Tesis Gobbi

Biología reproductiva y caracterización morfológica
de los estadios larvarios de Hermetia illucens
(L., 1758) (Diptera: Stratiomyidae). Bases
para su producción masiva en Europa
Flavia Paola Gobbi
Biología reproductiva y caracterización morfológica de los
estadios larvarios de Hermetia illucens (L., 1758) (Diptera:
Stratiomyidae). Bases para su producción masiva en Europa.
Flavia Paola Gobbi
Centro Iberoamericano de la Biodiversidad
Instituto Universitario de Investigación, Universidad de Alicante.
Programa de Doctorado: “Biodiversidad Gestión y Conservación de las Especies
Y sus Hábitat”
Diciembre de 2012
iii
Biología reproductiva y caracterización morfológica de los
estadios larvarios de Hermetia illucens (L., 1758) (Diptera:
Stratiomyidae). Bases para su producción masiva en Europa.
Tesis Doctoral presentada por la Licenciada en Biología Flavia Paola Gobbi para optar
al título de Doctor en Biología por la Universidad de Alicante
Directores:
Dr. Santos Rojo Velasco
Instituto CIBIO/Dpto. CARN
Universidad de Alicante
Dra. Ana Isabel Martínez Sánchez
Instituto CIBIO/Dpto. CARN
Universidad de Alicante
Alicante, 2012
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A Guillermo y
a mis padres,
Beatríz y Delmar
vii
AGRADECIMENTOS
Esta tesis no habría sido posible sin el apoyo de muchas personas, por lo
que me gustaría expresar mi agradecimiento a los siguientes colegas, amigos y
familiares.
En primer lugar agradezco a mis directores, el Dr. Santos Rojo y la Dra.
Ana Isabel Martínez-Sánchez, quienes me facilitaron día a día todos los
conocimientos y las herramientas necesarias para desarrollar las investigaciones
que llevaron a la presente tesis doctoral. También agradecerles la confianza que
depositaron en mi para la realización de todas las tareas de investigación que se
llevaron a cabo durante este proyecto, siendo muchas de ellas de gran
envergadura. La amistad y el aliento proporcionados por cada uno de ellos han
sido indispensables para el trabajo del día a día, así como también la paciencia
que necesitaron muchas veces. Gracias al aprendizaje con cada uno de ellos, me
siento capacitada y formada como investigadora para afrontar el camino de mi
siguiente etapa.
Me gustaría dar las gracias a la empresa Flysoil S. A. ya que han
contribuido a financiar parte de la presente tesis, así como también el haber
compartido algunos de sus conocimientos que facilitaron la comprensión de
algunos aspectos biológicos de Hermetia illucens.
Al Ministerio de Ciencia e Innovación por otorgarme la beca
Subprograma Torres Quevedo 2010 y 2011, importante financiamiento para la
realización de esta tesis doctoral.
También quisiera agradecer a la empresa Agriprotein S. A. por permitirme
compartir mis conocimientos, otorgándole peso a toda la investigación realizada.
ix
Me gustaría dar las gracias a todos los miembros del grupo de
investigación Bionomía, Sistemática e Investigación Aplicada de Insectos
Dípteros e Himenópteros de la Universidad de Alicante (Celeste, Tania,
Esperanza, Elena), porque sin su apoyo no habría sido lo mismo; en especial a
Yelitza, Berta y Pilar por todos los momentos distendidos que hemos compartido,
así como la amistad que hemos ido formando día a día.
También tengo que agradecer a los directivos, administrativos y al
personal técnico del CIBIO, ya que su apoyo ha facilitado la realización de este
proyecto. En especial a Antonio, David y Yolanda por solucionarme numerosos
problemas de papeleo; a Chema por ayudarme a resolver muchos problemas
técnicos de informática y por último a Carmen y Jesús que han sido un pieza
clave, ya que han aportado ideas fundamentales para el diseño experimental de la
tesis.
