS OF INTRACELLULAR
TRANSPORT: FROM BIOLOGY…TO PHYSICS
Bruno Goud. Department of Cell Biology (UMR 144 CNRS/Institut Curie),
Institut Curie, 26 rue d’Ulm, 75248 Paris Cedex 05, France; tel: (33) 1 42 34
63 98, email: bruno.goud@curie.fr
Vesicular traffic links the different intracellular compartments of eukaryotic
cells and allows for the exchange of macromolecules. A large number of
proteins that function directly or indirectly in vesicular traffic (estimated to
represent about 10-20% of the human “proteome”) have been identified.
Among them, small GTPases of the Rab family play a key regulatory role.
We will illustrate such a role for three Rab GTPases (Rab1, Rab6 and Rab11)
associated with compartments of the biosynthetic/secretory pathway.
The complexity of intracellular makes useful the development of model
systems. We will describe experimental systems based on giant unilamellar
vesicles that allows the binding of coat proteins and the formation of thin
membrane tubes with a diameter of several tens of nanometer. These assays
illustrate the role of membrane curvature, phase separation and membrane
tension in events that underlie transport events.
References
- Roux et al. 2002. Proc Natl Acad Sci USA 99: 5394
- Roux et al. 2005. EMBO J 24: 1537
- Saraste and Goud. 2007. Mol Biol Cell 18: 1430
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RESÚMENES DE
LAS COMUNICACIONES
ORALES
(Ordenadas por sesiones)
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
EXPRESIÓN DE ATM, p53, p21 y MDM-2 EN DIFERENTES LÍNEAS
DE MELANOMA HUMANO Y MELANOCITOS NORMALES
M.D. Boyano*, Y. Arroyo, I. Ortega-Martínez, N. Izaguirre, N. Andollo, F.
Nicolau-Galmés, A. García de Galdeano, M.L. Cañavate, A. Asumendi, G.
Pérez-Yarza, S. Alonso-Alegre. lola.boyano@ehu.es Tel: 94 6015689
Departamento de Biología Celular e Histología. Facultad de Medicina y
Odontología. Universidad del País Vasco/EHU. 48940 Leioa, Bizkaia.
Departamento de Genética, Antropología Física y Biología Animal. Facultad
de Ciencia y Tecnología. Universidad del País Vasco/EHU. 48940 Leioa,
Bizkaia.
Para entender los cambios moleculares implicados en la patogénesis del
melanoma humano, comparamos los perfiles de expresión génica en una
serie de melanocitos normales y de melanocitos tumorales. Los RNAs se
analizaron mediante microarrays de Affymetrix U133. Después de la
normalización de los datos, los resultados se analizaron mediante el software
Ontoexpress y SAM (Significance Análisis of Microarrays). Los
biomarcadores más significativos fueron la sobre-expresión del gen p53 y la
represión del gen ATM. Estos resultados se validaron mediante qRT-PCR.
Buscamos algún polimorfismo en la secuencia de la región codificante del
gen p53 y encontramos una mutación en el codón 72 responsable del cambio
de aminoácido Pro→Arg en la secuencia de cDNA. Sin embargo, el análisis
poblacional mediante ARMS-PCR mostró que era un polimorfismo común, lo
que sugiere que no está asociado al incremento de la expresión de p53. Para
estudiar la implicación de ATM y p53 en la patogenia del melanoma humano,
hemos analizado la fosforilación de ATM y p53 mediante microscopia
confocal y Western Blot. Hemos observado que durante la interfase, ATM
fosforilada en la Ser 1981 se encuentra localizada en el núcleo, pero se
incrementa espectacularmente su expresión durante la mitosis, tanto en
melanocitos normales como tumorales y colocaliza con proteínas del
citoesqueleto. Por otra parte, hemos detectado que la fosforilación de p53 en
la Ser 15 y en la Ser 46 en las líneas celulares de melanoma se relaciona con
una inhibición de la expresión de p21 y un incremento de la expresión de
MDM-2. Estos resultados sugieren que ATM y p53 podrían desempeñar un
papel importante en la patogénesis del melanoma.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
LA ACCIÓN PRO-DIFERENCIADORA Y ANTI-PROLIFERATIVA
DE LA VITAMINA D EN CÉLULAS DE CÁNCER DE COLON ESTÁ
MEDIADA POR Ca2+ Y LA VÍA RhoA-ROCK
P. Ordóñez-Morán*1, M.J. Larriba1, R.A. Valero2, C. Villalobos2, A.
Barbáchano1, S. Alvarez-Díaz1, D. Navarro1, M.T. Berciano3, M. Lafarga3 y A.
Muñoz1. 1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, Madrid;
2
Instituto de Biología y Genética Molecular, CSIC-UVA, Valladolid;
3
Universidad
de
Cantabria,
Santander.
Tfno.:
91-5854452.
*pordonez@iib.uam.es.
La 1α,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3), el metabolito más activo de
la vitamina D, promueve la diferenciación de células humanas de cáncer de
colon a través de la inducción de E-cadherina y el antagonismo de la ruta
Wnt/β-catenina. Nuestros resultados indican que la 1,25(OH)2D3 induce la
entrada de Ca2+ del medio extracelular al citosol, que a su vez es necesaria
para la activación transitoria de la GTPasa RhoA. La exoenzima C3, el
Y27632 (inhibidores de RhoA y su efector ROCK, respectivamente) o la expresión estable de un mutante dominante negativo de RhoA (N19-RhoA) reprimen la activación del promotor del gen CDH1/E-cadherina y la
acumulación de su RNA y proteína por la 1,25(OH)2D3, así como la formación del fenotipo adhesivo epitelial. La inhibición de RhoA impide la inducción
de genes diana de 1,25(OH)2D3 como p21CIP1, CYP24, vinculina, ZO-1 e integrina α3; y por el contrario, no altera la inducción de su receptor (VDR).
Además, la inhibición de RhoA bloquea la salida del núcleo de α-, β-, y p120cateninas promovida por 1,25(OH)2D3. La actividad RhoA es también necesaria para la inhibición de la actividad transcripcional de los complejos
β-catenina-TCF, así como de la proliferación celular. Nuestros resultados demuestran que la activación transitoria y dependiente del aumento de Ca2+ citosólico de RhoA media los efectos de la 1,25(OH)2D3 sobre la expresión
génica, la diferenciación epitelial y la vía Wnt/β-catenina.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
LA INHIBICIÓN DE LAS ERKS SENSIBILIZA A LA MUERTE
POR TGF-B EN CÉLULAS DE CARCINOMA HEPATOCELULAR
HUMANO
L. Caja1, P. Sancho1, E. Bertran1, D. Iglesias2, J. Gil2 e I. Fabregat1. Institut
d´Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) 1.Centre d´Oncologia
Molecular (COM), 08907 L´Hospitalet, Barcelona, Spain 2. Dpt. de Ciències
Fisiològiques II, Universitat de Barcelona. Tfno.: 93 260 77 75.
*lcaja@idibell.org.
El Factor de Crecimiento Transformante- beta (TGF-b) es una citoquina
inductora de apoptosis y de parada de ciclo en células epiteliales como los
hepatocitos. Muchas células de carcinoma hepatocelular humano (HCC) no
responden al TGF-b en términos de muerte. Nos centramos en estudiar líneas
de HCC resistentes a la muerte por TGF-b, usando como modelo la línea celular
HepG2. Nos planteamos si esta resistencia podía ser modulada
farmacológicamente mediante el uso de diferentes inhibidores de quinasas. La
inhibición de la vía de las ERKs con el inhibidor PD98059 (PD) potenció la
apoptosis inducida por el TGF-b medida por actividad caspasa-3 y número de
células hipodiploides. Todo ello correlaciona con un incremento de los niveles de
especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, al estudiar la expresión de genes
implicados en apoptosis, observamos un incremento de la expresión del gen
proapoptótico Bmf y un descenso de la expresión de los genes antiapoptóticos
Bcl-xl y Mcl-1, miembros de la familia Bcl-2. Para analizar la importancia del
incremento de ROS en la apoptosis inducida por TGF-b y PD se utilizaron GEE
(Glutation-Etil-Ester) y DPI (diphenyleneiodonium). Estos inhibieron parcial y
totalmente, respectivamente, la inducción de ROS, el incremento de actividad
caspasa-3 y el aumento de la expresión de Bmf. Además, cuando estos dos
antioxidantes se usaron conjuntamente fueron capaces de inhibir la caída de
Bcl-xl y Mcl-1. Como el DPI es un inhibidor general de flavoproteínas estudiamos
si la familia de NAPDH oxidasas estaba implicada en la inducción de apoptosis.
De todos los miembros de la familia NAPDH oxidasa observamos que sólo se
inducía la expresión de Nox4. El uso de siRNA contra Nox4 bloqueó en parte el
incremento de ROS e impidió totalmente la inducción de la actividad Caspasa3. En resumen, en la línea celular de HCC HepG2 la inhibición de la vía de las
ERKs sensibiliza a la apoptosis por TGF-b. Esta sensibilización depende de la
inducción de estrés oxidativo para inducir apoptosis, principalmente mediante
la inducción de la expresión de Nox4.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
EFECTO DE REVERASTROL SOBRE LA PARADA EN CICLO
INDUCIDA POR TGFβ. CONSECUENCIAS PARA LA CASCADA
DE SEÑALIZACIÓN DE TGFβ.
I. Legaz, EM. García, MC. López y FJ Nicolás. Unidad de Investigación,
Laboratorio de Oncología molecular y TGFβ. Hospital Universitario Virgen
de la Arrixaca, El Palmar, Murcia. Tel 968 369 036,
franciscoj.nicolas2@carm.es
TGFβ pertenece a una gran familia de citoquinas implicadas en procesos
de proliferación celular, morfogénesis, producción de matriz extracelular y
apoptosis. Células epiteliales estimuladas con esta citoquina experimentan
una potente parada en la fase G1 del ciclo celular. La pérdida de esta respuesta es una de las fases por las que atraviesan las células epiteliales en
su camino hacia la malignización tumoral.
En una búsqueda con fragmentos de Smad2, hemos detectado la proteína Sirt1. Ésta proteína es una desacetilasa de clase III NAD dependiente
cuyo homólogo de levaduras contribuye a la longevidad de las mismas. Sirt1
desacetila histonas y varios factores de transcripción incluyendo p53, FOXOs
y PPARγ. Recientemente, se ha descrito la acetilación de Smads (Smad2,
Smad3, Smad7…) como un evento esencial en su regulación. Sirt1 ha sido
implicada en la desacetilación de Smad7, lo que ocasiona su degradación via
ubiquitinación.
Reverastrol, un fitoestrógeno con estructura similar al estradiol, y con
propiedades antitumorales para ciertos tejidos, es un potente activador de la
actividad desacetilasa de Sirt1. El tratamiento de células HaCaT (epitelio humano) con TGFβ produce una potente parada en la fase G1. Sin embargo,
el tratamiento paralelo de estas mismas células con Reverastrol se opone a
la parada en ciclo inducida por TGFβ. Esto sugiere que la activación de Sirt1,
producida por Reverastrol, es capaz de desacoplar la parada en fase G1 de
la estimulación con TGFβ en células HaCaT. Sin embargo, a este respecto,
hemos observado que los efectos más inmediatos de la estimulación celular
de TGFβ, fosforilación de Smads 2 y 3 y su posterior translocación al núcleo,
no están alterados por la presencia de Reverastrol. Presentamos los posibles
mecanismos de actuación de Reverastrol sobre la respuesta celular a TGFβ.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
SEPARACIÓN MAGNÉTICA Y ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN
DE CÉLULAS MADRE TUMORALES
P. Castro-Garcia, A. Marín-Menéndez, J.L. Sánchez-Sánchez y C. Ramírez
Castillejo. Laboratorio de Células Madre. CRIB/Fac Medicina. UCLM.
Albacete. Tfno.: 967 599200 ext 2276. carmen.ramirez@uclm.es.
Las células madre son una población multipotente y quiescente que se ha
descrito en la mayoría de tejidos y sistemas. Desde hace algunos años, ha
proliferado mucho la hipótesis, de que una población similar, con características
multipotentes pueda ser el origen de los tumores y la causa subyacente a las
recidivas y nuevas apariciones de tumores tras los tratamientos.
Nosotros estamos interesados en el estudio de esta pequeña población
de células madre tumorales que ha sido descrita en distintas líneas tumorales
como la línea de glioma C6, la línea de adenocarcinoma HeLa, y la línea de
tumor de mama MCF7 1,2. El estudio de estas poblaciones de células madre
tumorales tanto de la expresión diferencial de ciertas proteínas de membrana
que nos puedan servir como marcadores de localización, así como de
proteínas intracelulares implicadas en su dinámica de división o su
multipotencialidad es el objetivo final de este trabajo. Se han descrito
inhibidores de la autorrenovación de la célula madre, como el fragmento cterminal de la proteína PEDF. En este trabajo se comprueba el efecto de este
inhibidor sobre la población de células madre tumorales caracterizadas
fenotípicamente por la expresión de los marcadores de superficie CD44,
CD166, CD34, CD133 y marcadores de cinética de división celular como el
DFFDA, utilizando citometría de flujo y separación magnética.
La búsqueda de factores expresados diferencialmente en esta población
de células madre tumorales puede abrir expectativas para el tratamiento y
desarrollo de futuras aplicaciones terapéuticas de enfermedades neoplásicas.
1. Setoguchi,T., Taga,T. & Kondo,T. Cancer stem cells persist in many cancer cell lines. Cell
Cycle 3, 414-415 (2004).
2. Kondo,T., Setoguchi,T. & Taga,T. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like
cells in the C6 glioma cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 781-786 (2004).
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
DISMINUCIÓN DE LA CAPACIDAD ANGIOGÉNICA DE LAS
CÉLULAS ENDOTELIALES MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA
POLI-ADP-RIBOSA-POLIMERASA-1
A. Peralta-Leal, D. Martín-Oliva, R. Quiles, JA. Muñoz-Gámez, R. AguilarQuesada, JM Ruiz de Almodovar, FJ. Oliver*. Depto. Biología Celular e
IBIMER-Universidad de Granada. IPBLN-CSIC. *joliver@ipb.csic.es. Tfno.:
(958) 181655
Numerosos estudios en modelos experimentales han puesto de
manifiesto que el bloqueo genético o la inhibición farmacológica de la PoliADP-Ribosa-Polimerasa-1 (PARP-1), proteína nuclear implicada en
fenómenos de señalización celular a través de modificaciones
postraduccionales mediante poli-ADP-ribosilación, confiere protección frente
a procesos citolíticos derivados que tienen lugar durante el desarrollo de la
respuesta inflamatoria1. Un denominador común en todos los procesos
inflamatorios es la secreción de diversos mediadores que van a
desencadenar la activación de PARP-1, la cual actúa como coactivador de
factores de transcripción como NF-κB y AP-1, dando lugar a la expresión de
genes proinflamatorios y proangiogénicos dependientes de éstos.
Trabajos publicados de nuestro laboratorio muestran cómo la eliminación
o inhibición de PARP-1 en ratones confiere resistencia al desarrollo de tumores
epidérmicos. En estos tumores la vascularización se encuentra muy disminuida,
así como los niveles de activación de los distintos factores de transcripción que
intervienen en los procesos proangiogénicos, incluido el Factor Inducible por
Hipoxia (HIF)2. En este sentido se han realizado experimentos para comprobar
la relación entre la inhibición de PARP-1 y la disminución de la capacidad
angiogénica de las células endoteliales mediante experimentos tanto in vitro
como in vivo de Matrigel, Transwell, RT-PCR y ELISA. Los resultados obtenidos
muestran cómo las células endoteliales tratadas con el inhibidor de PARP-1
(DPQ) muestran una disminuida capacidad de formación de nuevos vasos
sanguíneos en comparación con las células sin tratar.
Bibliografía
1
2
48
Szabo C et al., 2002.
Martín-Oliva D et al., 2006
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
PAPEL DE LOS RECEPTORES DE SOMATOSTATINA
TRUNCADOS sst5B Y sst5C EN TUMORES DE MAMA
Y EN LA LÍNEA CELULAR MCF7
M.D. Gahete1, M. Durán-Prado1, A.J. Martínez-Fuentes1, G. Moreno-Bueno2,
M. Hergueta2, M.M. Malagón1 y J.P. Castaño1*. 1Dept. de Biología Celular,
Fisiología e Inmunología. Univ. Córdoba. Córdoba. 2IIB, CSIC-UAM, Madrid.
Tfno.: 957218594. *justo@uco.es.
La somatostatina (SRIF) es un neuropéptido inhibidor de la secreción
neuroendocrina, que actúa además como regulador de la proliferación en un gran
número de tipos celulares, incluyendo células tumorales y líneas celulares. De
hecho, hoy día se emplean análogos sintéticos de SRIF para el tratamiento de
distintos tipos de tumores. Las acciones biológicas de este péptido están mediadas
por una familia de cinco receptores de 7 dominios transmembrana acoplados a
proteínas G, llamados sst1 a sst5, cuya expresión se regula por distintos factores.
Recientemente, hemos aislado y caracterizado dos nuevas isoformas truncadas
del receptor sst5 humano (hsst5B y hsst5C), que muestran un patrón de expresión
tisular propio, interaccionan con el resto de sst modulando su funcionalidad y
parecen mediar respuestas diferenciales a SRIF y sus análogos. Hemos detectado
el transcrito de ambas isoformas en muestras tumorales de cáncer de mama de
tipo ductal y en varias líneas celulares tumorales. Nuestros resultados indican que
la expresión de las isoformas truncadas es mayor en muestras tumorales de
estadios avanzados y están ausentes en mama normal. En la línea celular MCF7,
hemos observado que la expresión de ambos receptores truncados disminuye a
medida que aumenta el número de pases en cultivo, mientras se mantiene la de
otros sst. Resultados preliminares indican que estos cambios en los perfiles de
expresión de los sst truncados tienen consecuencias funcionales, ya que afectan
a la capacidad de SRIF para regular la concentración de calcio libre citosólico
([Ca2+]i). Así, mientras que en células con un bajo número de pases (3: que
expresan hsst5B y hsst5C) la SRIF no altera la [Ca2+]i, en células con un elevado
número de pases (20: no expresan hsst5B y hsst5C) la SRIF sí provoca una
disminución de la [Ca2+]i. Estos resultados indican que la presencia de los sst
truncados condiciona la respuesta a SRIF de este tipo celular, lo cual podría
repercutir en procesos proliferativos y/o tumorigénicos.
Financiación: CVI-139, CTS1705 (JA), BFU2004-03883 (MEC)
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
BÚSQUEDA DE NUEVAS PROTEÍNAS QUE INTERACCIONAN
CON SMAD 2 UTILIZANDO EL SISTEMA DOBLE HÍBRIDO
CYTO-TRAP
EM. García, MC. López y FJ Nicolás. Unidad de Investigación, Laboratorio
de Oncología molecular y TGFβ. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca,
El
Palmar,
Murcia.
968
369
036
evam.garcia5@carm.es,
franciscoj.nicolas2@carm.es
El factor de crecimiento transformante β (TGFβ) es miembro de una gran
familia de citoquinas implicado en procesos de proliferación celular,
morfogénesis, producción de matriz extracelular y apoptosis. Esta citoquina
juega un papel contradictorio en el cáncer. TGFβ induce una potente parada
en ciclo en células epiteliales a la par que ha sido implicada en la progresión
de metástasis de diversos tumores. Los principales mediadores de la
cascada de señalización inducida por TGFβ son las proteínas Smad, las
cuales son capaces de estimular o reprimir la expresión de una gran variedad
de genes. La respuesta génica a TGFβ es diferente dependiendo del tipo
celular, estado fisiológico de la célula estimulada y concentración del ligando,
lo que explica la diversidad de respuestas celulares que esta citoquina es
capaz de generar.
Nuestro laboratorio ha realizado una búsqueda e identificación de
nuevas proteínas que interaccionan con Smad2. Para esto hemos utilizado
el sistema doble híbrido Cyto-Trap, un sistema donde las interacciones
proteicas ocurren en la membrana citoplasmática en la luz del citosol. Hemos
utilizado diferentes fragmentos de la proteína Smad2 para buscar
interacciones proteicas con clones que provienen de una librería de
expresión obtenida de epitelio pulmonar de humano adulto.
Hemos obtenido 280 clones que interaccionaban con un fragmento de
Smad2 correspondiente a los dominios Linker-MH2. Todos los clones se
pudieron agrupar, atendiendo a su identidad de secuencia, en un total de
130 grupos. Se discute la naturaleza de dichos clones y sus implicaciones en
las respuestas celulares a TGFβ.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
LAS ACTINOTRIQUIAS TIENEN UN ORIGEN MIXTO,
ECTODÉRMICO Y MESENQUIMÁTICO, EN EL DESARROLLO
Y REGENERACIÓN DE LA ALETA DE DANIO RERIO
I. Durán*, J.A. Santamaría, M. Marí-Beffa, J. Becerra y L. Santos-Ruiz.
Laboratorio de Bioingeniería y Regeneración Tisular (LABRET), Laboratorio
de Biología del Desarrollo: Dpto. Biología Celular, Genética y Fisiología.
Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. Málaga. Tfno.: 952 131954.
*E-mail: ijduran@uma.es
Durante los últimos años, la biología regenerativa se ha convertido en un
campo de investigación en auge. Dentro de este ámbito, la regeneración
epimórfica es uno de los fenómenos de mayor interés y en el que se está
investigando intensamente. Los peces teleósteos son uno de los taxones con
capacidad de regeneración epimórfica, esta es, la restauración morfológica y
funcional de una estructura anatómica perdida en un organismo adulto. Nuestro
modelo de estudio de regeneración epimórfica es la aleta de pez cebra. El
esqueleto dérmico de la aleta de D. rerio esta compuesto de rayas óseas,
también denominadas lepidotriquias, segmentadas y bifurcadas, cada una
compuesta por dos hemirrayas simétricas; y por actinotriquias que son haces
de macrofibrillas hiperpolimerizadas de elastoidina, una molécula parecida al
colágeno, que se encuentran en la zona distal de la aleta, surgiendo del extremo
final de las lepidotriquias. A las actinotriquias se les supone un papel
morfogenético durante la formación de la aleta, y aunque hay estudios iniciales
que les asignan un origen ectodérmico, no existen resultados concluyentes que
aclaren una participación ectodérmica y/o mesenquimática durante el desarrollo
y la regeneración de la aleta. Para dilucidar este problema hemos producido
un anticuerpo que detecta actinotriquias y sus células asociadas, con el que
hemos realizado inmunohistoquímica tanto durante la formación del pliegue de
la aleta en el desarrollo, como en aletas adultas en regeneración. Nuestros
resultados sugieren una implicación tanto de la epidermis como de tejido
mesenquimático aunque con una participación diferencial en la formación de las
actinotriquias y más aun, con diferencias significativas en dicha participación en
los procesos de formación durante el desarrollo y la regeneración.
Financiado por la Consejería de Salud, gestión IMABIS (TC 201.1.2/04 y TCRM
0012/2006), FIS (PI06/1855), Red TerCel, MEC (BIO 2006-03599) y PAI (CVI-217).
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
EPIPROFINA/SP6, UN FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN
FUNDAMENTAL PARA EL DESARROLLO DE TEJIDOS
ECTODÉRMICOS
L. Jiménez1, T. Nakamura2, S. de Vega2, S. Fukumoto3, Y. Yamada2, F. Unda1.
1
Departmento de Biología Celular e Histología, Universidad del País Vasco,
Vizcaya. 2Craniofacial Developmental Biology and Regeneration Branch,
NIDCR, NIH, Bethesda, MD, USA. 3Department of Pediatric Dentistry, Kyushu
University, Fukuoka, Japan. E-mail: fernando.unda@ehu.es
Epiprofina/Sp6 es un factor de transcripción perteneciente a la familia de
los Sp/KLF, que se expresa durante el desarrollo embrionario en diversos
órganos de origen ectodérmico como el epitelio de la matriz de los folículos
pilosos, el epitelio distal de la uretra, el epitelio de la cresta ectodérmica
apical de las extremidades y el diente en desarrollo.
Recientemente, hemos estudiado la importancia de Epiprofina/Sp6
durante el desarrollo embrionario mediante la creación de un ratón mutante
para este gen. Los ratones mutantes homocigóticos (-/-) presentaron
malformaciones en los órganos de origen ectodérmico comentados
anteriormente. Su fenotipo se caracteriza por la perdida de pelo (alopecia),
alteraciones en el desarrollo de los genitales externos y las extremidades, la
formación de dientes supernumerarios, con hipoplasia del esmalte y
alteraciones en la dentina. Nuestro estudio se ha centrado principalmente
en el diente debido a que es un modelo muy significativo para el estudio de
los mecanismos genéticos y moleculares de la organogénesis.
Nuestros resultados demuestran que el factor de transcripción Epiprofina/Sp6
juega un papel clave en la morfogénesis dental y en la diferenciación del epitelio
y mesénquima dentales. Mediante hibridación in situ sobre tejidos enteros y
secciones, hemos observado que Epiprofina/Sp6 regula la expresión de Dkk1,
inhibidor de la vía de señalización Wnt/β-catenin, modulando además la
expresión de otros genes relacionados con dicha vía como es el caso de Lef1.
Agradecimientos: Este trabajo ha sido financiado por la UPV/EHU (GIU05/27) y el NIH (NIDCR).
Susana de Vega y Lucía Jiménez han sido becarias del Gobierno Vasco y de la UPV/EHU,
respectivamente.
Bibliografía
Nakamura y cols., J Biol Chem, 279: 626-634, 2004.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
CAMBIOS EN EL TEJIDO CONJUNTIVO DE LA DERMIS DE RATA
DEBIDOS A LA ACCIÓN DE RADIOFRECUENCIA A BAJA POTENCIA
E. Beltrán-Frutos1, A. Zuasti1; C. Ferrer1, S. Navarro2, CM. Bernal-Mañas1,
M. Canteras3, LM Pastor1. Departamento de Biología Celular1. Instituto de
Envejecimiento. Facultad de Medicina. Departamento de Estadística3.
Universidad de Murcia. España. Grupo Tahe2. Tfno: (968)
363949.bioetica@um.es.
Hay estudios celulares realizados sobre el efecto de la radiofrecuencia
(RF) en el tejido conjuntivo (TC), pero no tras sucesivas aplicaciones de RF
a baja potencia. El objetivo de este trabajo es estudiar los cambios en el TC
con RF a baja potencia analizando: a) proliferación de los fibroblastos, b) su
actividad biosintética, c) la producción de nuevo TC.
Se utilizaron 16 ratas de 3 meses de edad, 8 fueron tratadas y 8 control. Se
realizaron 4 grupos (1, 2, 3 y 5), cada uno de ellos con diferentes sesiones de
RF (1, 2, 3 y 5). Las ratas fueron sacrificadas una semana después del último
tratamiento, excepto el grupo 5 que fue 2 meses después. En todos los grupos
se determinó: a) el número de fibroblastos/área, b) el índice de proliferación
celular, c) índice de células positivas para Heat Shock Protein 47 y d)
porcentaje de TC por sección. Para el análisis estadístico de los parámetros
a, b y d se realizaron 2 grupos (A y B). El grupo A englobó a los grupos 1, 2 y
3 y el grupo B que incluyó al grupo 5. Para HSP-47 los grupos que recibieron
1 y 5 tratamientos formaron el grupo C y los de 2 y 3 tratamientos el grupo D.
Se observaron los siguientes resultados: a) incremento en el índice de
proliferación y número de fibroblastos/área en el grupo A con respecto al grupo B ,
b) aumento del porcentaje de TC en el grupo B y c) incremento en el índice celular
para la expresión de la proteína HSP-47 en el grupo D con respecto al grupo C.
En conclusión, la RF a baja potencia produce un efecto inmediato en la
proliferación celular y en el número de fibroblastos/área; un efecto a medio
plazo en la expresión de HSP-47; y a largo plazo un incremento del TC, sin
producir ningún cambio histopatológico en el mismo.
Financiado por el Proyecto SUE-0C 06/01-0004 de la Consejería de Educación y
Cultura de la Comunidad Autónoma de la Región de Murcia.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
ESTUDIO DE LA VASCULARIZACIÓN DE UN MODELO
DEL TUMOR TESTICULAR DE LAS CÉLULAS GERMINALES
U. Silván, A. Diez-Torre, I. Azcoitia, M.A. Konerding1, y J. Aréchaga*.
Laboratorio de Embriología Experimental y Molecular, Departamento de
Biología Celular e Histología. Universidad del País Vasco, Leioa.
*juan.arechaga@ehu.es. 1Departamento de Anatomía, Universidad
Johannes-Gutenberg, Mainz, Alemania.
La neovascularización es un proceso imprescindible para el crecimiento
de los tumores una vez que estos superan ciertas dimensiones. El inicio de
este fenómeno requiere la activación de señales angiogénicas específicas.
El objetivo de este trabajo ha sido estudiar la vascularización en
teratocarcinomas testiculares inducidos experimentalmente por el trasplante
de células madre embrionarias (células ES) de ratón en el interior de los
túbulos seminíferos (las células ES presentan un gran parecido morfológico
y bioquímico con las células del Carcinoma embrionario).
En nuestro modelo hemos empleado la línea de células ES marcadas
fluorescentemente AB1GFP. El estudio mediante corrosion casting reveló que
el incremento de la vascularización de los tumores, en comparación con la
del órgano control se debía, sobretodo, a que los capilares tienen mayor
diámetro, más que a factores como la distancia entre los vasos o el número
de ramificaciones de los mismos. El aspecto de la trama vascular revelaba
un fenotipo neoplasico, con vasos irregulares, comprimidos y con
terminaciones ciegas. Parte de los vasos sanguíneos formados de novo
estaban compuestos por células que expresaban GFP, indicando el origen de
las mismas a partir de las células neoplásicas.
Bibliografía
Diez-Torre A, Silván U, De Wever O, Bruyneel E, Mareel M y Aréchaga
J. (2004) Germinal tumor invasion and the role of testicular stroma.
International Journal of Developmental Biology, 48: 545-557 Konerding MA,
Fait E y Gaumann A. (2001) 3D microvascular architecture of pre-cancerous
lesions and invasive carcinomas of the colon. British Journal of Cancer,
84(10): 1354-1362
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Comunicación oral
PROLIFERACIÓN CELULAR EN LA GLÁNDULA DIGESTIVA
DEL MEJILLÓN: VARIABILIDAD NATURAL E IMPLICACIONES
EN LA EVALUACIÓN DE LA SALUD DEL MEDIO AMBIENTE
B. Zaldibar*, M. Soto, I. Cancio y I. Marigómez. Departamento de Zoología
y Biología Celular Animal. Universidad el País Vasco/Euskal Herriko
Unibertsitatea. Leioa. Tfno: (94) 6015416. *zobzaarb@lg.ehu.es
El epitelio de la glándula digestiva de los mejillones (Mytilus sp) está
compuesto por dos tipos celulares denominados células digestivas y
basofílicas. La acumulación de contaminantes presentes en el medio marino
provoca alteraciones en la glándula digestiva de los moluscos y uno de los
efectos más apreciables es el cambio en las proporciones relativas de los 2
tipos celulares. Así, las células digestivas normalmente más numerosas se
ven superadas por las células basofílicas.
Anteriores trabajos han demostrado que este reemplazo se debe a una
alteración en el balance proliferación/desaparición de células digestivas. Con el
fin de conocer y establecer la dinámica de proliferación celular habitual en el epitelio
digestivo; en el presente trabajo mejillones (M. galloprovincialis) de diferentes
edades, regímenes mareales y en diferentes períodos del año fueron tratados con
bromodeoxiuridina (BrdU). Posteriormente, se analizó inmunohistoquímicamente
la incorporación de BrdU cada 2 horas a lo largo de 48 horas, y se cuantificó el
número de células con marcaje con el fin de establecer los niveles de proliferación
celular en el epitelio digestivo en cada caso experimental.
Los resultados indicaron que la mayor tasa de proliferación celular se produce
en las células digestivas, de modo que las diferencias observadas entre los
diferentes grupos experimentales corresponden a dichas células. Los valores
más altos se obtuvieron durante el verano, mientras que en otoño y,
principalmente al final del invierno, los niveles son significativamente inferiores. La
dinámica de proliferación celular es similar entre mejillones adultos y juveniles, sin
embargo varía de manera notable entre mejillones intermareales y submareales.
Estos resultados pueden ser de utilidad para poder interpretar algunos resultados
controvertidos al emplear biomarcadores específicos de células digestivas en
mejillones centinela en la evaluación de la salud del medio marino.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
PAPEL DE WIP EN NEURITOGÉNESIS Y SEGMENTACIÓN
CEREBELAR
A. Franco*, I. Bañón-Rodríguez, J.J. Garrido, F. Wandosell, I.M. Antón.
Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”. Universidad Autónoma de
Madrid-CSIC. Tfno.: 91 4978475.
*afranco@cbm.uam.es.
El momento y la dirección de emisión de procesos neuronales son
parámetros claves para la consecución de una correcta conectividad
neuronal. Esta conectividad también depende de un adecuado
posicionamiento celular, resultante de la migración de neuroblastos
postmitóticos durante el desarrollo. Eventos morfogenéticos como la
diferenciación y la migración neuronales dependen en gran medida de la
reorganización del citoesqueleto de actina. Por estos motivos es fundamental
intentar comprender los mecanismos moleculares que regulan la dinámica de
este filamento. WIP (WASP interacting protein) es un regulador de la
polimerización localizada de actina en todos los tipos celulares estudiados
hasta ahora: linfocitos, fibroblastos, mastocitos, células dendríticas y células
endoteliales. WIP también participa en la estabilización y en la formación de
haces de F-actina in vitro. WIP se expresa a nivel de ARNm en cerebro pero
hasta la fecha no ha sido descrita ninguna función directa de WIP en sistema
nervioso. Nuestro objetivo es averiguar que funciones está realizando WIP
en cerebro, tanto en el desarrollo y morfogénesis cerebrales como en el
desarrollo neuronal in vitro. Para ello contamos con una colonia de ratones
deficientes en WIP. Por un lado, comparamos, a nivel anatómico e
histológico, cerebros de ratones WIP (+/+) y WIP (-/-). Hemos visto que WIP
interviene en el establecimiento de la simetría cerebral, de manera más obvia
en cerebelo. Por otro lado realizamos un seguimiento del desarrollo de
neuronas WIP (+/+) y WIP (-/-) empleando cultivos primarios de neuronas
disociadas de hipocampo de ratón E18. En este trabajo mostramos que WIP
participa en la regulación espacio-temporal de la neuritogénesis, ya que su
ausencia acelera la emisión de neuritas e incrementa su nivel de
ramificación. En este momento estamos estudiando que mecanismos de
transducción de señales podrían estar mediando el fenotipo observado a
nivel celular.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
DISTRIBUCIÓN DE LAS CÉLULAS MICROGLIALES DURANTE
EL DESARROLLO EMBRIONARIO Y POSTNATAL DE LA RETINA
DE RATÓN
AM. Santos, R. Calvente, M. Tassi, MC. Carrasco, D. Martín-Oliva, JL. MarínTeva, J. Navascués, MA. Cuadros*. Departamento de Biología Celular.
