Dra. Mary Maldonado de Katime Morfología I Medicina UFM-Barinas LA CELULA La célula. Estructura y función Hasta el final del s. XIX no se elaboró la teoría celular, que enuncia que la célula es la unidad morfológica, fisiológica y genética de todos los seres vivos, y que además toda célula proviene de otra. Todas las células tienen una estructura común: la membrana plasmática, el citoplasma y el material genético o ADN. Se distinguen dos clases de células: las células procariotas (sin núcleo) y las células eucariotas, mucho más evolucionadas y que presentan núcleo, citoesqueleto en el citoplasma y orgánulos membranosos con funciones diferenciadas. Forma y tamaño de las células La célula es una estructura constituida por tres elementos básicos: membrana plasmática, citoplasma y material genético (ADN). Las células tienen la capacidad de realizar las tres funciones vitales: nutrición, relación y reproducción. • La forma de las células está determinada básicamente por su función. La forma puede variar en función de la ausencia de pared celular rígida, de las tensiones de uniones a células contiguas, de la viscosidad del Citosol, de fenómenos osmóticos y de tipo de citoesqueleto interno. • El tamaño de las células es también extremadamente variable. Los factores que limitan su tamaño son la capacidad de captación de nutrientes del medio que les rodea y la capacidad funcional del núcleo. Cuando una célula aumenta de tamaño, aumenta mucho más su volumen (V) que su superficie (S) (debido a que V = 4/3pr3 mientras que S = 4/3pr2). Esto implica que la relación superficie/volumen disminuye, lo que es un gran inconveniente para la célula ya que la entrada de nutrientes está en función de su superficie y no del volumen. Por este motivo, la mayoría de las células maduras son aplanadas, prismáticas e irregulares, y pocas son esféricas, de forma que así mantienen la relación superficie/volumen constante. El aumento de volumen de la célula nunca va acompañado del aumento de volumen del núcleo, ni de su dotación cromosómica. Célula procariota: bacteria Gram positiva. Célula eucariota. Epitelial secretora. Estructura de las células La estructura común a todas las células comprende la membrana plasmática, el citoplasma y el material genético o ADN. • • • • Membrana plasmática: constituida por una bicapa lipídica en la que están englobadas ciertas proteínas. Los lípidos hacen de barrera aislante entre el medio acuoso interno y el medio acuoso externo. El citoplasma: abarca el medio líquido, o Citosol, y el morfoplasma (nombre que recibe una serie de estructuras denominadas orgánulos celulares). El material genético: constituido por una o varias moléculas de ADN. Según esté o no rodeado por una membrana, formando el núcleo, se diferencian dos tipos de células: las procariotas (sin núcleo) y las eucariotas (con núcleo). Las células eucariotas, además de la estructura básica de la célula (membrana, citoplasma y material genético) presentan una serie de estructuras fundamentales para sus funciones vitales El sistema endomembranoso: es el conjunto de estructuras membranosas (orgánulos) intercomunicadas que pueden ocupar casi la totalidad del citoplasma. • Orgánulos transductores de energía: son las mitocondrias y los cloroplastos. Su función es la producción de energía a partir de la oxidación de la materia orgánica (mitocondrias) o de energía luminosa (cloroplastos). • Estructuras carentes de membranas: están también en el citoplasma y son los ribosomas, cuya función es sintetizar proteínas; y el citoesqueleto, que da dureza, elasticidad y forma a las células, además de permitir el movimiento de las moléculas y orgánulos en el citoplasma. • El núcleo: mantiene protegido al material genético y permite que las funciones de transcripción y traducción se produzcan de modo independiente en el espacio y en el tiempo. En el exterior de la membrana plasmática de la célula procariota se encuentra la pared celular, que protege a la célula de los cambios externos. El interior celular es mucho más sencillo que en las eucariotas; en el citoplasma se encuentran los ribosomas, prácticamente con la misma función y estructura que las eucariotas pero con un coeficiente de sedimentación menor. También se encuentran los mesosomas, que son invaginaciones de la membrana. No hay, por tanto, citoesqueleto ni sistema endomembranoso. El material genético es una molécula de ADN circular