Métodos de estudio celular BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR TM. MsC. Willi Quino Sifuentes CLASIFICACIÓN I) Técnicas para el estudio fisicoquímico: sirven para conocer la composición y relacionar esta composición con las estructuras celulares. Estos métodos son: a) Centrifugación b) Cromatografía c) Electroforesis d) Cultivos "in vitro“ Hay un problema: • Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas. II) Técnicas para el estudio morfológico de la célula. Nos permiten conocer cómo es su forma, su tamaño y su estructura. Son, fundamentalmente: a) Microscopía óptica b) Microscopía electrónica: 1) Microscopio electrónico de Trasmisión (MET) 2) Microscopio electrónico de barrido (MEB) A) CENTRIFUGACIÓN Consiste en la separación de los componentes de una mezcla en función de las diferencias entre las velocidades que presentan al someterlos a elevadas rpm. Esta técnica requiere los siguientes pasos: 1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEIZACIÓN: Obtendremos así una "papilla" que estará compuesta de restos de membranas, orgánulos celulares, núcleos, moléculas libres y agua 2) CENTRIFUGACIÓN: B) CROMATOGRAFÍA Se fundamenta en la separación de los componentes de una mezcla por sus diferencias de absorción. Éstas diferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van der Wals que se establecen entre los componentes de la mezcla y una sustancia que actúa de fase estacionaria. Según la naturaleza de la fase estacionaria, tendremos los siguientes tipos de cromatografía: 1) CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL: 2) CROMATOGRAFÍA DE GASES El aparato consiste en un serpentín largo y delgado (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza y atraviesa el serpentín transportada por un gas. La fase estacionaria retiene más o menos los diferentes componentes de la mezcla. Éstos se detectan cuando al atravesar una llama entran en combustión, lo que aumenta la conductividad eléctrica del detector. C) ELECTROFORESIS Naturalmente este método se empleará con sustancias que presenten cargas eléctricas (proteínas y ácidos nucléicos) D) CULTIVOS IN VITRO • • Estos métodos nos van a permitir mantener líneas celulares en el exterior de un organismo en condiciones favorables a su multiplicación. La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biológico y su estandarización. Las células extraídas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones físicas y químicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son capaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada tipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos períodos de tiempo. II) MÉTODOS MORFOLÓGICOS • • Los métodos morfológicos nos van a permitir la observación directa de la estructura celular. El ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre sí 0,2 mm. Éste es el poder separador o poder de resolución del ojo. Las células de mamífero suelen tener unos 0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellas detalles estructurales. El microscopio va a permitir su observación al aumentar el poder de resolución del ojo CLASES DE MICROSCOPIOS A) MICROSCOPIO ÓPTICO O FOTÓNICO 1) FUNDAMENTO: Funciona de la siguiente manera: Una fuente luminosa envía rayos de luz a una primera lente, llamada condensador, que concentra los rayos de luz sobre el objeto a observar. Estos rayos atraviesan el objeto y una lente denominada objetivo da una imagen aumentada de éste. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por el objetivo. Esta última imagen es la que será recibida por el observador. 2) PREPARACIÓN DEL MATERIAL: En el microscopio óptico la luz atraviesa el objeto a observar. Si éste es muy grueso, la luz no lo atravesará y el objeto aparecerá demasiado oscuro; además se superpondrán los diferentes planos dando una imagen borrosa. Si el objeto es demasiado delgado o muy transparente, no se observarán sus estructuras. En cualquier caso, deberemos realizar una preparación. En general, una preparación requiere las siguientes etapas a- CORTE. Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominados micrótomos. Éstos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor, corrientemente entre 3 μ y 20 μ. b- FIJACIÓN. Su fin es matar a las células con la menor alteración de las estructuras posible, para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismo celular o por la descomposición. c- DESHIDRATACIÓN. La extracción del agua del interior de las células permitirá también una mejor conservación y la penetración de los colorantes. d- TINCIÓN. Es la coloración de las células o de partes de éstas para que resalten y posibilitar así su observación. Algunos colorantes son selectivos pues tiñen partes concretas de la célula. Existen dos clases de colorantes: 1) Los colorantes vitales. Que tiñen las estructuras celulares pero sin matar a las células (por ejemplo: el verde jano, el rojo neutro, el azul tripán, el azul de metileno). 2) Los colorantes no vitales. Que matan a las células (eosina, hematoxilina). e- MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre un porta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre "porta" y "cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duración limitada y sólo sirven para la observación momentánea o a lo sumo de unos días. Si se desea una mayor duración debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina . B1) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET) FUNDAMENTO: El microscopio electrónico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos teóricos de De Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partículas. Como ondas pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al ser partículas negativas pueden ser desviadas por campos eléctricos que actúan como lentes. Los microscopios electrónicos permiten aumentos útiles que van de 2000 a 100.000 pudiendo llegar hasta 600.000. Los microscopios electrónicos son aparatos de hasta 2 m de alto y llegan a pesar 500 kg. B2) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB) Este tipo de microscopio permite obtener imágenes tridimensionales del objeto a estudiar. Primero se efectúa un sombreado metálico de la superficie de la muestra, y la réplica obtenida es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se forman son captados y convertidos en imágenes sobre una pantalla de televisión. Estos microscopio son muy útiles para revelar estructuras anatómicas submicroscópicas, sin embargo su aumento no suele pasar de 20.000 Ernst Ruska Tinción de células para la observación microscópica Extensión de una fina capa de células sobre el porta Adición del colorante lavado y secado Secado al aire Fijación por flameado del porta Se coloca una gota de aceite de inmersión sobre el porta y se observa con el objetivo de 100X Tinción de Gram Tinción del frotis Paso 1 Paso 2 Previamente fijado al calor, con cristal violeta Durante 1 minuto. Todas las células se tiñen de color azul-violeta. Añadir Lugol, dejar actuar 2 minutos Todas las células siguen de color azul-violeta. Gram + Decolorar con alcohol Paso 3 Las células Gram + siguen de color azul-violeta. Las Gram negativas se decoloran. Tinción de contraste Con safranina 2 minutos. Las células G+ se ven azul-violeta. Paso 4 Las G- rosas o rojas. Gram - FORMA DE LAS BACTERIAS cocos bacilos espirilos L. Monocytogenes V. cholerae Helycobacter pylori Campylobacter sp. FLORA NORMAL VAGINAL lactobacilos célula epitelial Streptococcus Cocos gram positivos Bacilos Gram negativos TINCIÓN DE GRAM: APLICACIONES • • • • • • LCR y otros fluidos estériles Esputo Exudado uretral Exudado vaginal Exudados inflamatorios Orina 33 Microbiología Clínica: Tema 1 INFORMACIÓN QUE APORTA UNA TINCIÓN DE GRAM EN MUESTRAS CLÍNICAS (EXUDADOS INFLAMATORIOS Y FLUIDOS ESTÉRILES) • Permite evaluar la calidad de la muestra. Presencia de: – Células inflamatorias → muestra adecuada – Células epiteliales → posible contaminación • Permite visualizar la morfología, su disposición y localización intra o extracelular de las bacerias • Permite diferencias bacterias Gram + y Gram – • Permite detectar la presencia de flora contaminante • Permite cuantificar el número de bacterias 34 Microbiología Clínica: Tema 1 Coloración de Ziehl- Neelsen Bacterias, virus, viroides, y priones BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR TM. MsC. Willi Quino Sifuentes BACTERIA (HISTORIA) Anton van Leeuwenhoek (1683) observó la bacteria por primera vez. Ehrenberg (1828) propuso el nombre de bacteria derivado del griego “BAKTER” bastón . Louis Pasteur (1822-1895) y Robert Koch (1843-1910) describieron el papel de la bacteria como causa de enfermedades. MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS Salmonella enteritidis MEMBRANA CITOPLASMÁTICA GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA DIFERENCIAS • GRAM POSITIVA • GRAM NEGATIVA Es mas ancha. 