Universidad de Granada. Tfno.: (958) 246332. *macuadro@ugr.es.
Puesto que los precursores iniciales de las células microgliales, al ser de
origen mesodérmico, se originan fuera del tejido nervioso, estas células han de
invadir y colonizar las diferentes regiones del sistema nervioso durante el
desarrollo, hasta alcanzar el patrón de distribución de la microglía en el adulto1.
Para intentar establecer el patrón de colonización de la retina murina por parte
de las células microgliales, se han analizado, mediante técnicas
inmunocitoquímicas, y utilizando diferentes marcadores (los anticuerpos Iba1,
F4/80, anti-CD45 y anti-CD68 y la lectina de tomate), retinas de ratón a
diferentes edades de desarrollo, tanto embrionario como postnatal.
Siguiendo esta metodología se ha observado que durante el desarrollo
embrionario las células de tipo macrófago/microglial aparecen ya en la retina
a los 11.5 días de desarrollo embrionario (E11.5), aparentemente asociadas
a procesos de muerte celular. A partir de E12.5, comienzan a detectarse
células microgliales en diferentes zonas de la retina y que no guardan una
relación aparente con procesos de muerte de neuronas que se producen en
la retina en desarrollo. Entre E15.5 y el nacimiento, las células microgliales
ocupan la capa de células ganglionares (GCL) y en neuroepitelio en
desarrollo. Su distribución sugiere la entrada de nuevas células microgliales
en la retina a través del vítreo y el cuerpo ciliar.
El patrón definitivo de distribución de la microglía en la retina murina se
establece durante el desarrollo postnatal. En P0, las células microgliales se
observan en la GCL y capa plexiforme interna (IPL). A partir de P3, las células
microgliales ocupan cada vez regiones más esclerares de la retina, hasta
ocupar toda la retina, con excepción de la capa nuclear externa (ONL). Hacia
P14, la distribución microglial es ya semejante a la que aparece en la retina
adulta. Estas observaciones sugieren que las células microgliales migran,
durante el desarrollo de la retina, desde las capas más vítreas a las más
esclerales.
Bibliografía :1 Cuadros MA y Navascués J, 1998.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
LA ACTIVACIÓN DE LA CASPASA-11 EN RESPUESTA A
ISQUEMIA O A ESTRÉS DEL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
PRODUCE MUERTE CELULAR EN CULTIVOS PRIMARIOS DE
ASTROCITOS DE RATA
N. Fradejas*, D. Pastor, M. Burgos, S. Mora Lee, S. Calvo. Facultad de
Medicina y CRIB. Universidad de Castilla-La Mancha. Albacete. Tfno.: (967)
599200. *noelia.fradejas@uclm.es.
Recientemente hemos demostrado que los astrocitos sometidos a
isquemia sufren apoptosis debido a la inducción de estrés del retículo
endoplasmático (RE) que cursa con la activación de CHOP (CEBP/
Homologous protein). Los efectores de CHOP se desconocen por lo que el
objetivo de este trabajo fue analizar las vías proapotóticas activadas por
CHOP en la isquemia astrocitaria. El análisis de la expresión de diferentes
caspasas en un modelo de isquemia astrocitaria demostró que la caspasa 11
aumentaba específica y significativamente. Además, dicha caspasa 11
también fue activada por los fármacos thapsigargina o tunicamicina,
conocidos inductores de estrés del RE y por la sobreexpresión de CHOP,
demostrando, por primera vez, una relación directa CHOP-caspasa 11.
Los efectos de la activación de la caspasa 11 en la viabilidad astrocitaria
se analizaron mediante RNA de interferencia. La inhibición de la caspasa 11
disminuyó significativamente el daño isquémico astrocitario. Por último, la
inhibicición de las caspasas 1 y 3, mediadores de la caspasa 11, con
inhibidores específicos, mostró que únicamente la inhibición de la caspasa
1 tenía efecto protector.
En resumen, los datos presentados indican que la caspasa 11 es un
mediador de la actividad proapotótica de CHOP en el contexto de la
respuesta de estrés del RE y de la isquemia cerebral.
Financiado por MCYT(BFU 2006-14256) y JCCM (PAI 05-017) N.
Fradejas es becaria de la JCCM.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
VARIACIONES DE LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DE LAS
NEURONAS DEL GANGLIO DEL TRIGÉMINO EN RESPUESTA A
LA LESIÓN DEL DNA INDUCIDA POR RADIACIONES IONIZANTES
I. Casafont*, O. Tapia, E. Pena, M. Lafarga, MT. Berciano Departamento de
Biología Celular. Universidad de Cantabria. Santander. Tfno.: (942) 201930.
*casafonti@unican.es.
La respuesta celular al estrés genotóxico inducido por radiaciones
ionizantes (IR) incluye la formación de numerosos microfocos nucleares de
lesión/reparación del DNA. La lesión del DNA induce la fosforilación de la
histona H2AX en la serina 139, que sirve como plataforma para el
reclutamiento, en los microfocos de lesión, de proteínas implicadas en el
proceso de reparación del DNA. En este estudio analizamos los efectos de la
IR sobre la actividad transcripcional en neuronas del ganglio del trigémino
(GT) de ratas irradiadas con 4Gy. El ensayo de transcripción mediante la
incorporación de 5´-FU (inyectada intraperitonealmente) nos permitió analizar
la dinámica de los RNAs nacientes y medir con densitometría la actividad
transcripcional. Nuestros resultados muestran una rápida caída del 80% de la
transcripción nucleolar y extranucleolar a los 30´ post-IR, coincidiendo con el
número máximo de focos de γH2AX. El proceso fue reversible, recuperándose
gradualmente la actividad transcripcional para alcanzar valores similares al del
control a las 24h post-IR, coincidiendo con la reparación total del DNA.
El efecto de la IR sobre el procesamiento nuclear de los RNAs fue evaluado
analizando la dinámica de los cuerpos de Cajal (CBs). El CB es dependiente de
transcripción y concentra snRNPs y snoRNPs requeridas para el procesamiento
de los pre-mRNAs y pre-rRNAs, respectivamente. La inhibición transcripcional
a los 30 min post-IR conlleva una reducción del número de CBs por neurona
(1,78 vs 2,6, en el control). El número de CBs fue recuperándose
progresivamente alcanzando a las 24h un valor superior al control (2,98). En
respuesta a la IR, los CBs concentran, además de coilina, snRNPs y SMN, el
proteasoma activador PA28Aγ Este estudio demuestra que las neuronas del GT
son muy vulnerables a la acción de la IR y enfatiza la potencial importancia de
las lesiones del DNA en las neuropatías inducidas por agentes genotóxicos.
Financiado por CIBERNED (Instituto de Salud Carlos III).
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
ESTUDIO DE LOS DEPÓSITOS DE VESÍCULAS SINÁPTICAS
EN MICROCULTIVOS DE NEURONAS COLINÉRGICAS
AP. Pérez-González y A. Llobet*. Laboratorio de Neurobiología Celular y
Molecular. 08907 L’Hospitalet de Llobregat. Tfno.: (93) 4024279.
*allobet@ub.edu.
Hemos modificado el método de Furshpan et al. (1) para cultivar
neuronas del ganglio cervical superior en microislas. Las condiciones
experimentales han permitido obtener microcultivos de una sola neurona, la
cuál establece sinapsis consigo misma (autápticas) en ausencia total de glía.
Los contactos sinápticos alcanzan la madurez tras dos semanas en cultivo.
La naturaleza de la neurotransmisión es colinérgica, ya que la aplicación de
hexametonio en registros de current-clamp o voltage-clamp completamente
bloqueó la actividad autáptica y de manera reversible. Además, el corte de
la proteína vesicular sinaptobrevina tras la diálisis de la cadena ligera de la
toxina tetánica eliminó la neurotransmisión.
Actualmente estamos
combinando métodos electrofisiológicos, ópticos y de microscopía
electrónica para estudiar los depósitos de vesículas sinápticas en los
terminales de esta preparación. Los datos preliminares indican que el rango
de probabilidad de liberación de vesículas es variable y depende de la
magnitud de la señal de calcio presináptica. Además el depósito de
liberación rápida de vesículas tiene una dimensión fija que determina los
mecanismos de plasticidad a corto término.
Bibliografía
1.
Furshpan, E. J., Landis, S. C., Matsumoto, S. G., & Potter, D. D.
(1986) J Neurosci 6, 1061-1079.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
CÉLULAS CRIPTA EN EMBRIONES DE ESTURIÓN
Acipenser naccarii
S. Camacho Romero*, MV. Ostos Garrido, MT. Segura Moreno, A.
Domezain Fau, R. Carmona Martos. Departamento de Biología Celular.
Universidad de Granada. Tfno.: (958) 240760.
*susanac@ugr.es.
Los peces carecen de órgano vomeronasal al igual que ocurre en aves,
algunos monos del viejo mundo (cercopitécidos) y humanos. Todas las
neuronas receptoras olfatorias (NROs) forman parte de un único epitelio
sensorial: el epitelio olfatorio (EO). Las NROs son neuronas bipolares que en
su extremo apical presentan una prolongación bulbosa con cilios y
microvellosidades (NROs ciliadas) o exclusivamente con microvellosidades
(NROs con microvellosidades). En 1996, Morita y Finger describen en
teleósteos un tercer tipo de NROs cuya particularidad es una invaginación
apical, a modo de cripta, con varios cilios en su interior (células cripta). En la
actualidad se considera que la presencia de células cripta en el EO es una
característica común a todos los actinopterigios (Hansen and Finger, 2000).
En acipenséridos las células cripta sólo habían sido observadas en
ejemplares juveniles, sin que hasta el momento se hubiera despejado la duda
de si se diferencian junto con el resto de NROs durante el periodo lecitotrófico
o si por el contrario lo hacen en fases posteriores del desarrollo.
En el presente trabajo hemos seguido el desarrollo del EO en A. naccarii,
desde la eclosión hasta los días posteriores al establecimiento de la
alimentación exógena, mediante microscopía óptica y electrónica (MET y MEB).
Nuestras observaciones permiten afirmar que las células cripta están
presentes en el EO en los primeros días después de la eclosión, junto al
resto de NROs. Las células cripta aparecen con su núcleo muy próximo a la
lámina basal del epitelio y envueltas por las células de soporte al igual que
sucede con las demás NROs (con microvellosidades y ciliadas).
Bibliografía
Morita and Finger, 1996;
Hansen and Finger, 2000
Financiado por CGL 2006-12193
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PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR IN SITU DE LA ω3
DESATURASA FAD7 DE SOJA: EVIDENCIA DE LOCALIZACIÓN
EN LA MEMBRANA TILACOIDAL
V. Andreu1,2, R. Collados1, R. Picorel1, M. Alfonso1, P.S. Testillano2 y
M.C. Risueño2.
1
Departamento de Nutrición Vegetal, Estación Experimental de Aula Dei
(CSIC). Zaragoza.
2
Desarrollo de Plantas y Arquitectura Nuclear, Centro de
Investigaciones Biológicas (CSIC). Madrid
Las ω3 desaturasas son los enzimas responsables de la síntesis de los
ácidos grasos poliinsaturados en plantas. Estos enzimas regulan, por tanto,
la fluidez y permeabilidad de las membranas biológicas. Además, los ácidos
grasos trienóicos actúan como precursores del ácido jasmónico, hormona
que juega un papel muy importante en las rutas de transducción de señales
relacionadas con el desarrollo de la planta, y la respuesta a patógenos o a
la herida. El estudio de estas enzimas se ha realizado utilizando técnicas
moleculares, bioquímicas y genéticas pero se sabe muy poco acerca de su
patrón de distribución en la célula. En este trabajo, se ha estudiado la
localización subcelular de la ω3 desaturasa, FAD7, en suspensiones
celulares fotoautótrofas de soja mediante técnicas de inmunofluorescencia e
inmunomarcado con oro utilizando un anticuerpo monoespecífico contra
GmFAD7 y posterior análisis en microscopía confocal y electrónica. Los
resultados de inmunofluorescencia revelaron la localización de la proteína
GmFAD7 en el cloroplasto; la señal de GmFAD7 y la de la autofluorescencia
de la clorofila mostraron una colocalización específica. El inmunomarcado
con partículas de oro se realizó en muestras criofijadas y criosustituidas para
una correcta preservación de la reactividad antigénica y de la ultraestructura
e integridad de las membranas. Nuestros datos revelaron que la proteína
GmFAD7 se encuentra localizada preferencialmente en las membranas
tilacoidales del cloroplasto. El fraccionamiento bioquímico de cloroplastos
purificados y el análisis de las distintas subfracciones cloroplásticas mediante
western-blot identificadas con anticuerpos específicos de envuelta, estroma
y tilacoide, confirmaron estos resultados. Estos hechos sugieren que no sólo
la envuelta sino también las membranas tilacoidales pueden ser lugar de
desaturación de lípidos en plantas superiores.
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PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
APLICACIÓN DE NANOPARTÍCULAS IN PLANTA COMO
HERRAMIENTA PARA DIRIGIR SUSTANCIAS CON FINES
FITOSANITARIOS: VISUALIZACIÓN IN SITU EN TEJIDOS
VEGETALES
E. Corredor1, P. González-Melendi1,6, M.J. Coronado1, R. FernándezPacheco2, C. Marquina3, M.R. Ibarra2,3, D. Rubiales4, A. Pérez-de-Luque5,
P.S. Testillano1, M.C. Risueño1
1
CIB, CSIC, Madrid. 2Inst. Nanociencia de Aragón, Univ. Zaragoza. 3 ICM
Aragón-Dep.Física Materia Conden.,CSIC-Univ. Zaragoza. 4 IAS, CSIC,
Córdoba. 5IFAPA-CICE, Área de Mejora y Biotecnología, Córdoba 6 CBGP.
UPM-INIA, Madrid. E-mail: risueno@cib.csic.es
Dentro de las aplicaciones de la nanotecnología, se encuentra la distribución
dirigida de tratamientos in situ, que ha sido explotada inicialmente para usos
médicos. En agricultura esta metodología presenta también múltiples
aplicaciones, como en la lucha contra infecciones mediante nanosistemas
acoplados con pesticidas u otras sustancias. Estos podrían ser dirigidos
eficazmente a la zona afectada reduciendo por tanto la dosis de producto
liberada al ambiente. En este trabajo se ha realizado una primera aproximación
a la utilización de nanopartículas para la distribución restringida de productos en
zonas concretas de una planta, con especial énfasis a su localización a nivel
tisular y celular. Se han inoculado plantas de calabaza con una suspensión de
nanopartículas magnéticas, con un recubrimiento de carbono. Se recolectaron
muestras de distintos puntos de la planta, que fueron posteriormente fijadas,
cortadas y observadas mediante distintas metodologías para visualizar la
presencia de nanopartículas con distintas microscopias: óptica, de fluorescencia,
confocal y electrónica, con distintos procedimientos de fijación e inclusión. Los
resultados muestran que las nanopartículas pueden ser visualizadas por
reflexión en microscopía confocal; detectadas como áreas oscuras en un fondo
autofluorescente, y como un patrón punteado en campo claro, que se ha
identificado posteriormente como agregados de nanopartículas en microscopía
electrónica. Nuestros primeros datos muestran la presencia de nanopartículas
tanto en el espacio extracelular como dentro de algunas células.
Financiado por CSIC, proyecto PIF NanoAgro200540F0041.
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PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
ALTERACIONES MITOCONDRIALES, MITOFAGIA Y POSIBLE
MITOPTOSIS EN UN MODELO TRANSGÉNICO CONDICIONAL
DE ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
P. Gómez-Ramos*, M.A. Morán y J.J. Lucas. Departamento de Anatomía,
Histología y Neurociencia, Universidad Autónoma de Madrid (UAM) y Centro
de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM). Tfno.: 914975360.
*pilar.gomez@uam.es.
En la enfermedad de Huntington, con herencia autosómica dominante
por expansión de poliglutaminas en el exón 1 del gen que codifica para
huntingtina, las neuronas más vulnerables son las espinosas de tamaño
medio del estriado, habiéndose implicado alteraciones mitocondriales en esta
muerte neuronal específica. Hemos estudiado el posible papel de estas
alteraciones mitocondriales en el ratón HD94, transgénico condicional con
94 poliglutaminas, que reproduce gran parte de las alteraciones de estos
enfermos, como inclusiones neuronales de huntingtina, alteraciones motoras
y atrofia del estriado por atrofia y posterior muerte neuronal (Martín-Aparicio
y col 2001, Díaz-Hernández y col 2003 y 2004).
En el estudio ultraestructural de neuronas estriatales de ratones HD94
hemos observado, además de mitocondrias con morfología anómala,
imágenes de autofagia mitocondrial selectiva o mitofagia muy abundantes a
edades avanzadas, y numerosos restos de cisternas apiladas en elementos
de lipofucsina o cuerpos residuales. Con técnicas de inmunocitoquímica y
correlación MO-ME, utilizando anticuerpos que reconocen huntingtina mutada,
hemos observado en neuronas con intenso marcaje nuclear la presencia de
pequeños acúmulos citoplásmicos de huntingtina asociados a la membrana
mitocondrial externa. Además, las grandes inclusiones citoplásmicas de
huntingtina aparecen muy frecuentemente rodeadas de mitocondrias.
Estas alteraciones mitocondriales, y la mitofagia, podrían conducir a una
muerte neuronal por autofagia, o mitoptosis, justificando la atrofia y la
perdida neuronal que en ausencia de características apoptóticas
demostrables por tunel o tinciones de caspasas habíamos descrito en el
estriado de estos ratones.
- Díaz-Hernández M, y col., J. Neurosci. 24: 9361-9371 (2004)
- Díaz-Hernández M, y col., J. Neurosci. 23: 11653-11661(2003).
- Martin-Aparicio y col., J.Neurosci. 21:8772-8781 (2001)
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PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Comunicación oral
INFLUENCIA DE LA HIPOXIA EN EL ENDOTELIO LINFÁTICO:
ESTUDIO TRANSCRIPCIONAL Y FUNCIONAL
M. Irigoyen1, E. Ansó2, E. Martínez1, JJ. Martínez-Irujo2 y A. Rouzaut1*. Centro
de Investigación Médica Aplicada1 y Departamento de Bioquímica2.
Universidad de Navarra. Pamplona. Tfno.: (948) 194700. *arouzaut@unav.es.
La mayor causa de la mortalidad por cáncer es la propagación de las
células tumorales por distintas vías, como la vasculatura sanguínea y la
linfática. La influencia de la falta de oxígeno en la inducción de la formación
de nuevos vasos sanguíneos está ya establecida, sin embargo no se ha
estudiado todavía el papel de la hipoxia en la linfangiogénesis.
Con objeto de profundizar en el estudio de la hipoxia sobre el endotelio
linfático hemos utilizado la técnica de microarray de DNA en el que se comparó
la expresión génica diferencial de células primarias de endotelio linfático (LEC)
mantenidas en condiciones de normoxia o hipoxia (1% O2) durante 24 horas.
Para llevar a cabo el estudio diferencial seleccionamos los genes cuya
expresión génica varía al menos dos veces. Los genes seleccionados fueron
clasificados según su función en distintas categorías y validados por PCR a
tiempo real. Completamos nuestro estudio mediante diversos ensayos
funcionales: proliferación, viabilidad, reorganización del citoesqueleto, producción
de radicales tóxicos del oxígeno y adhesión a matriz y de células tumorales.
Entre estos genes cuya expresión se ve aumentada en situación de
hipoxia cabe destacar la pareja CXCR4-CXCL12. Estudios anteriores han
demostrado que CXCL12 y su receptor CXCR4, juegan un papel importante
en la regulación del tráfico celular. Dado que CXCR4 es expresado en
numerosas células tumorales quisimos comprobar si podía estar mediando
la adhesión de las células tumorales al endotelio.
En este trabajo demostramos, por primera vez, que el eje CXCR4CXCL12 actúa mediando la adhesión y migración a través del endotelio
linfático de células de carcinoma de pulmón y que la hipoxia actúa
promoviendo dicha adhesión e invasión. Pensamos que estos resultados
pueden ayudar a establecer dianas terapéuticas para frenar la diseminación
tumoral a través del endotelio linfático.
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INMUNOBIOLOGÍA
Comunicación oral
EL COLÁGENO ES UN POTENTE ACTIVADOR
DE LOS FAGOCITOS DE PECES
P. Castillo-Briceño*, M. P. Sepulcre, E. Chaves Pozo, J. Meseguer, A.
García Ayala y V. Mulero. Departamento de Biología Celular. Facultad de
Biología. Universidad de Murcia. 30100 Murcia. Tfno.: (968) 364964.
*pcasbri@um.es.
En células de mamíferos se conoce que la expresión y la modulación de
la actividad de proteínas de la matriz extracelular y de las metaloproteasas
de la matriz (MMPs) están estrechamente vinculadas a moléculas que
intervienen en los procesos inflamatorios. Así, se ha demostrado que varios
proteoglicanos (biglicano y ácido hialurónico) son capaces de activar los
macrófagos a través de los receptores TLR4 y TLR2. Sin embargo en peces
no se han realizado estudios que indiquen esta relación.
En el presente trabajo se usó ejemplares adultos de dorada (Sparus
aurata, Teleostei). Las dosis óptimas de colágeno y gelatina se determinaron
en ensayos de explosión respiratoria de leucocitos primarios de riñón cefálico
(órgano equivalente a la médula ósea). La expresión de varias citoquinas,
incluyendo IL-1β, TNF-α, TGF-β, COX-2 y CCL-4, se determinó mediante
RT-PCR a tiempo real en las dos poblaciones de fagocitos profesionales de
esta especie, granulocitos acidófilos y macrófagos, incubados con gelatina y
colágeno. En todos los casos se aplicaron tiempos de tres y 16 horas para
evaluar la respuesta a corto y largo plazo.
Los resultados indican que la gelatina es capaz de activar de forma dosis
dependiente la explosión respiratoria de los fagocitos de dorada, mientras
que el colágeno no tiene efecto alguno sobre esta actividad. Sin embargo,
tanto la gelatina como el colágeno son capaces de incrementar los niveles
del mRNA de la IL-1β, aunque no ejercen un efecto significativo sobre la
expresión del TNF-α, COX-2, TGF-β y CCL-4. Este patrón de expresión
contrasta con el observado en los fagocitos estimulados con moléculas
derivadas de patógenos (PAMPs), lo que podría sugerir una activación
alternativa de estas células que favoreciera la reparación tisular. Se están
realizando estudios en macrófagos primarios de ratón para ver si este
mecanismo está conservado en todos los vertebrados.
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INMUNOBIOLOGÍA
Comunicación oral
LOS GRANULOCITOS ACIDÓFILOS DE DORADA INFILTRAN
EL TESTÍCULO EN LA ETAPA DE INVOLUCIÓN TESTICULAR
S. Liarte*, E. Chaves Pozo, V. Mulero, J. Meseguer y A. García Ayala.
Departamento de Biología Celular. Facultad de Biología. Universidad de
Murcia. 30100 Murcia. Tfno.: (968) 364964. *sdll1@alu.um.es
Los leucocitos están presentes en el testículo de mamíferos y están
implicados en el control inmunológico y en la remodelación tisular que tienen
lugar en este órgano. El testículo de los peces de puesta estacional sufre un
proceso de regresión en cada ciclo reproductor, proceso que es
particularmente activo en las especies hermafroditas.
En el presente trabajo se han utilizado ejemplares de dorada (Sparus
aurata L., teleósteo), especie hermafrodita protándrica, durante el segundo
ciclo reproductor. Algunos ejemplares fueron inyectados intraperitonealmente
con BrdU antes de los muestreos. El estado de desarrollo gonadal de los
ejemplares se ha determinado mediante microscopía óptica y electrónica.
Para la caracterización de los granulocitos acidófilos se ha utilizado un
anticuerpo monoclonal específico contra los granulocitos acidófilos de dorada
(G7) mediante inmunocitoquímica y citometría de flujo. La proliferación
celular ha sido detectada con inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo
anti-BrdU y las células apoptóticas mediante la detección in situ de la
fragmentación del ADN.
El testículo de todos los ejemplares, durante el segundo ciclo
reproductor, sufre un proceso degenerativo, que se inicia tras la post-puesta
e incrementa al final del ciclo, acompañado de un aumento progresivo del
índice ovárico y de la aparición de ovocitos vitelogénicos. Sin embargo, sólo
el 40% de los ejemplares fueron machos en el tercer ciclo reproductor. Estas
etapas se caracterizan por el aumento del número de células en apoptosis
en el testículo. En las etapas de involución testicular se produce una
infiltración masiva de granulocitos acidófilos que se localizan en el intersticio
testicular, en el compartimento germinal entre las espermatogonias y en la luz
de los túbulos entre los espermatozoides.
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INMUNOBIOLOGÍA
Comunicación oral
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LOS INFs
EN EL PEZ CEBRA
M. A. López-Muñoz1,*, F. Alcaraz1,2, M. L. Cayuela2, J. Meseguer1, V. Mulero1.
1
Departamento de Biología Celular, Facultad de Biología, Universidad de
Murcia, Campus Universitario de Espinardo, 30100 Murcia. 2Unidad de
Cirugía Experimental, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, 30120 El
Palmar. *malms@um.es Tel: 647195971
El pez cebra (Danio rerio) ofrece numerosas ventajas como modelo para
el estudio del sistema inmunitario. Entre ellas podemos destacar su pequeño
tamaño, la gran cantidad de embriones producidos en cada cruce que se
desarrollan extrauterinamente y que son transparentes, la finalización de la
organogénesis y del sistema circulatorio en 24 horas, y la posibilidad de realizar escrutinios a gran escala tanto de moléculas, como de genes capaces
de afectar a la respuesta inmunitaria. Además, la secuenciación de su genoma ha puesto de manifiesto una gran conservación de las principales moléculas que participan tanto en la respuesta inmunitaria innata como en la
adaptativa. En el presente estudio, se analiza la actividad biológica de los
interferones (IFN) tipo III (λ) y II (γ) en células ZF4 mediante el estudio de la
expresión de varios genes pro-inflamatorios, tales como la interleuquina-1β
(IL-1β), el factor de necrosis tumoral α (TNFα), el Mx, la linfotoxina A (LTA) y
los IFNs. La actividad ha sido corroborada in vivo estudiando la movilización
de neutrófilos y de linfocitos T en peces cebra transgénicos mpo-GFP y lckgfp, respectivamente. Por último, se ha estudiado el papel desempeñado por
ambos tipos de IFNs en la protección frente a infecciones bacterianas y virales.
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INMUNOBIOLOGÍA
Comunicación oral
LOS MASTOCITOS DE LOS PECES EVOLUTIVAMENTE MÁS
AVANZADOS CONTIENEN HISTAMINA
I. Mulero +, M. P. Sepulcre, J. Meseguer, A. García-Ayala y V. Mulero
Departamento de Biología Celular, Facultad de Biología, Universidad de
Murcia, 30100 Murcia. España. Teléfono: 968364964. * ivan.mulero@um.es.
Los mastocitos o células cebadas se han descrito en todas las clases de
vertebrados y presentan características morfológicas y funcionales similares.
Sin embargo, los primeros estudios realizados indican que los mastocitos de
anfibios y peces carecen de histamina y que el almacenamiento de histamina
y su acción sobre el músculo liso aparecieron en los antecesores inmediatos
de los reptiles. En este estudio demostramos que los mastocitos de los peces
del orden Perciformes, el orden más grande y evolucionado de teleósteos,
contienen histamina. Además, la histamina es biológicamente activa en estos
peces donde es capaz de regular la respuesta inflamatoria mediante la
activación de los fagocitos. Las acciones de la histamina en estas células
del sistema inmunitario parecen estar mediadas por los receptores H1 y H2,
que junto con el receptor H3, están bien conservados en los peces óseos.
Teniendo en cuenta todos estos datos, proponemos que el almacenamiento
de histamina en los mastocitos y su utilización como mensajero de la
inflamación se establecieron hace unos 222 millones de años en los reptiles
primitivos (Lepidosauria). Este mismo acontecimiento parece haberse
producido de forma independiente en los peces Perciformes en una época
mucho más reciente, a principios del Eoceno, hace entre 45 y 55 millones de
años, un corto periodo durante el cual aparecieron la mayoría de las familias
de la serie Percomorpha.
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INMUNOBIOLOGÍA
Comunicación oral
NUEVOS AVANCES SOBRE LA ACTIVIDAD
BIOLÓGICA DEL TNFα DE PECES
F.J. Roca1, M.P. Sepulcre1, E. Sarropoulou2, G. Kotoulas2, J. Meseguer1, V.
Mulero1
1
Departamento de Biología Celular. Facultad de Biología. Universidad de
Murcia. 30100, Murcia.
2
Centro Helénico de investigaciones marinas. Instituto de Biología marina y
genética, Iraklio, Grecia.
Los macrófagos constituyen la primera línea de defensa frente a infecciones, reconociendo patrones moleculares asociados a patógenos
(PAMPs). Tras su activación los macrófagos producen citoquinas proinflamatorias como la interleuquina-1β (IL-1β) y factor de necrosis tumoral α
(TNFα), ambas responsables de la regulación de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa. En la dorada, un pez teleósteo, hemos demostrado que el
TNFα induce el reclutamiento y activación de granulocitos al ser inyectado intraperitonealmente, aunque la activación de estas células in vitro resulta ser
mínima. En el presente estudio revelamos que el TNFα de dorada es capaz
de inducir la expresión de E-selectina en células endoteliales con el consecuente aumento de la adhesión de leucocitos activados. Todos estos resultados demuestran que el TNFα de peces teleósteos esta principalmente
involucrado en el reclutamiento de leucocitos al sitio de inflamación mas que
en su activación, siendo las células endoteliales la diana principal de esta citoquina.
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INMUNOBIOLOGÍA
Comunicación oral
EVOLUCIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA INNATA
EN VERTEBRADOS: EL TLR4 DE PECES NO ESTÁ IMPLICADO
EN EL RECONOCIMIENTO DEL LPS
M.P. Sepulcre*, M.A. López-Muñoz, J. Meseguer, V. Mulero. Dpto. Biología
Celular, Facultad de Biología, Universidad de Murcia. Campus de Espinardo
30100, Murcia. Tfno.:968364964.*mpsepul@um.es
Los TLRs son una familia de receptores esenciales en la respuesta
inmunitaria. Estos receptores reconocen estructuras muy conservadas en los
patógenos, denominadas patrones moleculares asociados a patógenos
(PAMPs). La señalización a través de estos receptores conduce a la activación
de la respuesta inmunitaria mediante la inducción de la expresión de citoquinas
inflamatorias y quimioquinas, así como la producción de radicales reactivos de
nitrógeno y oxígeno y de péptidos antimicrobianos. En peces, ha sido descrito
un amplio grupo de TLRs, incluyendo ortólogos de las 10 familias de mamíferos
y 2 miembros específicos de peces. Hay evidencias de que algunos de estos
ortólogos son funcionalmente análogos a los TLRs de mamíferos. Sin embargo,
también existen ciertas divergencias entre mamíferos y peces. Así, en el pez
cebra Danio rerio se han identificado dos receptores homólogos del TLR4 de
mamíferos, por el contrario el pez globo Fugu rubripes carece de dicho receptor.
El TLR4 está implicado en el reconocimiento de lipopolisacárido (LPS).
Sin embargo, ha sido descrito que el LPS de ciertas bacterias, como
Porphyromonas gingivalis, cuya estructura difiere del LPS de enterobacterias,
son capaces de activar la respuesta inmunitaria a través del TLR2 y/o TLR4.
Teniendo en cuenta las diferencias entre peces y mamíferos, tanto en la
resistencia al choque endotóxico inducido por LPS, como en las dosis de
LPS requeridas para la estimulación de la respuesta inmunitaria en diferentes
especies de peces, nos propusimos estudiar el papel de los TLRs de peces
en el reconocimiento de LPS. Para ello leucocitos de dorada (Sparus aurata)
fueron estimulados con diferentes LPSs. A continuación se analizó la
explosión respiratoria y la expresión de citoquinas para evaluar la activación
celular. Igualmente la línea celular de pez cebra ZF4 fue previamente
caracterizada a nivel de expresión de TLRs y, a continuación, estimulada con
diferentes LPSs y otros PAMPs. Los resultados obtenidos sugieren que el
TLR4 de peces no estaría implicado en el reconocimiento del LPS.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Comunicación oral
LA INCUBACIÓN DE CÉLULAS HELA A 15ºC INDUCE LA
FORMACIÓN DE ESTRUCTURAS TUBULARES DINÁMICAS EN
EL COMPARTIMENTO INTERMEDIO
M. Tomás, E. Martínez-Alonso, J. Ballesta, J.A. Martínez-Menárguez*.
Departamento Biología Celular, Facultad Medicina, Universidad de Murcia.
Tfno.: 968-39-8306. *jamartin@um.es.
