FUNDAMENTOS DE PRUEBAS DIAGNÓSTICAS INTRODUCCIÓN Los anticuerpos son glucoproteínas que se unen específicamente, tanto dentro del animal, como en distintos materiales de laboratorio, a determinados epítopes (determinante antigénico constituido por 10-15 aa, que es reconocido por un Ac). Estos anticuerpos se encuentran en los líquidos y secreciones orgánicas, como sangre, leche o secreciones vaginales, en los que pueden establecerse su especificidad (determinación cualitativa) y/o concentración (reacción cuantitativa), mediante la aplicación de las pruebas inmunológicas. Estas expresan indirectamente la respuesta inmune mediada por Ac, inducidos en el organismo por sustancias o partículas extrañas al mismo. Las reacciones Ag-Ac se desarrollan, in-vitro, en dos etapas. La primera comprende la unión específica entre el sitio activo del Ac y los epítopes correspondientes del Ag. La segunda etapa, genera un fenómeno visible (precipitación o aglutinación). La primera etapa no se detecta visualmente mientras que la segunda puede ser fácilmente revelada. En el caso particular de los haptenos, la segunda etapa puede no ser completa y bajo ciertas condiciones, estar ausente. La velocidad de las reacciones es diferente: ya que en la primera es rápida mientras que la segunda puede llegar a ser muy lenta en comparación con la anterior. Dada la especificidad de la reacción Ag-Ac, esta ha sido utilizada para la identificación de microorganismos o sus productos y para la identificación de Ac séricos, principalmente con fines diagnósticos. Toda prueba requiere de un medio con un medio con pH determinado. Generalmente el neutro favorece la mayoría de las reacciones (7,3-7,5), aunque ciertos isotipos de IgG reaccionan mejor a pH ácido (ej: en brucelosis con Ag acidificados en que la IgG1 se encuentra activa, mientras que la IgG2 y la IgM están inactivas. La presencia de electrolitos es necesaria para la aglutinación de las bacterias, aunque la combinación del Ac con el Ag puede efectuarse en su ausencia. Esta reacción es favorecida por el aumento de las concentraciones salinas, pero si son muy elevadas inhiben la reacción. La velocidad es directamente proporcional a la temperatura en el rango de 0º a 37º. Por encima, la velocidad de unión puede aumentar muy poco, teniendo como límite los 46ºC donde comienzan a alterarse los Ac. Las técnicas inmunoserológicas se pueden clasificar en 3 categorías: 1. 2. 3. Pruebas primarias, que miden directamente la unión de Ag con Ac. Pruebas secundarias, que miden el resultado de la unión Ag-Ac in-vitro, con menor sensibilidad, pero más fácil de realizar. Pruebas terciarias, que miden el efecto protector de los Ac en el animal, in-vivo PRUEBAS PRIMARIAS TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS Aptos para determinar la presencia de Ag en la superficie de células, bacterias y parásitos o para la detección de microorganismos en materiales infectados. Se basan en la aplicación de reacciones Ag-Ac únicas o secuenciales, altamente sensibles y específicas, que se evidencian con distintos métodos. Para la determinación de IHQ en cortes de tejido, es necesario que sea cortado por congelación (para técnicas de inmunofluorescencia) o incluidos en parafina. También pueden ser aplicadas a materiales de estudio citológico; improntas de tejido, líquidos de cavidades, extendidos cérvico vaginales, cepillados prepuciales, lavados y aspirados. INMUNOFLUORESCENCIA Los fenómenos de fotoluminiscencia son aquellos en los que se produce la emisión de luz por efecto de distintos tipos de radiaciones. En la fosforescencia, cuando cesa el estímulo, el cuerpo irradiado sigue emitiendo luz, mientras que en la fluorescencia dicha emisión cesa con la excitación. La radiación proviene de los rayos UV (originados en un microscopio de fluorescencia) y las sustancias que reaccionan son la fluoresceína, rodamina y naranja de acridina. El principio básico es utilizar un Ac marcado con una sustancia fluorescente para detectar la presencia de Ag en los tejidos. En la Inmunofluorescencia directa los anticuerpos marcados con la sustancia fluorescente reaccionan directamente con el Ag presente el en tejido. En la inmunofluorescencia indirecta, el Ac primario no se conjuga con la sustancia fluorescente, ya que esta se encuentra unida a un segundo Ac (anti anticuerpo marcado), que se halla dirigido contra las Ig’s del animal del cual se obtuvo el Ac primario. Al aumenta la cantidad de sitios activos de los antisueros marcados, se amplifica la reacción y por ende la sensibilidad del sistema. TÉCNICAS DE INMUNOPEROXIDASA Conjunto de métodos de inmunoreacción que tienen en común la enzima peroxidasa (que puede ser reemplazada por fosfatasa alcalina). Estas enzimas están acopladas a un Ac y otras sustancias y su revelado por medio de técnicas de histoquímica enzimática, permite localizar Ag contra el cual se