Especial agradecimiento al personal de los Servicios Técnicos de
Investigación de la Universidad de Alicante; en especial al Dr. Pablo Candela
Antón de la unidad de espectrometría de masas, a Verónica López Belmonte de
la unidad de microscopía y a Sara Alcañiz Lucas y José Luis Carbonell Garrigós
del área de infraestructuras de apoyo, por la paciencia y ayuda que han
proporcionado para el óptimo desarrollo de esta tesis doctoral.
A todos mis amigos del CIBIO, que gracias a su compañía y a todos esos
buenos momentos, mi trayectoria en el departamento durante la realización de
esta tesis ha resultado más llevadera; no hubiera sido lo mismo sin ellos.
Por último, me gustaría expresar mi más profundo agradecimiento a mi
familia por su inquebrantable amor y apoyo. Esta tesis no habría sido posible sin
ellos, ya que son una base fundamental en mi vida. A mis padres, que me han
enseñado los valores importantes de la vida, y que me han enseñado que sin
lucha no hay recompensa, no hay palabras que puedan expresar mi gratitud hacia
ellos. A Guillermo, mi compañero de vida, sin el nada de esto hubiera podido
x
hacerse
realidad,
siempre
ha
permanecido
a
mi
lado
apoyándome
incondicionalmente sin esperar nada a cambio; él hace que sea mejor persona.
xi
xii
ÍNDICE
RESUMEN…………………..…….…….….…………………………………...1
ABSTRACT……………………….…….……………………………………....6
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………....7
1. Antecedentes y generalidades……………………………………………….…9
1.1. Parámetros biológicos de Hermetia illucens……..…..……………..13
1.2. Importancia económica de Hermetia illucens……………………....16
1.3. Hermetia illucens como agente implicado en el cálculo del intervalo
postmortem (IPM) en entomología forense…………..………………….18
2. Objetivos y estructura de la tesis……..….…...……...……………………….19
3. Bibliografía……………………………...……...…...…………………..…....28
CAPÍTULO I: Estudio de la morfología larvaria y análisis preliminar de la
variación de los hidrocarburos cuticulares durante el desarrollo preimaginal
de Hermetia illucens (L.) (Diptera, Stratiomyidae)..........................................29
1. Introducción……..….………………………...……...……………………….32
2. Material y Métodos……..……..……………...……...……………………….35
2. 1. Caracterización morfológica de las larvas……………………….....36
2. 2. Cuantificación de hidrocarburos cuticulares………………………..52
2. 3. Análisis estadístico………………………………...……………….53
3. Resultados……...…………………………...……...……………..…………..53
3. 1. Análisis morfológico……………………………..…………………53
xiii
3. 2. Análisis de hidrocarburos cuticulares……………...……………….60
4. Discusión……..………….………………...….…...……………...………….65
5. Bibliografía………………………………...….…...…...………....………….69
CAPÍTULO II: Growing curves of the Black Soldier Fly, Hermetia illucens
(Diptera: Stratiomyidae) in two different larvae media. ……………..…….77
1. Introduction…...…………………………...….…...……………...…………..80
2. Methodology….…………………………...….…...……………...……….….81
3. Results………..…………………………………...….…...……...………..….83
4. Discussion….....…………………………………...….…...……...……….….92
5. Bibliography.……………………….…...….…....………...……...………….96
CAPÍTULO III: The effects of larval diet on adult life-history traits of the
Black Soldier Fly, Hermetia illucens (L.) (Diptera, Stratiomyidae). ....…...101
1. Introduction….…………………………...….…...……………...…………..104
2. Methodology……………………………...….…...……………...………….105
2.1. Experimental design….…….…………...….…...……………...….106
2.2. Statistical analysis….……….…………...….…...……………...….108
3. Results……………………………..……...….…...……………...………….109
3.1. Mortality, duration of stages and sex-ratio….………...….…....…..109
3.2. Adult size and ovarian development….……….……………….....111
4. Discussion………………………………...….…...……………...………….118
5. Bibliography.……..……………………...….…...….…………...………….121
xiv
CAPÍTULO
IV:
Mass
rearing
of
Hermetia
illucens
(Diptera:
Stratiomyidae): identifying bottlenecks in egg production. ….....……...….127
1. Introduction….…………………………...….…...……………...……….….130
2. Methodology……………………………...….…...……………...………….132