que está condensada en una región denominada nucleoide. No está dentro de un núcleo con membrana y no se distinguen nucléolos. ORGÁNULOS CELULARES El sistema endomembranoso delimita compartimentos u orgánulos con funciones muy definidas dentro de la célula: el retículo endoplasmático, el aparato de Golgi, los lisosomas y los peroxisomas. Los orgánulos productores de energía (mitocondrias y cloroplastos en plantas) desempeñan funciones fundamentales para la célula. Las membranas también forman vesículas que se mueven de unos orgánulos a otros y hacia el interior o exterior celular (endocitosis, exocitosis), lo que incrementa la superficie efectiva de la célula para el intercambio de materia con el exterior. EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO Es un sistema membranoso compuesto por una red de sáculos aplastados o cisternas, vesículas y túbulos sinuosos. Se halla comunicado con la envoltura nuclear y se extiende por todo el citoplasma de la célula, teniendo un único espacio interno denominado lumen. Se distinguen dos clases de retículo endoplasmático, según sus funciones y su composición: • Retículo endoplasmático rugoso (RER): Presenta ribosomas anclados en la membrana, en su cara citosolica. Está formado por cisternas y vesículas, que salen de dichas cisternas, y está comunicado con la membrana nuclear y con el retículo endoplasmático liso. Su función principal es la síntesis de proteínas mediante los ribosomas anclados en su membrana. Las proteínas se translocan al lumen e inician una ruta biosintética que las transportará, a través de vesículas, a otros orgánulos o bien a la membrana plasmática. • Retículo endoplasmático liso (REL): Su estructura carece de ribosomas. Está formado por una red de túbulos unidos al RER, que se extiende por todo el citoplasma. La función principal del REL es la síntesis de todos los lípidos constituyentes de las membranas: colesterol, fosfolípidos, glucolípidos, etcétera. Sólo los ácidos grasos se sintetizan en el Citosol. Origen del aparato de Golgi y los lisosomas. Aparato de Golgi Está formado por uno o varios dictiosomas, que son una agrupación en paralelo de cuatro a ocho sáculos discoidales o cisternas membranosas. Está polarizado, ya que el dictiosomas presenta una cara cis, próxima al RER, y una cara trans, próxima a la membrana plasmática. Entre las cisternas hay un tráfico de vesículas; la cara cis recibe vesículas de transición que provienen del retículo endoplasmático. El contenido del dictiosoma va avanzando hacia la cara trans de maduración, mediante vesículas intercisternas. El contenido de las cisternas de la cara trans se acumula en el interior de vesículas de secreción que podrán fusionarse con lisosomas o bien secretarse al medio extracelular por exocitosis. El aparato de Golgi continúa la ruta biosintética iniciada en el RER. Su función consiste en el transporte, maduración, acumulación y secreción de proteínas procedentes del retículo endoplásmico. Lisosomas Son vesículas que provienen del aparato de Golgi. Poseen membrana, y en su interior contienen enzimas hidrolasas ácidas que, para ser activas, necesitan un pH ácido mantenido gracias a una bomba de H+ que tiene en su membrana. La función de los lisosomas es digerir las sustancias que lleguen a su interior. Los lisosomas primarios son aquellos que sólo contienen las enzimas digestivas, mientras que los lisosomas secundarios, por haberse fundido con una vesícula con materia orgánica, contienen también sustratos en vía de digestión: vacuolas digestivas o heterofágicas, cuando el sustrato procede del exterior, y vacuolas autofágicas, cuando procede del interior. Mitocondrias Son los orgánulos polimorfos de las células eucariotas que se encargan de la obtención de energía. Su principal función es la respiración mitocondrial, proceso por el que el poder reductor producido en las reacciones de oxidación entra en la cadena transportadora de electrones y se obtiene energía en forma de ATP (proceso quimiosmótico). Están formadas por: • • • La membrana externa, con gran número de proteínas transmembranales o porinas. El espacio intermembranoso, de contenido similar al del Citosol. La membrana interna, con numerosas invaginaciones denominadas crestas. Contiene proteínas con tres funciones importantes para realizar la respiración mitocondrial: llevar a cabo reacciones de oxidación en la cadena respiratoria; sintetizar ATP