La incubación de células a 15ºC produce un bloqueo del transporte a
nivel del compartimento intermedio (ERGIC) y es por ello utilizado como
modelo experimental para el estudio del tráfico intracelular. Estudios previos
de nuestro grupo de investigación han demostrado que esta temperatura
induce la formación de túbulos derivados del aparato de Golgi (MartínezAlonso et al., 2005; 2007), que podrían ser representantes de los
intermediarios que median en el transporte intra-Golgi. En este trabajo hemos
analizado si la baja temperatura también induce tubulación a nivel del
ERGIC. Para ello hemos analizado la distribución y dinámica in vivo de YFPP58, marcador del ERGIC, mediante microscopia confocal en células HeLa
cultivadas a 15ºC y a 37ºC. Los estudios in vivo han demostrado que la baja
temperatura produce la formación de estructuras tubulares en el ERGIC de
comportamiento muy dinámico y máxima expresión en el rango de 40-50
minutos tras la incubación, estructuras que no se aprecian en condiciones
fisiológicas. Es interesante destacar que este patrón observado en el ERGIC
es muy similar al obtenido tras el tratamiento con BFA a tiempos más cortos
(10 min). Estos resultados nos permiten postular que la formación de estos
túbulos podría ser consecuencia de la disociación de las cubiertas COPI ya
que tanto el tratamiento con BFA como la baja temperatura (Martínez-Alonso
et al., 2005) inducen la disociación de este complejo de las membranas.
También, hemos analizado mediante microscopía de fluorescencia y
crioinmunocitoquímica ultraestructural la distribución de otros marcadores
de compartimento intermedio. Hemos observado que la baja temperatura
también induce la disociación de las cubiertas tipo COPII desde las
membranas a zonas electrodensas del citosol, lo que podría explicar la
ralentización del transporte desde el RE hasta el compartimento intermedio
observado a 15ºC.
Financiado por el proyecto subvencionado por el MEC (BFU 2004-05568).
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Comunicación oral
EL DIACILGLICEROL ES NECESARIO PARA LA FORMACIÓN DE
VESICULAS TIPO COPI EN EL TRANSPORTE DE PROTEÍNAS
DEL APARATO DE GOLGI AL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
I. Fernández-Ulibarri, M. Vilella, F. Lázaro-Diéguez, E. Sarri, S. E. Martínez,
N. Jiménez, E. Claro, I. Mérida, K. N.J. Burger y G. Egea. Departament de
Biologia Cel.lular i Anatomia Patològica, Facultat de Medicina, Barcelona.
Tel. 93-4021912; fernandezulibarri@ub.edu
El diacilglicerol (DAG) es necesario en el transporte post-Golgi pero su
relevancia funcional en las etapas tempranas de la vía secretora no está
clara. Por ello, hemos investigado el papel del DAG en la zona de tráfico de
membranas entre el retículo endoplasmático (RE) y el Golgi utilizando
agentes farmacológicos que alteran distintas vías de formación de DAG.
Vemos que los tratamientos con propanolol, U73122 y fumonisin B1
disminuyen los niveles de DAG en las membranas de Golgi y redistribuyen
el mutante inactivo de la PKD del Golgi al citosol. Las células tratadas
muestran un transporte del RE-al-Golgi normal pero se observa un cambio
en la distribución subcelular del receptor de KDEL, lo que es indicativo de que
el transporte del Golgi-al-RE está alterado. Ultraestructuralmente se observa
un incremento en la densidad de perfiles vesiculares tipo COPI muy próximos
a las cisternas del Golgi. La tomografía electrónica pone de manifiesto que
la mayoría son vesículas que permanecen unidas a la cisterna por un cuello
estrecho, indicando que se produce una alteración en su fisión de la cisterna.
La disminución del DAG también disminuye los niveles de ARFGAP1 en el
Golgi, pero no altera la asociación del coatómero ni la proteína de fisión de
membranas CtBP3/BARS. La adición de 1,2-dioctanoyl-sn-glycerol o el
análogo sintético phorbol 12,13-dibutyrate previene los defectos morfológicos
y de tráfico producidos por la disminución de DAG en el Golgi. Por lo tanto,
nuestros resultados demuestran que el DAG participa en la regulación del
transporte retrógrado del Golgi al RE y sugieren que juega un papel esencial
en los últimos pasos de formación de las vesículas de tipo COPI.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Comunicación oral
EL CITOMEGALOVIRUS HUMANO Y LA MAQUINARIA
CELULAR PARA EL TRANSPORTE DE PROTEÍNAS A LOS
CUERPOS MULTIVESICULARES
A. Fraile-Ramos1*, A. Pelchen-Matthews2, C. Risco3, M.T. Rejas4, V. C.
Emery5, A. F. Hassan-Walker5, M. Esteban1 y M. Marsh2. 1Departamento de
Biología Molecular y Celular, y 3Departamento de Estructura de
Macromoléculas, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid. 2MRC
Laboratory for Molecular Cell Biology, London. 4Sevicio de Microscopía
Electrónica, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC,
Madrid.5Department of Virology, Royal Free and University College Medical
School, London. *corresponding author: Alberto.Fraile@cnb.uam.es
El citomegalovirus humano (CMVH), miembro de la familia de los herpesvirus, es
un patógeno ubicuo que causa graves enfermedades en individuos inmunodeficientes.
La replicación del CMVH, como la de otros virus con envoltura, depende de la interacción
con los sistemas de membranas celulares. El CMVH adquiere su envoltura final en
membranas citoplásmicas antes de ser secretado al medio extracelular. Sin embargo,
se posee escasa información sobre el origen de estas membranas y los mecanismos
implicados en el envolvimiento y la secreción del CMVH y de otros herpesvirus.
Mediante experimentos de inmunomarcaje con partículas de oro y microscopía
electrónica encontramos que tanto peroxidasa de rábano (HRP) absorbida por las
células infectadas como un marcador celular de los cuerpos multivesiculares
(MVBs), CD63, se incorporaban en la envoltura viral. Estos resultados apoyan la
noción de que los virus utilizan las membranas endocíticas para su envolvimiento.
Basándonos en estas observaciones investigamos si la maquinaria celular
para el transporte de proteínas a los MVBs (“the endosomal sorting complex
required for transport (ESCRT) machinery”) desempeña un papel en el
envolvimiento del CMVH. Para ello utilizamos RNAs de interferencia que silencian
la expresión de las proteínas VPS4A y VPS4B. Estos siRNAs inhibieron el
transporte del factor de crecimiento epidérmico a los lisosomas y la formación de
partículas pseudo-virales derivadas de la proteína Gag del virus de la
inmunodeficiencia humana. Sin embargo aumentaron la producción de las
partículas del CMVH. Además en células infectadas por CMVH el silenciamiento
de los componentes ESCRT Tsg101 y ALIX/AIP1 no afectó la producción viral.
Estos estudios sugieren que a diferencia de lo que ocurre con algunos virus
RNA con envoltura, el CMVH no usurpa la maquinaria celular para el transporte de
proteínas a los MVBs para su envolvimiento, si no que esta maquinaria podría estar
implicada en los mecanismos celulares para la degradación del virus.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Comunicación oral
CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO MARCADOR
INTRACELULAR DE TUMORES HIPOFISARIOS
R. Vázquez-Martínez1, M.R. Pulido1, A.J. Martínez-Fuentes1, L. JiménezReina2, A. Quintero-Cabello1, P. Benito-López3, S.M. Webb4, A. Leal-Cerro5,
J.P. Castaño1 and M.M. Malagón1
1
Dpto. Biología Celular, 2Ciencias Morfológicas y 3Servicio de Endocrinol. y Nutrición,
Univ. Córdoba, E-14014; 4Dpto Endocrinología, Univ. Autónoma de Barcelona, E08025 Barcelona y 5División de Endocrinología, H. Virgen del Rocío, E-41013 Sevilla.
Las proteínas GTPasas Rab coordinan los pasos secuenciales del
transporte intracelular de vesículas. Alteraciones en estas GTPasas están
surgiendo como la causa molecular de diversos tipos de cáncer y otras
enfermedades. Estudios recientes de nuestro laboratorio han demostrado
que Rab18, una Rab poco conocida, se asocia a la membrana de una
población particular de gránulos de secreción con movilidad reducida. Más
aún, la sobreexpresión de Rab18 provoca una reducción de la capacidad
secretora de células neuroendocrinas en respuesta a estímulos
extracelulares, lo que apoya un papel inhibitorio en el tráfico intracelular de
gránulos de secreción. En este contexto, nos planteamos si Rab18 podría
actuar en condiciones patológicas de hipersecreción hormonal, como las que
se producen en pacientes con acromegalia, caracterizados por altos niveles
de la hormona del crecimiento (GH) en plasma. Nuestros resultados
muestran que los altos niveles de GH en plasma no sólo se deben a
hiperplasia de las somatotropas, sino que también es el resultado de que las
somatotropas individuales presentan hipersecreción de GH (tres veces
mayor que en células procedentes de tumores no funcionantes -NF- con
niveles normales de GH en sangre). Además, en todas las acromegalias
analizadas, la hipersecreción de GH estaba acompañada por niveles
reducidos de expresión de Rab18 (15%) y de contenido de proteína (30%),
lo que sugiere que la expresión de Rab18 se encuentra reprimida en
acromegalias. Mediante microscopía electrónica, Rab18 se detectó asociada
a gránulos de secreción en células somatotropas de tejidos acromegálicos en
menor medida que en las aisladas de adenomas NF y estudios funcionales
mostraron que la sobreexpresión de Rab18 reduce en un 40% la capacidad
de respuesta a la estimulación con GHRH en células somatotropas
individuales. En conjunto, estos resultados sugieren que Rab18 podría
considerarse un marcador de patologías hipersecretoras humanas como la
acromegalia. Financiación: CVI 139 (JA) y BFU2004-03883 (MEC).
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Comunicación oral
EL ÁCIDO LISOFOSFATÍDICO REESTABLECE LOS NIVELES
DE RHOA ACTIVADO Y DE FOSFOINOSITIDOS EN
ASTROCITOS EXPUESTOS CRONICAMENTE A ETANOL
S.E. Martínez, F. Lázaro-Diéguez, J. Selva, F. Calvo, J. Renau-Piqueras, P.
Crespo, E. Claro and G. Egea.
Departament de Biologia Cel.lular i Anatomia Patològica, Facultat de
Medicina, Universitat de Barcelona. Tel. 93-4021912; jselva@ub.edu
La exposición prolongada a etanol produce alteraciones en la absorción
de glucosa y en el tráfico de membranas endocítico y biosintético. Estas
alteraciones parecen estar asociadas a cambios en la dinámica y
organización del citoesqueleto de actina. Estudios previos de nuestro
laboratorio han puesto en evidencia de que en cultivos primarios de astrocitos
de rata tratados crónicamente con etanol (100 mM de etanol durante 7 días)
muestran severos cambios en la organización del citoesqueleto de actina.
Aquí mostramos cómo estos cambios producidos por el etanol vienen
producidos por una disminución en los niveles endógenos de la forma activa
de RhoA (RhoA unida a GTP/GTP-RhoA), sin que ni Rac ni Cdc42 se vean
alteradas en absoluto. El descenso de los niveles de GTP-RhoA se debe a
un aumento en la actividad GAP (GTPase-activating protein) de RhoA y no
a una disminución en los niveles de proteína como se había descrito
anteriormente. El etanol produce también una disminución significativa de
los niveles de fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol-4-fosfato (PIP) y
especialmente de fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2). Estos resultados
resultan especialmente relevantes ya que PIP y PIP2 participan activamente
en el ensamblaje de actina. También mostramos aquí que el efecto que
describimos anteriormente por el que el ácido lisofosfatídico (LPA) prevenía
y revertía los cambios en la organización de la actina producidos por el etanol
se produce porque el LPA restaura los niveles normales de GTP-RhoA y de
fosfoinosítidos. Por lo tanto, nuestros resultados muestran un mecanismo
molecular implicado en la etiopatogénesis del etanol en astrocitos y explican
además la acción citoprotectora del LPA.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Comunicación oral
ASOCIACIÓN ENTRE LA REGULACIÓN HOMEOSTÁTICA INTRAGOLGI Y LOS FILAMENTOS DE ACTINA EN EL MANTENIMIENTO
MORFO-FUNCIONAL DEL APARATO DE GOLGI
F. Lázaro-Diéguez,1,2,3* J. Llopis,4 y G. Egea1,2,3. 1Departament de Biologia
Cel·lular i Anatomia Patològica, Facultat de Medicina, 2Institut de
Nanociències i Nanotecnologia (IN2UB), 3Institut d’Investigacions
Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Universitat de Barcelona,
Barcelona. 4Facultad de Medicina, CRIB, Universidad de Castilla-La Mancha,
Albacete. Tfno.: (93) 4021912 *flazaroz@ub.edu.
La despolimerización de los microfilamentos provoca alteraciones en la
arquitectura del aparato de Golgi así como un incremento de su pH. Este pH
se encuentra regulado por la acción conjunta de distintas proteínas, entre
ellas las H+-ATPasas vacuolares, intercambiadores catiónicos (NHEs) y
aniónicos (AEs) que a nivel de la membrana plasmática se ha descrito que
interaccionan con los filamentos de actina. En este trabajo analizamos las
alteraciones morfo-funcionales originadas por agentes que interfieren en la
regulación del pH intra-Golgi. Células tratadas con inhibidores específicos
frente a la H+-ATPasa vacuolar, bafilomicina A1, o intercambiadores
catiónicos, benzamil, originan alteraciones en la arquitectura del aparato de
Golgi que resultan indistinguibles a las provocadas por el agente
despolimerizador de microfilamentos latrunculina B. Se observó también un
retraso en el flujo de membranas inducido por brefeldina A en la zona Golgiretículo endoplasmático en las células tratadas con bafilomicina A1 y
benzamil, provocando este último además una alteración en la distribución
subcelular del receptor KDEL. El incremento de pH intra-Golgi producido por
la bafilomicina A fue menor en células previamente tratadas con latrunculina
B. Según estos resultados las alteraciones morfo-funcionales que acontecen
en el aparato de Golgi como consecuencia de la destrucción del
citoesqueleto de actina podrían ser debido en parte a la inhibición parcial de
las H+-ATPasas vacuolares localizadas en el Golgi.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Comunicación oral
LA EXPOSICIÓN CRÓNICA AL ETANOL AFECTA
EL TRANSPORTE NUCLEOCITOPLÁSMICO EN ASTROCITOS
M.P. Marín1*, M.Tomás2, L. Megías3, C. López,-Iglesias4 G. Egea5 y J. RenauPiqueras1. 1Ctr. Invest. Hospital La Fe Valencia, 2Dep. Biol. Cel. Univ. Murcia,
3
Dep. Anatomía Humana, Univ. Granada, 4Parc Cientific Barcelona, 5Dep.
Biol. Cel.
IDIBAPS, Barcelona. Tfno.: 963862700 ext. 50411.
*marin_mpm@gva.es.
La exposición al etanol induce alteraciones en la glicosilación y en el
tráfico intracelular de proteínas (exo y endocitosis) en diferentes tipos
celulares, incluyendo astrocitos y hepatocitos. Se desconoce si dicha
exposición también afecta el tráfico entre citoplasma y núcleo.
En el presente estudio hemos analizado el efecto de la exposición a distintas
concentraciones (30, 50 y 100 mM) de etanol in vitro sobre el transporte
nucleocitoplásmico en astrocitos durante la fase de proliferación. Para ello, las
células se incubaron en presencia de 3 H-metionina por diferentes periodos de
pulso y caza, tras los cuales se midió la radioactividad en célula total y en núcleos
aislados. Además, se analizó, mediante criofractura la densidad y distribución de
los poros nucleares y mediante Western blot e inmunomicroscopía óptica y
electrónica la cantidad y distribución de varias proteínas implicadas en la
estructura del poro nuclear (p62) así como, en la cadena de transporte
citoplasma-núcleo-citoplasma. Entre estas proteínas se analizaron las importinas
α y β, las RanBP-1 y BP-2 así como la GAP1. Por último, se evaluó la cantidad
de actina nuclear. Los resultados obtenidos hasta el momento indican un efecto,
no dosis-dependiente del alcohol sobre dicho transporte, consistente en un
incremento en el núcleo, tras 24 h de pulso, de la cantidad de proteína marcada
para concentraciones de etanol de 30 mM. Esta misma concentración de alcohol,
da como resultado un incremento en el número de poros nucleares así como
cambios en su distribución. Los efectos sobre las proteínas mencionadas fueron
heterogéneos no pudiendo establecerse relación entre estas variaciones y el
incremento de proteínas marcadas en el núcleo. Por último, la exposición a una
concentración 30 mM de etanol inducía un incremento en la actina nuclear,
determinada mediante inmunoblot, lo que contrasta con la disminución de la
misma cuando se evalúa la totalidad de la célula.
Ayudas: SAF2005-00615, FEPAD y RTA (FIS)
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Comunicación oral
REORGANIZACIÓN DE LA ARQUITECTURA NUCLEAR
DURANTE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA INDUCIDA
POR ESTRÉS EN CÉLULAS VEGETALES
M.J. Coronado, N. Chakrabarti, J. Cortes-Eslava, M.C Risueño, P.S
Testillano.
Desarrollo de Plantas y Arquitectura Nuclear. Centro de Investigaciones
Biológicas. CSIC. Ramiro de Maeztu 9, Madrid
Tfno.: (91) 8373112(4229). *mariajose@cib.csic.es.
La muerte celular programada (PCD) es un proceso fisiológico clave
durante el desarrollo, senescencia o respuesta a estrés en animales y
plantas. Los sucesos celulares que conlleva la PCD están bien definidos en
animales pero son mucho menos conocidos en plantas. En este trabajo se
caracteriza la reorganización de la arquitectura nuclear durante la PCD
inducida por estrés en células proliferantes de raíz, como sistema modelo, y
en microsporas inducidas a embriogénesis mediante tratamientos de estrés
in vitro, sistema de reprogramación celular y de interés agronómico para
obtención de doble-haploides. Se ha realizado un estudio citoquímico e
inmunocitoquímico a nivel de microscopía óptica, confocal y electrónica de
transmisión con diferentes marcadores nucleares en muestras
crioprocesadas. Los resultados muestran cambios estructurales similares a
los descritos durante la apoptosis en células animales. En el núcleo, la
cromatina, las estructuras intercromatínicas y los componentes nucleolares
se segregan durante el proceso de PCD y las RNPs se reorganizan en
nuevas estructuras tipo “HERDS” observadas por primera vez en plantas y
propuestas en células animales como marcadoras de parada transcripcional.
Estos resultados aportan nuevas evidencias sobre las rutas de PCD en
plantas y abren nuevas posibilidades para la manipulación de cultivos in vitro
de microsporas con inhibidores de apoptosis para obtener mayores
rendimientos.
Financiado por proyectos BFU2005-01094 y AGL2005-05104.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Comunicación oral
AGREGACIÓN NUCLEAR DE LA PROTEÍNA PABPN1
(“Poly(A)-binding protein nuclear 1”) EN CÉLULAS UR61
R. Bengoechea*, I. Casafont, N. Terán-Villagrá, MT. Berciano y M. Lafarga.
Dpto. de Anatomía y Biología Celular.
Universidad
de
Cantabria.
Santander.
Tfno:(942)201930.
*rocio.bengoechea@alumnos.unican.es
La distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) es una miopatía causada por
expansiones de tripletes de polialanina (GCG)8-13 en el gen PABPN1. La
agregación de la forma mutada de la PABPN1 (exp-PABPN1) conduce a la
formación de inclusiones intranucleares (IINs) que secuestran, además, poly (A)
RNAs, chaperonas y componentes de la vía ubiquitina proteasoma. Sin embargo,
la forma silvestre (wt) de la PABPN1 forma también IINs en las neuronas del núcleo
supraóptico en condiciones fisiológicas, sugiriendo que la agregación de la
PABPN1 no es patogénica y que las expansiones de polialanina no son esenciales
para la agregación nuclear. En este estudio analizamos los patrones de agregación
de la PABPN1 en células UR61 transfectadas con diferentes construcciones de
GFP-PABPN1 (wt, exp7-ala, ΔN, ΔM y ΔC). Solamente las formas wt y 7-ala se
agregan para formar IINs. La deleción del “NLS” (ΔC) retiene la PABPN1 en el
citoplasma, la deleción de la región rica en polialanina (ΔN) concentra la PABPN1
en “speckles” nucleares y la deleción del dominio de unión al RNA (ΔM) produce
un patrón nucleoplásmatico difuso.
Los estudios de microscopía confocal y electrónica revelan tres patrones de
agregación, tanto en la PABPN1 wt como de la exp7-ala: cuerpos nucleares,
grandes IINs formadas por ordenaciones laminares y agregados peri- e
intranucleolares. Las IINs PABPN1 se localizan en el dominio intercromatínico y
establecen asociaciones espaciales con los cuerpos de Cajal y con las áreas de
factores de “splicing”. Los estudios de hibridación in situ y el ensayo de
transcripción con 5’-FU demuestran la acumulación de RNAs en las IINs. También
concentran los factores REF e Y14, que están asociados a los pre-mRNAs, poly
(A) polimerasa (PAP) y snRNPs. Estos datos sugieren que las IINs PABPN1+
representan un sistema de retención nuclear de RNAs poliadenilados y snRNPs.
Financiado por BFU-2005-01030, CIBERNED e IFIMAV
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Comunicación oral
UN MUTANTE DE Arabidopsis PARA EL GEN PRINCIPAL DE LA
NUCLEOLINA REVELA SU PAPEL FUNCIONAL EN LA SÍNTESIS
DE rRNA Y EN LA ORGANIZACIÓN DEL NUCLEOLO
I. Matía1, F. Pontvianne2, M. Echeverría2, J. Sáez-Vásquez2 y FJ. Medina1*.
1
Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Madrid. *fjmedina@cib.csic.es.
2
CNRS-Université de Perpignan, Francia.
La nucleolina es una proteína nucleolar mayoritaria, de estructura
tripartita, evolutivamente conservada y ha sido definida como multifuncional,
implicada en diferentes etapas de la biogénesis de los ribosomas y también
en otras funciones no relacionadas con este proceso celular. Al contrario que
en animales y levaduras, el genoma de la planta modelo A. thaliana contiene
dos genes de nucleolina, AtNUC-L1 y AtNUC-L2, si bien sólo el primero se
expresa en los tejidos de plantas crecidas en condiciones convencionales. En
estas plantas, la nucleolina presenta una localización específicamente
nucleolar, acumulada en el componente fibrilar denso en las proximidades de
los centros fibrilares. Un mutante de inserción para el gen AtNUC-L1
presenta importantes alteraciones en el desarrollo y la diferenciación de la
planta. Estos efectos se asocian a la ausencia de expresión de AtNUC-L1
combinada con la activación de AtNUC-L2, evidenciada in situ por la
presencia de esta proteína en las células, detectada en el nucleolo mediante
un anticuerpo específico. Sin embargo, las plantas mutantes Atnuc-L1
poseen niveles reducidos del precursor primario pre-rRNA y procesan este
precursor con menor eficacia. Los nucleolos de las células meristemáticas de
estas plantas mutantes muestran una dramática reorganización estructural,
en la que desaparece la discriminación neta de los subcomponentes del
nucleolo y aparecen numerosos intersticios en los que se localizan unos
gránulos de mayor tamaño que los del componente granular, que han sido
identificados como los denominados “gránulos pericromatínicos nucleolares”,
(NPG) asociados en trabajos anteriores a diversas situaciones, fisiológicas
o inducidas, de inhibición de la actividad nucleolar. En concreto, se ha
sugerido que estos NPG contendrían precursores de rRNA incorrectamente
procesados. En conclusión, se demuestra el papel central de la nucleolina en
la biogénesis de los ribosomas y la asociación de este proceso con el
crecimiento y la proliferación celular y con el desarrollo de la planta.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Comunicación oral
RELOCALIZACIÓN NUCLEOLAR DE LA COILINA Y
ALTERACIÓN DE LOS CUERPOS DE CAJAL INDUCIDA POR
RADIACIONES IONIZANTES EN CÉLULAS MCF-7
O. Tapia*, I. Casafont, J. Soto, M. Lafarga, MT. Berciano. Departamentos
de Anatomía y Biología Celular y Física-Médica. Universidad de Cantabria.
Santander. Tfno.: (942) 20 19 30. *olga.tapia@alumnos.unican.es.
El cuerpo de Cajal (CB) concentra snRNPs y snoRNPs requeridos para
el procesamiento de los pre-mRNAs y pre-rRNAs, respectivamente. Además
contiene la proteína coilina, un marcador del CB, que juega una papel
esencial en el ensamblaje de los CBs. Existe una relación dinámica,
estructural y funcional, de los CBs con el nucleolo. Así, los CBs
frecuentemente se asocian con el nucleolo en células transcripcionalmente
muy activas, la coilina se relocaliza en anillos perinucleolares en respuesta
a la inhibición transcripcional y aparecen CBs intranucleolares en líneas
celulares de cáncer de mama. En este estudio presentamos un nuevo
modelo de interacción de los CBs con el nucleolo: la relocalización nucleolar
de la coilina, sin formación de CBs, en respuesta a la radiación ionizante (IR)
de las células MCF-7. Los efectos de la IR (2Gy) se analizaron mediante la
expresión de H2AX fosforilada en Ser-139 (γH2AX), que detecta los focos de
lesión/reparación en la doble hebra de DNA. El número máximo de focos de
γH2AX se observa a los 30min post-IR, coincidiendo con una dramática
caída de la actividad transcripcional (medida con el ensayo de incorporación
in situ de 5-fluorouridina en el RNA naciente). La proporción de células con
coilina intranucleolar aumenta desde un 4,3% (0h) hasta el 17,7% a las 3h
post-IR, retornando a valores control (5,4%) a las 24h post-IR cuando se ha
completado la reparación del DNA. La localización intranucleolar de la coilina
se confirmó por la expresión de dos marcadores nucleolares: fibrilarina y
UBF. Las células que poseen coilina intranucleolar tienen menos CBs que el
resto de la población. Además, estos CBs no son funcionales, dado que
carecen de snRNPs espliceosomales y SMN. La presencia de coilina
intranucleolar fue confirmada en experimentos de transfección con GFPcoilina en células MCF-7. El desensamblaje de los CBs y la migración de la
coilina al nucleolo pueden reflejar una forma distinta de respuesta celular a
la inhibición transcripcional inducida por el estrés celular de las IR.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Comunicación oral
LOS SNP ARRAYS Y EL PERFIL DE EXPRESIÓN DE miRNAs
PODRÍAN PERMITIR UNA MEJOR CLASIFICACIÓN DE
PACIENTES CON LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA Y CARIOTIPO
NORMAL
C. Vicente*, I. Vázquez, E. Bandrés, N. Marcotegui, G. Rivell, I. Cristóbal, C.
Carranza, M.J. Larrayoz, M.J. Calasanz, M.D. Odero. Departamento de
Genética y CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona. Tfno.: (948) 194700
ext 1035. *cvicente@alumni.unav.es.
La leucemia mieloide aguda (LMA) surge como consecuencia de
alteraciones genéticas adquiridas. Los pacientes con cariotipo normal
representan más del 40% de todas las LMA y carecen de pautas de
tratamiento bien definidas. OBJETIVOS: Analizar mediante arrays de SNPs
(Affymetrix) y cuantificación de la expresión de 157 microRNAs mediante
PCR a tiempo real 47 pacientes con LMA y cariotipo normal molecularmente
bien caracterizados. RESULTADOS: Quince pacientes no presentaron
ningún cambio en los arrays de SNPs (32%). Identificamos 10 casos con
regiones de deleción y/o duplicación crípticas (21%) y 28 casos (60%) con
pérdida de heterocigosidad (LOH) por disomía uniparental (DUP). Algunas de
estas regiones fueron recurrentes y se localizaron en regiones
frecuentemente delecionadas o reordenadas en LMA: 4q21-q35 (5 casos),
5q23-5q31 (2 casos), 7q22-q32 (5 casos), 11q23-11q24 (2 casos), and
13q12-q22 (7 casos). Además, dos casos con LOH en 13q12 presentaron
mutación homocigótica de FLT3. No se encontró asociación estadística entre
la presencia de LOH y las variables con significado pronóstico en LMA: FLT3ITD, edad>60 años y no alcanzar remisión completa. Esto sugiere que la
presencia de LOH por DUP no tiene impacto en la supervivencia de los
pacientes, aunque será necesario confirmarlo en una serie mayor. Al mismo
tiempo realizamos el perfil de expresión de 157 microRNA maduros en 28
pacientes y 3 individuos normales. Se obtuvieron perfiles de expresión
diferencial en 22 miRNAs. CONCLUSIÓN: Hemos identificado un perfil de
expresión diferencial de miRNAs en una serie de pacientes con LMA y
cariotipo normal, los más significativos estadísticamente son los miR-155,
miR-17-5p, miR-181a y miR-181b. Nuestros resultados muestran que la
prevalencia de LOH por UPD es elevada, 60% en nuestra serie.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Comunicación oral
CARACTERIZACIÓN DE NUEVAS ALTERACIONES GENÉTICAS
EN LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA Y EXPRESIÓN
DIFERENCIAL DE MICRORNAS
M. Gómez-Benito*, I. Cristóbal, M. Valgañon, E. Bandres, M.J. Calasanz, P.
Giraldo, M.D. Odero. C. Investigación Médica Aplicada y D. Genética.
UdeNavarra,Pamplona; Tfno.:(948)194700 (1008). *magomezb@unav.es.
Aunque se han identificado parámetros biológicos que permiten predecir el
curso clínico de los pacientes de leucemia linfática crónica (LLC) y su respuesta
al tratamiento, entre los que se incluyen alteraciones citogenéticas y el estado
mutacional de los genes IgVh, todavía se desconocen los eventos que conducen
a la transformación tumoral.
Con el objetivo de identificar nuevas alteraciones genéticas, empleamos la
técnica de arrays de SNPs en pacientes con LLC, observándose buena
correlación entre los resultados de FISH y de los arrays. Estos últimos, nos
permitieron además, caracterizar 8 nuevas alteraciones, 2 recurrentes: 2
pacientes sin hipermutación somática IgVh presentaban una ganancia en 2p142pter y 2 con hipermutación somática presentaban una ganancia en
19q13.33-19qter, También detectamos 9 regiones de pérdida de heterocigosidad
(LOH) con número normal de copias de DNA, todas ellas no recurrentes.
Como las LOH se producen con frecuencia en sitios frágiles del genoma, en
los que abundan microRNAs (miRNAs), cuantificamos la expresión de 157
microRNAs por RT-PCR en células mononucleares de sangre periférica de
pacientes con CLL y de donantes sanos. Tras normalizar los datos y realizar un
análisis estadístico se detectó disminución significativa en la expresión de miR154, miR-199, miR-224, miR-299 y miR-370; y aumento de expresión de miR-96,
miR-155, miR-183 y miR-210 en las células de todos los pacientes
independientemente de la citogenética y del estatus IgVh. Al evaluar la expresión
de estos miRNAs en muestras al diagnóstico y post-tratamiento con fludarabina,
se encontró una disminución de los niveles de miR-155 en post-tratamiento en
pacientes con remisión completa, pero no en pacientes con fracaso.
Como conclusión, los arrays de SNPs puede ayudar a caracterizar nuevas
alteraciones genéticas implicadas en el desarrollo de la LLC. Por otro lado, un patrón
de miRNAs de sangre periférica puede ser útil en el diagnóstico de la LLC y en su
monitorización. Principalmente, los niveles de miR-155, que podrían emplearse
como indicativos de la respuesta al tratamiento y el seguimiento de la enfermedad.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Comunicación oral
ANÁLISIS DEL PAPEL TEJIDO ESPECÍFICO
DE Pitx2 DURANTE LA CARDIOGÉNESIS
A. Chinchilla*, A.E. Aránega, D. Franco. Departamento de Biología
Experimental. Universidad de Jaén. Jaén. Tfno.: (953) 212763.
*acruiz@ujaen.es
El primer órgano que presenta una asimetría morfológica durante el
desarrollo embrionario es el corazón. Sin embargo, la cascada de
señalización molecular izquierda-derecha se inicia en estadios más
tempranos del desarrollo. Nosotros hemos caracterizado la expresión de
Pitx2 durante la cardiogénesis y hemos visto que Pitx2 se expresa en la mitad
izquierda del tubo cardiaco lineal. Conforme avanza la cardiogénesis, vemos
que Pitx2 confina su expresión al lado izquierdo en el miocardio atrial y tracto
de entrada, pero pasa a expresarse en la porción dorso-ventral del miocardio
ventricular. Se ha demostrado que los mutantes nulos sistémicos Pitx2 tienen
un papel crítico durante la cardiogénesis, dando lugar a distintos fenotipos
como el DORV.
En nuestro laboratorio estamos interesados en entender el papel
espacio/temporal de Pitx2 durante la cardiogénesis. Así, hemos desarrollado
mutantes condicionales nulos tejido-específicos de miocardio ventricular
(Mlc2v-Cre), miocardio atrial (ANF-Cre) y células endoteliales (Tie2-Cre).
Hemos observado que la pérdida de función de Pitx2 en el miocardio atrial y
ventricular produce una localización cardiaca ectópica transitoria, aunque
son viables hasta el estadio adulto. Además, la carencia de Pitx2 en el
miocardio atrial en adultos provoca una hipoplasia de las cámaras atriales.
La falta de Pitx2 en componentes endoteliales parece ser irrelevante en la
cardiogénesis. Actualmente, hemos cuantificando la expresión de distintos
factores de transcripción y proteínas estructurales en estos mutantes nulos
condicionales mediante PCR a tiempo real, así como mediante hibridación in
situ. Dichos resultados concuerdan con los datos de cuantificación de
sobreexpresión de Pitx2 en un modelo in vitro de cardiomiocitos derivados de
células madre embrionarias. A su vez, estamos investigando las diferencias
de expresión génica en estos mutantes de Pitx2 mediante microarrays. Los
resultados serán comentados.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Comunicación oral
CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE LOS CANALES DE SODIO
DURANTE LA CARDIOGÉNESIS EN UN MODELO DE RATÓN
TRANSGÉNICO DE SÍNDROME DE QT LARGO
Á. de la Rosa*, F. Navarro, J. Nicolás Domínguez, D. Franco y A.E. Aránega.
Departamento de Biología Experimental. Universidad de Jaén. Jaén. Tfno.:
(953)212604. *arosa@ujaen.es.
El corazón embrionario inicia una contracción asincrónica y peristáltica
pero conforme avanza el desarrollo adquiere una contracción sincrónica y
coordinada a través un tejido especializado, el sistema de conducción cardiaco.
Los canales de sodio dependientes de voltaje (formados por
subunidades alfa y beta) son los responsables del rápido incremento de la
permeabilidad de la membrana celular hacia los iones Na+.