2.1. Adult density experime……..…………...….…...……...………….133
2.2. Mass rearing experiment……..…………...….….……………...….134
2.3. Data analysis and statistic……..…………...….…...…………...….134
3. Results………..……………………………...….…...……………...……….137
3.1. Effect of density on the production of eggs……..…………...…….137
3.2. Experiment mass rearing with different protocols……..…………..141
4. Discussion….....…………………...………...….…...…………...………….145
5. Bibliography.....………………….………...….…...……………...………...148
CONCLUSIONES………………………………...………….……………....153
xv
xvi
RESUMEN
Hermetia illucens (Linnaeus, 1758) es un díptero estratiomido (Diptera,
Stratiomyidae) vulgarmente denominado “mosca soldado negra” (Black Soldier
Fly, BSF en inglés) de origen posiblemente neotropical pero actualmente está
presente en zonas cálidas de todo el mundo, debido a su transporte accidental o a
su introducción deliberada con diferentes usos. La especie es susceptible de ser
criada a escala masiva y los estadios larvarios pueden alimentarse de multitud de
restos orgánicos de muy diverso origen. Es por ello que esta especie presenta un
gran interés desde un punto de vista aplicado ya que por su versatilidad puede ser
utilizada tanto para la transformación de residuos/subproductos orgánicos en
biomasa útil para la alimentación animal o la obtención de biomoléculas, como
bioindicador forense por su papel en investigaciones forenses y su uso para el
cálculo del intervalo postmortem. Por todos estos motivos se necesita una
información profunda sobre la morfología, biología y ecología de H. illucens y
en particular sobre los parámetros biológicos asociados a su cría artificial y
producción masiva. Con el fin de obtener y analizar estos conocimientos se
propuso la realización de la presente tesis doctoral, incidiendo especialmente en
la situación de su cría en Europa. Los principales parámetros estudiados se
abordaron en diferentes capítulos resumidos a continuación.
Se analizó la morfología de los diferentes estadios larvarios y fases
preimaginales, prestando especial atención a la quetotaxia, el tamaño de la
capsula cefálica y la caracterización morfológica de los espiráculos anteriores y
posteriores. No se observaron diferencias sustanciales en la quetotaxia ni en lo
relativo a los espiráculos anteriores de las larvas de diferentes edades; sin
embargo, en el tamaño de la capsula cefálica y la morfología de los espiráculos
posteriores ocurrió lo contrario, detectándose características diagnósticas válidas
-1-
para los diferentes estadios larvarios. También, se presentan los resultados de la
caracterización bioquímica de los hidrocarburos presentes en la cutícula del
exoesqueleto de los diferentes estadios larvales. En este sentido, pudo
comprobarse que a medida que aumenta la edad de las larvas, aumenta de manera
progresiva la abundancia de diferentes compuestos hidrocarbonados. Este hecho
puede ser utilizado en diversas vertientes del ámbito aplicado como por ejemplo
la estimación de la edad en el cálculo del intervalo postmortem o su aplicación
como factor de control de calidad en la producción masiva de H. illucens con
diversos fines industriales.
A continuación, se determinaron los requerimientos térmicos o suma
térmica según el modelo de grados-día de la especie para su posterior empleo en
investigación aplicada. Esta técnica permite relacionar cada fase de desarrollo
con una acumulación de unidades térmicas, sobre una temperatura umbral (la
constante térmica). Se estudió el efecto de la temperatura y el desarrollo
preimaginal de H. illucens sobre diferentes medios de alimentación. Entre los
parámetros analizados se encuentran el tiempo de desarrollo y el efecto en el
crecimiento larvario (longitud y peso), a tres temperaturas constantes (25, 30 y
35 ºC). Con los datos de desarrollo se calculó la temperatura mínima de
desarrollo (T0) y se elaboró un diagrama isomorfo para cada medio de desarrollo
(carne de cerdo y pienso de gallina ponedora).