halla dirigido el Ac. Al igual que el anterior hay métodos directos e indirectos. El directo, el Ac específico dirigido contra el Ag que se desea encontrar se halla conjugado con peroxidasa. La reacción consiste en incubar el Ac marcado con el tejido que contiene el Ag buscado. Se revela la enzima con soluciones de cualquier cianógeno, siguiendo el principio de la reacción E+S=ES= P+E. En el indirecto, el Ac primario o específico no se halla marcado, sino el anti Ac al igual que en la inmunofluorescencia. ENZIMOINMUNOENSAYOS Los fundamentos son similares a los de la inmunofluorescencia, de los que se diferencia en que se emplean Ac para la determinación directa y anti Ac para la indirecta marcados con una enzima capaz de desarrollar una reacción coloreada. La enzima utilizada es la peroxidasa y el sustrato el agua oxigenada. ELISA (“ENSAYO DE INMUNOABSORCIÓN CON LIGADURA DE ENZIMAS”) Permite determinar en forma cuantitativa la concentración de Ac o Ag mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y otro en solución. Por lo general, el material fijado a la fase sólida es aquel cuya presencia o concentración se quiere determinar. A este se fija un Ac específico marcado con una enzima (directo) o un complejo Ac-anti Ac marcado (indirecto) el cual puede ser puesto en evidencia mediante la adición del sustrato. El método competitivo es una variación del original que detecta Ac’s en las muestras. Se basa en el principio de la unión de los Ac a los Ag presentes en los tejidos y posterior inhibición de un Ac ligado a una enzima que reacciona con el Ag (competencia de unión). En este método la ausencia de color denota una reacción positiva. La cuantificación de la reacción se realiza por medio de un lector de densidad óptica con el filtro adecuado a la enzima y el sustrato utilizados. PRUEBAS SECUNDARIAS PRECIPITACIÓN La mayoría de los Ac tiene la capacidad de formar una malla que, al atrapar al Ag soluble, resulta muy pesada como para mantenerse en solución. Sin embargo, no siempre se observará reacción cuando haya correspondencia de Ag-Ac. Este efecto solo se logra cuando hay equivalencia en la concentración de ambos reactantes. Tanto el exceso de Ag como de Ac inducen a una escasa precipitación. Los resultados pueden interpretarse por el hecho de que los Ac son divalentes, pudiendo unirse solo a dos epítopes por vez, mientras que las proteínas antigénicas son generalmente multivalentes, presentando gran cantidad de epítopes. En una mezcla que contiene exceso de Ac , cada molécula de Ag se cubre con un Ac, previniendo así la precipitación. Ante el exceso de Ag, cada Ac se une solo a un par de Ag y por lo tanto no se forma la malla , los conjugados se mantienen solubles y no se observa precipitación. Se realizan en medios líquidos y semisólidos. Para la precipitación en medios líquidos se deben mezclar volúmenes similares de Ag y Ac, interpretando la prueba positiva, en aquella donde se observa turbidez. La misma prueba debe ser evidenciada con mayor claridad si se evita la mezcla de ambos volúmenes, pudiendo observar un anillo en la interfase de los líquidos, cuando haya correspondencia inmune (prueba Ascoli-Valente para Antrax). Pueden ser cualitativas solo si se desea saber cual es el Ag contra el que reaccionan los Ac o cuantitativas, si se realizan diluciones seriadas del suero o del Ag. Para la precipitación en medios semisólidos se usan las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforesis. La inmunodifusión en agar se basa en el hecho de que la mayoría de las proteínas difunden a través de un gel. Si los Ac contactan con el Ag mientras migran, se forma una banda de precipitado en el punto donde ambas concentraciones alcancen la equivalencia (AIE o Leucemia bovina). La inmunodifusión radial (variante de la precipitación en placa) que permite realizar determinaciones cuantitativas de Ag o de Ac. El suero sembrado en la fase semisólida, al igual que el Ag sembrado en el pocillo, difunden radialmente. En la reacción positiva se formará un halo de precipitación alrededor de un pocillo conteniendo una concentración conocida de Ag. El diámetro del halo, en la zona de equivalencia, estará relacionado con la concentración del Ac. La electroinmunodifusión es un método cuantitativo que permite que un Ag difunda en el agar que contiene el antisuero. En este caso el Ag es dirigido dentro del gel por medio de la electroforesis. Las líneas de precipitación que se forman entre el Ac y el Ag siguiendo la dirección de la corrida dan origen a la denominación de esta técnica (electroforesis de cohetes). Se utiliza para detectar clases de inmunoglobulinas o proteínas del complemento en plasma. También para la detección de inmunodeficiencias o excesos de inmunoglobulinas. AGLUTINACIÓN Cuando un Ac reacciona con un Ag particulado (GR, bacterias, células). Los mismos Ac que presentan la capacidad