Recientemente hemos descrito los patrones de expresión de la
subunidad alfa del canal de sodio cardiaco (Scn5a) y la subunidad beta
(Scn1b) durante el desarrollo cardiaco, demostrando que ambas son
preferencialmente expresadas en los componentes ventriculares del sistema
de conducción cardiaco.
Para determinar si la cardiomiopatía hipertrófica dilatada (detectada en
nuestro laboratorio en un modelo de ratón transgénico de síndrome de QT
largo) es secundaria a la sobre-expresión de Scn5a y Scn1b (también
detectada en corazones adultos que portaban el transgen), o viceversa;
hemos analizado tanto la morfología cardiaca como los patrones de expresión
de Scn5a y Scn1b durante el desarrollo embrionario en este modelo
transgénico. De acuerdo con los resultados obtenidos hasta el momento, se
ha observado un aumento de los niveles de expresión de Scn5a y Scn1b entre
los E13.5 – E14.5, mientras que los signos morfológicos de una
cardiomiopatía hipertrófica dilatada no fueron detectados hasta el E18.5.
Este estudio puede tener importantes repercusiones en el entendimiento
de los mecanismos y consecuencias de las alteraciones electrofisiológicas en
los recién nacidos y puede abrir el camino hacia un mejor entendimiento de
entidades clínicas relevantes como anomalías congénitas, arritmias y muerte
súbita perinatal.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Comunicación oral
LA TERFENADINA INDUCE GENOTOXICIDAD Y APOPTOSIS A
TRAVÉS DE LA ACTIVACIÓN DE TIROSINQUINASASY LA
MODULACIÓN DEL CA2+ INTRACELULAR.
F. Nicolau-Galmés*, J. Sh. Muhialdin, M. B. Ruiz-Larrea, N. Andollo, M. L.
Cañavate, A. Asumendi, G. Pérez-Yarza, I. Ortega-Martínez, Y. Arroyo and
M. D. Boyano. Departamento de Biología Celular e Histología. Facultad de
Medicina y Odontología. Universidad del País Vasco/EHU. 48940 Leioa,
Bizkaia.
Telf: 94 601 5689. * xiscang@yahoo.com
En trabajos previos hemos demostrado que la terfenadina induce daño en
el DNA y apoptosis en diferentes líneas celulares de melanoma humano.
Además, la histamina aumenta la proliferación de dichas células, pero bloquea
sólo parcialmente la apoptosis inducida por terfenadina. Por otro lado, el bloqueo
de la expresión de H1HR mediante RNAi protegió, aunque no totalmente, a las
células del melanoma A375 de la apoptosis mediada por tefenadina. Estos
resultados sugieren que otra ruta celular, independiente de la ruta de la
histamina, podría estar implicada. Para explorar los mecanismos celulares
responsables del efecto de la histamina y de la terfenadina, hemos estudiado los
niveles intracelulares de Ca2+ mediante espectrofluorimetria utilizando Fura-2.
Los resultados mostraron que, al contrario que la histamina, la terfenadina indujo
un incremento muy significativo en los niveles de Ca2+ citosólico en las células
del melanoma humano A375. El efecto de la terfenadina está mediado por la
liberación del Ca2+de los depósitos del retículo endoplásmico, seguido de una
entrada de Ca2+ del medio extracelular a través de los SOCs (Store Operated
Channels). Además, el aumento de Ca2+ citoplasmático y la apoptosis inducida
por terfenadina parecen ser dependientes de la fosfolipasa C (PLC), ya que la
neomicina y el U73122, dos inhibidores de la PLC, impiden la salida del Ca2+ y
la apoptosis. Finalmente, hemos encontrado que la inhibición de tirosinquinasas
mediante genisteina impidió la liberación de Ca2+, la fragmentación del DNA y
la apoptosis inducida por terfenadina. Estos resultados sugieren que la actividad
tirosinquinasa es un punto esencial en la vía de señalización intracelular, ya sea
inducida a través del receptor H1HR y de una posterior activación de
tirosinquinasas, o a través de otro receptor independiente.
Bibliografía: Jangi Sh M. y cols. Carcinogenesis 27 (9), 1787-96
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Comunicación oral
LA ISOFLAVONA GENISTEÍNA POTENCIA SELECTIVAMENTE
LA INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR LA DROGA
ANTILEUCÉMICA TRIOXIDO DE ARSÉNICO MEDIANTE
GENERACIÓN DE ESTRÉS OXIDATIVO
Y. Sánchez, C. Fernandez, D. Amrán, E. De Blas, P. Aller.
Departamento fisiopatología. CIB-CSIC.Madrid.Tfno.:
*sdyoli@cib.csic.es.
(91)8373112.
El trióxido de arsénico (ATO, TrisenoxTM), droga de uso clínico en el
tratamiento de la leucemia promielocítica aguda, podría ser también útil frente a
otras neoplasias hematológicas, pero ello requeriría la generación de estrategias
capaces de potenciar su acción apoptótica. Dada la dependencia de la acción
del ATO respecto al estrés oxidativo, este resultado podría lograrse por cotratamiento con agentes que eleven el tono oxidativo celular. Experimentos
usando la isoflavona de soja genisteína indican que: (a) El co-tratamiento con
concentraciones tolerables de genisteína (25-50 μM) potencia la acción
apoptótica del ATO (0.5-4 μM) en líneas celulares leucémicas humanas (U937,
HL60, THP-1, Jurkat, y RPMI 8866), pero no en linfocitos humanos no tumorales.
(b) La genisteína provoca acumulación de células en fase G2/M del ciclo
proliferativo, que no es determinante para la potenciación de apoptosis. (c) La
genisteína induce sobre-acumulación transitoria de especies reactivas de
oxígeno (ROS), y la toxicidad de genisteína/ATO es atenuada por el antioxidante
N-acetil-L-cisteina. La potenciación de apoptosis por genisteína es mimetizada
por otros agentes pro-oxidantes o la adición exógena de H2O2. (d) La genisteína
no potencia, e incluso atenúa la acción citotóxica de otras drogas antitumorales,
como el cisplatino, doxorubicina, camptotecina, MS-275 (inhibidor de histonas
deacetilasas) y 2-metoxiestradiol, que son insensibles al estrés oxidativo. (e) La
genisteína, sola o en combinación con ATO, no afecta la fosforilación/activación
de NF-κB, PI3K/Akt, MEK/ERK, ni JNK. Sin embargo provoca la
fosforilación/activación de quinasas sensibles a estrés oxidativo p38-MAPK y
AMPK, y la apoptosis es atenuada por inhibidores de estas quinasas.
Estos resultados indican que el co-tratamiento con genisteína y
posiblemente otros flavonoides con acción oxidante podría ser útil para
incrementar la eficacia clínica del trióxido de arsénico.
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Comunicación oral
CATÁSTROFE MITÓTICA EN CÉLULAS HeLa SOMETIDAS A
TERAPIA FOTODINÁMICA CON FTALOCIANINA DE ZINC
S. Rello-Varona*, M. Cañete, J.C. Stockert y Á. Villanueva. Departamento de
Biología. Universidad Autónoma de Madrid. Tfno.: 91 497 2821.
*santiago.rello@uam.es.
La Terapia Fotodinámica (TFD) del cáncer se basa en la aplicación,
tópica o sistémica, de compuestos fotosensibilizadores (FSs) que se
acumulan preferentemente en los tejidos tumorales. La irradiación del área
tumoral con luz visible de longitud de onda apropiada, ocasiona la formación
de especies altamente reactivas de oxígeno (ROS), con efectos citotóxicos.
En relación con las terapias oncológicas convencionales, la principal ventaja
de la TFD es su mayor selectividad, ya que el daño celular queda restringido
a la zona donde se reúnen los tres agentes necesarios: FS, luz y oxígeno, lo
que conlleva una importante disminución de los efectos secundarios.
Los estudios realizados en cultivos celulares muestran que los
mecanismos de muerte inducida por la TFD son variables, en función de las
dosis de tratamiento así como de la naturaleza del propio FS.
La ftalocianina de zinc (ZnPc) es uno de los nuevos FSs que está
demostrando poseer mejores propiedades para incrementar la eficacia de la
TFD, por lo que está siendo objeto de múltiples estudios tanto in vitro como
in vivo. En la presente comunicación se evidencia que la ZnPc vehiculizada
en liposomas, penetra en el interior de las células HeLa (carcinoma de útero
humano) y se acumula en un área próxima al núcleo, que se correspondería
con la localización subcelular del aparato de Golgi.
Utilizando tratamientos fotodinámicos subletales (aproximadamente 50%
de muerte celular) con ZnPc, se induce una acumulación de células en
mitosis que se inicia 6 h después del tratamiento y que permanece 24 h
después. Las células bloqueadas en metafase se caracterizan por presentar
alterados los microtúbulos del huso mitótico y la disposición de los
cromosomas en la placa ecuatorial. Una muerte celular con las
características morfológicas de la apoptosis, se desencadena a partir de las
48 h de finalizar el tratamiento fotodinámico.
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Comunicación oral
MECANISMOS INTRACELULARES QUE PARTICIPAN EN LA
INDUCCIÓN DEL GEN DE SOMATOSTATINA POR BDNF EN
CÉLULAS CEREBROCORTICALES DE EMBRIONES DE RATA
I. Sánchez*, F. Sánchez-Franco2, N. Palacios, M. Fernández, C. Navarro, M.
Sánchez-Grande y L. Cacicedo. Servicio de Endocrinología, Hospital Ramón
y Cajal. Hospital Carlos III2. Madrid Tfno.: (91) 3368549.
*misabel38@hotmail.com
En estudios previos hemos demostrado que el tratamiento con BDNF activa la
expresión del gen de SS. Los objetivos del presente estudio fueron definir las vías
de señalización intracelular que participan en dicha activación, asi como confirmar
si existe regulación transcripcional del gen de SS por BDNF mediante transfecciones
transitorias. Cultivos primarios de células cerebrocorticales de embriones de rata de
17 días se trataron con BDNF (50 ng/ml) durante 10 minutos, observándose una
activación de ERKs. Para definir qué vías de señalización mediaban esta activación
se utilizaron inhibidores específicos de las distintas vías: PD098059 para la vía
MAPKs, RpAMPcs y H89 para la vía AMPc/PKA y KN62 y KN93 para la vía CaMKs.
Observamos que en la activación de ERKs por BDNF participan las tres vías
estudiadas, si bien la vía MAPKs parece predominante. Asimismo, estudiamos la
activación del factor transcripcional CREB que es crucial en la inducción génica por
BDNF. Comprobamos que CREB se activa a los 10 minutos de exposición a BDNF
y que su activación está mediada por las vías MAPK y AMPc/PKA. A continuación,
analizamos cual de estas vías activadas por BDNF participaba en la inducción del
gen de SS por BDNF observando que el bloqueo de las vías AMPc/PKA, MAPK y
CaMKs abole la inducción de SS por BDNF. Una vez determinadas las vías de
señalización que son activadas por BDNF y que conducen a la inducción de SS,
estudiamos la regulación transcripcional del gen de SS transfectando la línea celular
PC12trkB con las distintas construcciones del promotor de SS unidos al gen
reportero CAT, encontrando que existe una mayor actividad CAT en las células
transfectadas con el promotor SS65 que contiene el elemento CRE. Estudios
similares se realizaron en los cultivos primarios transfectados con las distintas
construcciones del promotor de SS unidas al gen reportero de la luciferasa,
obteniendo los mismos resultados.
Estos resultados indican que: 1. La inducción del gen de SS por BDNF está
mediada por las vías AMPc/PKA, CaMKs y MAPK. 2. BDNF activa directamente
la transcripción del gen de SS. 3. La regulación transcripcional de SS por BDNF
está mediada por el elemento CRE presente en el promotor SS65.
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Comunicación oral
PAPEL DE C-MET EN LA REGULACIÓN DE APOPTOSIS EN
CÉLULAS PROGENITORAS HEPÁTICAS
G. del Castillo*(1), M. Fernández(1), C. Roncero(1), V.M. Factor(2), S.S.
Thorgeirsson(2), I. Fabregat(3) y A. Sánchez(1). (1)Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular II. Fac. Farmacia. Universidad Complutense.
Madrid. Tfno.: (91) 3941627. *gcastill@farm.ucm.es. (2)Laboratory of
Experimental Carcinogenesis. NCI/NIH. Bethesda, USA. (3) Institut
d’Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL), L’Hospitalet, Barcelona.
Estudios comparativos llevados a cabo por nuestro grupo en células progenitoras adultas hepáticas (células ovales) con (metflx/flx) y sin c-met (met-/-)
sobre la respuesta a estímulos proapoptóticos (retirada de suero y/o tratamiento con TGF-β), han demostrado una mayor sensibilidad de las células
met-/- a la apoptosis. Actualmente estamos tratando de definir los mecanismos moleculares responsables de este fenómeno, y para ello hemos comenzado por analizar la relevancia del estrés oxidativo asociado al proceso
apoptótico inducido por TGF-β. Además, estamos interesados en estudiar el
papel de c-met en la respuesta celular a otros factores, como el EGF, con el
fin de comprobar si existe una interacción directa entre las rutas de EGFR y
c-met. Los resultados muestran una amplificación del estrés oxidativo asociado al proceso apoptótico inducido por TGF-β en células met-/-, con una
mayor producción de ROS, una caída temprana de los niveles del enzima antioxidante MnSOD y una depleción más acusada y prolongada de glutation.
Tanto las células metflx/flx como met-/- expresan constitutivamente HGF y ligandos del EGFR, lo que sugiere la existencia de regulación autocrina. El tratamiento con un inhibidor del EGFR disminuye la viabilidad celular, de forma
más acusada en células met-/-, lo que se correlaciona con una mayor tasa de
apoptosis en estas células y una mayor activación de caspasa-3. Además, el
inhibidor potencia la apoptosis inducida por TGF-β, tanto en presencia como
ausencia de c-met, lo que indica que la activación de EGFR, al igual que cmet, promueve la supervivencia de células ovales tanto en condiciones basales (ausencia de suero) como bajo tratamiento con TGF-β. No se detecta
fosforilación de c-met por EGF ni de EGFR por HGF, lo que sugiere que las
dos vías funcionan de forma independiente.
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Comunicación oral
LA GTPASA RAS, ERK Y AKT MODULAN LA SÍNTESIS DE
MATRIZ EXTRACELULAR Y LA PROLIFERACIÓN INDUCIDAS
POR EL FACTOR DE CRECIMIENTO TRANSFORMANTE-β 1
I. Fuentes-Calvo, E. Santos1, J. M. López-Novoa, C. Martínez-Salgado*2.
Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca,
1
Centro de Investigación del Cáncer, y 2Unidad de Investigación, Hospital
Universitario de Salamanca Tfno.: (923) 294500 ext. 1945.
*carlosms@usal.es.
Las proteínas Ras son GTPasas que regulan la supervivencia celular, el crecimiento y la diferenciación. El factor de crecimiento transformante β-1 (TGF-β1)
es fundamental en el origen y mantenimiento de la glomerulosclerosis y de la fibrosis túbulointersticial. Las vías de señalización de Ras y del TGF-β están relacionadas: TGF-β1 potencia los efectos mitogénicos de Ras, y Ras interfiere en la
señalización por TGF-β1. Hemos estudiado el papel de Ras y de sus efectores Erk
y Akt, en la síntesis de matriz extracelular (MEC) y en la proliferación mediada por
TGF-β1 en fibroblastos embrionarios de ratones knockout (KO) para Sos 1 (sos
1-/-), un factor intercambiador de nucleótidos de guanina y principal proteína activadora de Ras; evaluamos la expresión de proteínas de MEC fibronectina y colágeno tipo I, así como de Erk, Akt y la citoquina profibrótica CTGF (factor de
crecimiento de tejido conectivo) por western blot; valoramos la síntesis total de colágenos mediante la captación de [3H]-prolina por proteínas colágenas; valoramos
la proliferación celular por tinción de núcleos con cristal violeta; analizamos la activación de Ras por precipitación por afinidad de Ras-GTP con Raf.
La expresión de CTGF, Akt fosforilado, fibronectina, colágeno tipo I y la síntesis total de colágeno, es mayor en los fibroblastos sos 1-/- que en los fibroblastos sos 1+/+, no encontrándose diferencias detectables en la expresión de Erk
fosforilado. La inhibición de las fosforilaciones de Erk (por U0126) o de Akt (por
LY294002) reduce significativamente la síntesis de MEC inducida por TGF-β1. La
activación de Ras es mayor en los fibroblastos sos 1-/- que en los controles. La proliferación celular inducida por TGF-β1 es también mayor en fibroblastos sos 1-/que en los controles; a su vez, la inhibición de la fosforilación de Erk y/o Akt inhibe la proliferación inducida por TGF-β1 en estos fibroblastos.
Estos estudios sugieren que Ras, junto con las rutas de señalización de
Erk y Akt, participan en la regulación de la síntesis de MEC y en la proliferación inducidas por TGF-β1.
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Comunicación oral
EFECTO DEL COLÁGENO TIPO I EN LA DIFERENCIACIÓN
OSTEOCONDROGÉNICA IN VIVO DE CÉLULAS
ESTROMÁTICAS DERIVADAS DE GRASA VISCERAL DE RATA
M. Alonso*, S. Claros, E. Jiménez-Enjuto, J. Becerra y J.A. Andrades.
Laboratorio de Bioingeniería y Regeneración Tisular (LABRET): Dpto.
Biología Celular, Genética y Fisiología. Facultad de Ciencias, Universidad de
Málaga. Málaga.Tfno.: 952 131954. *E-mail: malonso@usp.br
Estudios recientes demuestran que las células estromáticas de la grasa
(ADAS) resultan prometedoras para su uso en terapia celular debido a su
capacidad para diferenciarse hacia tipos celulares mesenquimales, incluido hueso
y cartílago. Hemos investigado si el colágeno tipo I estimularía la formación de
hueso in vivo por parte de células ADAS implantadas ectópicamente.
Las células fueron aisladas de la grasa inguinal de ratas Wistar. Células en p1
y p4 se incubaron en medio osteogénico (dexametasona, ácido ascórbico y ßglicerol fosfato) durante 2-4 semanas. Las células indiferenciadas se mantuvieron
en DMEM/FBS. La diferenciación osteogénica se determinó citoquímicamente por
von Kossa y fosfatasa alcalina, y la expresión de marcadores específicos de
osteocitos se analizó por RT-PCR. Cámaras de difusión (n=5) se llenaron con 106
células mezcladas con (o sin) colágeno I e implantaron subcutáneamente en ratas
durante 4 u 8 semanas. Los controles incluyeron: 1) células indiferenciadas (con o
sin colágeno), 2) colágeno sin células y 3) cámaras vacías.
Las células incubadas en medio osteogénico se tiñeron positivamente con von
Kossa y fosfatasa alcalina. La producción de osteocalcina confirmó que estas células
se habían diferenciado en osteoblastos in vitro. No se observó diferenciación
osteocondrogénica en las células cultivadas en medio control. Tras 4 semanas, la
formación de hueso y cartílago in vivo se demostró sólo en cámaras conteniendo
células osteoinducidas durante 4 semanas y colágeno (confirmado por tricrómico de
Goldner y azul alciano, respectivamente). Los controles presentaban tejido fibroso.
Estos resultados sugieren que el colágeno puede mantener la sobrevivencia y/o la
expresión del fenotipo osteogénico y condrogénico en células ADAS in vivo.
Financiado por la Consejería de Salud, gestión IMABIS (TC 201.1.2/04 y TCRM
0012/2006), FIS (PI06/1855), Red TerCel, MEC (BIO 2006-03599) y PAI (CVI-217).
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Comunicación oral
CAPACITACIÓN CONDRO-OSTEOGÉNICA DE CÉLULAS
MADRE MESENQUIMÁTICAS PROCEDENTES DE MÉDULA
ÓSEA DE RATA CON rhBMP-2
S. Claros*, J.A. Andrades y J. Becerra. Laboratorio de Bioingeniería y
Regeneración Tisular (LABRET): Dpto. Biología Celular, Genética y
Fisiología. Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. Málaga. Tfno.: 952
131954. *E-mail: silviacg@uma.es
La rhBMP-2 es un fuerte inductor óseo y su expresión promueve la
elaboración de factores específicos de transcripción que intervienen en la
formación de hueso, en la diferenciación de osteoblastos, en la formación
de hueso osteocondral y en la neovascularización.
En este estudio evaluamos el efecto de la rhBMP-2 en células de médula
ósea de rata. Las células obtenidas de fémures de rata de 12 semanas se
cultivaron en DMEM 10% FCS. El subcultivo se realizó en placas de 100mm
que, al alcanzar el 70% de semi-confluencia, fueron tratadas con rhBMP-2
(100 ng/ml) durante 24 horas y ascorbato-2-fosfato, β-glicerol fosfato y
dexametasona durante 2 días. Después del período de inducción se analizó
la expresión de fosfatasa alcalina y la presencia de depósitos minerales (von
Kossa) en los cultivos in vitro, y se implantaron 106 células en cámaras de
difusión, en cámaras de matriz ósea desmineralizada y en piezas de
hidroxiapatita, bajo la piel de la espalda en ratas Wistar consanguíneas
durante 14, 28 y 56 semanas. Los implantes se sometieron a un estudio
histológico, histoquímico e inmunohistoquímico, que reveló la presencia de
condensaciones tisulares con características de matriz ósea y cartilaginosa.
Los resultados muestran que las células de la médula ósea, tras un pulso
de 24 horas de rhBMP-2 y 2 días con inductores, expresan marcadores de
células óseas y forman depósitos de fosfato cálcico in vitro, e in vivo son
capaces de formar hueso y cartílago.
Financiado por la Consejería de Salud, gestión IMABIS (TC 201.1.2/04 y TCRM
0012/2006), FIS (PI06/1855), Red TerCel, MEC (BIO 2006-03599) y PAI (CVI-217).
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Comunicación oral
NUEVAS ALTERNATIVAS AL TRASPLANTE DE ÓRGANO
ENTERO: DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE
MESENQUIMALES ADULTAS HACIA LINAJE HEPÁTICO
A. Bonora-Centelles, R. Jover, R. Talens-Visconti, J.V. Castell and M.J.
Gómez-Lechón. Unidad de Hepatología Experimental, Hospital La Fe,
Valencia. Tfno. 96 1983048. abonora_cen@hotmail.com
Existe una necesidad urgente de buscar alternativas al transplante de
órgano entero. El uso de “células madre” se considera actualmente un
método terapéutico muy atractivo para enfermedades metabólicas del hígado
y para el mantenimiento de la función hepática hasta la obtención de un
injerto adecuado para transplante. El objetivo de este trabajo es determinar
las condiciones para inducir la transdiferenciación in vitro de células madre
mesenquimales de tejido adiposo (ADSC) y de médula ósea (BMSC) a
linajes hepáticos. Las células BMSC se han obtenido de pacientes sometidos
a artroplástia y las células ADSC a partir de lipoaspirados. Se ha utilizado un
protocolo que consiste en la adición secuencial de factores de crecimiento,
citoquinas, hormonas y nutrientes en varias etapas (acondicionamiento,
diferenciación y maduración), tratando de reproducir las condiciones
durante el desarrollo embriológico del hígado. Para evaluar si las células
adquieren funcionalidad hepática, se determinó mediante RT-PCR la
expresión de genes marcadores hepáticos en comparación con células no
diferenciadas (citoqueratina 18 y 19, transtiretina, albúmina, α-fetoproteína,
CYP3A4 y 2E1, factores de transcripción hepáticos clave HNF4 y C/EBPβ;
y marcadores mesenquimales como THY1. Los resultados muestran que la
expresión de HNF4 y CEBPβ, albúmina y los CYPs 3A4 y 2E1 aumentan en
ambos tipos de células a partir del día 14 del proceso, mostrando diferencias
significativas con respecto a las células indiferenciadas. Para investigar la
relevancia de este hecho, transfectamos células indiferenciadas con vectores
adenovirales (Ad-CEBPβ) y analizamos sus efectos en la transición hacia
fenotipo hepático. Los resultados mostraron un incremento del CYP3A4 y un
descenso en la expresión del marcador mesenquimal THY1.
Los resultados indican que bajo ciertas condiciones las células MSC
pueden diferenciarse a linaje hepático in vitro. El tejido adiposo constituye
una fuente ideal para obtener una gran cantidad de células madre autólogas,
lo que representa una alternativa a los hepatocitos para terapia celular.
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Comunicación oral
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE PRECURSORES
NEURALES A PARTIR DE PIEL HUMANA ADULTA
N. Gago y A. Izeta*. Departamento de Células Madre Epiteliales. Fundación
Inbiomed. San Sebastián. Tfno.: (943) 309064. *aizeta@inbiomed.org
Estudios recientes han demostrado la existencia de células progenitoras
multipotentes [Skin-derived precursors (SKPs)] derivadas de la cresta neural y residentes en la dermis, que son capaces de auto-renovarse y diferenciarse a linaje neural (neuronas y glía) y mesodérmico (adipocitos y músculo
liso). Aunque en ratón se localizan en la papila dérmica de los folículos pilosos, todavía se desconoce el nicho de las SKPs humanas.
Nuestro objetivo es aislar y caracterizar el fenotipo y localización de las
SKPs humanas para su utilización en medicina regenerativa. Nos interesa
determinar su abundancia y capacidad de diferenciación dependiendo de la
edad del individuo -ya que las enfermedades neurodegenerativas cursan mayormente en la edad adulta- y de la zona donante, para optimizar la traslación de las mismas a la clínica.
Para ello se han procesado >50 prepucios humanos procedentes de operaciones de adultos (16-82 años) habiendose puesto a punto el cultivo, mantenimiento, proliferación y diferenciación de las SKPs. Estas células crecen
en suspensión formando agregados celulares esféricos que proliferan y se fusionan hasta alcanzar 100-150 μm de diámetro. Las esferas son positivas
para marcadores de células indiferenciadas, y no expresan marcadores de
células precursoras. Una vez disgregadas las células y sometidas a medios
de diferenciación, se obtienen buenos porcentajes de diferenciación a neuronas y músculo liso. En estos momentos, estamos analizando la abundancia relativa y fenotipo de las SKPs en relación a la edad del donante, sin
tener todavía resultados concluyentes.
Estos datos serán de gran importancia para la utilización de esta subpoblación de células en protocolos clínicos futuros. Las SKPs son a priori
una buena fuente para terapia celular dado el fácil acceso a las mismas y el
protocolo de purificación y diferenciación, relativamente simple.
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Comunicación oral
LA AUTORENOVACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS
MADRE MESENQUIMALES ESTÁ REGULADA
POR LA MAP KINASA ERK2
I. Cárcamo Orive, N. Tejados, A. Gaztelumendi, I. Ferrín,
J. Delgado y C. Trigueros.
Departamento de Células Madre Hematopoyéticas y Mesenquimales.
Fundación Inbiomed. Donostia-San Sebastián. Tfno.: (943) 309064.
*icarcamo@inbiomed.org
Las células madre mesenquimales (CMM) son una población celular
pluripotencial que es capaz de autorenovarse y dar lugar a distintos linajes
como el adipocítico, osteocítico o condrocítico, representando un buen
modelo para el estudio de las señales que gobiernan el crecimiento y
diferenciación de las células madre.
La ruta de ERK (extracellular signal-regulated kinase) juega un papel
crucial en diversas funciones celulares esenciales tales como la proliferación
y diferenciación en diferentes sistemas celulares. Para estudiar la función de
ERK1 y ERK2 en la autorenovación y diferenciación de CMM se utilizó la
tecnología del RNAi para inhibir la expresión de ambas proteínas.
Nuestros datos demuestran que la isoforma ERK2 es necesaria para la
proliferación de las CMM, mientras que ERK1 es prescindible. Dicha
inhibición es debida principalmente a una parada en la fase G0/G1 del ciclo
celular, no observándose ningún tipo de muerte celular inducible (apoptosis).
Por su parte aunque ERK1 no parece tener ningún efecto, la isoforma
ERK2 inhibe la diferenciación hacia el linaje adipocítico. Ensayos de
diferenciación dirigida demuestran que la capacidad adipogénica de las CMM
es dependiente de contacto celular a través de la isoforma ERK2, ya que su
inhibición permite la diferenciación adipogénica en ausencia de contacto
celular.
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RESÚMENES DE
LOS POSTERS
(Ordenados por sesiones)
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
MARCADO Y SEGUIMIENTO DE CÉLULAS MADRE IN VIVO
MEDIANTE EL USO DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES EN
EL PEZ CEBRA
Francisca Alcaraz-Pérez 1,2*, María Azucena López-Muñoz1, Victoriano
Mulero 1, María. L. Cayuela2.
1
Departamento de Biología Celular, Universidad de Murcia, 30100 Murcia.
Tfno: 968364964
2
Unidad de Cirugía Experimental. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.
30120 Murcia. Tfno: 968395328 *palcaraz@um.es
Aprovechando las ventajas que ofrece el pez cebra (Danio rerio) como
modelo para estudiar in vivo el desarrollo del cáncer, se ha utilizado la
longitud telomérica como marcador para identificar células madre y células
progenitoras (aquellas que presentan los telómeros más largos). La
identificación de las células madre in vivo nos permite estudiar su implicación
en cáncer (células madre cancerosas) que según numerosos estudios son
las responsables últimas del mantenimiento del cáncer y de la resistencia a
la quimioterapia. Para ello, estamos caracterizando la región promotora de
una proteína que se une al telómero de manera proporcional a la longitud
telomérica, TRF1 (telomeric repeat-binding factor 1). Con este promotor
hemos expresando la proteína TRF1 fusionada a la proteína amarilla
fluorescente (YFP) en líneas celulares con longitud telomérica conocida. La
fluorescencia se ha determinado mediante técnicas de citometría de flujo y
de microscopía para ver su correlación con la longitud telomérica.
Finalmente, se están generando peces transgénicos que expresen de
forma fisiológica TRF1-YFP para evaluar el uso de la longitud telomérica en
la identificación in vivo de las células madre y estudiar su papel en el
desarrollo de los tumores. La citada línea transgénica constituirá una
herramienta sin precedentes para evaluar el papel de las células madre en
el desarrollo del cáncer así como para el escrutinio de drogas antitumorales
y para la identificación de genes que regulen la longitud telomérica.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
EFECTO DE LOS FLAVONOIDES SOBRE LA PRODUCCIÓN DEL
FACTOR DE CRECIMIENTO DEL ENDOTELIO VASCULAR EN
CÉLULAS DE CÁNCER DE PULMÓN HUMANO
E. Ansóa, A. Zuazoa, M. Irigoyenb, E. Martínezb, A. Rouzautb y J.J. MartínezIrujoa*. aDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de
Navarra. Pamplona. bLaboratorio de Microambiente Tumoral. Centro de
Investigación Médica Aplicada. Pamplona. Tfno.: (948) 425600.
*jjmirujo@unav.es.
Los flavonoides constituyen una familia de compuestos polifenólicos de
origen vegetal que se incorporan al organismo mediante la dieta. Diversos
estudios epidemiológicos han puesto de relieve su efecto beneficioso contra
el cáncer. De hecho se ha demostrado que algunos de ellos, como
quercetina, fisetina o luteolina, tienen capacidad de inducir la apoptosis de
células tumorales. Otro aspecto menos estudiado, pero que puede ser
esencial en las propiedades anticarcinogénicas de los flavonoides es su
capacidad para inhibir la angiogénesis tumoral. Al someter las células a
condiciones de hipoxia se produce un aumento del factor de transcripción
inducible por hipoxia (HIF), que a su vez promueve la activación de un gran
número de genes. Entre ellos se encuentra el factor de crecimiento del
endotelio vascular (VEGF-A), que estimula la angiogénesis y la
linfangiogénesis tumoral.
En este trabajo hemos seleccionado un conjunto de 40 flavonoides
estructuralmente relacionados, y hemos analizado su efecto sobre la
proliferación, la viabilidad y la producción de VEGF-A de varias líneas de
cáncer de pulmón. Hemos encontrado que varios de ellos inhiben la
producción de este factor a concentraciones no citotóxicas. Para entender las
bases moleculares por las cuales inhiben la producción de VEGF-A y el
crecimiento tumoral hemos analizado su efecto sobre la expresión de HIF y
las vías de señalización implicadas. El conocimiento del mecanismo de
acción de estos compuestos y de las relaciones estructura-función de los
mismos, podría permitir el diseño de nuevos inhibidores de la angio y
linfanfiogénesis tumoral.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
EFECTO DEL BEXAROTENO SOBRE LA RUTA
DE SEÑALIZACIÓN p53/p73, EN LINFOMA CUTÁNEO
HUMANO DE CÉLULAS T
Nieto-Rementería N., Apraiz A., Boyano MD., Izu R., Pérez-Yarza G., DíazPérez JL., Asumendi A*. Departamento de Biología Celular e Histología.
Universidad del Pais Vasco. Leioa. Tfno.: (94) 6013004.
*aintzane.asumendi@ehu.es.
Los linfomas cutáneos de células T (CTCL) representan un grupo
heterogéneo de linfomas T asociados a la piel. Se ha aprobado
recientemente el uso del bexaroteno, retinoide sintético selectivo para
receptores RXR, en el tratamiento de estas patologías. Sin embargo, el
efecto del bexaroteno varía notablemente de unos pacientes a otros, por lo
que resulta imprescindible caracterizar su mecanismo de acción.
La activación de la ruta de señalización p53/p73 puede tanto frenar la
progresión del ciclo celular como inducir apoptosis. El bexaroteno induce ambos
procesos –si bien predomina la inhibición proliferativa-, en las líneas de CTCL
estudiadas: las líneas HH y Hut-78 (de sensibilidad alta y media respectivamente)
y la línea MJ (infectada con HTLV-1 y poco sensible al tratamiento). El bexaroteno
no induce cambios significativos en la expresión de p53, ni en su fosforilación en
el residuo Ser-46, implicado en la actividad proapoptótica. Sin embargo, en Hut78 se observa un claro incremento en el grado de fosforilación de p53 en Ser-15,
lo que favorece su unión a promotores responsables de frenar el ciclo celular. El
tratamiento no afecta a la actividad de MDM2, implicada la degradación de p53.