También se analizó el efecto de tres medios de desarrollo larvario (pienso
de gallina ponedora, harina cárnica multiespecie y harina cárnica mezclada con
pienso de gallina ponedora) en diferentes parámetros biológicos de los imagos
obtenidos como el tamaño alar (analizado mediante morfometría geométrica) y el
desarrollo ovárico de las hembras de H. illucens. Se encontraron diferencias
significativas en el tamaño alar de los imagos obtenidos en su fecundidad,
mortalidad, y otros parámetros estudiados,
Por último, con objeto de identificar y resolver los cuellos de botella
relacionados con la producción masiva de huevos de H. illucens en condiciones
de cría artificial, se determinaron los principales factores abióticos y bióticos
-2-
relacionados con el desarrollo y maduración de los imagos estableciendo los
límites de la producción de huevos. Los principales resultados indican que tanto
la luz solar como la densidad de adultos y el tamaño de la caja de cría, tienen una
influencia significativa sobre el desarrollo del ciclo biológico de la especie.
-3-
-4-
ABSTRACT
Hermetia illucens (Linnaeus, 1758) is a dipterous stratiomido (Diptera,
Stratiomyidae) commonly called "black soldier fly" (BSF), with neotropical
origin that currently occurs in warm worldwide areas because of accidental
transportation or intentional introduction of different uses. The species is capable
of being raised on a massive scale, the larval stages have a higher resistance
feeding a large amount of organic matter of diverse origin. The versatility of this
species can be used for processing of waste/biomass byproducts into useful
organic feed or obtaining biomolecules and to use in forensic investigations for
calculating the postmortem interval. For all these reasons it takes a deep
information on the morphology, biology and ecology of H. illucens particularly
on biological parameters associated with its artificial breeding and mass
production. In order to obtain and analyze this knowledge is proposed to hold
this thesis, with special emphasis on the status of their breeding in Europe. The
main parameters studied were addressed in different chapters summarized below.
Were analyzed the morphology of the different larval stages and phases
preimaginal, paying particular attention to the chaetotaxy, the size of the head
capsule and morphological characterization of the anterior and posterior
spiracles. No substantial differences were observed in the chaetotaxy and in the
previous spiracles larvae of different ages, however, the head capsule size and
morphology of the posterior spiracles showed different characteristics with
respect to the age of the larvae, valid for features diagnostic of different larval
stages. We present the results of the biochemical characterization of the
hydrocarbons in the cuticle of different larval stages. In this regard, it was found
that with increasing age of the larvae, progressively increases the abundance of
different hydrocarbon compounds. This fact can be used in various areas of
-5-
applied field such as age estimation in the postmortem interval calculation factor
or its application as quality control in mass production of H. illucens with various
industrial purposes.
The following requirements were determined thermal or heat summation
by degree-day model of the species for later use in applied research. This
technique relates each development phase with an accumulation of heat units
above a threshold temperature (constant temperature). Was studied the effect of
temperature on different media of larval development of H. illucens. Was
analyzed the development time and the effect on larval growth (length and
weight) on three constant temperatures (25, 30 and 35 º C). With the
development data was calculated minimum temperature development (T0) and
developed a diagram isomorphic to each development environment (pork meat
and hen feed).
We also analyzed the effect of the media in the larval development (hen
feed, meat meal+hen feed mixed and meat meal alone) on different biological
parameters as adults wing size (analyzed by geometric morphometrics) and
ovarian development H. illucens females. Significant differences in the wing
size, in fertility, mortality, and other parameters studied, was obtained.
Finally, in order to identify and resolve bottlenecks related to the mass
production of eggs of H. illucens in artificial rearing conditions, were determined
the abiotic and biotic factors related to the development and maturation of adults.
The main results show that both, sunlight and adult density and size of the
breeding box, have a significant influence on the development of the life cycle of
the species.