mediante • la enzima ATP-sintetasa (embebida en esta membrana) y permitir el paso selectivo de metabolitos mediante proteínas transportadoras. La matriz, delimitada por la membrana interna. En ella se da un gran número de reacciones metabólicas de oxidación, como el ciclo de Krebs y la b-oxidación de los ácidos grasos. Además, contiene ribosomas, ADN mitocondrial, ARNt y las enzimas requeridas para la expresión de los genes mitocondriales. Cloroplastos Los cloroplastos son orgánulos típicos de las células vegetales, que poseen clorofila, y cuya función es realizar la fotosíntesis (transformación de la energía luminosa en energía química contenida en forma de ATP). Presentan doble membrana: una plastidial externa, y una plastidial interna. En el interior está el estroma. Inmerso en éste se encuentran los tilacoides o lamelas, que contienen los pigmentos fotosintéticos en su membrana (membrana tilacoidal). Los cloroplastos presentan forma irregular, pero están formados invariablemente por una membrana externa, un espacio intermembranoso, una membrana interna, el estroma y los tilacoides, que se disponen apilados. MEMBRANA Y CITOPLASMA La membrana plasmática es una delgada lámina que envuelve la célula, separando el citoplasma del medio externo. Su función principal es la de regular el paso de sustancias, manteniendo las diferencias esenciales entre el citoplasma y el medio extracelular. En el interior celular, el citoplasma está compuesto por un medio líquido, denominado Citosol, una red de filamentos proteicos, (el citoesqueleto) y un sistema de orgánulos membranosos. Estructura de la membrana plasmática MODELO DE MOSAICO FLUIDO El modelo de su estructura, denominada mosaico fluido, fue propuesto por Singer y Nicholson en 1972. La estructura consiste en una bicapa de lípidos en la que se asocian moléculas proteicas. Estas proteínas pueden disponerse en ambas caras de la superficie de la membrana o bien estar englobadas en la misma. El término fluido se debe a que los lípidos e incluso las proteínas pueden moverse lateralmente en esta bicapa. LA BICAPA LIPÍDICA Está compuesta básicamente por fosfolípidos, colesterol y glucolípidos, que constituyen el 40% de la membrana. • • • Fosfolípidos: son los componentes más abundantes y tienen básicamente una función estructural. Debido a su carácter anfipático se autoensamblan, formando dos capas. Presentan una alta movilidad lateral y de giro sobre sí mismos, produciendo una gran fluidez en la membrana. Glucolípidos: son mucho menos abundantes. Tienen también un carácter anfipático. Su componente glucídico, siempre orientado en la cara externa de la membrana, interviene en procesos de reconocimiento y señales entre células. Colesterol: se asocia a los lípidos disminuyendo la fluidez de la monocapa y manteniendo la estabilidad de la bicapa. LAS PROTEÍNAS DE MEMBRANA Son aquellas en las que se desarrollan la mayoría de las actividades de la membrana. Se clasifican según su disposición en: • • Proteínas integrales o intrínsecas: pueden asociarse a la membrana por una cara, mediante un grupo o sector lipofílico. Cuando atraviesan totalmente la membrana, presentando dos regiones polares y una región transmembranal, se denominan proteínas transmembranosas. Proteínas periféricas o extrínsecas: son solubles y se asocian mediante interacciones débiles a otras proteínas integrales o a lípidos de la membrana. EL GLUCOCÁLIX Es el conjunto de cadenas de oligosacáridos pertenecientes a los glucolípidos y a las glucoproteínas de la membrana. Sólo aparecen en la cara externa de la membrana, lo que proporciona a ésta una estructura asimétrica. Su función es actuar como señales que deben ser reconocidas por las células. Estructura de mosaico fluido. TRANSPORTE A TRAVÉS DE LA MEMBRANA Para vivir, la célula necesita intercambiar sustancias con el medio externo. La bicapa lipídica sólo permite el paso de moléculas lipófilas, pero las proteínas de la membrana van a regular el paso selectivo de moléculas polares. El transporte de las sustancias puede realizarse de dos maneras: • • Transporte pasivo: difusión de sustancias siempre a favor de su gradiente. El gradiente puede ser de concentración o eléctrico. El gradiente electroquímico es originado por la suma de ambos. Este transporte puede darse por: • Difusión simple: las moléculas pasan a favor de su gradiente electroquímico. • Difusión facilitada: transporte de moléculas