Sin embargo,en las líneas sensibles el retinoide aumenta los niveles de expresión
de p73, miembro de la familia p53 que puede desencadenar rutas supresoras de
tumores independientes de p53. Se ha descrito que tanto p53 como p73 inducen
la expresión de bax, que a su vez puede desencadenar alteraciones
mitocondriales que causan apoptosis tras la exposición a ciertos tratamientos.
Nuestros resultados demuestran un incremento en la expresión de bax tras el
tratamiento en las líneas sensibles, así como la translocación de bax desde el
citosol a la mitocondria, responsable de su activación.
En conclusión, nuestros resultados apuntan a que el bexaroteno actúa en
células de linfoma cutáneo regulando el ciclo celular a traves de una vía p53/p73
dependiente y que la apoptosis contribuye a su efecto anticarcinogénico.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
TGFB INDUCE EMT REVERSIBLE EN CÉLULAS FAO DE
HEPATOMA DE RATA.
E. Bertran, L.Caja, E. Navarro, A. Vinyals, A. Fabra I. Fabregat. Institut
d´Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL),Centre d´Oncologia
Molecular (COM), 08907 L´Hospitalet, Barcelona, Spain Tfno.: 93 260 77 75.
*ebertran@idibell.org.
El Factor de Crecimiento Transformante-beta (TGFb) regula el crecimiento de
los hepatocitos inhibiendo la proliferación e induciendo apoptosis. En resultados
previos del grupo observamos que el TGFb tiene un papel dual en células FaO
de hepatoma de rata pudiéndose observar tanto un efecto pro-apoptótico como
inductor de la progresión tumoral. Así, detectamos la muerte del 50% de estas
células transcurridas 48 h de la exposición a la citoquina, mientras que en las
células que sobreviven observamos cambios morfológicos que se pueden asociar
a una transición Epitelio-Mesénquima (EMT). Hemos establecido una línea celular
sometiendo a las células a una selección con una dosis elevada de TGFb y un
posterior mantenimiento con dosis bajas de la citoquina, a estas células las
llamamos TbT-FaO. Esta nueva línea mantiene una morfología mesenquimática
convirtiéndose, por otro lado, en resistente al TGFb en términos de muerte y de
parada del crecimiento. Al retirar el TGFb la EMT se revierte obteniendo de nuevo
células epiteliales y sensibles a la muerte por TGFb. Las TbT-FaO migran tanto
en un ensayo de huella como atravesando una matriz de colágeno IV y invaden
el matrigel en respuesta a diferentes medios condicionados actividad que las FaO
no fueron capaces de desencadenar. Cada vez más estudios ponen de
manifiesto el importante papel las quemoquinas, citoquinas con actividad
quimiotáctica, y sus receptores durante la metástasis tumoral. Las células FaO
que carecen de la capacidad de desencadenar metástasis, expresan bajos
niveles del receptor CXCR4 sin capacidad para responder a su ligando, SDF-1a.
En cambio, en estas células, tras sufrir un proceso de EMT (TbT-FaO) por efecto
del TGFb se induce la transcripción de este receptor. Observamos además la
localización del receptor en muchas de estas células de forma polarizada en el
frente de migración celular. El CXCR4 en TbT-FaO es activo ya que la exposición
a SDF-1a i nduce la activación de vías de señalización en las que Erks y
JNK/SAPK se ven implicadas, mientras que la adición al cultivo de un antagonista
específico del CXCR4, AMD3100, bloquea por completo la señalización.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
IDENTIFICACIÓN DE GENES REGULADOS POR VEGF
IMPLICADOS EN EL DESARROLLO DE METÁSTASIS
PULMONARES DE CÁNCER DE MAMA
R. Catena1, V. Segura2, E. Guruceaga2, I. Gil-Bazo1, J.-I. Huh3, O. GonzalezMoreno1, R. Dickson4, J. E. Green4 y A. Calvo1
1
Área de Oncología, CIMA y Departamento de Histología y A.P. 2Ceit and
Tecnun (1,2U. de Navarra, Pamplona). 3Lombardi Cancer Center,
Georgetown U. Washington DC. 4Laboratory of Cancer Biology and
Genetics, NIH (3,4: USA).
La metástasis es causa principal de muerte de los pacientes oncológicos.
La identificación de los mecanismos moleculares que controlan el proceso
metastático es esencial para el desarrollo de estrategias que impidan la
diseminación tumoral. En el presente estudio hemos comparado el potencial
metastático de ratones transgénicos MMTV-Myc/VEGF, con sobreexpresión
de Myc y VEGF en la glándula mamaria, con ratones MMTV-Myc. En el
primer grupo sólo se encontraron micrometástasis pulmonares, en 40% de
los animales. En cambio, en ratones MMTV-Myc/VEGF se detectó
micometástasis en un 90% de los ratones y macrometástasis en 40%.
Mediante análisis de microarrays identificamos la huella genética de tumores
primarios MMTV-Myc/VEGF que permite a estos tumores diseminarse en el
pulmón. Mediante análisis bioinformático se compararon estos perfiles con
perfiles genéticos de cáncer de mama metastático humano (GEO GSE2603),
obteniéndose un patrón común para Tenascina-C, (TNC) MMP-2, Colágeno
6A1, Manosidasa-a-1 y HLA-DPA1. El bloqueo de la TNC mediante
anticuerpos ó shRNA causó una disminución de la capacidad migratoria de
células metastáticas de cáncer de mama. El bloqueo de la expresión de TNC
in vivo produjo disminución significativa del volumen tumoral (50%, p<0.05)
y disminución de la capacidad metastática pulmonar. Nuestros resultados
demuestran que la sobreexpresión de VEGF es responsable de la alteración
de la expresión de numerosos genes relacionados con el microambiente
tumoral, lo cual facilita la diseminación metastática de las células de mama.
Uno de estos genes, TNC, favorece el crecimiento tumoral y la metástasis.
TNC podría considerarse por tanto como una nueva diana terapéutica contra
el cáncer de mama metastático.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
POTENCIACIÓN DEL EFECTO DE LA RADIOTERAPIA EN
CÁNCER DE PRÓSTATA MEDIANTE NUEVOS COMPUESTOS
ANTIESTROGÉNICOS
Roque Díaz1, Diego Serrano1, Oscar González-Moreno1, Paul Nguewa1, Raúl
Catena1, David Sherris2, Alfonso Calvo1
1
Laboratorio de Nuevas Dianas Terapéuticas, Área de Oncología, CIMA y
Departamento de Histología y A.P. Universidad de Navarra. Pamplona.
2
SherrisPharma, Inc. USA.
La radioterapia (RT) se emplea como tratamiento habitual en el cáncer de
próstata localizado. Estudios recientes han demostrado que el efecto de la RT
se puede potenciar mediante el bloqueo de diversas vías intracelulares, como
las de EGF, mTOR y VEGF. También se ha demostrado que algunos
compuestos antiestrogénicos, como el tamoxifeno, potencian el efecto
terapéutico de la RT.
En el presente trabajo hemos analizado el efecto radiopotenciador en
cáncer de próstata de dos nuevos derivados del estradiol con efecto
antiestrogénico y antitumoral: El 2-metoxiestradiol (2ME2) y el P300®
(SherrisPharma). El tratamiento de células PC-3 (células andrógeno
independientes de cáncer de próstata) con 2ME2 ó P300 produjo una
inhibición del crecimiento celular, con IC50s de 5 y 3 microM, respectivamente.
Dosis de radiación de 2, 4 y 8 Gy redujeron el crecimiento celular en un 45%,
75% y 90%, respectivamente, con respecto al control. La combinación de RT
con 2 microM de 2ME2 ó P300 aumentó el efecto antiproliferativo en un 50%
(aproximadamente), para todas las dosis de RT empleadas. Los ensayos
clonogénicos, de ciclo celular y apoptosis demostraron también un efecto
potenciador de la RT al añadir cualquiera de los dos fármacos.
Para los estudios in vivo se utilizaron modelos de xenotransplante, en los
que se utilizó una dosis única de RT de 6Gy, con o sin P300 (50 mg/Kg). El
P300 redujo el volumen tumoral en un 45% con respecto a los controles; la RT,
en un 55%; la combinación de ambas terapias redujo el volumen tumoral en
un 80%. Por lo tanto, nuestros resultados demuestran que los compuestos
antiestrogénicos 2ME2 y P300 potencian el efecto de la radioterapia en cáncer
de próstata.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
INFLUENCIA DE LA FAMILIA TRAF EN LA PROGRESIÓN
DEL CANCER DE PRÓSTATA
M. Royuela1, I. García-Tuñon1, C. Núñez-González1, P. Martínez-Onsurbe2,
R. Paniagua1 y B. Fraile1*. Dept. Biología Celular y Genética. Univ. Alcalá.
2
Dept. de Anatomía Patológica, Hospital Príncipe Asturias. Alcalá de
Henares. Madrid Tfno.: 91 8854798. *benito.fraile@uah.es.
INTRODUCCIÓN: Los factores asociados al receptor de TNF (TRAFs), tienen
como función activar factores de transcripción y proteínas quinasas. Esta familia
se compone de 6 miembros y de ellos, TRAF-2 y TRAF-6 se relacionan con
activación de NIK, componente de la ruta de activación de NF-kB. TRAF-2 es
miembro de la ruta de transducción de TNF-α que activa factores de transcripción
(AP-1 y NF-kB). Resultados previos de nuestro grupo en las mismas muestras
sugieren que la vía proapoptótica (AP-1) se encuentra desactivada y quizás
desviada hacia otra vertiente. Nuestro objetivo fue determinar la expresión de
TRAF-2, TRAF-6, NIK y su relación con la progresión del cáncer de próstata.
MATERIAL Y MÉTODOS: 20 próstatas normales (PN) y 78 de cáncer
(PC) (divididas en tres grupos: 14 de bajo, 42 de medio y 22 de alto Gleason)
fueron procesadas para inmunohistoquímica y Western-blot.
RESULTADOS: TRAF-2, TRAF-6 y NIK se localizaron siempre len el
citoplasma, expresándose en el 60%, 80% y 100% (respectivamente) de
muestras con PN. En PC, el porcentaje de muestras positivas se redujo al
aumentar el grado Gleason para TRAF-2 mientras que fue superior al 85%
para TRAF-6 y NIK. Mientras que la densidad óptica para TRAF-2 disminuye
en PC, para TRAF-6 y NIK aumenta significativamente en PC.
CONCLUSIÓN: La vía proliferativa mediada por TRAF-2 participa
escasamente en la activación de NIK, que estaría activado principalmente por la
vía de TRAF-6 en cáncer. NIK es un intermediario clave en la ruta de transducción
de la IL-1 y que finaliza con la activación de NF-kB, relacionado con la proliferación
celular. Por ello, la inhibición de NIK, podría tenerse en cuenta a la hora de buscar
nuevas dianas moleculares para frenar la progresión del cáncer de próstata.
AGRADECIMIENTOS: Este trabajo ha sido subvencionado mediante un Proyecto
de Financiación Puente de la Universidad de Alcalá (2007).
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
RELACIÓN DE DIFERENTES MIEMBROS DE LA FAMILIA IL-6
EN LA PROGRESIÓN DEL CANCER DE MAMA.
I. García-Tuñon1*, B. Fraile1, J.I. Busteros2, A. Zapico3, R. Paniagua1 y M.
Royuela1. 1Departamento de Biología Celular y Genética, Universidad de
Alcalá. 2Departamento de Anatomía Patológica y 3Departamento de
Ginecología y Obstetricia, Hospital Príncipe de Asturias. Alcalá de Henares.
Madrid. Tfno.: 91 8854798. *mar.royuela@uah.es.
INTRODUCCIÓN: La familia de la Interleuquina-6 (IL-6) está formada
por: IL-6, factor inhibitorio de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM), factor
neutrófico ciliar (CNTF), IL-11, cardiotrofina y neurotrofina. De ellos son IL6, OSM y LIF, los asociados tradicionalmente con la progresión tumoral.
Todos ellos utilizan gp-130 como parte de su complejo receptor. Nuestro
objetivo fue determinar la expresión de IL-6, LIF, OSM y gp-130, así como su
relación con la progresión del cáncer de mama.
MATERIAL Y MÉTODOS: Biopsias de 17 pacientes con patología
benigna y 62 con cancer (17 con tumor in situ y 45 con infiltrativo) fueron
procesadas para inmunohistoquímica y Western-blot.
RESULTADOS: En todos los casos, el porcentaje de pacientes positivos
aumentó en tumores respecto a patologías benignas. Dentro de los tumores,
el porcentaje fue mayor en tumores infiltrativos (74% en gp-130, 82.8% en IL6, 80% en LIF) que en in situ ( 22.6% en gp-130, 41.2% en IL-6 y 70.5% en
LIF). El porcentaje de pacientes positivos en OSM siempre fue del 100% en
ambos tipos de tumores)
CONCLUSIÓN: Aunque se han descrito funciones contradictorias para
gp130 en tumores, su escasa expresión en patologías benignas; el aumento
de expresión que sufre en tumores; la sobrexpresión de IL-6, LIF y OSM en
tumores infiltrativos; y que todos estos factores ejercen su función mediante
gp-130, hace pensar que éste podría constituir un punto crucial en el
desarrollo de tumores infiltrativos en el cáncer de mama. Por ello, podría ser
considerado como una diana terapéutica en la terapia del cáncer de mama.
AGRADECIMIENTOS: Este trabajo ha sido subvencionado mediante un Proyecto
de Financiación Puente de la Universidad de Alcalá (2007).
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
EL ÁCIDO METILSELENÍNICO (MSA) AUMENTA EL EFECTO
DEL ETOPÓSIDO EN LA INHIBICIÓN DEL CÁNCER
DE PRÓSTATA IN VIVO
Oscar González-Moreno, Diego Serrano, Paul Nguewa, Celia Prior, Alfonso
Calvo
Laboratorio de Nuevas Dianas Terapéuticas, Área de Oncología, CIMA y
Departamento de Histología y A.P. Universidad de Navarra. Pamplona.
El cáncer de próstata (CaP) es el tipo de cáncer más frecuente en
hombres y la segunda causa de muerte por cáncer en los países
occidentales. En la actualidad se están llevando a cabo ensayos clínicos
para determinar si las dietas enriquecidas en antioxidantes (como la vitamina
E y el selenio) resultan en una efectiva quimioprevención. El objetivo de
nuestro estudio fue determinar el efecto del Ácido Metilselenínico (MSA) y el
selenito sódico (Na2SeO3) en líneas celulares de CaP del modelo transgénico
C3(1)/Tag. Estas líneas celulares representan distintos estadios de la
progresión tumoral del CaP: Neoplasia Intraepitelial Prostática (PIN) (Pr111),
tumor invasivo (Pr14) y tumor metastático (Pr14C1). Se estudió la
citotoxicidad e inducción de apoptosis por parte de dichos compuestos,
mediante ensayos de MTT y activación de caspasa-3. Estos ensayos
demostraron que el MSA es muy efectivo en la inhibición de la proliferación,
inducción de apoptosis y disminución de los niveles de p-ERK1/2 y p-AKT en
las células tumorales, pero no en la línea no tumorigénica Pr111. Se
realizaron tratamientos combinatorios empleando bajas dosis de etopósido
o docetaxel (Taxotere®) y MSA, demostrando que el MSA aumenta
significativamente el efecto de la quimioterapia. Además, estudios in vivo en
modelos Xenograft utilizando la línea Pr14, demostraron una disminución
significativa (50%) del volumen tumoral con tratamientos de MSA con
respecto a los controles. La combinación MSA más etopósido produjo un
aumento muy significativo del efecto antitumoral del etopósido (VePesid®),
con una disminución del volumen tumoral del 80%. Estos resultados sugieren
un posible empleo del MSA en el tratamiento del CaP para potenciar el efecto
del etopósido.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
ESTUDIO DE NUEVOS MECANISMOS MOLECULARES
ANTITUMORALES Y ANTIANGIOGÉNICOS ACTIVADOS
POR EL 2-METOXIESTRADIOL
Paul Nguewa1*, Jung-Im Huh2, Roque Díaz1, Celia Prior1, Raúl Catena1,
Jeffrey E. Green2, Alfonso Calvo1
1
Laboratorio de Nuevas Dianas Terapéuticas, Área de Oncología, CIMA y
Departamentos de Microbiología (*) e Histología y A.P. Universidad de
Navarra. Pamplona.2Laboratory of Cell Regulation and Carcinogenesis. NCI,
NIH, Bethesda, MD, USA
El 2-metoxiestradiol (2ME2) es un metabolito natural del 17-beta
estradiol, cuya actividad antitumoral se ha comprobado en distintas líneas
celulares en cultivo y en modelos animales de xenotransplante. El 2ME2 es
un potente inhibidor de la proliferación celular e inductor de apoptosis. Los
mecanismos de acción del 2ME2 son diversos, incluyendo el bloqueo de la
despolimerización de microtúbulos, activación de las vías extrínseca e
intrínseca de la apoptosis y la inhibición de HIF-1alfa.
El objetivo de este trabajo fue la identificación de nuevas vías intracelulares
activadas por el 2ME2, responsables de sus efectos antiangiogénicos y
antitumorales. Para ello, se utilizó análisis de microarrays y PCR a tiempo real en
células de cáncer de mama tratadas con 2ME2. El 2ME2 alteró significativamente
la expresión 121 genes a las 6 horas de tratamiento y 50 a las 24h. Estos genes
estaban implicados en diversas vías intracelulares, como el ciclo celular,
apoptosis, modificación de la matriz extracelular y angiogénesis. El 2ME2 indujo
una fuerte disminución de la expresión de topoisomerasa IIa (Top2a) y tenascina
C (Tnc). Además, se encontró un aumento en la expresión de genes inductores
de apoptosis, como Bax y citocromo-C. El tratamiento con 2ME2 produjo también
represión de genes involucrados en la angiogénesis tumoral e invasión, como
los Inhibidores de la Diferenciación-1 y -3 (Id-1 e Id-3). Además, el 2ME2 indujo
la expresión de la metaloproteasa-12 (MMP12), proteasa que genera el factor
antiangiogénico Angiostatina. En efecto, el tratamiento con 2ME2 de células de
cáncer de mama resulta en la generación de Angiostatina, probablemente
mediado por MMP-12. En conclusión, el 2ME2 normaliza la expresión de genes
cuya expresión se altera durante el desarrollo tumoral y la angiogénesis.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
EXPRESIÓN DE VEGF-A EN CÁNCER DE PULMÓN
M.J. Pajares*, J. Agorreta, M.J. Larrayoz, J. Zulueta, N. Rodríguez-Spiteri,
M.D. Lozano, R. Pio , el consorcio de investigadores EU-ELC y L.M.
Montuenga. Dptos de Bioquímica, Histología, Neumología, Cirugía Torácica
y Laboratorio de Biomarcadores (División de Oncología, CIMA). Universidad
de Navarra. Pamplona. Tfno.: (948) 194700 *mpajares@unav.es.
La formación de nuevos vasos (angiogénesis) es un punto clave para el
crecimiento de los tumores, ya que garantiza el aporte de oxígeno y
nutrientes a las células tumorales y favorece el desarrollo de metástasis. El
factor de crecimiento del endotelio vascular A (VEGF-A) y sus receptores
juegan un papel muy importante en la angiogénesis de muchos tumores
sólidos. Sin embargo, en el caso del cáncer de pulmón la función de este
factor es controvertida. A pesar de esta controversia la FDA americana ha
aprobado el uso de el anticuerpo anti VEGF como tratamiento en segunda
línea contra el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC). Ante este hecho,
el esclarecimiento de la función de este factor y sus receptores en el cáncer
de pulmón es necesario. Para ello se han analizado muestras de 301
pacientes con estadios iniciales de NSCLC y recogidos en el ámbito del
proyecto europeo “The use of molecular biomarkers in early lung cancer
detection” (EU-ELC; V Programa Marco). Según su estado de salud a los 12
meses de la cirugía, estos pacientes se han dividido en dos grupos:
pacientes sanos y pacientes que desarrollaron metástasis. Se utilizaron
técnicas inmunocitoquímicas para la detección de las proteínas VEGF,
VEGFR-1, VEGF-R2, CD34 (marcador de vasos sanguíneos) y podoplanina
(marcador de vasos linfáticos). Se observó que la expresión de VEGF no
estaba relacionada con alta densidad microvascular (MVD) y/o linfática (LAD)
en estos pacientes. Estos resultados sugieren que VEGF-A no está implicado
en la angiogénesis en estadios tempranos de NSCLC. Asimismo, se ha
estudiado la asociación entre la expresión de VEGF y sus receptores y la
progresión de la enfermedad. Por último, mediante estadística multivariante,
se ha determinado el valor pronóstico de la expresión de VEGF y sus
receptores en estadios iniciales de cáncer de pulmón no microcítico.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
RELACIÓN DE ADN DE VPH Y P16INK4a EN ADENOCARCINOMA
CERVICAL
C. Pérez Menéndez*1, J. Velasco Alonso1,R. Hernandez2 1.Unidad de
Epidemología Molecular del Cáncer.Instituto Universitario de Oncología del
Principado de Asturias (IUOPA).Telf:985123000/24043.2.Laboratorios CyT.
Avilés. *crisperez81@homail.com.
Durante la última década, estudios epidemiológicos, apoyados por
técnicas moleculares, identificaron la infección por ciertos tipos de virus del
papiloma humano (VPH) como causa necesaria para el desarrollo de cáncer
cervical, considerándose actualmente una enfermedad de transmisión sexual
y aceptándose el papel del virus del papiloma humano como el inductor de
la carcinogénesis.El gen p16INK4a es un gen oncosupresor que está inactivado
funcionalmente en muchos tumores. No obstante se ha observado una
marcada regulación por incremento de la proteína p16INK4a y, por tanto, una
elevada sobreexpresión en las células epiteliales cervicales competentes
para la replicación, donde las oncoproteínas del papilomavirus de alto riesgo
(VPH AR) comienzan su proceso de transformación celular, tal incremento es
debido a que la expresion de p16INK4a esta regulada por un feed back (-) pRb
dependiente, siendo pRb inactivada por ciertas oncoproteínas virales de VPH
AR en el proceso de oncogénesis.
Una vez demostrado que tanto la infección persistente producida por
VPH AR como la sobreexpresión de la proteína p16INK4a son marcadores
excelentes de displasia, en este estudio queremos determinar la relación
existente entre la detección de ADN de VPH AR mediante PCR y la detección
de p16INK4a mediante técnicas de inmunohistoquímica a partir de tejidos de
adenocarcinomas fijados en formol e incluidos en parafina.
De los 21 casos a estudiar, 20 fueron positivos para p16INK4a (95,23%), 16
con patrón difuso (76,19%) y 4 (19,04%) focal. El caso negativo fue ADN
VPH positivo.Por otra parte, de los 20 casos positivos para p16INK4a,19 casos
fueron ADN VPH positivos y dos indeterminados.El genotipo que se detecta
con mayor frecuencia es el genotipo 18 aunque la frecuencia del genotipo 16
es similar.
Trabajo financiado por el proyecto FIS (02/1744).
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
CÉLULAS DIFERENCIADAS REPROGRAMADAS POR ESTRÉS
A PROLIFERACIÓN Y EMBRIOGÉNESIS: UNA HERRAMIENTA
PARA MEJORA DEL OLIVO
Solís MT1, Bueno MA2, Pintos B2, Risueño MC1, Testillano PS1
1
Centro de Investigaciones Biologicas. CSIC. Ramiro de Maeztu 9, 28040
Madrid.
2
CIFOR-INIA, Lab. Biotecnología Forestal. Madrid.
E-mail: testillano@cib.csic.es
Bajo condiciones de estrés, el polen en diferenciación puede cambiar su
programa de desarrollo gametofítico reprogramándose hacia proliferación y
embriogénesis, dando lugar a una planta doble-haploide, de gran interés en
mejora vegetal. En árboles, aunque su aplicación ha sido más limitada, el
sistema ofrece unas ventajas únicas para la regeneración rápida de nuevas
líneas isogénicas. Recientemente se ha desarrollado en olivo, cultivo de
gran interés económico, un sistema in vitro para inducir la reprogramación de
microsporas hacia embriogénesis (Bueno et al. 2006), obteniéndose por
primera vez estructuras multicelulares y proembriones derivados de polen.
En este trabajo se han analizado los cambios en los compartimentos
celulares durante las primeras etapas del proceso y los sucesos metabólicos
asociados al cambio de programa, identificándose marcadores celulares de
la reprogramación a embriogénesis. Se realizó un estudio citoquímico e
inmunocitoquímico para localización de componentes citoplásmicos
(almidón, lípidos, RNA), nucleares (DNA) y de pared celular (celulosas,
pectinas esterificadas y no esterificadas). Los resultados muestran que los
principales cambios afectan al núcleo, sustancias de reserva (amiloplastos y
lípidos), vacuolas y pared celular, constituyendo marcadores del proceso,
además de proporcionar los primeros datos sobre las bases celulares del
proceso de reprogramación celular en una especie leñosa de interés
agroalimentario en la cual este proceso no ha sido estudiado.
Financiado por proyectos MEC, BFU2005-01094 y AGL2005-05104.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
CENTRAL ROLE OF HER3/ERBB3 IN THE INVASIVENESS OF
PROSTATE EPITHELIAL CELLS TRIGGERED
BY NEUREGULIN-1 AND EPIDERMAL GROWTH FACTOR
M. Soler, P. L. Fernández y T. M. Thomson. IBMB-CID-CSIC, Barcelona;
Hospital Clínic, Barcelona. Tfno: 936004100
HER3 (ERBB3) is a member of the EGFR receptor tyrosine kinase family
that lacks intrinsic kinase activity. Binding of neuregulins to HER3 causes its
heterodimerization with HER2 and trans-phosphorylation of HER3. The
HER3-HER2 dimer is a functional unit that promotes cell growth, survival,
migration, invasiveness and angiogenesis.
We report the majority of primary prostate cancers express abnormally
high levels of HER3, but not HER2 or EGFR.
In culture, in the presence of either nrg-1 or EGF, overexpression of
HER3 caused enhanced invasiveness of prostate epithelial cells. The
increased invasiveness dependent on HER3 overexpression and triggered
by nrg-1 required HER2, but not EGFR, whereas, reciprocally, that triggered
by EGF required EGFR, but not HER2. Upon exposure to nrg-1, HER3 was
trans-phosphorylated by HER2, and, in the presence of EGF, HER3 was
rapidly trans-phosphorylated by EGFR.
Thus, HER3 overexpression plays a pivotal role in the augmented
invasiveness triggered by ligand-specific activation of either HER2 or EGFR,
suggesting that, in prostate cancer, HER3 may be a preferred therapeutic
target over other members of this receptor family.
112
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
BÚSQUEDA DE NUEVOS BIOMARCADORES
RELACIONADOS CON EL METABOLISMO DEL ARN
EN CARCINOGÉNESIS PULMONAR
I. Vallés*, V. Segura, MJ. Pajares, D. Blanco, A. Rubio, LM. Montuenga y R.
Pío. Lab. de Biomarcadores. CIMA. Universidad de Navarra. Pamplona.
Tfno.: (948) 194700. *ivalles@unav.es.
El cáncer de pulmón es una de las neoplasias con mayor tasa de
mortalidad en los países occidentales. Un diagnóstico en fases tempranas de
la enfermedad mejora sensiblemente su supervivencia. Por tanto, resulta de
interés disponer de biomarcadores para su detección precoz. Durante el
proceso de carcinogénesis, las células tumorales sufren diversas alteraciones
moleculares que desregulan algunos aspectos clave de la biología celular. Uno
de los mecanismos afectados es el procesamiento del ARN. Existen numerosos
datos experimentales que sugieren que este mecanismo se ve frecuentemente
afectado en cáncer y más concretamente en cáncer de pulmón.
En este estudio hemos identificado genes relacionados con el metabolismo del
ARN que se expresan de forma diferente en el tejido tumoral y el tejido normal de
pulmón. Se analizaron tres experimentos de microarrays de expresión en muestras
de cáncer de pulmón (principalmente adenocarcinomas y carcinomas
escamosos). Se realizó, para cada base de datos y tipo histológico, un ANOVA con
un nivel de significación del 1% para obtener genes cuya expresión normalizada
fuera distinta entre muestras normales y tumorales y que además estuvieran
relacionados con el metabolismo del ARN. Se seleccionaron 10 genes, 9 con una
expresión significativamente mayor en los tumores y 1 con una expresión menor.
Los resultados se validaron con una cuarta base de datos. A continuación, la
expresión diferencial de estos genes se confirmó por PCR a tiempo real en una
batería de líneas celulares de cáncer de pulmón y en una serie independiente de
pacientes con adenocarcinoma o carcinoma escamoso de pulmón.
En conclusión, hemos identificado una serie de candidatos a
biomarcadores diagnósticos relacionados con el metabolismo del ARN cuya
expresión parece estar alterada en cáncer de pulmón en relación con su
expresión en tejido pulmonar sano.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
PROCESOS INVASIVOS Y AUTOFÁGICOS EN LA GLÁNDULA
DE HARDER DE HÁMSTER SIRIO
I. Vega-Naredo, C. Tomás-Zapico, B. Caballero, C. Huidobro-Fernández, C.
Soria-Valles, D. Tolivia, MJ Rodríguez-Colunga y A. Coto-Montes*.
Departamento de Morfología y Biología Celular. Universidad de Oviedo.
Asturias. Tfno.: 985102779. *acoto@uniovi.es.
La Glándula de Harder (GH) de hámster sirio ha suscitado un gran
interés científico debido a la alta acumulación de porfirinas que sufre, ya que
los procesos de fotorreaccion en que estos compuestos están implicados al
ser la GH accesible a la luz, provocan unos altísimos niveles de estrés
oxidativo que esta glándula sufre sin comprometer su integridad.
Los estudios desarrollados por nuestro laboratorio nos han permitido
concluir que la GH de hámster sirio ha desarrollado dos mecanismos
complementarios que le permiten continuar con su fisiología normal.
Por un lado ha desarrollado procesos autofágicos de igual intensidad en
ambos sexos. Los datos a microscopía electrónica muestran abundantes
mitocondrias y retículo endoplásmico dentro de una amplia variedad de
vacuolas. Estos resultados fueron corroborados por western blot de la
cadena ligera 3 (LC3), marcador ideal de procesos autofágicos ya que la
LC3 se transforma en LC3-I y parte de esta proteína modificada se convierte
en LC3-II que se localiza únicamente en las membranas autofagosomales.
El segundo mecanismo encontrado fueron los procesos invasivos
desarrollados por esta glándula. Estos procesos, se caracterizan por
desorganización acinar, obliteración de la luz, liberación de células
glandulares al tejido conectivo, pérdida de relación núcleo-citoplasma y
eventual intravasación. Estas características morfológicas son dependientes
del sexo ya que muestran una mayor frecuencia en hembras. Estos
resultados han sido corroborados por los estudios de actividad y expresión
de catepsina H, superiores en hembras que en machos.
Ambos procesos son inherentes a la GH y no parecen tener efecto en el
resto de los órganos del animal. Recientemente se ha hipotetizado sobre una
relación inversa entre autofagia y cáncer. La presencia de ambos procesos de
forma simultánea en la GH facilitaría el estudio de la relación entre ellos.
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PROLIFERACIÓN, DIFERENCIACIÓN CELULAR Y CÁNCER
Póster
LA MITOCONDRIA COMO DIANA CELULAR DEL DICUMAROL,
UN INHIBIDOR DE QUINONA REDUCTASAS QUE MUESTRA
ACTIVIDAD ANTITUMORAL
D. González-Aragón, J. Ariza y J.M. Villalba*. Departamento de Biología
Celular, Fisiología e Inmunología. Universidad de Córdoba. Córdoba. Tfno.:
(957) 218595. *jmvillalba@uco.es.
El dicumarol es un anticoagulante natural cuya actividad mejor
caracterizada es la inhibición de la NAD(P)H:quinona oxidorreductasa 1
(NQO1). Este compuesto produce un incremento significativo en la
generación celular de superóxido, e inhibe el crecimiento de las células de
cáncer de páncreas, habiéndose propuesto como posible agente antitumoral.
En nuestro Grupo hemos estudiado el mecanismo a través del cual el
dicumarol ejerce sus efectos sobre células de leucemia mielocítica humana
HL-60, ya que nuestros resultados previos indican que estos efectos pueden
ser independientes de la inhibición de NQO1.
El objetivo de nuestro estudio ha sido el comprobar la hipótesis de que la
mitocondria puede ser una diana preferente del dicumarol en las células HL-60.
De acuerdo con esto, el dicumarol incrementó los niveles de superóxido en las
células HL-60, pero no en células deficientes en la función mitocondrial obtenidas
a partir de esta línea. Además, el dicumarol produjo una inhibición de la actividad
de los complejos mitocondriales II, III y IV in vitro. El uso de distintos inhibidores
y efectores de la respiración mitocondrial nos ha permitido concluir que el
incremento de superóxido que tiene lugar en las células tratadas con dicumarol
se debe a la estimulación del flujo electrónico inverso en el complejo II.
Otro efecto del dicumarol sobre las células HL-60 es la producción de
importantes alteraciones en la progresión a lo largo del ciclo celular, con un
notable incremento de la población celular en la fase S. Este efecto tampoco
se debe a la inhibición de NQO1, sino a la inhibición de la síntesis
mitocondrial de pirimidinas. Nuestros resultados demuestran que la posible
actividad antitumoral del dicumarol se debe a una interferencia de la función
mitocondrial de las células.
Agradecimientos – Ministerio de Educación y Ciencia (BFU200500137/BMC), Junta de Andalucía (CVI-276) y Universidad de Córdoba.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
MIGRACIÓN DE LAS CÉLULAS MICROGLIALES EN CULTIVOS
ORGANOTÍPICOS DE RETINA EMBRIONARIA DE CODORNIZ
M.C. Carrasco*, J.L. Marín-Teva, M. Tassi, A.M. Santos, R. Calvente, M.A.
Cuadros, D. Martín-Oliva y J. Navascués. Dpto. de Biología Celular. Facultad
de Ciencias. Universidad de Granada. Granada. Tfno.: (958) 243232.
*mcsierra@ugr.es.