-6-
INTRODUCCIÓN GENERAL
-8-
Generalidades de Hermetia illucens
1. Antecedentes y generalidades
El orden Diptera constituye uno de los principales grupos de insectos,
presentando aproximadamente 100 familias descritas y más de 85.000 especies
conocidas. Una gran parte de estos insectos presentan gran importancia
económica, bien sea por su importante papel en la descomposición de la materia
orgánica, por actuar como fauna útil en el control de plagas o por su papel como
agentes polinizadores tanto en agrosistemas como hábitats naturales. Por otro
lado, algunos grupos, especialmente aquellos con hábitos hematófagos, son
importantes vectores de diversos agentes infecciosos en el ámbito médicoveterinario (Borror et al., 1976).
Los Brachycera son el grupo más diversificado de dípteros, y a él
pertenece la familia Stratiomyidae, con alrededor de 2.600 especies descritas
integradas en aproximadamente 400 géneros (Woodley, 2001). La familia
Stratiomyidae se encuentra presente en todas las regiones biogeográficas del
planeta, estando sus larvas en diversos tipos de hábitats, aunque preferentemente
en zonas húmedas o saturadas de agua, en el medio edáfico, bajo cortezas, y en
materia orgánica en descomposición de diversos orígenes. Los imagos presentan
una llamativa diversidad morfológica superior al resto de familia de dípteros, y
normalmente se localizan sobre la vegetación cercanos a los lugares de desarrollo
larvario (Borror et al., 1976; Woodley, 2001). Las larvas presentan significativas
características diagnósticas, con el tegumento endurecido por depósitos
calcáreos, el cuerpo aplanado dorso-ventralmente, y en ocasiones un sifón corto
al final del cuerpo (James, 1981).
Hermetia illucens (Linnaeus, 1758) (Figura 1) conocida como “mosca
soldado” (= Black Soldier Fly) es un Stratiomyidae, posiblemente originario del
Nuevo Mundo (Kovac & Rozkosny, 1995) pero que a causa de la actividad
-9-
Introducción general
humana se ha distribuido por todas las regiones tropicales húmedas y
subtropicales del planeta (James, 1935). Sin embargo, pueden tolerar
temperaturas extremas (Callan, 1973), aunque no durante el momento de la
ovoposición (Drees & Jakman, 1998). En Europa, se registró por primera vez en
Malta en 1926, y desde entonces, se ha citado en amplias zonas de la región
Mediterránea, Albania, Croacia, Francia, Italia, el sur de Suiza, Portugal y
España (Martínez-Sanchéz et al., 2011). En la península Ibérica, H. illucens se
registró por primera vez en 1954 en España, y en Portugal en 1995 (MartínezSánchez et al., 2011).
Figura 1. Adulto de Hermetia illucens (de www.CritterZone.com).
Los adultos, probablemente presentan una dieta florícola en condiciones
naturales, pero en cautividad pueden sobrevivir varias semanas sin alimento
(Tomberlin et al., 2002). Por el contrario, las larvas pueden desarrollarse en una
amplia diversidad
de
materia
orgánica, desde estiércol
y carne en
descomposición, hasta frutos y vegetales; por otra parte, en ocasiones pueden
- 10 -
Generalidades de Hermetia illucens
causar miasis accidental en el ser humano (James, 1947; Calderón-Arguedas et
al., 2005).
Los imagos son muy variados en forma y coloración, presentando un
mimetismo con ciertos grupos de himenópteros, que en principio les confiere sus
ventajas ante ciertos depredadores. Otra particularidad son sus conspicuos ojos
dicópticos. La hembra suele presentar un tamaño superior al macho, aunque no
existe un evidente dimorfismo sexual. El aparato genital fue descrito por primera
vez por Rozkosny (1983) (Figura 2). La genitalia masculina es relativamente
corta y presenta dos pares de lóbulos posteriores laterales, un par de cercos y un
par de gonostilos muy reducidos. El complejo edeagal es muy delgado y se
encuentra dilatado en su parte basal. La terminalia femenina se compone de un
par cercos largos formados por dos segmentos; posee una larga placa subgenital
en su parte distal de forma puntiaguda y una furca genital subtriangular (Üstüner
et al., 2003). La estructura genital representa el único carácter de dimorfismo
sexual de esta especie (Figura 3).