mediante proteínas de membrana. El paso de pequeños iones se realiza a través de canales proteicos. Se facilita el paso de moléculas polares por proteínas transportadoras o permeasas. Transporte activo: el transporte de las sustancias se realiza en contra de su gradiente electroquímico, por lo que siempre se requiere un gasto de energía, en forma de ATP, que se hidroliza. Las proteínas transportadoras se denominan bombas. La bomba de Na+ y K+ es un ejemplo de transporte activo. Formas de transporte a través de la membrana. EL CITOPLASMA El citoplasma está constituido por el citosol, el citoesqueleto y los orgánulos celulares. • • El citosol también denominado hialoplasma, es el medio interno del citoplasma. Es el espacio entre la membrana plasmática, la envoltura nuclear y las distintas membranas de los orgánulos. Es un medio acuoso (85% de agua), en el que están disueltas todas las moléculas que la célula necesita para su metabolismo. En el citosol, los ribosomas realizan la síntesis de proteínas. La mayor parte de ellas permanecen en él, aunque otras pasarán por el sistema endomembranoso, mediante tráfico vesicular, al exterior celular, o bien irán al núcleo. El citoesqueleto aparece sólo en células eucariotas. Está constituido por una red de filamentos proteicos de tres tipos: • Microfilamentos: son básicamente filamentos de actina. Constituyen el córtex, que bajo la membrana plasmática da forma y elasticidad a la célula. Facilitan la emisión de prolongaciones citoplasmáticas o pseudópodos. Junto con los filamentos de miosina, posibilitan el movimiento contráctil de las células musculares. • Filamentos intermedios: constituidos por proteínas filamentosas. Los principales son los neurofilamentos, los filamentos de queratina y los de vimentina. Desempeñan funciones estructurales. • Microtubulos: son filamentos tubulares constituidos por polímeros de Tubulina. Se originan a partir del centro organizador de microtubulos. Son componentes principales del citoesqueleto, y organizan y distribuyen el resto de los filamentos y orgánulos celulares. El huso acromático o mitótico está formado por microtubulos. Los cilios y flagelos son estructuras derivadas de los microtubulos. EL NÚCLEO CELULAR El núcleo, elemento distintivo de las células eucariotas, está constituido por una envoltura nuclear que rodea el material genético de la célula. El interior del núcleo recibe el nombre de nucleoplasma. En él se encuentran condensadas las fibras de ADN, que reciben el nombre de cromatina, y el nucléolo, corpúsculo muy rico en ARNr. La estructura del núcleo varía según el estado de la célula. A lo largo del ciclo celular se distinguen dos formas denominadas núcleo en interfase y núcleo en división. La envoltura nuclear La envoltura nuclear está constituida por: • • • • • La membrana externa, que está en comunicación con la membrana del retículo endoplasmático. Presenta también ribosomas asociados y puede realizar las mismas funciones que él. El espacio perinuclear, que es prácticamente igual al citosol. La membrana interna: presenta proteínas transmembranosas que sirven de anclaje para las otras proteínas que constituyen la lámina nuclear. La lámina nuclear: está constituida por proteínas fibrilares que se anclan en la membrana interna y se unen a las fibras de cromatina. Hacen de soporte de la envoltura, y se despolimerizan durante la mitosis produciendo la pérdida de la envoltura. Los poros nucleares: perforan la envoltura, siendo contiguas ambas membranas en estos puntos. Tienen un diámetro de 800 Å y están compuestos por gran cantidad de proteínas. Regulan el paso de las proteínas del citoplasma hacia el núcleo y de los ARN en el sentido inverso. NUCLEOPLASMA Y NUCLÉOLO El nucleoplasma o matriz nuclear es una dispersión coloidal en estado gel, compuesta por proteínas relacionadas con la síntesis y el empaquetamiento de los ácidos nucleicos. El nucléolo está constituido básicamente por ARN y proteínas. Se distingue una zona fibrilar denominada «organizadora nucleolar» donde están, formando bucles, las moléculas de ADN que contienen las múltiples copias de genes de ARN nucleolar . El nucléolo desaparece durante la mitosis, ya que en este momento no se requieren ribosomas para sintetizar proteínas. Ultraestructura del núcleo. La cromatina Se halla constituida por fibras de ADN en diferentes grados de condensación. El número de filamentos es igual al número