En la retina de embriones de codorniz, las células microgliales ameboides
siguen un patrón de migración característico, que tiene lugar en etapas del
desarrollo muy bien definidas. Así, estas células entran en la retina desde la
cabeza del nervio óptico y base del pecten (CNO/BP) entre 7 y 16 días de
incubación (E7-E16) y migran tangencialmente sobre su superficie vítrea en
dirección centro-periférica (Navascués et al., 1995; Marín-Teva et al., 1998).
Desde E9 hasta la mitad de la primera semana post-eclosión, las células
microgliales migran radialmente, en dirección vítreo-escleral, para alcanzar
las capas plexiformes interna y externa, en las que se diferencian para dar
microglía ramificada (Navascués et al., 1995; Marín-Teva et al., 1999).
Con el fin de profundizar en el estudio de los mecanismos celulares
implicados en la migración de estas células hemos puesto a punto un modelo
experimental in vitro. Se utilizaron explantes de retina de embriones de codorniz
de E7, E8 y E9 que fueron matenidos en cultivo desde 1 hora hasta 10 días.
Hemos demostrado que, independientemente de la edad de partida, las células
microgliales en estos explantes eran capaces de entrar en la retina desde la
región de la CNO/BP y migrar tangencialmente en la parte vítrea de ésta
mostrando una morfología alargada y polarizada, similar a la observada en
retinas in vivo. Además tras diferentes tiempos en cultivo y bajo ciertas
condiciones experimentales las células microgliales también migraban
radialmente hacia niveles más esclerales para alcanzar la capas plexiforme
interna y externa retinianas. El análisis de montajes totales y secciones
histológicas de los explantes cultivados ha revelado que la organización de las
capas retinianas, la expresión de factores de transcripción como Islet-1, la
distribución de tenascina en las capas plexiformes y la morfología de las células
de Müller eran semejantes a las de retinas de edades equivalentes in vivo.
Trabajo financiado por el MEC (Proyecto BFU 2004- 01209)
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
EFECTO OXIDATIVO CEREBELAR POR EXPOSICIÓN A ÁCIDO
δ-AMINOLEVULÍNICO. CUESTIONABLE EFECTO DE LA
MELATONINA
C. Huidobro Fernández, I. Vega-Naredo, B. Caballero, V. Sierra-Sánchez,
C. Soria-Valles, D. Tolivia, M. J. Rodríguez-Colunga y A. Coto-Montes.
Departamento de Morfología y Biología Celular. Universidad de Oviedo.
Tfno.: 985102779. chuidobro83@hotmail.com
La acumulación de ácido δ-aminolevulínico (ALA), como la que se
produce durante la Porfiria Aguda Intermitente, es una fuente endógena de
Especies Reactivas del Oxígeno, que puede ocasionar importante daño
oxidativo en macromoléculas. Así mismo, el ALA es capaz de atravesar la
barrera hematoencefálica produciendo daños en el encéfalo en general y en
el cerebelo en particular dando lugar a síntomas neurológicos, como
convulsiones.
La melatonina (MEL) es una hormona pineal implicada en múltiples
procesos fisiológicos y cuyos efectos beneficiosos sobre las patologías
asociadas al estrés oxidativo, debido a su función antioxidante, han sido
descritos en los últimos años.
En este estudio, se utilizaron cerebelos de hámster sirio (Mesocricetus
auratus) bajo cuatro condiciones experimentales: control, MEL, ALA,
ALA+MEL; durante uno y dos meses de tratamiento. Se valoró el daño
oxidativo en proteínas, lípidos y ADN y la actividad de la Catalasa y de la
Superóxido Dismutasa como índice del sistema antioxidante.
Al cabo de un mes, la MEL redujo el daño en lípidos y proteínas. Por el
contrario, el ALA produjo un claro aumento del daño oxidativo con respecto
al grupo control. Al cabo de dos meses, la administración crónica de MEL se
tradujo en un aumento del daño respecto al control aunque la actividad de los
enzimas antioxidantes también aumentó de manera significativa. En ninguno
de los casos el daño inducido se aproximó al observado en ALA.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
DEFECTS IN NMDA RECEPTOR ENDOCYTIC TRAFFICKING
CAUSED BY AGGREGATION OF MUTANT HUNTINGTIN
Sonia Marco1, Jesús Torres-Peraza2, Jordi Alberch2 and Isabel PérezOtaño1. 1Dpt. of Neurosciences, CIMA, Pamplona, Spain, 2Dept. Biologia
Cel.lular i Anatomia Patologica, Facultat de Medicina. IDIBAPS. Univ. de
Barcelona, Spain. Tfno.: (948) 194700 x2010. smarcom@unav.es.
Recent studies have implicated selective alterations in the responses of
NMDA receptors (NMDARs), in the cell specific death observed in mouse
models of Huntington’s disease (HD). Disruption of NMDAR transmission
may also account for cognitive and psychiatric impairment of HD patients.
How mutations in huntingtin (htt) are linked to alterations in NMDAR function
remains unclear. We have recently discovered that one of the htt-interacting
proteins, PACSIN1/syndapin 1, behaves as an endocytic adaptor for
NMDARs by targeting the novel NMDAR subunit NR3A (Nature
Neuroscience, 9, 611, 2006). Interestingly, the interaction of PACSIN1 with htt
is repeat-length dependent and is enhanced with mutant htt (Hum Mol Genet.
11, 2547, 2002). Thus, we hypothesized that mutant htt might disrupt NMDAR
endocytic trafficking by sequestering PACSIN1 into cellular aggregates,
leading to enhanced NMDAR surface expression, synaptic dysfunction and
increased excitotoxicity. Our results show that, indeed, N-terminal fragments
of mutant htt transfected into cultured striatal neurons sequester PACSIN1,
but also other endocytic proteins such as dynamin I, into cytoplasmic and
neuritic but not nuclear aggregates. Sequestration results in a significant
redistribution of PACSIN1 and dynamin I from neuronal processes to the
soma. Defects in endocytic protein expression and localization seem to
predominantly affect the trafficking of NMDARs, at least at early stages, as
they are accompanied by significant accumulation of NR3A-containing
NMDARs at the neuronal plasma membrane without concomitant alterations
in general endocytic capacity or surface expression of other glutamate
receptor subunits such as GluR1. Consistent with in vitro data, R6/1 mice
expressing mutant htt with 115 CAG repeats display progressively reduced
PACSIN1 and increased NR3A levels in the striatum and cortex, principal
regions affected in HD, without general alterations in other synaptic proteins
or glutamate receptors.
FUNDING: Hereditary Disease Foundation (to I.P.O.)
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
NUEVO MÉTODO AUTOMÁTICO PARA EL ANÁLISIS
MORFOMÉTRICO DE NERVIOS UTILIZANDO IMAGE J
E. Martínez Pinilla*, C. Ordóñez Camblor, C. Pérez-Carbajales, A. Navarro
Incio, J. Tolivia. Departamento de Morfología y Biología celular. Universidad
de Oviedo. Asturias. Tfno.: (985) 102773. *UO80040@uniovi.es
El estudio de las patologías del sistema nervioso periférico requiere a
menudo el análisis morfométrico de sus fibras como complemento de otros
estudios histopatológicos. Actualmente para la realización de estos análisis
podemos adoptar tres estrategias diferentes. Los métodos manuales
consistentes en mediciones directas sobre la sección y los semiautomáticos
que utilizan sistemas computerizados con la participación imprescindible del
experimentador, resultan a menudo tediosos y consumen mucho tiempo
además de que la fatiga del operador y la subjetividad de sus decisiones
suponen una importante fuente de errores. Los métodos automáticos
basados en programas de análisis de imagen sin la intervención del
experimentador son más rápidos, sin embargo, tienen problemas para
discriminar las fibras mielínicas mas próximas, utilizan muestreos aleatorios
no siempre representativos del total de la sección y la mayoría requieren
equipos especializados con programas de alto coste y complicados de
utilizar.
En este trabajo describimos un sencillo método automático para el
análisis morfométrico de secciones de nervios, utilizando un programa de
libre difusión como es el Image J, exponiendo los resultados obtenidos al
aplicarlo al estudio de secciones de nervios ciáticos procedentes de ratones
salvajes y Knock-out para la apolipoproteína D.
Los resultados muestran que el método descrito permite el estudio
morfométrico de secciones completas de nervios periféricos, de manera
rápida y fiable con una perdida mínima de fibras e incluso discriminando
aquellas que se encuentran muy próximas entre si. Todo ello de manera
totalmente automatizada, mediante la utilización de un programa de bajo
coste y fácil aplicación que hace factible la utilización de este sistema de
manera rutinaria en cualquier laboratorio.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
RELACIÓN ENTRE LA APOLIPOPROTEÍNA D Y EL 17-β
ESTRADIOL EN UNA SITUACIÓN DE ELEVADO ESTRÉS
OXIDATIVO EN LA LÍNEA CELULAR 1321-N1
C. Ordóñez Camblor*, E. Martínez Pinilla, C. Pérez-Carbajales, R. BajoGrañeras, A. Navarro Íncio y J. Tolivia Fernández. Departamento de
Morfología y Biología Celular. Universidad de Oviedo. Asturias. Tfno.: (985)
102773. * c_ordo@hotmail.com
Los estrógenos son la principal hormona sexual femenina, pero
actualmente se les atribuye también un importante papel neuroprotector
mediante mecanismos a largo plazo mediados por su unión al receptor
aumentando la transcripción de determinados genes, o bien actuando como
antioxidante por su analogía con la vitamina E. Recientes estudios muestran
como la administración de estradiol en ratas menopaúsicas mejora la
actividad de los enzimas antioxidantes. La apolipoproteína D (apo D)
pertenece al grupo de las apolipoproteínas plasmáticas pero también se
expresa en gran variedad de tejidos, observándose un aumento de la
expresión de la misma en el sistema nervioso durante el envejecimiento y en
determinadas condiciones patológicas caracterizadas por un elevado estrés
oxidativo como es el caso de la enfermedad de Parkinson, el Alzheimer o la
esquizofrenia. Esto hace que se le atribuya un posible papel neuroprotector.
Basándonos en la capacidad neuroprotectora tanto de los estrógenos
como de la apo D y en el hecho de que el promotor de la apo D presenta
elementos reguladores de respuesta a estrógenos, nos planteamos un
estudio inmunocitoquímico de expresión de apo D en la línea celular 1321N1 procedente de un astrocitoma humano en condiciones normales, tras la
adición de determinadas dosis de 17-β estradiol, al inducir estrés oxidativo
mediante la adición de paraquat, y al combinar ambos tratamientos.
Los resultados obtenidos cuando las células no están sometidas a una
situación de elevado estrés oxidativo reflejan un aumento de la expresión de
apo D directamente proporcional a la concentración de estrógenos aplicada.
Al añadir paraquat se observa un aumento en la expresión de apo D
independiente de la adición de 17-β estradiol.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
EFECTO DEL TRATAMIENTO A LARGO PLAZO CON 17betaESTRADIOL EN EL MANTENIMIENTO DE LA INTEGRIDAD
HIPOCAMPAL
C. Pérez-Carbajales, A. Alonso, C. González, A. Navarro, C. Ordóñez, E.
Martínez y J. Tolivia. Departamento de Morfología y Biología Celular.
Universidad de Oviedo. Oviedo. 985102774. perezcristina@uniovi.es
Durante el envejecimiento, una serie de cambios morfológicos y fisiológicos
acontecen en el cerebro de todos los mamíferos, donde el tipo celular más
severamente afectado es la glía. Los astrocitos se multiplican y se vuelven reactivos
al experimentar un aumento en el grosor de sus prolongaciones. A nivel morfológico,
uno de sus rasgos característicos es el incremento en el contenido de la proteína
mayoritaria del citoesqueleto astroglial, la proteína glial fibrilar ácida (GFAP).
Numerosos trabajos han demostrado que las hormonas sexuales
desempeñan un importante papel en la progresión del envejecimiento, habiendo
sido especialmente estudiados los estrógenos. Esta hormona, que ejerce sus
acciones bien a través de la unión con su receptor, el cual actúa como un factor de
transcripción o bien a través de su unión a receptores de membrana,
desempeñando a través de esta ruta acciones rápidas, lleva a cabo su función
neuroprotectora. En particular, se localizan receptores de estrógenos en el
hipocampo, existiendo una regulación de la síntesis del receptor por su ligando. En
ratas, se ha visto que en los días previos al estruo cuando la capacidad sexual
alcanza su cenit, existe un incremento significativo en la densidad de espinas
dendríticas hipocampales.
En este trabajo nos hemos propuesto el estudio inmunohistoquímico de las
características citoarquitectónicas de las neuronas hipocampales a lo largo del
proceso de envejecimiento en tres grupos de animales: ratas control,
ovariectomizadas y ovariectomizadas a las que se ha administrado terapia
hormonal sustitutiva. Hemos estudiado además la presencia y distribución del
receptor de estrógenos y de la proteína glial fibrilar ácida en esta zona telencefálica.
Según nuestras observaciones, existe un incremento de la gliosis edaddependiente, siendo más significativo en ausencia del 17β-estradiol. Aunque no se
observan diferencias significativas en cuanto a la densidad celular, la morfología
celular en presencia de la hormona parece mejor conservada.
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
MOLECULAR SIGNALS CONTROLLING THE ENDOCYTOSIS
AND SORTING OF NR3A-CONTAINING NMDARs
E. Saint-Michel, I. López-Garcia and I. Pérez-Otaño*. Laboratorio de
Neurobiología Celular, Departamento de Neurociencias, Centro de
Investigación Médica Aplicada (CIMA), Universidad de Navarra, Pamplona.
Tfno.: (948) 194700 ext 2010. *otano@unav.es.
NR3A subunits are non-conventional members of the NMDA receptor
(NMDAR) subunit family and have the potential to modulate NMDARdependent synaptic plasticity by altering both the calcium permeability and
magnesium sensitivity of the receptor complexes. We have recently shown
that their functional expression is regulated by endocytosis and reported a
role for the multifunctional adaptor PACSIN1 in facilitating NR3A endocytosis
in neurons. However, the molecular signals which mediate the endocytosis of
NR3A-containing NMDARs remain unclear.
To map potential endocytic signals in NR3A, we fused different fragments
of the NR3A intracellular carboxy-terminal domain to the interleukin 2α
receptor (Tac) and assessed their endocytic abilities. We found that the NR3A
C-terminus contains an autonomous endocytic signal that drives clathrinmediated endocytosis. Internalized Tac-NR3A accumulates in recycling
endosomes but seems to be excluded from late endosomes. Using
deletion/mutagenesis studies, we identified a membrane proximal tyrosinebased signal (YWL) which is sufficient and necessary for NR3A
internalization. This motif is conserved in NR3A and NR3B subunits. Further,
we found that the adaptor protein PACSIN1, apart from modulating
endocytosis, modifies the sorting or kinetics of NR3A accumulation into
recycling compartments through motifs independent of the YWL endocytic
signal. Current studies are directed to define the underlying endocytic
mechanisms and understand the role of PACSIN1 on NR3A receptor
recycling and sorting.
Funding: Marie Curie IRG, NARSAD Young Investigator Award and
Hereditary Disease Foundation (to I.P.O.).
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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NEUROBIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
EL TRATAMIENTO CON GH Y GHRP-6 REVIERTE LA
HIPOMIELINIZACIÓN DEL CEREBRO DE RATAS VIEJAS
M.Sánchez-Grande*,F.Sánchez-Franco1,N.Palacios,I.Sánchez y
L.Cacicedo.Servicio de Endocrinología, Hospital Ramón y Cajal y 1
Hospital Carlos III. Madrid, Tlf (91-3368549) *hedera79@hotmail.com.
El envejecimiento se acompaña de un declinar de la hormona de
crecimiento (gh). Entre los cambios cerebrales asociados al envejecimiento
está la hipomielinización. Previamente hemos observado que gh y el
secretagogo de gh, ghrp-6, revierten ciertas alteraciones cerebrales
relacionadas con el envejecimiento. Además, encontramos que la gh
incrementa el número de oligodendrocitos. El presente trabajo pretende
investigar si la gh y/o el ghrp-6 revierten la hipomielinización del snc en la rata
vieja, y dilucidar el posible papel mediador de igf-i en esta acción.
Se emplearon ratas Wistar macho adultas jóvenes (3 meses) y viejas (24
meses). Un grupo de ratas viejas recibió GH intracerebroventricular (ICV)
(1μg/hora) durante 7 días. Otro grupo de ratas viejas se trató con GHRP-6
subcutáneo (sc) (20μg/kg) durante 15 días.La expresión de mielina (MBP) se
valoró mediante técnicas inmunohistoquímicas frente a MBP. Se analizó la
expresión de MBP en cuerpo calloso (CC) y comisura anterior (CA). El
tratamiento con GH y GHRP-6 aumentó marcadamente la expresión de MBP
en el CC y CA de de las ratas viejas. Para investigar el papel del IGF-I , se
administró el antagonista de IGF-I, J-B1, previamente al tratamiento con GH
y GHRP-6. El antagonista de IGF-I bloqueó completamente la inducción de
MBP promovida por GH y GHRP-6. No se observaron cambios en los niveles
circulantes de IGF-I.
Estos resultados indican que tanto GH (ICV) como GHRP-6 (sc) revierten
la hipomielinización en el cerebro de la rata vieja. Además, sugieren que
estas acciones están mediadas por la inducción local de IGF-I. Los efectos
de GHRP-6 apoyan la posibilidad de su utilización terapeútica en el
envejecimiento.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL GLP-1 EN EL INTESTINO
DE RATONES NOD (NON-OBESE DIABETIC)
A. Arrieta*, I. Imbuluzqueta, A.C. Villaro, M.P. Sesma y M.E. Bodegas.
Departamento de Histología y Anatomía Patológica. Universidad de Navarra.
Pamplona. Tfno.: 948425600 ext 6215
* aaaramendi@alumni.unav.es
El diagnóstico clínico de la diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) es precedido
por una etapa (“pre-diabetes”) caracterizada por infiltración linfocitaria
(“insulitis”), seguida por la destrucción de las células beta del páncreas,
principalmente mediante apoptosis. Se ha observado que durante la prediabetes, hay una neogénesis de islotes, como un intento del organismo para
compensar la pérdida de células beta, pero por algún motivo desconocido
este proceso fracasa y se detiene.
La cepa murina NOD ha sido el modelo animal más ampliamente
utilizado en el estudio de DM1 y el mejor caracterizado hasta el momento
desde que fue descrito en 1980, ya que desarrolla insulitis y diabetes de
forma espontánea, con una patología similar a la que se observa en humanos
El GLP-1 además de estimular la biosíntesis y secreción de insulina,
aumenta la proliferación e inhibe la apoptosis de las células beta y promueve
la neogénesis de los islotes. En la actualidad se conoce que existe una
disminución de las concentraciones plasmáticas de GLP-1 en pacientes con
DM2, pero no se conoce qué ocurre con los niveles de GLP-1 en la DM1.
En este trabajo se ha estudiado la expresión del GLP-1, mediante
inmunocitoquímica y análisis de imagen, en el intestino de ratones NOD a en
el desarrollo de la enfermedad. Los niveles de la expresión del GLP-1 se
correlacionarán con las variaciones de proliferación y apoptosis que se dan
en los islotes de Langerhans. Financiado con fondos del Proyecto FIS
P1050755
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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Página 125
PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
ESTUDIO DE LA REGENERACION DE CÉLULAS BETA
PANCREÁTICAS EN RATONES NOD (NON-OBESE DIABETIC)
I. Imbuluzqueta *, M.E. Bodegas, M.P. Sesma y A.C. Villaro. Departamento
de Histología y Anatomía Patológica. Universidad de Navarra. Pamplona.
Tfno.: 948425600 ext 6215. *iimbuluz@alumni.unav.es.
La diabetes tipo 1 (DM-1) es una enfermedad autoinmune crónica en la que las
células ß son destruidas por el sistema inmunitario. El diagnóstico clínico de la DM1 es precedido por una etapa de pre-diabetes caracterizada por infiltración linfocitaria (insulitis), seguida por la destrucción de las células β. Se conoce que las células
β se replican durante el desarrollo embrionario y ante la presencia de estímulos regeneradores como la pancreatectomía parcial. Sin embargo, existe controversia
sobre el mecanismo y el tipo celular que origina las nuevas células. Persiste también el debate sobre la existencia de regeneración de forma espontánea en la vida
adulta y sobre su aumento durante la fase de insulitis que precede a la DM-1.
El ratón NOD, es el modelo animal de DM-1 mejor caracterizado. El 100%
muestran insulitis entre las 4-7 semanas de vida. Seguidamente ocurre el desarrollo
espontáneo de diabetes franca, que empieza a observarse a partir de la semana
15 y que ocurre en aproximadamente el 70-80% de las hembras y 20-40% de los
machos hacia la semana 30 de vida. El estudio de la regeneración de células β
durante la fase de insulitis puede ayudar a ampliar el conocimiento de los procesos
que preceden a la diabetes clínica.
El objetivo a largo plazo del presente trabajo es estudiar si en fase de insulitis
existe un aumento de regeneración de células β, y si tal regeneración se produce,
estudiar el origen de las nuevas células. En concreto, presentamos la puesta a
punto y aplicación de anticuerpos frente a PCNA y marcadores de células β (insulina…) para detectar posibles células β en regeneración.
En el presente trabajo, para determinar si la regeneración observada es debida
a la multiplicación de las células β o a los linfocitos que producen la insulitis, se
identifica las células en proliferación con marcadores específicos (insulina y CD3).
Financiado con fondos del Proyecto FIS P1050755
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
ENDOGLINA MODULA PROCESOS BIOLÓGICOS
DE LAS CÉLULAS ENDOTELIALES
A. Rodríguez-Barbero, M. Pericacho, M.
Laboratorio de Fisiología Celular. Unidad
Cardiovascular. Instituto Reina Sofía de
Universidad de Salamanca. Salamanca.
barberoa@usal.es
Prieto, JM. López-Novoa.
de Fisiopatología Renal y
Investigación Nefrológica.
Tlf: 923 294472. e-mail:
La endoglina es una glicoproteína de membrana que se expresa
fundamentalmente en células endoteliales y que está involucrada en la
regulación de la señalización de diversas moléculas de la superfamilia del
TGF-β. Los ratones que carecen de endoglina (Eng-/-) mueren antes de nacer
debido a una angiogénesis deficiente. La mutación del gen de la endoglina
causa en humanos Telangectasia Hemorrágica hereditaria, una enfermedad
caracterizada por displasias vasculares en diversos órganos. El objetivo de
este estudio fue evaluar el papel de la endoglina en procesos celulares
involucrados en angiogénesis como son la proliferación celular y la síntesis de
matriz extracelular en células endoteliales. Hemos obtenido cultivos primarios
de células endoteliales de aorta de ratón de los pseudocapilares derivados de
los anillos de aorta de los ratones Eng+/- C57BL/6 y sus respectivos controles
Eng+/+. Los análisis de Western blot revelan que la expresión de endoglina está
reducida en un 50% en las células Eng+/-. Los efectos de la haploinsuficiencia
de endoglina en la proliferación celular se estudiaron determinando aumento
en el número de células. Las células Eng+/- proliferaron más lentamente que las
Eng+/+. Los estudios de citometría de flujo mostraron un mayor porcentaje de
células Eng+/- en fase G0/G1. La síntesis de colágeno y fibronectina, analizada
mediante incorporación de [3H]prolina y Western blot respectivamente, fue
significativamente mayor en las células Eng+/- comparadas con las Eng+/+. Dado
que VEGF es un importante mediador de la proliferación, determinamos este
mediante ELISA. Los niveles de VEGF estaban significativamente reducidos
en las células Eng+/- respecto a las Eng+/+. Los efectos mitogénicos de VEGF
sobre las células endoteliales son dependientes de óxido nítrico (NO) y
necesita una expresión adecuada de eNOS. Las células endoteliales Eng+/expresan reducidos niveles de eNOS respecto a las células Eng+/+. Estos datos
muestran la importancia de la endoglina modulando importantes propiedades
biológicas relacionadas con la angiogénesis.
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PATOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Póster
PAPEL DE ENDOGLINA EN
LA MIGRACIÓN Y ADHESIÓN ENDOTELIAL
S. Velasco*, M. Pericacho, JM. López-Novoa y A. Rodríguez-Barbero.
Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular. Instituto Reina Sofía de
Investigación Nefrológica. Universidad de Salamanca. Salamanca. Tfno.:
(923) 294472. *a71357@usal.es.
Endoglina (CD105) es una glicoproteina de membrana que se expresa
fundamentalmente en células endoteliales y modula diversas respuestas
celulares. La mutación del gen de la endoglina causa en humanos una
enfermedad conocida como Telagienctasia hemorrágica hereditaria tipo I,
caracterizada por displasias vasculares en diversos órganos. Por el contrario,
las células epiteliales de los vasos neoangiogénicos, sobre todo los
tumorales, presentan una elevada expresión de endoglina. Todos estos datos
hacen pensar que la endoglina juega un papel clave en la regulación de la
angiogénesis del adulto. Además, endoglina participa de forma importante
en angiogénesis, remodelado vascular y desarrollo cardiovascular, pudiendo
estar implicada en procesos de disfunción endotelial.
Estudiamos el papel de endoglina en la migración y adhesión endotelial.
Para ello nos planteamos la obtención de células endoteliales de aorta
procedentes de ratones haploinsuficientes en endoglina Eng+/- y sus
respectivos controles Eng +/+. Los ratones que carecen de endoglina (Eng-/-)
mueren antes de nacer debido a una angiogénesis deficiente.
La migración de las células endoteliales, determinada con la técnica de
wound healing es menor en las células Eng+/- que en las Eng+/+. En cuanto
a la adhesión al plástico y a colágeno, medida por cristal violeta, existe una
mayor adhesión en las células Eng+/- que en las células endoteliales Eng+/+.
Además, analizamos por western blot la expresión de PECAM-1, ICAM-1 y
VCAM-1 y observamos que la haploinsuficiencia en endoglina produce una
disminución en la expresión de ICAM-1, no encontrando diferencias em
PECAM-1 y VCAM-1 entre ambos tipos de endoteliales.
El conjunto de estos resultados demuestra la importancia de endoglina
en procesos de migración y adhesión endotelial, sugiriendo que endoglina
juega un papel importante en la regulación de la angiogénesis.
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INMUNOLOGÍA
Póster
EL VIRUS DE LA NECROSIS NERVIOSA (NNV) INDUCE UNA
INFLAMACIÓN CRÓNICA EN EL CEREBRO DE LA DORADA
(Sparus aurata L., Teleostei)
I. Fuentes1,*, I. Mulero1, I. Cano2, J. Meseguer1 y V. Mulero1,*
1
Departamento de Biología Celular, Facultad de Biología, Universidad de
Murcia, 30100 Murcia, Spain. 2Departamento de Microbiología, Facultad de
Ciencias, Universidad de Málaga. Spain. * ifm@um.es.
El virus de la necrosis nerviosa es un betanodavirus que infecta la mayoría de especies marinas objeto de cultivo intensivo. La dorada es una especie portadora y generalmente asintomática, por lo que se convierte en un
problema importante en piscifactorías que cultivan otras especies más susceptibles. Para profundizar en la respuesta inmunitaria de la dorada frente a
este virus, hemos analizado la expresión de diferentes citoquinas pro- y antiinflamatorias así como diferentes receptores similares a Toll (TLRs) en el
riñón cefálico (equivalente a la médula ósea de mamíferos) y en el cerebro
(órgano diana) de ejemplares infectados experimentalmente con dicho virus.
Los datos han sido correlacionados con la presencia del virus en estos órganos mediante inmunohistoquímica y PCR. Los resultados indican que el
virus induce la expresión de IL-1b en el cerebro 24 tras la infección, pero
después retornan a niveles basales. Sin embargo, los niveles del mRNA del
TLR9, TNFα, y Mx aumentan de forma drástica a este mismo tiempo, pero
se mantienen elevados hasta 30 días después de la infección, a pesar de
que los peces no mostraron síntomas de enfermedad y no se detectó mortalidad alguna.
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INMUNOLOGÍA
Póster
DESARROLLO DE UN MODELO DE INFLAMACIÓN EN EL PEZ
CEBRA Y ESTUDIO DEL PAPEL DE LA PROTEOLISIS
INTRAMEMBRANA DEL TNFα EN LA REGULACIÓN
DE LA RESPUESTA INMUNITARIA
R. Espín, F.J. Roca*, S. Candel, J. Meseguer, V. Mulero
Departamento de Biología Celular, Facultad de Biología, Universidad de
Murcia, 30100 Murcia. España. *fjroca@um.es
La activación de moléculas señalizadoras y factores de transcripción por
proteolisis intramembrana regulada (RIP) es un paradigma de señalización
directa en las células eucariotas. Normalmente, esta proteolisis ocurre en
dos pasos: i) un procesamiento inicial por una proteasa que elimina el dominio extracelular y ii) una hidrólisis intramembrana que promueve la liberación
del dominio intracellar (ICD) que se transloca al núcleo. Los homólogos de
las peptidasas de péptido señal (SPPLs) son aspartil-proteasas recientemente identificadas y que podrían catalizar la proteolisis intramembrana de
moléculas señalizadoras ancladas a membrana tipo II. Así, recientemente
se ha demostrado que la SPPL2a y SPPL2b, que se localizan en endosomas
y en la membrana plasmática, respectivamente, son proteasas funcionales
que catalizan la hidrólisis intramembrana del factor de necrosis tumoral α
(TNFα). Las dos proteasas liberan el ICD del TNFα, que a continuación induce la expresión de la interleuquina-12 (IL-12) en células dendríticas humanas activadas. En el presente trabajo hemos desarrollado un modelo de
activación de la respuestas inmunitaria de larvas de pez cebra (Danio rerio).
Para ello, larvas de pez cebra han sido estimuladas con TNFα, poli I:C y DNA
bacteriano en presencia de varios inhibidores de estas enzimas ((Z-LL)2 quetona y L-685,458) y, a continuación, se ha determinado la expresión de varias citoquinas (TNFα, IL-1β, IL-12 y linfotoxina α) mediante RT-PCR a tiempo
real. Por último, también se ha estudiado el efecto de morfolinos dirigidos
contra la SPPL2b en la producción de citoquinas.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Póster
LOCALIZACIÓN CELULAR DE WIP E IMPLICACIÓN DE LA MISMA
EN LA ESTRUCTURA DEL APARATO DE GOLGI
I. Bañón-Rodríguez*, E. Martínez-Alonso, A. Franco, G. Egea e I.M.
Antón. Departamento de Biología Molecular. CBM-UAM. Madrid. Tfno.: (91)
4978475. *ibanion@cbm.uam.es.
El mantenimiento de la estructura plana de las cisternas que componen
el aparato de Golgi depende de la integridad del citoesqueleto de actina.
Entre las proteínas reguladoras de la formación de filamentos de actina
localizadas en el aparato de Golgi destacan Cdc-42, N-WASP (WiskottAldrich Syndrome Protein) y el complejo Arp2/3. La función de esta vía está
regulada por WIP (WASP Interacting Protein), inhibiendo la nucleación de
actina inducida por Arp2/3 en respuesta a la activación de WASP. WIP
interacciona con cortactina y profilina, las cuales favorecen la nucleación de
actina, y estabiliza los filamentos de actina. El objetivo de este trabajo
consiste en definir la implicación de WIP en la estructura del aparato de Golgi.
Mediante técnicas de inmunofluorescencia observamos la colocalización
de WIP con GM-130 (marcador de cis-Golgi) tanto en la línea de fibroblastos
murinos NIH3T3 como en esta misma línea transfectada con pcDNA3 WIPGFP. Actualmente estamos estudiando los efectos de WIP en la arquitectura
del aparato de Golgi en fibroblastos de pulmón derivados de ratones WIP+/+
y ratones WIP-/-. También estamos realizando experimentos con toxinas
(citocalasina D) capaces de alterar la dinámica de actina y observando sus
efectos en la estructura del Golgi tanto en células que sobreexpresan WIP
como en las carentes de ella.
Con estos resultados y sabiendo que WIP es esencial para la correcta
polimerización del citoesqueleto de actina y estabilización de los filamentos
de actina, y teniendo en cuenta que WIP ha sido implicada en procesos de
endocitosis en levaduras donde la actina es crucial, podríamos pensar en un
papel en el mantenimiento de la estructura del aparato de Golgi así como en
el correcto funcionamiento de dicho orgánulo.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Póster
AUMENTO DE LA EXPRESIÓN DE CAVEOLINA-1 EN TEJIDO
ADIPOSO HUMANO DE PACIENTES OBESOS Y SU RELACIÓN
CON LA INSULINO-RESISTENCIA
V. Catalán*, J. Gómez-Ambrosi*, A. Rodríguez*, C. Silva†, Fernando
Rotellar‡, M.J. Gil§, J. A. Cienfuegos‡, J. Salvador†, M.A. Burrell&, G.
Frühbeck*,†, *Laboratorio de Investigación Metabólica y Dptos. de
†
Endocrinología, ‡Cirugía, §Bioquímica e &Histología. Clínica Universitaria de
Navarra. Universidad de Navarra. Pamplona. vcatalan@unav.es
La caveolina-1 (CAV1) es una proteína de membrana, que interviene en
funciones como la transcitosis, la homeostasis del colesterol y la transducción de
señales intracelulares. En este estudio se analizaron los niveles de expresión génica
de CAV1 en tejido adiposo humano de pacientes obesos y su relación con la
insulino-resistencia, y se estableció su posible implicación en el estado de
inflamación crónica de bajo grado asociado a la obesidad. Se utilizaron muestras de
grasa visceral (VIS) y subcutánea (SUB) de 15 mujeres. Las pacientes se clasificaron
como delgadas (IMC<25 kg/m2) u obesas (IMC>35 kg/m2). Este último grupo se
subdividió en mujeres normoglucémicas (NG) y con diabetes mellitus tipo 2 (DMT2).
Se determinaron las concentraciones circulantes de metabolitos, hormonas y
adipoquinas. La cuantificación de la expresión de CAV1 y proteína quimiotáctica de
monocitos 1 (MCP-1) se realizó por PCR en tiempo real. La inmunohistoquímica
identificó CAV1 en los distintos tipos celulares del tejido adiposo. Al microscopio
electrónico se observaron abundantes caveolas tanto en VIS como SUB. Las
pacientes obesas tanto NG como con DMT2 presentaron una expresión de CAV1
significativamente aumentada (P<0,05) en VIS y SUB. No se detectaron diferencias
significativas entre pacientes obesas NG y con DMT2 en VIS. Sin embargo, en SUB
se puso de manifiesto una mayor expresión de CAV1 en las muestras de mujeres
diabéticas, con respecto a las pacientes NG (P<0,05). Los niveles de expresión de
CAV1 se correlacionaron de forma positiva y significativa (P<0,05) con diferentes
marcadores de inflamación, así como con la expresión de MCP-1 en VIS.