Los imagos presentan una pigmentación predominantemente oscura, con
alas de color marrón o negro. El tamaño de las antenas es al menos dos veces la
longitud de la cabeza y están constituidas por ocho artejos irregulares; el último
flagelómero, presenta la arista. Las patas son principalmente negras, aunque en la
zona basal de todos los tarsos se observa una pigmentación blanca. El abdomen
consta de cinco segmentos visibles de color negro, pero en la parte posterior del
margen de los terguitos 1 y 2
se encuentran un par de manchas (también
llamados espejos=“mosca de espejuelos”) translúcidos, blancos y oblongos con
función desconocida (Üstüner et al., 2003) (Figura 1).
- 11 -
Introducción general
Figura 2. 53-55: Genitalia masculina de un Stratiomyidae; 53: vista dorsal; 54: vista lateral; 55
vista ventral. 56-58: Terminalia femenina de un Stratiomyidae; 56: vista dorsal; 57: furca
genital; 58: vista ventral. (aed: complejo edeagal, cerc: cerco, ep: epandrium, epipr: epiprocto,
gcx: gonocoxito, gcxap: apodema gonocoxal, gst: gonostylus, S: esternito, synst: synsternito, T:
terguito) (Rozokosny 1983).
A
B
Figura 3. Vista ventral del final del abdomen en un macho (A) y hembra de Hermetia illucens.
- 12 -
Generalidades de Hermetia illucens
1.1. Parámetros biológicos de Hermetia illucens
Aproximadamente cinco días después de la emergencia del adulto puede
ocurrir la cópula. Tingle y colaboradores (1975) describieron la conducta de
apareamiento de esta especie indicando que las hembras que se encuentran en
reposo atraen a los machos en vuelo, de manera que estos descienden para la
cópula. Sin embargo, Copello (1926) señaló previamente que el apareamiento se
producía durante el vuelo y no en reposo. Tomberlin y Sheppard (2001)
proporcionaron una nueva descripción del apareamiento de esta especie. Según
estos autores, el macho intercepta a la hembra en el aire descendiendo luego en
copula, en determinados lugares que son defendidos contra otros machos
(sistema de “lekking”).
Tras el apareamiento las hembras depositan alrededor de 600 huevos en
grietas o hendiduras cerca de materia orgánica en descomposición (Sheppard,
1983). Cada huevo con forma de óvalo mide aproximadamente 1 mm de
longitud, su coloración varía de blanco a amarillo pálido o crema, emergiendo
larvas de primer estadio en aproximadamente cuatro días a 24 ºC (Booth &
Sheppard, 1984). Las larvas son de crecimiento rápido y se caracterizan por seis
estadios larvales (L1, L2, L3, L4, L5 y prepupa). Las larvas pueden llegar a
medir hasta 3 cm de longitud, son de un color opaco y blanquecino y presentan
una característica quetotaxia tanto en su parte ventral como dorsal (Hall &
Gerhardt, 2002). Al finalizar su crecimiento, las larvas abandonan el medio de
desarrollo buscando un sitio seco y protegido, a este estadio se lo denomina
prepupa (sexto estadio larval). Esta etapa se caracteriza por el endurecimiento y
oscurecimiento de la cutícula, así como por su gran movilidad y tras unos días se
transforma en pupa caracterizada por la falta de movimiento activo (Hall &
Gerhardt, 2002).
- 13 -
Introducción general
Los adultos emergen aproximadamente después de dos semanas tras la
formación de la prepupa (Tomberlin et al., 2002). Los adultos no necesitan
alimentarse por lo que dependen de las reservas acumuladas durante la fase
larvaria (Newton et al., 2005). La duración de cada etapa del ciclo de vida de H.
illucens está influenciado por diversos factores abióticos y bióticos, que pueden
alterar de forma significativa el desarrollo de las etapas preimaginales de esta
especie (Tomberlin & Sheppard, 2002).