de cromosomas durante la división del núcleo. Gracias a la coloración que adquiere con colorantes básicos, desde antiguo se distinguen dos tipos de cromatina: la heterocromatina o cromatina condensada, que no se descondensa durante la interfase, y la eucromatina o cromatina difusa, que sí se descondensa. La heterocromatina que está siempre condensada en todas las células de un organismo se llama heterocromatina constitutiva, y se denomina heterocromatina facultativa aquella que está condensada en sólo algunas células del organismo. La cromatina está constituida básicamente por la denominada fibra de 100 Å, también llamada «collar de perlas». Dicha fibra está, a su vez, formada por la doble hélice de ADN de 20 Å, que se asocia a unas proteínas básicas denominadas histonas. La fibra de cromatina de 100 Å es una sucesión de nucleosomas. Esta estructura está formada por un octámero de histonas (ocho moléculas de cuatro tipos distintos de histonas), sobre el que se enrolla la fibra de ADN de 20 Å, y separada por un tramo de ADN espaciador. Cuando la fibra de 100 Å se asocia a un quinto tipo de histona se produce un acortamiento y condensación de la cromatina y se forma la denominada fibra de 300 Å o forma condensada. LOS CROMOSOMAS Son estructuras con forma de bastoncillo que aparecen durante la división del núcleo, cuando se rompe la envoltura nuclear. Están constituidos por ADN e histonas. Cada fibra de cromatina constituye un cromosoma, siendo su número constante en todas las células del organismo de una misma especie. La función básica es facilitar el reparto de la información genética contenida en el ADN de la célula madre entre sus dos células hijas. La división celular se inicia cuando ya se ha duplicado el ADN. Por tanto, hay dos fibras idénticas de ADN, que se denominan cromáticas, y que permanecen unidas por un punto denominado centrómero. El cromosoma será distinto según la fase de la mitosis en la que se encuentre; así, el cromosoma metafásico presenta dos cromátidas unidas, mientras que el cromosoma anafásico presenta una sola cromátida. El centrómero es una constricción primaria que separa los dos brazos del cromosoma, y los telómeros son los extremos de los brazos. Puede aparecer cerca del telómero una constricción secundaria que da lugar a un corto segmento denominado satélite. NIVELES DE EMPAQUETAMIENTO EN EL CROMOSOMA • • • • • Primer nivel de empaquetamiento de la cromatina: la fibra de 100Å. Segundo nivel: la fibra de 300 Å. Éste es el nivel más bajo de empaquetamiento de un cromosoma, y se produce por el enrollamiento de la fibra de 100 Å sobre una histona denominada H1. Este modelo se denomina solenoide. Tercer nivel: dominios estructurales en forma de bucle. El grado de empaquetamiento de los cromosomas en el núcleo es del orden de diez mil. Se ha observado que la fibra de 300 Å forma bucles, que según algunos autores están estabilizados en el centro del cromosoma por proteínas, formando el llamado armazón central o andamio. Cuarto nivel: sería el formado por estos bucles enrollados sobre sí mismos. Seis bucles formarían una roseta y treinta rosetas seguidas un rodillo. Quinto nivel: el cromosoma. Estaría formado por la sucesión de rodillos. LA DIVISIÓN CELULAR El ciclo de una célula comprende el periodo de tiempo que va desde que se forma hasta que se divide, dando lugar a nuevas células. En las especies eucariotas pluricelulares se pueden distinguir dos tipos de células: las diploides y las haploides. EL CICLO CELULAR Pasado un tiempo más o menos largo, todas las células se dividen o mueren. En ambos casos la célula inicial deja de existir. La duración de la vida celular es muy variable. El tiempo que comprende todo el ciclo celular se denomina tiempo de generación (T). La existencia en los organismos pluricelulares de células que viven menos tiempo que el individuo, implica la necesidad de un ritmo de reproducción celular que al menos iguale el ritmo de las células que mueren. En el ciclo celular se diferencian dos etapas: una inicial de larga duración, en la que la célula presenta un núcleo definido, denominada interfase; y una etapa final corta, en la que la célula presenta cromosomas, denominada división o fase M. LA INTERFASE Consta de tres etapas: • • • Fase G1: en la que se producen la transcripción y la traducción. Cuando alcanzan el denominado punto R o sin retorno la célula entrará inevitablemente en la