10% de la estructura es peptidoglicano. El 90% esta constituida por peptidoglicano. Capa adicional de Lipopolisacáridos 10% acido teicoico. PORINAS ZONA PERIPLASMATICA Locomoción polar lofotricos anfitricos peritricos FIMBRIAS • Son estructuras opcionales producidas por algunos microorganismos. • NO PARTICIPAN EN LA MOTILIDAD. • Son más cortos que los flagelos y más numerosos. • Son de naturaleza proteica. • Son estructuras que participan en la fijación de los microorganismos a los tejidos del huésped. PILI/PELOS • Son estructuralmente similares a las fimbrias. • Son más largos y solo existe uno o unos pocos sobre la superficie. • También participan en el mecanismo de patogénesis. • Participan en el proceso de conjugación. CAPA “S” • PARACRISTALINA. • Capa superficial formada por una disposición bidimensional de proteínas. • Protege a la bacteria de mecanismos de defensa del hospedador. Endosporas • Endospora – Estrucutra de supervivenvia. – Resistente a: • • • • • • Calor Disecación Radiación Ácidos Desinfectantes Químicos fuertes – Presente en bacterias del suelo – Su descubrimiento ayudó al desarollo de métodos y técnicas adecuadas de esterilización Factores que afectan el crecimiento – Oxígeno • Aeróbico • Anaeróbico – pH • Acidofílicos (+) • Alcalófilos (-) – Temperatura • Psicrofilos (10-15°C) • Psicrotolerante (15-30°C) • Termófilo (45-80°C) • Mesófilo (30-40°C) • Hipertermófilo (80°C o mas) DIVISIÓN CELULAR Virus Características • Elementos genéticos • Los virus, para poder multiplicarse deben obligadamente entrar en una célula. • Los virus, aprovechan la maquinaria metabólica de la célula huésped. • Los virus integran su material genético en el de la célula huésped, adquiriendo todas las características y propiedades, como por ejemplo el carácter de heredabilidad. • Los virus adquieren un carácter patógeno debido a que durante su replicación al interior de la célula huésped, se produce la destrucción de esta. Virus • Partícula viral completa formada por moléculas de ADN o ARN y rodeada por una cubierta de proteínas simple o compleja formada por carbohidratos, lípidos y proteínas. Fase extracelular • Los virus son incapaces de reproducirse y no realizan funciones enzimáticas. Fase intracelular • Son considerados como ácidos nucleicos que se replican e inducen el metabolismo de la célula huésped para sintetizar todos los componentes del virión. Clasificación de los virus en función de sus genomas Clasificación de los virus en función de sus huéspedes Virus de Bacterias Virus de Plantas Virus de Animales Virus Bacterianos, Bacteriófagos Cáncer Virus Genoma Leucemia de Células T Leucemia Humana RNA Linfoma de Burkitt Epstein-Barr DNA Carcinoma Nasofaringeo Epstein-Barr DNA Carcinoma hepatocelular Hepatitis B DNA Cáncer cervical y de piel Papiloma DNA Son agentes patógenos formados por una proteína ( proteína del prión o PPr ). Producen entre otras, la enfermedad de las "vacas locas" o encefalopatía bovina espongiforme. Esta proteína se acumula en el cerebro de animales enfermos , dando lugar a la estructura esponjosa de la corteza cerebral que da nombre a la enfermedad. Los priones, o las enfermedades producidas por priones, tienen un comportamiento sorprendente, por un lado se transmiten verticalmente , como cualquier enfermedad hereditaria típica, mientras que por otro lado se comportan de manera infectiva, transmitiéndose horizontalmente, mediante contagios que pueden darse entre individuos de distintas especies. La proteína del prión (PrP) normal, tiene una secuencia de aminoácidos, (estructura primaria) idéntica a la proteína del prión patógena. La diferencia entre las dos recae en la estructuras secundaria y terciaria. Puede ocurrir que la proteína patógena infecte individuos que producen proteína normal (a), como ha ocurrido por ejemplo al consumir las vacas piensos elaborados a partir de ovejas enfermas. En este caso la proteína patógena origina un cambio conformacional de la proteína normal (b), transformando las hélices alfa de su estructura proteíca en láminas beta. Las nuevas proteínas patógenas inducen el cambio en otras normales, lo cual produce un efecto de "cascada".