Nuestros datos muestran una sobre-expresión de CAV1 en VIS y SUB de
mujeres obesas NG y con DMT2 respecto a delgadas, lo que sugiere un papel de
CAV1 en obesidad y DMT2. Asimismo, la asociación con distintos marcadores de
inflamación puede indicar la implicación de CAV1 en el estado de inflamación crónica
de bajo grado asociado a la obesidad.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Póster
NECC1 y 2: DOS NUEVAS PROTEÍNAS DE LA RUTA
SECRETORA DE CÉLULAS (NEURO)ENDOCRINAS
D. Cruz-García1, J.A. Díaz-Ruiz1, R. Vázquez-Martínez1, Y. Anouar2, M.C.
Tonon2, H. Vaudry2, J.P. Castaño1 y M.M. Malagón1. (1) Dpto. Biol. Celular,
Fisiol. e Inmunol. Univ. Córdoba. (2) Lab. Cellular and Molecular
Neuroendocrinolgy. Univ. Rouen (France).
El adecuado funcionamiento de la ruta secretora implica que los procesos
de biogénesis, transporte, y anclaje y fusión de transportadores de membrana
ocurran de forma específica y regulada. Este conjunto de procesos es de
especial importancia en neuronas y en células endocrinas, ya que la
regulación precisa de la secreción en las mismas es fundamental para la
homeostasis del organismo. Entre las proteínas que intervienen en el control
de la ruta secretora se incluyen las golginas, asociadas al Complejo de Golgi
(CG), EEA1 y Rabaptin-5, relacionadas con endosomas o CAST y liprin-α,
asociadas a la zona presináptica, estando todas ellas caracterizadas por la
presencia de un largo dominio coiled-coil en su secuencia. Recientemente,
hemos identificado, mediante un análisis genómico diferencial en células
endocrinas, dos nuevas proteínas pertenecientes a una misma familia génica
que hemos denominado NECC1 y 2 (neuroendocrine long coiled-coil protein)
sobre la base de su expresión preferencial en tejidos (neuro)endocrinos y a
la existencia de un largo dominio coiled-coil en sus secuencias. Además, en
su extremo C-terminal presentan un dominio transmembrana que permitiría su
anclaje a membrana. De hecho, estudios de distribución subcelular en células
endocrinas confirmaron que ambas proteínas se localizan en el CG lo que,
junto a sus características estructurales, indica que las proteínas NECC
presentan similitudes con ciertos miembros de la familia de las golginas. No
obstante, a diferencia de la mayoría de las golginas, en células endocrinas y,
fundamentalmente en células con fenotipo neuronal (i.e. células PC12
diferenciadas con NGF, neuronas de hipocampo), las NECCs también están
asociadas a vesículas y, en particular, colocalizan con marcadores sinápticos.
El conjunto de nuestros resultados indican que NECC1 y 2 podrían estar
implicadas en el control del tráfico intracelular en neuronas y en células
endocrinas. Los estudios funcionales en marcha permitirán conocer el papel
específico de estas proteínas en dicho proceso. Financiación: CVI-139 (Junta de
Andalucia), y BFU2004-03883 y HF2005-0053 (MEC).
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Póster
DOCK10/ZIZIMIN3, UNA NUEVA PROTEÍNA QUE INTERACCIONA
CON RHO-GTPASAS, CDC42/RAC: CLONACIÓN Y EXPRESIÓN
INDUCIBLE EN CÉLULAS HELA.
L. Gimeno*, E. Yelo, M.V. Bernardo, R. Álvarez-López y A. Parrado.
Servicio de Inmuno a. Hospital Virgen de la Arrixaca.
Servicio Murciano de Salud-FFIS.El Palmar. Murcia. Tfno.: 968369464.
*lourdes.gimeno@carm.es.
Hemos identificado una nueva proteína inducida por IL4 en muestras de
pacientes con LLC-B cultivadas in vitro. La clonación y secuenciación del fragmento
puso en evidencia que correspondía a un gen, DOCK10, cuya secuencia codificante
no era conocida por completo. El nuevo gen codifica una proteína caracterizada por
la presencia N-terminal de un dominio PH, y dos dominios, uno central (CZH1) y otro
C-terminal (CZH2), de homología con una nueva familia de proteínas denominada
CZH, que tienen actividad GEF (activadora) sobre pequeñas GTPasas de la
subfamilia Rho/Rac. Dicha actividad GEF reside en el dominio CZH2.
DOCK10 es una proteína formada por 2.180 aminoácidos homóloga a
Zizimin1/DOCK9 y Zizimin2/DOCK11, dos proteínas recientemente descritas que
actúan como GEF (activadores) específicos de la GTPasa Cdc42, de la familia de
pequeñas GTPasas Rho (Rho, Rac, Cdc42). Dentro de la familia CZH, DOCK10 es
el tercer miembro identificado de la subfamilia Zizimin. Los otros dos factores de la
subfamilia Zizimin ya han sido clonados: Zizimin1/DOCK9 y Zizimin2/DOCK11, con
los que comparte aproximadamente un 50% de identidad de secuencia. Estos dos
factores tienen actividad GEF específica de la GTPasa Cdc42. Los dominios PH se
han relacionado con funciones tales interacciones entre proteínas y regulación del
citoesqueleto. Se ha demostrado que Zizimin1/DOCK9 interviene en la regulación del
citoesqueleto de actina.
En este trabajo hemos estudiado la localización subcelular y la función celular de
DOCK10 en clones de células HeLa que expresan esta proteína estable e
induciblemente. La inmunocitoquímica para la detección de DOCK10 en células HeLa
expresoras, mostraron una localización fundamentalmente citoplasmática de esta
proteína. Los ensayos de interacción pulldown de DOCK10 con diversas RhoGTPasas fusionadas a GST (GST-Cdc42, GST-Rac1, GST-RhoA), en condiciones
libres (nf) o unidos a GDP o GTP, muestran la especificidad de unión de DOCK10 con
Cdc42 y Rac1 en condiciones nf.
Nuestros resultados preliminares muestran como DOCK10 interacciona in vitro
con Cdc42 y Rac1, y sugiere que podría actuar como un GEF específico para estas
GTPasas, es decir como activador de Cdc42 y Rac1, como se ha demostrado para
sus homólogos DOCK 9 y 11.
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CITOESQUELETO Y TRÁFICO INTRACELULAR
Póster
ANÁLISIS DE LAS GRANINAS SECRETOGRANINA II y
CROMOGRANINA A EN TEJIDO ADIPOSO
M.R. Pulido*, A. Díaz-Ruiz, R. Vázquez-Martínez, D. Cruz-García, J.P.
Castaño, M.M. Malagón. Dpt. Biología Celular, Fisiol. e Inmunol. Univ.
Córdoba. Córdoba. *bc2pultm@uco.es.
El tejido adiposo se ha considerado habitualmente como un simple reservorio
energético de grasa. Sin embargo, actualmente se considera como un verdadero
órgano endocrino, capaz de secretar una notable variedad de moléculas, las
adipoquinas (leptina, adiponectina, resistina, LPL, VEGF, citoquinas, IL-6, etc.), que
desempeñan funciones cruciales en el control del metabolismo, la reproducción y
los sistema inmune y cardiovascular, y cuya disfunción parece estar estrechamente
relacionada con distintos tipos de enfermedades (obesidad, dislipemias, resistencia
a insulina, etc.). Pese al gran número de moléculas secretadas por el adipocito, el
conocimiento de la ruta secretora y los mecanismos que controlan el tráfico
intracelular y exocitosis de las adipoquinas en este tipo celular no se conoce aún
con precisión. En este contexto, nos propusimos estudiar la posible presencia en
los adipocitos de proteínas características de células con ruta de secreción
regulada. En concreto, analizamos dos miembros representativos de la familia de
las graninas, proteínas almacenadas en gránulos de secreción de células
neuroendocrinas, secretogranina II (SgII) y cromogranina A (CgA). Para ello,
utilizamos dos modelos experimentales, células 3T3-L1 y tejido adiposo visceral
de rata, y cebadores específicos de ambas graninas, así como anticuerpos contra
las mismas, con los que analizamos, respectivamente, la expresión de SgII y CgA
por RT-PCR y la distribución y características de ambas proteínas mediante
estudios de inmunocitoquímica para microscopía confocal y de Western blot.
Adicionalmente, evaluamos las graninas durante el proceso de diferenciación de
células 3T3-L1, así como en las fracciones que componen el tejido adiposo (i.e.
estroma vascular y adipocitos maduros). Nuestros resultados muestran que ambas
graninas se expresan en tejido adiposo, aunque están asociadas con diferentes
elementos celulares y muestran además distinta distribución intracelular. En
conjunto, estos datos sugieren que, como en otras células endocrinas, las graninas
podrían intervenir en el proceso secretor en adipocitos, posiblemente
desempeñando funciones al menos parcialmente distintas.
Financiación: CVI-139, CTS1705 (JA), BFU2004-03883 (MEC) y CIBER de Obesidad y Nutrición
(Instituto de Salud Carlos III).
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Póster
PRESENCIA DE SUMO-1 EN CUERPOS DE CAJAL DE
CÉLULAS UR61 Y NEURONAS
J. Navascués, R. Bengoechea, M. Lafarga y M.T. Berciano*. Departamento
de Anatomía y Biología Celular. Universidad de Cantabria. Santander. Tfno.:
(942) 201930. *berciant@unican.es
El cuerpo de Cajal (CB) es una organela nuclear muy dinámica en neuronas y
dependiente de transcripción. Sin embargo, se sabe relativamente poco acerca del
ensamblaje molecular de sus componentes esenciales (coilina, snRNPs
espliceosomales, SMN y fibrilarina), de las modificaciones post-traduccionales de
sus proteínas y de los procesos de intercambio molecular que realiza con el
nucleoplasma.
“Small ubiquitin modifier-1” (SUMO-1) modifica covalentemente distintas
proteínas implicadas en importantes funciones nucleares. La conjugación con
SUMO-1 de proteínas interviene en la regulación de la expresión génica, reparación
del DNA y relocalización subnuclear y función de proteínas, particularmente en los
cuerpos PML, cuerpos SUMO-1 (SNBs) y el complejo del poro nuclear.
En este estudio demostramos la presencia de SUMO-1 en CBs de células
UR61 (neurona-“like”), indiferenciadas (35% CBs) y diferenciadas (18%), así como
en neuronas del núcleo supraóptico y ganglio de trigémino, en respuesta al estrés
osmótico y al AdOx (inhibidor de las metiltransferasas), respectivamente. SUMO1 colocaliza con coilina, snRNPs espliceosomales y SMN en CBs, lo que sugiere
que los CB-SUMO-1 positivos son funcionales. Experimentos de transfección
celular con GFP-coilina y GFP-SMN en células UR61 confirman la localización de
SUMO-1 endógeno en algunos CBs que contienen las proteínas de fusión. En
neuronas, la mayor incidencia de CBs con SUMO-1 se detectó 6h después del
estrés osmótico y 4h después del tratamiento con AdOx, coincidiendo con una fase
de reformación y reorganización de los CBs, tras una fase más temprana en la que
se produce una reducción dramática e estos cuerpos nucleares. Estos datos
sugieren que la modificación transitoria de proteínas del CB con SUMO-1 (coilina
y SMN son candidatos putativos) puede intervenir en el proceso de reclutamiento
y ensamblaje molecular requerido para la formación de CBs, al menos en
determinados tipos celulares y bajo determinadas condiciones metabólicas.
Financiado por CIBERNED (Instituto de Salud Carlos III)
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Póster
FACTORES QUE REGULAN PROLIFERACIÓN VS
DIFERENCIACIÓN EN CARDIOMIOCITOS DERIVADOS
DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
A.E. Aránega, E. Lozano Velasco*; Departamento de Biología Experimental.
Universidad
de
Jaén.
Jaén.
Tfno.:
(953)212604.
*estefania.lozano@gmail.com
El fallo cardiaco está caracterizado por una pérdida de función de los
cardiomiocitos. Dado que los cardiomiocitos adultos son incapaces de
regenerarse, el transplante cardiaco es el único tratamiento efectivo en pacientes
que sufren un fallo cardiaco severo. Uno de los fenotipos que se desarrollan a
partir de mesodermo in vitro son clusters de cardiomiocitos que se contraen
espontáneamente (beating areas). Estudios realizados, indican que las células
madre embrionarias suponen un enorme potencial para la cardiomioplastia celular.
Pitx-2 es un factor de transcripción con un papel central en los últimos eventos
que conducen a la asimetría derecha-izquierda durante la morfogénesis. Hasta el
momento 3 diferentes isoformas de Pitx2 han sido identificadas y es Pitx2c la que
ha sido identificada en corazón y los patrones de expresión de Pitx2c durante el
desarrollo cardiaco de ratón han sido descritos. Ratones mutantes para Pitx2,
muestran malformaciones cardiacas severas.
Estudios in vitro con líneas celulares de mioblastos, muestran a Pitx2 como un
regulador transcripcional en la progresión de la fase G1 del ciclo celular en las
células que lo expresan y mediante ensayos de inmunoprecipitación de la
cromatina en células C2C12 (mioblastos) se ha demostrado que también actúa
como modulador de genes específicos de control del crecimiento, indicando que
Ciclina D2, D1 y c-Myc son genes diana para este factor de transcripción. Datos
obtenidos por nuestro laboratorio muestran que la sobreexpresión de Pitx2c en
cultivos de mioblastos induce proliferación y bloquea procesos de diferenciación
en estas células, modulando la expresión de genes específicos de musculatura
esquelética (myogenina, Myo-D y s-troponina-I). Así, Pitx2 se perfila como un gen
candidato en la regulación de la proliferación de células que han iniciado una ruta
específica de diferenciación. Como las células cardiacas expresan este factor de
transcripción, es necesario establecer el papel de Pitx2c en la proliferación de
cardiomiocitos.
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Póster
CONTRIBUCIÓN CELULAR AL SISTEMA DE CONDUCCIÓN
CARDIACO DURANTE EL DESARROLLO
N. Moreno-Rascón, S. Melhiac1, R. Kelly2, M. Buckingham1, D. Franco
Grupo de Desarrollo Cardiovascular, Departamento de Biología
Experimental, Universidad de Jaén, 1Departamento de Biología del
Desarrollo, Instituto Pasteur, Paris, Francia, 2Instituto de Genetica Molecular
y del Desarrollo de Marsella, Marsella, Francia
El Sistema de Conducción Cardíaco (CCS) está compuesto por: nódulo
sinoatrial (SAN), nódulo atrioventricular (AVN), fascículo de His, ramas
derecha e izquierda (RBB y LBB) y las fibras de Purkinje. Aunque los
mecanismos moleculares que regulan la formación del corazón han sido
ampliamente estudiados, las contribuciones celulares y el estudio de su linaje
celular no se conocen con detalle. Para comprender el origen morfogenetico
de los distintos componentes del CCS y su relación con el miocardio de
trabajo (WM) estamos usando análisis clonal en embriones de ratón,
basándonos en el inserción de un gen marcador nlaacZ en el región
codificante del gen de la alfa-actina cardíaca.
En los embriones nlaacZ (E 14.5) se está evaluando la frecuencia,
tamaño y situación de los clones en el CCS. Los clones próximos al CCS, se
están analizando por inmunohistoquímica con distintos marcadores, para
confirmar su situación dentro del CCS. Se han analizado alrededor de 750
corazones y se ha observado que un aproximadamente un 2,5-3% de los
mismos presenta al menos un clon relacionado con el CCS. Los clones más
grandes incluyen en todos los casos células en algún componente del CCS
y el WM adyacente. Aunque, los mas pequeños pueden estar solo en el CCS,
solo en el WM adyacente o a veces, en ambos linajes. Estos datos indican
a) que todos los componentes del CCS tienen un origen miocárdico, y b) que
la incorporación de células al CCS parece disminuir según avanza el
desarrollo. De hecho, un análisis detallado de los clones nlaacZ en la cepa
murina de conexina-40-EGFP (knock-in) en estadios postnatales (P21) pone
de manifiesto que los clones pequeños solo están en uno (CCS) o en otro
tipo (WM) de linaje celular.
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NÚCLEO Y EXPRESIÓN GÉNICA
Póster
DINÁMICA NUCLEAR DURANTE EL DESARROLLO Y MUERTE
CELULAR DEL TAPETUM DE ANTERAS DE COLZA Y TABACO:
PATRONES DE DISTRIBUCIÓN DE 5-METIL-CITOSINA
P.S. Testillano1, E. Corredor1, N. Chakrabarti1, M.T. Solís1, A. RodríguezHuete1, I. Raska2, M.C. Risueño1
1
Centro de Investigaciones Biologicas. CSIC. Ramiro de Maeztu 9, 28040
Madrid. 2 Dept. Cell Biology, Inst. Physiology, Acad. Sciences Czech
Republic. Prague. E-mail: testillano@cib.csic.es
El tapetum, tejido nutritivo de la antera, tiene un papel fundamental
durante la microsporogénesis y el desarrollo del polen, terminando su función
y degradándose posteriormente. En este trabajo se analiza la dinámica del
núcleo del tapetum durante el desarrollo y muerte celular, en Brassica napus
L y Nicotiana tabacum L. caracterizándose una secuencia temporal de
cambios apoptóticos en etapas concretas durante el desarrollo del polen.
Mediante citoquímicas e inmunocitoquímicas y análisis al CLSM y MET se
han analizado cambios característicos en citoplasma (localización del
Citocromo C y expresión de proteasas específicas tipo “caspasa-3”) y núcleo,
en el que se observó una progresiva condensación cromatínica, lobulación
nuclear y formación de cuerpos apoptóticos, cambios en la distribución de
RNA y segregación de RNPs. Se ha analizado también la metilación del DNA
como una marca epigenética del estado funcional de la cromatina mediante
la distribución de 5-metil-citosina (5mC) en el núcleo durante distintas etapas
del desarrollo y muerte celular del tapetum, observándose cambios en el
patrón de distribución de 5mC, en pequeños “spots” en todo el núcleo en
etapas activas, hasta los núcleos apoptóticos en los que la señal de 5mC se
concentra en la cromatina muy condensada.
Financiado por proyectos MEC, BFU2005-01094 y AGL2005-05104, y
CSIC 2006CZ0006 (Proy. Conjunto Hispano-Checo).
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
CARACTERIZACIÓN PARCIAL POR HPLC-MASAS DE
FRACCIONES DE GANODERMA LUCIDUM CON ACTIVIDAD
APOPTÓTICA EN CÉLULAS LEUCÉMICAS Y DE LINFOMA
E. Calviño*, J.L. Manjóno, J. A. Ochoao, L. Pajuelo*, M.C. Tejedor*, P.
Sancho*, y J.C. Diez*.
*Dpto de Bioquímica y Biología Molecular. oDpto. Biología Vegetal.
Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares (Madrid). Tfno.: (91) 8854582.
*josecarlos.diez@uah.es.
Se han descrito diferentes compuestos presentes en el hongo
Ganoderma
lucidum
con
posibles
actividades
antitumorales,
inmunomoduladoras, entre otras.
Se ha estudiado la acción de extractos preparados a partir de cultivos de
Ganoderma lucidum. Se obtuvieron fracciones por cromatografía en columna
de gel de sílice y se probaron en células de linfoblastoma de ratón (DA-1) y
leucémicas humanas (NB-4). En el primer caso, se obtuvieron valores de
reducción de viabilidad celular a 59% a 19 horas de tratamiento (dilución
1/100). En células NB-4, la viabilidad celular alcanzó valores de 75% tras
tratamiento durante 19 horas con fracciones diluidas 1/200. La apoptosis
(aparición de DNA subdiploide) inducida por estas fracciones (diluidas 1/100)
fue de 18 % en células DA-1. Dichas fracciones diluidas 1/100 producen la
muerte total del cultivo de células NB-4, infiriéndose una mayor sensibilidad
de las células leucémicas frente a los compuestos contenidos en las
fracciones. Diluciones 1/200 de dichas fracciones inducen 55% de apoptosis
en células NB-4.
Fraccionamientos posteriores por HPLC-masas permitieron obtener
fracciones que presentan un reducido número de compuestos que
tentativamente podrían ser los responsables de inducción de apoptosis en
estas líneas tumorales. La elucidación de la estructura de estos compuestos
está actualmente siendo estudiada en nuestro laboratorio.
Agradecimientos. El presente trabajo se ha financiado en parte con
Proyectos de la Comunidad de Madrid y la Universidad de Alcalá (CAMUAH2005/040 y CG06-UAH/SAL-0672)
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
REGULACIÓN FUNCIONAL DE LOS RECEPTORES
DE SOMATOSTATINA hsst2 Y hsst5 POR DOS ISOFORMAS
TRUNCADAS DEL hsst5, hsst5B Y hsst5C
M. Durán-Prado*, MD. Gahete, S. García-Navarro, MM. Malagón y JP.
Castaño. Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología.
Universidad de Córdoba. Córdoba. Tfno.: (957) 218594. *bb2duprm@uco.es.
Los péptidos somatostatina (SRIF) y cortistatina (CST) actúan como factores
pleiotrópicos, inhibiendo diversos procesos celulares mediante la activación de
una familia de receptores de 7 dominios transmembrana acoplados a proteínas
G, denominados receptores de somatostatina o ssts. Se conocen hasta ahora
cinco isoformas diferentes de ssts (sst1-sst5) así como una isoforma alternativa
del sst2 (sst2B) originada por splicing alternativo. Tanto las propiedades
farmacológicas como de transducción de señales de los sst murinos y humanos
son ampliamente conocidas. Ambos péptidos, SRIF y CST, presentan una
afinidad similar por todos los sst y, en modelos celulares heterólogos, actúan
inhibiendo la adenilato ciclasa e incrementando la concentración de calcio libre
citosólico ([Ca2+]i). Sin embargo, existen funciones diferenciales de SRIF y CST
que no pueden explicarse de forma satisfactoria con los ssts conocidos. En este
contexto, utilizando PCR RACE, y partiendo de muestras tumorales humanas
hemos clonado recientemente dos nuevas isoformas truncadas del sst5 humano,
que codifican receptores de 5 y 4 DTMs, llamados hsst5B y hsst5C, con
respuesta selectiva a SRIF y CST, respectivamente. Mediante FRET observamos
que, pese a ser truncadas, ambas isoformas retienen su capacidad de
dimerización, al igual que la isoforma larga hsst5A. Es más, hsst5B y hsst5C
interaccionan físicamente con el receptor hsst2, llevándolo desde un estado basal
multimérico a un estado dimérico. Mas aún, estudiando la dinámica de la [Ca2+]i
en respuesta a SRIF y CST en células cotransfectadas, hemos observado que
la interacción física entre los ssts truncados y las isoformas largas conlleva
también una interacción funcional entre ellas que se traduce en una disminución
de la respuesta inducida por los receptores no truncados sobre la [Ca2+]i. En
conjunto, nuestros datos sugieren que estos dos nuevos receptores podrían
mediar respuestas diferenciales por si mismos a SRIF y CST, y también actuar
como atenuadores de la respuesta mediada por otros ssts a dichos péptidos.
Financiación: CVI-139, CTS1705 (JA), BFU2004-03883 (MEC)
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
ESTUDIO DE LOS MECANISMOS IMPLICADOS EN
LA RESISTENCIA A LA APOPTOSIS INDUCIDA POR TGF-BETA
EN HEPATOCITOS QUE SUFREN TRANSICIÓN
EPITELIO-MESÉNQUIMA.
G. del Castillo(1), I. Carmona-Cuenca(1), M.M. Murillo(1,2), A. AlvarezBarrientos(3), E. Bertrán(2), M. Fernández(1), A. Sánchez(1),
I.
Fabregat*(2). (1) Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II. Fac.
Farmacia. Universidad Complutense. Madrid. (2) Institut d’Investigació
Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL), L’Hospitalet, Barcelona. (3) Fundación
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Madrid. * Tfno.:
932607828. E-mail: ifabregat@idibell.org
Diferentes evidencias experimentales indican que los procesos de
transición epitelio-mesénquima (EMT) confieren resistencia a apoptosis, lo
que induce una ventaja selectiva a las células que sufren dichos procesos
para migrar y participar en procesos de invasión y metástasis. En nuestro
laboratorio hemos aislado una subpoblación de hepatocitos fetales que han
sufrido EMT tras el tratamiento con TGF-β (células TβT-FH, de TGF-β-treated
fetal hepatocytes) y son resistentes a sus efectos apoptóticos (Valdés et al,
Mol. Cancer Res., 1, 68-78, 2002). Hemos comprobado que dichas células
producen factores de supervivencia que actúan autocrinamente. Así,
expresan ligandos del receptor de EGF (EGFR), como TGF-alpha y HB-EGF,
y presentan una activación constitutiva del EGFR. El cambio fenotípico
inducido por la EMT confiere a las células capacidad de producir TGF-β y es
dicho TGF-β el que media la expresión de los ligandos del EGFR. Dado que
la apoptosis inducida por TGF-β en hepatocitos es mediada por un proceso
de estrés oxidativo, hemos comenzado analizando la posible relación entre
el estado redox celular y el fenotipo de resistencia a muerte. Resultados
preliminares indican que las TβT-FH muestran un mayor contenido basal de
especies reactivas de oxígeno (ROS) que los hepatocitos fetales, lo que
indicaría que el fenotipo mesenquimático requiere niveles altos de ROS, que
no inducen daño oxidativo. La expresión de Bcl-xL, uno de los principales
genes regulados por estrés oxidativo en la apoptosis inducida por TGF-β, no
parece ser modulado por dicha citoquina en las TβT-FH. Estos resultados
indican que el estado oxidativo de las TβT-FH puede jugar un papel
importante en su resistencia a apoptosis.
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR DE LOS EFECTOS
TUBULARES DE TGF-β1
O. García-Sánchez*, R. Núñez-Lozano, S.M. Sancho-Martínez, Y. Quiros, A.
Esteller, J.M. López-Novoa, F.J. López-Hernández.
Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca y
Universidad de Salamanca. Tel.: 923 294 472. omargs82@hotmail.com
La muerte de las células tubulares es un evento fisiopatológico determinante en el curso de la enfermedad renal crónica (ERC). El factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFbeta1) es un mediador muy importante de
muchos eventos patológicos de la ERC, que incluyen la degeneración tubular. Nuestro grupo de investigación ha estudiado el efecto directo del
TGFbeta1 en líneas celulares tubulares de dos especies (humanas, HK2, y
caninas, MDCK). Nuestros resultados indican que esta citoquina no es capaz
de inducir directamente la muerte celular en ninguno de estos dos tipos celulares. TGFbeta1 induce un efecto antiproliferativo en MDCK pero no en
HK2, cuya intensidad es inversamente dependiente de la cantidad de suero
presente en el medio de cultivo, que parece estar mediado por el receptor de
TGFbeta ALK-5, y que produce una parada del ciclo celular en la fase G0/G1.
En ambos tipos celulares, TGFbeta1 induce la fosforilación rápida de Smad2,
pero no de Smad1 ni de ERK o Akt. En ambos tipos celulares también se
observa un cambio fenotípico por acción del TGFbeta1 y una disminución
de la cantidad de E-cadherina, especialmente relevante en las células HK2.
Por lo tanto, este último efecto, asociado a la inducción de transición epitelio-mesenquimal, aparece disociado del efecto antiproliferativo.
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL Y FARMACOLÓGICA
DE ANÁLOGOS MODIFICADOS DE LA KISSPEPTINA-10
E. Gutiérrez-Pascual1, A.J Martínez-Fuentes1, J. Leprince2, H. Vaudry2, M.M.
Malagón1, J.P. Castaño1. 1Dpto. Biología Celular, Univ. Córdoba. 2Univ.
Rouen, Rouen. Francia. bc2gupam@uco.es
Las kisspeptinas, identificadas originalmente como supresores de
metástasis tumoral, son un conjunto de péptidos generados por
procesamiento proteolítico del producto del gen KiSS-1, que actúan a través
del receptor GPR54. Más recientemente se ha descrito que el sistema KiSS1/GPR54 tiene un papel crucial en el control neuroendocrino del eje
reproductor. En concreto, KiSS-1 aumenta la secreción de gonadotropinas
(LH y FSH) tanto estimulando la secreción de GnRH hipotálamico, como
mediante su acción directa sobre las gonadotropas hipofisarias. Por ello y
con objeto de esclarecer el papel del sistema KiSS/GPR54, hemos
desarrollado y evaluado la funcionalidad de agonistas y/o antagonistas de la
kisspeptina-10 mediante un sistema FlexStation en respuesta al tratamiento
con dichos análogos estructurales sobre la cinética de [Ca2+]i en células CHO
establemente transfectadas con GPR54. Así, observamos que análogos
originados por sustitución de los aminoácidos originales de kisspeptina-10
por alanina en las posiciones 1 a 5 y 7 a 9, presentaron una EC50 de entre
1,04 x 10-8 y 1,27 x 10-7 M, similar a la EC50 de la Kisspeptina-10 de rata y
humano (1,54 - 2,6 x 10-8 M), lo que sugiere que los aminoácidos de estas
posiciones no desempeñan un papel destacado en la actividad de la
kisspeptina-10. Por el contrario, los análogos originados por sustitución en las
posiciones 6 ó 10 presentaron una de EC50 muy superior al de kisspeptina10 y del resto de análogos estudiados (> 6,46 µM), sugiriendo la ausencia de
acoplamiento de estos análogos con el receptor GPR54, y por tanto, que
dichos residuos son críticos para la actividad funcional de la kisspeptina.
Estos datos concuerdan con los obtenidos por microfluorimetría sobre células
individuales, que revelan una disminución tanto en la magnitud del aumento
de la [Ca2+]i como de la proporción de células que responden a dichos
análogos. Estos resultados sugieren que modificaciones en estas posiciones
pueden proporcionar nuevos agonistas/antagonistas de la kisspeptina
potentes y eficaces.
Financiación. CVI-139, CTS1705 (JA), BFU2004-03883 (MEC), PI042082 (IS Carlos III):
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
ACCION DIRECTA DE KISSPEPTINA-10 SOBRE CÉLULAS
PRODUCTORAS DE INSULINA
A.J. Martínez-Fuentes*, E. Gutiérrez-Pascual, M.M. Malagón y J.P. Castaño.
Dpto. Biología Celular, Fisiología e Inmunología. Universidad de Córdoba.
Tel.: 957 218594. *bc2mafua@uco.es.
Las kisspeptinas, ligandos naturales del receptor acoplado a proteínas G
GPR54, son un conjunto de péptidos relacionados estructuralmente
codificados por el gen KiSS-1. Éste fue originalmente identificado por su
carácter inhibidor de la progresión tumoral y más recientemente se ha
documentado la participación del sistema KiSS-1/GPR54 en el
mantenimiento del eje reproductor estimulando la secreción de
gonadotropinas, fundamentalmente a través de su acción sobre la liberación
del decapéptido hipotalámico GnRH. Sin embargo, las acciones biológicas de
KiSS-1 y GPR54 no sólo parecen estar restringidas al nivel hipotalámico,
puesto que más recientemente se ha descrito la expresión de ambos en
páncreas humano y de ratón, lo que sugiere un posible papel de las
kisspeptinas en la regulación de la función de los islotes pancreáticos. Con
objeto de profundizar en el estudio de estas posibles acciones biológicas del
sistema KiSS-1/GPR54, nos propusimos determinar el efecto de kisspetina10 sobre células beta-pancreáticas Ins-1. En primer lugar, mediante RT-PCR
demostramos la expresión de transcritos de KiSS-1 y GPR54 en las células
Ins-1. A continuación, evaluamos la acción directa de la kisspeptina-10 sobre
la dinámica del calcio libre citosólico ([Ca2+]i) mediante estudios
microfluorimétricos, observando que aproximadamente el 70% de las células
Ins-1 respondían con un aumento significativo en la [Ca2+]i. La demostrada
correspondencia que existe entre dicho aumento y la subsiguiente secreción
hormonal, permite sugerir que las kisspeptinas pueden aumentar
directamente la liberación de insulina. Además, la detección de KiSS-1 y su
receptor en el mismo tipo celular sugiere que las kisspeptinas endógenas
podrían regular la liberación de insulina mediante una acción autocrina.
Estudios adicionales permitirán esclarecer la contribución concreta del
tándem KiSS-1/GPR54 en la (pato)fisiología del páncreas endocrino.
Financiación. CVI-139, CTS1705 (JA), BFU2004-03883 (MEC), PI042082 (IS Carlos III)
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
REGULACIÓN DE LA SUPERVIVENCIA NEURONAL POR LA VÍA
mTOR/S6K: IMPLICACIONES DE LA SUPRESIÓN DE ESTA VÍA
EN LA ISQUEMIA CEREBRAL
S. Mora-Lee*, M. D. Pastor, N. Fradejas y S. Calvo. Departamento de
Farmacología. Facultad de Medicina y CRIB. Universidad de Castilla La
Mancha. Albacete. Tel 967599200 ext 2998. *Silvia.Mora@alu.uclm.es
La isquemia cerebral constituye la tercera causa de muerte en la
población adulta de los países industrializados y provoca un gran número de
deficiencias neurológicas graves e irreversibles.
Las S6K son una familia de serina/treonina quinasas, que desempeñan
funciones esenciales en el control de la síntesis proteica y del ciclo celular y
participan en la regulación del tamaño, motilidad y supervivencia celular . La
S6K fosforila y activa la proteína ribosómica S6 que es esencial para el
mantenimiento de los componentes de la maquinaria celular de síntesis proteica.