siguiente fase. Hay células que pasan un periodo largo sin alcanzar este punto R y entran en la llamada fase G0. Aquellas células tan especializadas que no se dividen (como las neuronas) quedan detenidas en G0. Fase S: se produce la duplicación del ADN. Fase G2: se inicia cuando acaba la síntesis de ADN, y termina en el momento que se distinguen los cromosomas. Ciclo celular. La división celular o fase M Comprende la división del núcleo o mitosis, también denominada cariocinesis; y la división del citoplasma o citocinesis. LA MITOSIS La mitosis es el tipo de división nuclear que tiene lugar cuando se han de generar células con igual número de cromosomas que la célula madre. Se divide en cuatro fases: • • • • Profase: se inicia cuando empiezan a condensarse las fibras de ADN hasta formar las dos cromátidas, unidas por el centrómero. Se forma el complejo centriolar, constituido por un centriolo y un procentriolo diplosoma y el material pericentriolar o centrosoma, a partir del cual se forman los microtubulos que formarán el huso acromático. Se despolimeriza la lámina nuclear y se rompe la envoltura. Se forma la placa cinetocórica en el centrómero. Metafase: debido al alargamiento de los microtúbulos cinetocóricos, los cromosomas quedan equidistantes a ambos complejos centriolares, disponiéndose en la mitad del huso y constituyendo la placa ecuatorial. Anafase: se inicia con la separación de las dos cromátidas hermanas, que constituyen el cromosoma metafásico, formando el cromosoma anafásico con una sola cromátida. La anafase acaba cuando un juego de cromosomas anafásico llega a un polo y el otro juego al polo opuesto. Telofase: comienza a unirse la lámina nuclear a los cromosomas, facilitando la formación de la nueva envoltura nuclear. Los cromosomas empiezan a desenrollarse, lo que posibilita la transcripción y la formación de la región organizadora nucleolar. CITOCINESIS La división del citoplasma en las células animales se realiza por estrangulación del citoplasma. Comienza al final del anafase, cuando aparece el surco de división como resultado de la formación del anillo contráctil interno. El anillo está formado por polímeros de actina. La Meiosis La meiosis es la división celular que permite la reproducción sexual. Comprende dos divisiones sucesivas: una primera división meiótica, que es una división reduccional, ya que de una célula madre diploide (2n) se obtienen dos células hijas haploides (n); y una segunda división meiótica, que es una división ecuacional, ya que las células hijas tienen el mismo número de cromosomas que la madre (como la división mitótica). Así, de dos células n de la primera división meiótica se obtienen cuatro células n. Igual que en la mitosis, antes de la primera división meiótica hay un periodo de interfase en el que se duplica el ADN. Sin embargo, en la interfase de la segunda división meiótica no hay duplicación del ADN. PRIMERA DIVISIÓN MEIÓTICA • Profase I: es la más larga y compleja, puede durar hasta meses o años según las especies. Se subdivide en: leptoteno, se forman los cromosomas, con dos cromátidas; zigoteno, cada cromosoma se une íntimamente con su homólogo (fenómeno de sinapsis); paquiteno, los cromosomas homólogos permanecen juntos formando un bivalente o tétrada; diploteno, se empiezan a separar los cromosomas homólogos, observando los quiasmas; diacinesis, los cromosomas aumentan su condensación, distinguiéndose las dos cromátidas hermanas en el bivalente. • • • Metafase I: la envoltura nuclear y los nucléolos han desaparecido y los bivalentes se disponen en la placa ecuatorial. Anafase I: los dos cromosomas homólogos que forman el bivalente se separan, quedando cada cromosoma con sus dos cromátidas en cada polo. Telofase I: según las especies, bien se desespiralizan los cromosomas y se forma la envoltura nuclear, o bien se inicia directamente la segunda división meiótica. SEGUNDA DIVISIÓN MEIÓTICA Está precedida de una breve interfase, denominada intercinesis, en la que nunca hay duplicación del ADN. Es parecida a una división mitótica, constituida por la profase II, la metafase II, la anafase II y la telofase II. Comparación entre mitosis y meiosis. Referencia Bibliográfica: BIOLOGÍA CELULAR>>https://www.educacionholistica.org/notepad/documentos/Biologia/Celula/Celula.doc. Introducción a la biología celular https://books.google.co.ve/books?isbn=8479035234 Bruce Alberts, Dennis Bray - 2006
