Guia 4 extraccion ADN (1)

UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA
DE COLOMBIA. UPTC
Biología Molecular
GUÍA PRÁCTICA N°3
EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE
CÉLULAS SANGUÍNEAS
1. OBJETIVOS
- Comprender los principios de la extracción de ADN de células animales.
- Realizar la extracción y purificación de ADN a partir de sangre periférica.
2. INTRODUCCIÓN
La extracción de ADN es uno de las metodologías más útiles en biología molecular, ya que
muchos procedimientos dependen de una buena cantidad y calidad de ADN. Este es el
paso inicial en técnicas como amplificación, clonación y secuenciación entre otros. En el
proceso de extracción es necesario separar el ADN de otras moléculas y partículas
celulares para tenerlo de la manera más pura posible.
Existen muchos métodos para extraer el ADN, para elegir uno se debe tener en cuenta: el
tipo de tejido del cual se va a obtener, la integridad del tejido y la cantidad disponible para
hacerlo. Adicionalmente, es importante considerar el tipo de estudio a realizar. Lo usual al
trabajar con animales es obtenerlo de sangre, mucosa oral, folículo piloso y porciones de
tejido, entre otros.
El proceso de extracción requiere de una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen
que romperse la pared celular (en el caso de células con pared) y la membrana plasmática
para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la
membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de
enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite.
3. MATERIALES Y REACTIVOS NECESARIOS
1. Muestra de 5ml de sangre periférica en tubo con EDTA
2. Buffer de lisis de glóbulos rojos
3. Buffer de lisis de glóbulos blancos
1
4.
5.
6.
7.
Solución precipitante de proteínas
Isopropanol frío
Etanol 70% (frío)
Agua desionizada estéril
Procedimiento antes del laboratorio
1. Revise los conceptos necesarios para tratar de explicar por qué se usan esos reactivos
en cada una de las soluciones de trabajo en este laboratorio.
2. Revise cuál es el funcionamiento de los equipos que se usarán en esta práctica.
3. Previo a la clase se requiere de una muestra de 5ml de sangre periférica que se
tomará en el laboratorio de ciencias naturales. Esta muestra se tomará por
venopunción en un tubo que contenga EDTA como anticoagulante.
Procedimiento durante el laboratorio.
1. En un tubo Falcon de 15 ml medir 6 ml de buffer de lisis de glóbulos rojos y sobre este
adicionar 5 ml de sangre total (lo que contenga el tubo tapa lila). Mezclar muy bien y
con mucha suavidad hasta completa homogenización.
2. Agitar fuertemente en una plataforma (shaker) durante 15 minutos a temperatura
ambiente.
3. Centrifugar a 3000 rpm durante 8 minutos.
4. Descartar el sobrenadante y conservar el pellet.
5. Mezclar vigorosamente el pellet (vórtex) en el líquido residual.
6. Adicionar 2,5 ml de buffer de lisis celular y mezclar cuidadosamente con chupa plástica
varias veces, hasta completa homogenización. Dejar al menos 30 minutos a
temperatura ambiente (preferiblemente 12 horas a 37°C).
7. Adicionar 800 ul de solución precipitante de proteínas (no mezclar).
8. Centrifugar a 4000 rpm durante 20 minutos.
9. Verter el sobrenadante en un tubo Falcon de 15 ml que contenga 2,4 ml de
isopropanol frío, dejar en reposo al menos unos 5 minutos.
10. Mezclar cuidadosamente por inversión hasta precipitar el DNA.
11. Envolver el DNA en una pipeta pasteur de vidrio y pasarlo rápidamente por Etanol
70% frío, dejar secar a temperatura ambiente por unos segundos y resuspender
finalmente en T10E1 (50 – 500 ml) dependiendo de la cantidad de DNA recuperado.
12. Colocar en plataforma (shaker) a velocidad lenta, toda la noche a temperatura
ambiente para resuspender por completo el DNA.
13. Chequear al día siguiente en agarosa y almacenarlo a -20°C.
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Preparación de reactivos
Buffer de lisis de glóbulos rojos
1. 8,3 g de cloruro de amonio
2. 2 ml de EDTA 0,5 M pH: 8.0
3. 1 g de bicarbonato de potasio
4. 800 ml de H2O destilada
Mezclar en un erlenmeyer con magneto hasta homogenización completa.
Completar a 1000 ml con H2O destilada.
Autoclavar en alícuotas de 500 ml
Almacenar a 4°C.
Buffer de lisis celular (lisis glóbulos blancos)
1. 50 ml de EDTA 0,5 M pH: 8.0
2. 200 ml de SDS 10%
3. 600 ml de H2O
Mezclar cuidadosamente (evitando la formación de espuma) en un erlenmeyer hasta
homogenización completa.
Completar a 1000 ml en una probeta con H2O destilada.
No autoclavar.
Almacenar a temperatura ambiente en alícuotas de 500 ml.
Solución precipitante de proteínas
1. 385,4 g de acetato de amonio
2. 100 ml de H2O destilada.
Mezclar en un erlenmeyer usando magneto hasta completa homogenización, puede
requerir calentamiento ligero.
Completar a 500 ml con agua destilada.
Autoclavar en alícuotas de 250 ml.
Almacenar a 4°C.
4. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1) ¿Cuál es la función del buffer de lisis de glóbulos rojos dentro de la reacción?
Explique su reacción osmótica.
2) ¿Para qué sirve el etanol frío?
3) ¿Para qué se precipitan las proteínas?
5. BIBLIOGRAFÍA
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of the Cell, 5th ed., Garland Pub., 2007.
Alberts B, Brays D, Hopkin K, Jhonson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P, López G.
Introducción a la biología celular. Médica Panamericana, 2011.
Lodish, H., Berk, A., Zipursky, L., Matsudaira, P., Baltimore, D. and Darnell, J. Molecular
Cell Biology, 5th ed., W. H. Freeman, 2004.
Watson, J.D., et al. Molecular Biology of the Gene, 6th ed., Benjamin Cummings and
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008.
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