Durante la isquemia cerebral se produce una parada de la síntesis proteica que
se asocia a una disminución de la S6K fosforilada y total . La recuperación de la
viabilidad neuronal tras la isquemia depende, en gran medida, del grado de
recuperación de la síntesis proteica durante el periodo de reperfusión. Estos datos,
que identifican a la S6K como un importante factor protector durante la isquemia
cerebral, nos han llevado a analizar el papel de esta quinasa en modelos de isquemia
cerebral. Para ello hemos utilizado los ratones knockout S6K-/-, en los que ambas
formas de S6K han sido suprimidas mediante recombinación génica. El modelo
utilizado ha sido la privación de oxígeno y glucosa (POG) en cultivos primarios de
células granulares de cerebelo. Tras someterse a diferentes periodos de POG la
viabilidad de las neuronas S6K-/- y control fue medida mediante tinción con
Anexina/Ioduro de Propidio y por la técnica de MTT. Nuestros resultados indican que
las neuronas S6K-/- son más susceptibles a la isquemia que las neuronas control ya
que la POG indujo significativamente más muerte celular en las neuronas S6K-/- que
en las control. Además, periodos de POG de 30 minutos que no afectan la viabilidad
de las neuronas control, resultaron letales para un 20% de las neuronas S6K-/-.
Financiado por MCYT (BFU 2006-14256) y JCCM (PAI 05-017). S. Mora- Lee es becaria del
convenio CONACYT-UCLM de México-España.
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
SEÑALIZACIÓN DEL TGF-β A TRAVÉS DE SMADS EN
FIBROBLASTOS DE PIEL DEFICIENTES EN ENDOGLINA
M. Pericacho*, M. Prieto, S. Velasco, JM. López-Novoa y A. RodríguezBarbero. Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular. Instituto Reina
Sofía de Investigación Nefrológica. Universidad de Salamanca. Salamanca.
Tfno: 923294472. *pericacho@usal.es.
Endoglina (CD105) es un co-receptor del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) expresado mayoritariamente en células endoteliales e implicado en remodelación vascular y angiogénesis. La señalización intracelular
iniciada por TGF-β1 utiliza múltiples vías de señalización intracelular. En la
ruta clásica, TGF-β se une a los receptores tipo II que a su vez reclutan a los
receptores tipo I que determinan la especificidad de la señal. En la mayoría
de las células, TGF-β actúa a través del receptor de tipo I ALK-5 (activin receptor-like kinase 5) que induce la fosforilación de Smad2/3 que provocaría
respuestas celulares como la acumulación de matriz extracelular o la parada
de la proliferación. Sin embargo, se ha descrito recientemente que en células endoteliales, existe una segunda vía en la cual TGF-β se une al receptor
de tipo I ALK-1, promoviendo la fosforilación de Smad1/5 y la activación de
la proliferación. Se ha sugerido que los niveles relativos de endoglina podrían determinar que la señalización de TGF-β en células endoteliales fuera
a través de una u otra vía. En experimentos previos, nosotros hemos demostrado que fibroblastos de piel en cultivo primario procedentes de ratones
haploinsuficientes en endoglina (Eng+/-) presentan una mayor proliferación y
migración con respecto a los control (Eng+/+). Ante estos resultados, nos planteamos si esas diferencias se podrían deber a una activación diferencial en
la vía de las SMADs. Nuestros resultados demuestran, mediante Western
Blot y PCR, que en nuestro modelo celular se encuentran los dos tipos de receptor tipo I (Alk-1 y Alk-5) y que se activa tanto Smad1 como Smad2 en respuesta a TGF-β. A continuación hemos investigado si existe una diferente
activación de las rutas en función de la expresión de endoglina. Sin embargo,
no observamos diferencia en la activación entre los fibroblastos Eng+/+ y
Eng+/-. Esto nos lleva a pensar que las diferencias encontradas previamente
en proliferación y migración no se deben a una activación diferencial de la vía
clásica de TGF-β, debida a la expresión de endoglina.
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
FENOTIPOS DE MUERTE CELULAR INDUCIDA
POR CISPLATINO
S.M. Sancho-Martínez, Y. Quiros, O. García-Sánchez, R. Núñez-Lozano,
J.M. López-Novoa, F.J. López-Hernández.
Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, y
Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca. Tel.:
923 294 472. e-mail: smsanchom@usal.es
El cisplatino es un citostático ampliamente utilizado en la quimioterapia
anticancerosa. Uno de sus efectos secundarios más importantes y limitante
de su actividad terapéutica es la nefrotoxicidad resultante principalmente de
la muerte de las células tubulares. En el segmento proximal, esta muerte
ocurre en su mayoría por necrosis, mientras que en el segmento distal por
apoptosis. En células en cultivo se ha observado que la inducción de un
fenotipo de muerte u otro depende de la dosis de este fármaco. Con objeto
de identificar dianas terapéuticas sobre las que actuar para impedir o
minimizar el daño tubular, nos planteamos estudiar las vías de señalización
que ponen en marcha diferentes dosis de cisplatino en células tubulares y
tumorales humanas en cultivo e identificar aquellas cuya inhibición reduce la
muerte celular. Nuestros resultados indican que dosis altas (>100 microM) de
cisplatino inducen muerte celular por necrosis, mientras que dosis más bajas
(10-100 microM) inducen apoptosis. El bloqueo farmacológico de las vías de
señalización de ERK, AKT, p38 kinasa, Jun kinasa no modifica el porcentaje
ni el fenotipo de muerte celular con ninguna de las dosis de cisplatino
estudiadas (10-1000 microM). El cisplatino, de forma dosis dependiente,
impide la activación de las caspasas y la aparición del fenotipo apoptósico
inducidos por la estimulación del receptor Fas. Esto nos indica que,
probablemente, las concentraciones altas del citostático bloqueen algún
punto de la señalización proapoptósica. De acuerdo con esto, en la muerte
celular por necrosis inducida por altas dosis de cisplatino, la señal intracelular
no llega a la mitocondria y el citocromo c no sale al citosol, lo que sugiere que
el bloqueo de las rutas de apoptosis es anterior a estos eventos.
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SEÑALIZACIÓN Y MUERTE CELULAR
Póster
ESTADO OXIDATIVO DE LA GLÁNDULA DE HARDER DE Spalax
judaei EN CONDICIONES DE NORMOXIA.
C. Soria-Valles, B. Caballero, I. Vega-Naredo, V. Sierra-Sánchez, C.
Huidobro-Fernández, D. Tolivia, M.J. Rodríguez-Colunga, A. Joel*, E. Nevo*,
A. Avivi* y A. Coto-Montes. Departamento de Morfología y Biología Celular.
Universidad de Oviedo.Tfno.: (985) 102779. csoriavalles@hotmail.com
*Laboratory of Animal Molecular Evolution, Institute of Evolution, University
of Haifa, Mount Carmel, 31905 Haifa, Israel
La rata topo Spalax, ha desarrollado estrategias evolutivas para tolerar las
condiciones que se dan en el subsuelo desértico, lugar que constituye su hábitat
natural. La hipoxia provoca daños oxidativos importantes en los animales mantenidos
en estas condiciones que, sin embargo, Spalax ha conseguido contrarrestar. Debido
a ello, este animal es un buen modelo para el estudio de los mecanismos necesarios
para contrarrestar los daños celulares motivados por variaciones de oxígeno.
Hemos estudiado el estado redox de la glándula de Harder (GH) de Spalax, tanto
a nivel macromolecular como en cuanto a su defensa antioxidante. Los resultados
obtenidos se compararon con los existentes en el hámster Sirio, ambos mantenidos
en condiciones de normoxia y se comprobó que, en estas condiciones, Spalax
presenta un daño molecular considerablemente menor tanto a nivel de lípidos como
de proteínas, así como una mayor actividad de enzimas antioxidantes, sobre todo
superóxido dismutasa (SOD), lo cual puede formar parte de sus mecanismos
adaptativos a las fluctuaciones de los niveles de oxígeno.
La apoptosis es un tipo de muerte celular programada controlado por varios
agentes, siendo las caspasas y las catepsinas, los más importantes. Debido a ello,
se estudió la posible alteración de la actividad de las catepsinas B, D y H relacionando
su actividad proteolítica con la actividad de caspasa-3. Los resultados muestran en
Spalax un descenso significativo de la actividad de las catepsinas D y H, en
comparación con la actividad de las mismas en el hámster Sirio. Sin embargo, la
catepsina B, indicadora de la supervivencia celular, no presenta diferencias
significativas entre especies. Los resultados positivos en Spalax del efector apoptótico
caspasa-3, muestran la existencia de este tipo de muerte celular en la GH de la rata
topo, proceso que, sin embargo, no se produce en el hámster Sirio, probablemente
debido al exceso de oxígeno que, para Spalax representa, la condición de normoxia
utilizada.
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Póster
EXPANSIÓN EX VIVO DE CÉLULAS CD34 POSITIVAS DE
SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL MEDIANTE ÁCIDO
VALPROICO
A. Gaztelumendi Onecha, I. Cárcamo, N. Tejados , I. Ferrín y C. Trigueros.
Departamento de Células Madre Hematopoyéticas y Mesenquimales.
Fundación Inbiomed. Donostia-San Sebastián. Tfno.: (943) 309064.
* agaztelumendi@inbiomed.org
La expansión ex vivo de las Células Madre Hematopoiéticas (CMH) y el
mantenimiento de su capacidad de autorrenovación representan un
importante objetivo en terapia celular y génica. Se ha visto que hay
compuestos químicos que son capaces de mantener durante más tiempo la
expresión del marcador de membrana CD34 en cultivo, el cual agrupa a una
población rica en CMH y progenitores. Uno de estos compuestos es el ácido
valproico, un potente inibidor de la actividad histona deacetilasa (HDAC). La
inhibición de la desacetilación de las histonas conlleva el mantenimiento de
la activación transcripcional de determinados genes durante los procesos de
diferenciación. En el presente estudio se ha analizado el efecto del ácido
valproico en el mantenimiento de la capacidad de autorenovación de las
células CD34 procedentes de sangre de cordón umbilical. Nuestros datos
demuestran que el mantenimiento de fenotipo inmaduro de dichas células
es debida principalmente a una inhibición de la diferenciación del linaje mielomonocítico (CD45RA+14- y CD45RA+CD14+). Por su parte, el ácido
valproico no parece tener ningún efecto en eritropoyesis (CD235+).
Experimentos preliminares de cribado utilizando RNAi sobre HDAC sugieren
que la proteína HDAC3 sería la responsable del efecto observado mediante
la utilización de ácido valproico en células madre hematopoyéticas.
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Póster
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LA SUBPOBLACIÓN
CELULAR CD34+ DE PIEL HUMANA
A. Gutiérrez Rivera1, K. Braun2, F. Jiménez3, E. Poblet4 y A. Izeta1,*.
1
Fundación Inbiomed, San Sebastián. Tfno.: (943) 309064,
*aizeta@inbiomed.org. 2Centre for Cutaneous Research, University of
London. 3Clínica del Pelo, Las Palmas de Gran Canaria. 4Complejo
Hospitalario Universitario y Universidad de Castilla-La Mancha, Albacete.
La epidermis requiere de una autorrenovación contínua que se cree
mediada por las células madre epiteliales (CME). Las CME murinas son CD34+
y se sitúan en la protuberancia (bulge) de la vaina externa que recubre el folículo
piloso. En el ser humano, hay discrepancias importantes en la literatura sobre
la localización y fenotipo de las CME.
Nuestro principal objetivo fue el aislamiento y caracterización de las células
CD34+ a partir de piel humana, así como la localización de las mismas en el
folículo piloso y la epidermis interfolicular, mediante técnicas de
inmunofluorescencia sobre wholemounts. El tratamiento de biopsias de piel
total de donantes sanos con colagenasa dio lugar a una suspensión celular con
un alto porcentaje (4-30%) de células CD34+. Tras descartar su origen
hematopoyético y endotelial, estudios de citometría e inmunofluorescencia
demostraron el origen dérmico de una proporción elevada de la población
CD34+, descartandolas como CME. Ensayos de clonogenicidad demostraron
una mayor capacidad clonogénica de las células CD34- frente a las CD34+.
Sin embargo, una pequeña proporción de las células CD34+ podría
corresponder con la fracción CME de piel humana. Un estudio comparativo de
la expresión de CD34 en distintas fracciones obtenidas mediante distintos
tratamientos de la piel en biopsias del mismo donante, confirmó la existencia de
una elevada proporción de células CD34+ en la dermis (11-20%) y una menor
expresión en la epidermis (0,07-0,28%). Se está caracterizando la capacidad de
auto-renovación y diferenciación de las diferentes fracciones obtenidas en
comparación con otros marcadores descritos.
Bibliografía
Poblet y cols. (2006) Clin. Exp. Dermat., 31, 807–812.
follicles: a comparative study with the bulge marker CK15
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Póster
MEJORA DE EQUIVALENTES CUTÁNEOS PARA SU USO EN
ENSAYOS CLÍNICOS DE TERAPIA CELULAR
A. Monfort, V. Pérez, A. Pavón y A. Izeta*. Inbiobank, Laboratorio
farmacéutico de terapia celular (N. 4206-E), San Sebastián. Tlfno.: (943)
306094, *aizeta@inbiomed.org
La epidermolisis bullosa distrófica (EBD) es una enfermedad genética
rara, actualmente sin cura, donde mutaciones en el gen que codifica el
colágeno VII provocan la formación de ampollas a nivel de la unión
dermoepidérmica con grave afectación de la calidad de vida de los afectados.
En muchos casos, la contínua autorrenovación del tejido deriva en carcinoma
espinocelular a edades relativamente tempranas (<35 años).
Nuestro grupo está actualmente en fase de producción de láminas de
piel ingenierizada para su uso en un ensayo clínico en fase II, como una
nueva terapia paliativa para la EBD. Los equivalentes incluyen una bicapa
donde la epidermis es de origen autólogo y la dermis artificial se compone de
fibroblastos alogénicos (que proveen el colágeno VII necesario para que las
láminas se anclen correctamente) embebidos en plasma sanguíneo
coagulado procedente de donantes de plasmaféresis. Se espera que estos
equivalentes proporcionen una cura paliativa de larga duración que mejore
la calidad de vida de estos pacientes.
Nuestros objetivos en este trabajo son: 1) implementar mejoras en el
proceso de producción de las láminas, estudiando la densidad óptima de
plaqueo celular y la capacidad de formación de estrato córneo, 2) mejorar
estética y funcionalmente el producto mediante la introducción de nuevos
tipos celulares y 3) dotar a la piel de un tejido graso subyacente a la dermis
que confiera a nuestro producto una mayor facilidad de manejo y mejor
adaptabilidad al cuerpo del paciente. Se discutirán los logros alcanzados en
estas áreas y su comparación con otros equivalentes cutáneos disponibles
en el mercado.
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Póster
INHIBICIÓN ADIPOGÉNICA DE CÉLULAS MADRE
MESENQUIMALES ADULTAS HUMANAS MEDIADA POR
LA INHIBICIÓN DE LAS DEACETILASAS DE HISTONAS
N. Tejados, I. Cárcamo, A. Gaztelumendi, I. Ferrín y C. Trigueros.
Departamento de Células Madre Hematopoyéticas y Mesenquimales.
Fundación Inbiomed. Donostia-San Sebastián. Tfno.: (943) 309064.
*ntejados@inbiomed.org.
Los mecanismos epigenéticos, los cuales constan de modificaciones del
DNA y de las histonas, tienen como resultado el silenciamiento heredable de
los genes sin afectar a la secuencia codificante.
Tanto en células madre embrionarias como adultas el proceso de
diferenciación está controlado por dichos mecanismos epigenéticos, dando
una mayor o menor accesibilidad a la trascripción génica. En la actualidad
existen numerosos compuestos químicos capaces de inhibir las proteínas
responsables de dichos procesos. Estas drogas provocan normalmente la
inhibición de enzimas como son las DNA-metiltransferasas (DNMTs) o
Deacetilasas de Histonas (HDACs). En este sentido, el ácido valproico,
utilizado en el tratamiento de diferentes patologías humanas, es capaz de
inhibir las HDAC y, más concretamente, las pertenecientes a la familia de
clase I constituida por HDAC1, HDAC2, HDAC3 y HDAC8.
La utilización del ácido valproico da lugar a una inhibición de los procesos
adipogénicos. Sin embargo, no existe en la actualidad un conocimiento
exacto sobre el papel de cada una de las HDACs en los procesos de
proliferación y diferenciación de células madre mesenquimales. Por esta
razón, se decidió realizar un cribado funcional de la familia de clase I de las
HDAC mediante RNA de interferencia. Nuestros datos demuestran que la
proteína HDAC2 es necesaria para el crecimiento de las Células Madre
Mesenquimales humanas procedentes de médula ósea. Al mismo tiempo,
hemos concluido que dicha proteína es una de las responsables de la
capacidad adipogénica de dichas células, ya que la inhibición de su
expresión da lugar a una disminución en el número de adipocitos generados.
La accesibilidad trascripcional de los genes responsables de los procesos
adipogénicos a través de HDAC2 está siendo valorada en estos momentos.
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CÉLULAS TRONCALES Y TERAPIA CELULAR
Póster
INESTABILIDAD CROMOSÓMICA EN CULTIVOS IN VITRO
DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS DE RATÓN
N. Gaztelumendi1, A. Pla2, J. Cairó2 F. Gódia2 y C. Nogués1.
1
Dep. Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia y 2Dept. Enginyeria
Química. Universitat Autònoma de Barcelona.
93-5811112. carme.nogues@uab.es
Las células madre embrionarias (ESC) son células indiferenciadas
pluripotentes, derivadas de la masa celular interna de embriones en estadio
de blastocisto. Su gran potencial de proliferación y diferenciación in vitro a
todos los tejidos, ha generado grandes expectativas dentro del campo de la
medicina regenerativa y terapia celular. El proyecto donde se enmarca esta
comunicación consiste en la obtención de islotes pancreáticos y condrocitos
a partir de la diferenciación in vitro de la línea celular E14 de ESCs de ratón.
Durante el desarrollo de los experimentos, se observaron cambios en la
morfología y ritmo de crecimiento en algunos de los cultivos de
mantenimiento de ESC indiferenciadas. Para dilucidar si los cambios
observados eran debidos a una transformación celular, se aplicaron técnicas
de citogenética clásica, obteniendo un cariotipo modal aberrante a pase 65.
Para averiguar en qué momento se produjo la transformación se analizó
el cariotipo a pases inferiores: 29, 33, 36 y 39. En todos ellos, el cariotipo
modal difería del normal, siendo de 42 cromosomas a pase 29, bimodal a
pase 33 y de 52 a pases 36 y 39. Se detectaron también cambios
cromosómicos estructurales, observando la presencia de cromosomas
submetacéntricos en muchas de las metafases analizadas.
Actualmente se esta ampliando el estudio citogenético a otras líneas
celulares para caracterizar la estabilidad cromosómica de las ESC en cultivo.
En esta comunicación discutimos la importancia de la caracterización
citogenética de las líneas de células madre embrionarias antes y durante el
desarrollo de protocolos de diferenciación.
Financiación: BIO2005-08190
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ÍNDICE
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Página 155
Agorreta J. ...............................109
Aréchaga J.................................54
Aguilar-Quesada R. .....................8
Ariza J. .....................................115
Alberch J. ...................................18
Arrieta A. ..................................124
Alcaraz-Pérez F.......................8,99
Arroyo Y.................................43,87
Alfonso M. ....................................2
Asumendi A....................43,87,101
Aller P. ..........................................8
Avivi A. .....................................148
Alonso, A....................................21
Azcoitia I. ...................................54
Alonso M. .....................................3
Bajo-Grañeras R. .....................120
Alonso M.A...................................9
Ballesta J. ..................................72
Alonso-Alegre S. ..........................3
Bandres E. ............................83,84
Álvarez Barrientos A. .................33
Bañón-Rodríguez I..............56,130
Alvarez-Barrientos A. ...............141
Barbáchano A. ...........................44
Alvarez-Díaz S. ..........................44
Batista A.....................................29
Álvarez-López R. .....................133
Becerra J..........................51,93,94
Amrán D.....................................88
Beltrán-Frutos E.........................53
Andollo N. .............................43,87
Bengoechea R. ...................80,135
Andrades J.A. .......................93,94
Benito-López P...........................75
Andrés L.....................................29
Berciano M.T. .......44,59,80,82,135
Andreu V. ...................................62
Bernal-Mañas C.M. ....................53
Anouar Y...................................132
Bernardo M.V. ..........................133
Ansó E. ...............................65,100
Bertran E......................45,102,141
Antón I.M............................56, 130
Blanco D...................................113
Antón O......................................29
Bodegas M.E. ...................124,125
Apraiz A....................................101
Bonifacino J.S. ...........................28
Aranda J.F..................................29
Bonora-Centelles A. ...................95
Aránega A.E...................85,86,136
Bos E. ........................................36
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Página 156
Boyano M.D. ..................43,87,101
Carmona-Cuenca I...................141
Braun K. ...................................150
Carranza C.................................83
Buckingham M. ........................137
Carrasco M.C. .....................57,116
Bueno M.A................................111
Casafont I.........................59,80,82
Burger K.N.J. .............................73
Castaño J.P.
Burgos M....................................58
...........49,75,132,134,140,143,144
Burrell M.A. ..............................131
Castell J.V. .................................95
Busteros J.I. .............................106
Castillo-Briceño P.......................66
Caballero B.................114,117,148
Castro-Garcia P..........................47
Cacicedo L. .........................90,123
Catalán V..................................131
Cairó J......................................153
Catena R....................103,104,108
Caja L..................................45,102
Cayuela M.L..........................68,99
Calasanz M.J. .......................83,84
Chakrabarti N......................79,138
Calvente R. .........................57,116
Chaves Pozo E. ....................66,67
Calviño E..................................139
Chinchilla A. ...............................85
Calvo A................103,104,107,108
Cienfuegos J.A.........................131
Calvo F. ......................................76
Claro E. .................................73,76
Calvo S. ..............................58,145
Claros S. ...............................93,94
Camacho Romero S. .................61
Coll E. ........................................37
Canales J.J. ...............................25
Collados R. ................................62
Cancio I......................................55
Coronado M.J. ......................63,79
Candel S. .................................129
Correas I. ...................................34
Cano I. .....................................128
Corredor E. .........................63,138
Canteras M. ...............................53
Cortés A. ....................................26
Cantero-Nieto G.........................23
Cortes-Eslava J..........................79
Cañavate M.L........................43,87
Coto-Montes A............114,117,148
Cañete M. ..................................89
Crespo P. ...................................76
Cárcamo I. ........................149,152
Cristóbal I..............................83,84
Cárcamo Orive I.........................97
Crosas B. ...................................24
Carmona Martos R.....................61
Cruz-García D...................132,134
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Página 157
Cuadrado A. ...............................32
Fabregat I................45,91,102,141
Cuadros M.A. ......................57,116
Factor V.M..................................91
de Blas E....................................88
Fernandez C. .............................88
de la Rosa Á. .............................86
Fernández M..................90,91,141
de Marco M.C. ...........................29
Fernández P.L. .........................112
de Vega S. .................................52
Fernández-Chacón R.................23
del Castillo G.......................91,141
Fernández-Pacheco R. ..............63
Delgado J...................................97
Fernández-Ulibarri I. ..................73
Díaz R. ..............................104,108
Ferrer C......................................53
Díaz-Pérez J.L. ........................101
Ferrín I. ........................97,149,152
Díaz-Ruiz A. .............................134
Fradejas N. .........................58,145
Díaz-Ruiz J.A. ..........................132
Fraile B..............................105,106
Dickson R.................................103
Fraile-Ramos A. .........................74
Diez J.C. ..................................139
Franco A..............................56,130
Diez-Torre A. ..............................54
Franco D. .......................85,86,137
Dolado I......................................32
Freije J.P. ...................................21
Domezain Fau A. .......................61
Frühbeck G. .............................131
Durán I. ......................................51
Fuentes I. .................................128
Durán-Prado M. ..................49,140
Fuentes-Calvo I..........................92
Echeverría M..............................81
Fukumoto S................................52
Egea G.................73,76,77,78,130
Gago N.......................................96
Egeblad M..................................19
Gahete M.D.........................49,140
Emery V.C. .................................74
García Ayala A. .....................66,67
Espada J. ...................................21
García de Galdeano A. ..............43
Espín R. ...................................129
García E.M............................46,50
Esteban M..................................74
García-Ayala A...........................69
Esteller A..................................142
García-Junco-Clemente P..........23
Esteller M. ..................................31
García-Navarro S.....................140
Ewald A.J. .................................19
García-Sánchez O. ...........142,147
Fabra A. ...................................102
García-Tuñon I. .................105,106
157
CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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Página 158
Garrido J.J. ................................56
Hurley J......................................28
Gaztelumendi A...................97,152
Ibarra M.R. .................................63
Gaztelumendi N. ......................153
Iglesias D. ..................................45
Gaztelumendi Onecha A. .........149
Imbuluzqueta I. .................124,125
Gil J............................................45
Irigoyen M. ..........................65,100
Gil M.J......................................131
Izaguirre N. ................................43
Gil-Bazo I. ................................103
Izeta A. .........................96,150,151
Gimeno L. ................................133
Izu R.........................................101
Giraldo P. ...................................84
Jiménez A. .................................29
Gódia F.....................................153
Jiménez F.................................150
Gómez-Ambrosi J. ...................131
Jiménez L...................................52
Gómez-Benito M. .......................84
Jiménez N. .................................73
Gómez-Lechón M.J....................95
Jiménez-Enjuto E.......................93
Gómez-Ramos P. .......................64
Jiménez-Reina L. .......................75
González, C. ............................121
Joel A. ......................................148
González-Aragón D..................115
Jover R.......................................95
González-Melendi P. ..................63
Kelly R......................................137
González-Moreno O...103,104,107
Konerding M.A. ..........................54
Gosálbez A.................................34
Kotoulas G. ................................70
Goud B.......................................41
Lafarga M.............44,59,80,82,135
Green J.E..........................103,108
Lafarga V....................................32
Guruceaga E............................103
Larrayoz M.J. ......................83,109
Gutiérrez Rivera A....................150
Larriba M.J. ................................44
Gutiérrez-Pascual E..........143,144
Lázaro-Diéguez F.............73,76,77
Hassan-Walker A.F.....................74
Leal-Cerro A...............................75
Hergueta M. ...............................49
Legaz I. ......................................46
Hernandez R. ...........................110
Leprince J. ...............................143
Hernandez-Verdun D. ................30
Lerma J. .....................................22
Huh J.I...............................103,108
Liarte S.......................................67
Huidobro Fernández C.114,117,148
Linares-Clemente P....................23
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Llobet A. .....................................60
Martínez E................................121
Llopis J.......................................77
Martínez G. ................................37
López M.C.............................46,50
Martínez Pinilla E. .............119,120
López-Garcia I. ........................122
Martínez S.E. ........................73,76
López-Hernández F.J........142,147
Martínez-Alonso E. .............72,130
López-Iglesias C. ..................37,78
Martínez-Fuentes A.J.
López-Muñoz M.A............68,71,99
................................49,75,143,144
López-Novoa J.M.
Martínez-Irujo J.J. ...............65,100
................92,126,127,142,146,147
Martínez-Menárguez J.A............72
López-Otín C..............................21
Martínez-Onsurbe P. ................105
Lospitao E. .................................34
Martínez-Salgado C. ..................92
Lozano M.D..............................109
Matía I. .......................................81
Lozano Velasco E. ...................136
Medina F.J..................................81
Lucas J.J....................................64
Megías L. ...................................78
Madrid R. ...................................29
Melhiac S. ................................137
Malagón M.M.
Mérida I. .....................................73
...........49,75,132,134,140,143,144
Meseguer J.
Manjón J.L. ..............................139
............66,67,68,69,70,71,128,129
Marco S......................................38
Monfort A..................................151
Marco S. ...................................118
Montuenga L.M. ...............109,113
Marcotegui N..............................83
Mora-Lee S. ........................58,145
Marí-Beffa M. .............................51
Morán M.A. ................................64
Marigómez I. ..............................55
Moreno-Bueno G. ......................49
Marín M.P. ..................................78
Moreno-Rascón N....................137
Marín-Menéndez A.....................47
Muhialdin J.Sh. ..........................87
Marín-Teva J.L. ...................57,116
Mulero I. ..............................69,128
Marquina C. ...............................63
Mulero V.
Marsh M. ....................................74
.......66,67,68,69,70,71,99,128,129
Martín-Oliva D. ...............48,57,116
Muñoz A. ....................................44
Martínez E...........................65,100
Muñoz-Gámez J.A. ....................48
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CONGRESO BIOLOGIA:Maquetación 1
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Página 160
Murillo M.M. .............................141
Pacios-Bra C..............................34
Murthy N. ...................................28
Pajares M.J. ......................109,113
Nakamura T................................52
Pajuelo L. .................................139
Navarro, A. ...............................121
Palacios N...........................90,123
Navarro C...................................90
Paniagua R. ......................105,106
Navarro D...................................44
Parrado A. ................................133
Navarro E.................................102
Pastor D. ....................................58
Navarro F. ..................................86
Pastor L.M..................................53
Navarro Incio A..................119,120
Pastor M.D. ..............................145
Navarro S...................................53
Pavón A....................................151
Navascués J.................57,116,135
Pelchen-Matthews A. .................74
Nebreda A.R. .............................32
Pena E. ......................................59
Nevo E. ....................................148
Peralta-Leal A. ...........................48
Nguewa P...................104,107,108
Pérez Menéndez C. .................110
Nicolás Domínguez J. ................86
Pérez V.....................................151
Nicolás F.J.............................46,50
Pérez-Carbajales C....119,120,121
Nicolau-Galmés F..................43,87
Pérez-de-Luque A. .....................63
Nieto-Rementería N. ................101
Pérez-Ferreiro C.M. ...................34
Nogués C. ................................153
Pérez-González A.P. ..................60
Núñez-González C...................105
Pérez-Otaño I....................118,122
Núñez-Lozano R. ..............142,147
Pérez-Victoria F.J. ......................28
Ochoa J.A. ...............................139
Pérez-Yarza G. ..............43,87,101
Odero M.D. ...........................83,84
Pericacho M. ..............126,127,146
Oliver F.J. ...................................48
Peters P......................................36
Ordóñez Camblor C. .........119,120
Picorel R. ...................................62
Ordóñez C................................121
Pierson J. ...................................36
Ordóñez-Morán P.......................44
Pintos B. ...................................111
Ortega-Martínez I..................43,87
Pio R. ................................109,113
Ortiz de Solórzano C..................35
Pla A.........................................153
Ostos Garrido M.V......................61
Poblet E. ..................................150
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Pontvianne F. .............................81
Rozas J.L. ..................................23
Prabhu Y.....................................28
Rubiales D. ................................63
Prieto M.............................126,146
Rubio A.....................................113
Prior C...............................107,108
Ruiz de Almodovar J.M. .............48
Prósper F....................................40
Ruíz S. .......................................37
Pulido M.R. .........................75,134
Ruiz-Larrea M.B.........................87
Quiles R. ....................................48
Ruiz-Sáenz A. ............................34
Quintero-Cabello A.....................75
Sáez-Vásquez J.........................81
Quiros Y.............................142,147
Saint-Michel E..........................122
Ramírez Castillejo C. .................47
Salvador J. ...............................131
Raska I.....................................138
Sánchez A...........................91,141
Real F.X. ....................................20
Sánchez I. ...........................90,123
Rejas M.T. ..................................74
Sánchez Madrid F. .....................27
Rello-Varona S...........................89
Sánchez Y. .................................88
Renau-Piqueras J. ................76,78
Sánchez-Franco F...............90,123
Risco C. .....................................74
Sánchez-Grande M.............90,123
Risueño M.C.......62,63,79,111,138
Sánchez-Sánchez J.L. ...............47
Rivell G. .....................................83
Sancho P.............................45,139
Roca F.J. .............................70,129
Sancho-Martínez S.M. ......142,147
Rodríguez A. ............................131
Santamaría J.A. .........................51
Rodríguez-Barbero A. 126,127,146
Santos A.M..........................57,116
Rodríguez-Colunga M.J.
Santos E. ...................................92
....................................114,117,148
Santos-Ruiz L. ...........................51
Rodríguez-Huete A. .................138
Sarri E. .......................................73
Rodríguez-Spiteri N. ................109
Sarropoulou E. ...........................70
Rojas R. .....................................28
Segura Moreno M.T. ..................61
Roncero C..................................91
Segura V............................103,113
Rotellar F..................................131
Selva J. ......................................76
Rouzaut A. ..........................65,100
Sepulcre M.P...............66,69,70,71
Royuela M.........................105,106
Serrano D..........................104,107
161
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Sesma M.P........................124,125
Unda F........................................52
Sherris D. .................................104
Valero R.A. .................................44
Sierra-Sánchez V. .............117,148
Valgañon M. ...............................84
Silva C......................................131
Vallés I......................................113
Silván U......................................54
Varela I. ......................................21
Solchaga L.A..............................39
Vaudry H. ..........................132,143
Soler M. ....................................112
Vázquez I. ..................................83
Solís M.T............................111,138
Vázquez-Martínez R. ...75,132,134
Soria-Valles C.............114,117,148
Vega-Naredo I. ...........114,117,148
Soto J.........................................82
Velasco Alonso J. .....................110
Soto M........................................55
Velasco S. .........................127,146
Stockert J.C. ..............................89
Vicente C. ..................................83
Talens-Visconti R. ......................95
Vilella M. ....................................73
Tapia O..................................59,82
Villalba J.M. ..............................115
Tassi M. ...............................57,116
Villalobos C. ...............................44
Tejados N. ....................97,149,152
Villanueva Á. ..............................89
Tejedor M.C..............................139
Villaro A.C. .......................124, 125
Terán-Villagrá N. ........................80
Vinyals A. .................................102
Testillano P.S. .....62,63,79,111,138
Wandosell F................................56
Thomson T.M............................112
Webb S.M. .................................75
Thorgeirsson S.S. ......................91
Werb Z. ......................................19
Tolivia D. .....................114,117,148
Yamada Y. ..................................52
Tolivia Fernández J. .................120
Yelo E.......................................133
Tolivia. J. ...........................119,121
Zaldibar B...................................55
Tomás M. ..............................72,78
Zapata A.G.................................26
Tomás-Zapico C. ......................114
Zapico A. ..................................106
Tonon M.C................................132
Zuasti A. .....................................53
Torres-Peraza J. .......................118
Zuazo A....................................100
Trigueros C. .................97,149,152
Zulueta J. .................................109
Ugalde A.P. ................................21
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