de precipitar, también pueden inducir la aglutinación, hecho que depende exclusivamente del estado del Ag (en solución o en suspensión). Los principios son los mismos que para la precipitación (formación de mallas). En la aglutinación, la presencia de electrolitos de carga opuesta en la solución de reacción o en los líquidos corporales, neutralizaría en parte las cargas superficiales de las partículas antigénicas, evitando el rechazo entre ellas y asegurando la aproximación indispensable para que una molécula bivalente de Ac pueda iniciar la formación de grumos, que llevaría a la aglutinación específica. Los métodos cualitativos permiten determinar la presencia de bacterias en el suero, si se dispone de sueros monoespecíficos. Los métodos semicuantitativos determinan cual es la máxima dilución del suero capaz de aglutinar al Ag específico. La variación del título de Ac puede ser muy útil para seguir la evolución de una infección. La IgM aparece en forma temprana (con mayor capacidad aglutinante) seguido por la IgG y la IgA. La cuantificación de Ac por aglutinación puede realizarse mediante reacciones de lectura lenta o rápida, siendo esta última mas usada en serología diagnóstica de la brucelosis o salmonelosis. En forma similar a la precipitación, el exceso de Ac induce la inhibición de la aglutinación (prozona). También se puede observar cuando un Ac se une específicamente al Ag no pueden inducir la aglutinación (Ac asimétricos). Posiblemente la presentación de epítopes en la porción profunda de la superficie de la partícula antigénica impida el entrecruzamiento Ag-Ac. Para ello se recurre a la aglutinación indirecta, donde el suero e es incubado con partículas antigénicas, las cuales adsoben los Ac asimétricos. Luego de remover los Ac no ligados, las partículas restantes se miden con suero antigamaglobulina. Cuando esta reacciona con los Ac adheridos , induce la aglutinación de las partículas. Esta técnica es mas sensible que la precipitación. Algunos virus tienen la particularidad de combinarse con receptores presentes en la superficie de GR y aglutinarlos. En este principio se basa la prueba de hemaglutinación. La prueba de inhibición de la hemaglutinación expresa la capacidad que presentan ciertos Ac antivirales específicos para impedir la combinación del virus con los hematíes. FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO El complemento, en su fase final puede inducir la lisis del Ag particulado (bacteria, GR, etc) a través de su unión con el Ac específico (generalmente IgG). Permite valorar tanto la presencia de Ac como de Ag, mediante un sistema indicador específico hematíe-hemolisina (sistema revelador) que puede fijar el complemento. Si hay correspondencia entre la cepa viral a identificar y un Ac específico conocido, el complemento agregado al sistema se unirá al inmunocomplejo. La posterior incorporación del sistema hemolítico inducirá la sedimentación del mismo (positivo). Si por el contrario, no existe correspondencia inmune entre el Ag y el Ac, el complemento se fijará al sistema revelador produciendo la hemólisis (negativo). PUEBAS TERCIARIAS Si un organismo o Ag posee actividad biológica, es posible experimentar con Ac para neutralizar dicha actividad. Estas reacciones incluyen la hemólisis de eritrocitos, lisis de células nucleadas y la posibilidad de inducir la enfermedad y la muerte de animales. NEUTRALIZACIÓN Estima, in-vitro, la capacidad de un Ac, en contacto con un Ag, para neutralizar su actividad biológica. Son utilizadas para identificar toxinas bacterianas. Las pruebas son altamente específicas y extremadamente sensibles. Consisten en la incubación de un Ag y un Ac y su posterior valoración biológica. Si se conoce la capacidad infectiva de un virus se pueden realizar dos tipos de pruebas de neutralización. En la primera, la concentración viral se mantiene constante, realizando diluciones seriadas del antisuero. Asi es posible determinar la capacidad neutralizante de un suero. Inversamente se puede mantener constante la concentración sérica y diluir el Ag viral. La valoración biológica de la efectividad se puede realizar sobre cultivos celulares o sobre animales vivos. En los primeros se puede determinar la capacidad de inhibir el efecto citopático, la capacidad de hemólisis o la incapacidad para dividirse medido por la acidez del medio de cultivo. En los segundos se medirá la inhibición de los procesos mórbidos y hasta la muerte del individuo. PROTECCIÓN Las pruebas son semejantes a las de neutralización solo que realizadas in-vivo. La capacidad de protección que posee un suero puede ser valorada mediante su inoculación en diluciones seriadas en un grupo de animales de laboratorio, para luego desafiarlo con el Ag. El valor de protección de los sueros se expresa como Dosis Protectiva 50% (DP50) que es aquella que protege al 50% de los animales inoculados.