En Hermetia illucens al igual que en la mayor parte de los insectos, la
temperatura afecta directamente sobre el crecimiento y desarrollo de las etapas
preimaginales independientemente de la disponibilidad de alimento (Gullan &
Cranston, 2000). El desarrollo de un insecto se puede describir mediante una
curva de rendimiento térmico, donde desde una temperatura mínima su desarrollo
aumenta hasta una temperatura óptima, disminuyendo rápidamente a una
temperatura máxima (Deutsch et al., 2008). Las temperaturas mínima y máxima
se denominan umbrales de desarrollo y cuando los insectos se enfrentan a
entornos ambientales más allá de sus umbrales de desarrollo, éste se relentiza o
detiene. Las temperaturas óptimas para el ciclo biológico de H. illucens se sitúan
en el rango 24 a 29,3 °C (Furman et al., 1959; Tingle et al., 1975; Bradley &
Sheppard, 1983; Booth & Sheppard, 1984; Sheppard & Newton, 2000).
Al igual que la temperatura, la humedad ambiental puede tener
importantes efectos fisiológicos afectando al desarrollo, longevidad y la
oviposición de H. illucens (Gullan & Cranston, 2000). La cutícula del
exosesqueleto está formada por un capa lipídica superficial impermeable al agua
(Wigglesworth, 1944). La tasa de transpiración a través de la cutícula en especies
adaptadas a climas húmedos tiende a ser superior a las de ambientes más secos
(Wigglesworth, 1984). Por ello es importante conocer los mecanismos
conductuales empleados por los insectos con este fin. En particular, se han
- 14 -
Generalidades de Hermetia illucens
descrito diversas estrategias durante la ovoposición, tales como la agrupación de
huevos en masa y la selección del sitio de oviposición, por ejemplo en la parte
inferior de una hoja húmeda cerca de la fuente de alimento. Las hembras de H.
illucens suelen ovopositar en grietas secas cerca de un recurso húmedo (Booth &
Sheppard, 1984), de manera que larvas recién eclosionadas pueden rápida y
fácilmente abrirse camino hacia el recurso antes de la desecación. Además, las
larvas también se encuentran amenazadas por la pérdida de agua corporal en un
ambiente terrestre (Gullan & Cranston, 2000). Estudios de laboratorio con H.
illucens determinaron que el rango óptimo para el desarrollo de la especie es 50
a 99% de humedad relativa del aire (Furman et al., 1959; Tingle et al., 1975;
Bradley & Sheppard, 1983; Booth & Sheppard, 1984).
Por otro lado, algunos estudios indican que determinadas características
lumínicas estimulan el apareamiento de los adultos, en particular se ha propuesto
que los ojos de H. illucens presentan características particulares únicas de
fotorrecepción (Tomberlin & Sheppard, 2002; Zhang et al., 2010).
Otros factores como la calidad y cantidad de alimento así como también la
densidad poblacional son de vital importancia en el desarrollo de esta especie
(Sheppard et al., 2002; Tomberlin & Sheppard, 2002). Según Liu y
colaboradores (2008) la cantidad de alimento diario que requieren las larvas para
su adecuado crecimiento depende de su contenido nutricional (Sheppard et al.,
2002). En condiciones ideales, las larvas tardan dos semanas en alcanzar el
estado de prepupa, pero si hay limitaciones de alimento este período se puede
extender hasta cuatro meses (Furman et al., 1959). Esta habilidad para extender
el estado larval en respuesta a la disponibilidad de alimento aumenta las
posibilidades de supervivencia a largo plazo en condiciones naturales (Sheppard
- 15 -
Introducción general
et al., 1994) permitiendo su adaptación a diferentes tipos de hábitats y medios de
desarrollo.
Para la cría en cautividad de Hermetia illucens, Tingle y colaboradores
(1975) señalaron que el apareamiento y la ovoposición solo se lograba en cajas
de colonia de 3 x 6,1 x 1,8 m y 0,76 x 1,14 x 1,37 m. Sin embargo, Sheppard y
colaboradores (2002) obtuvieron resultados similares en cajas de colonia de 2 x 2
x 4 m. Estos resultados podrían estar relacionados con la necesidad de espacio de
los imagos para el adecuado desarrollo del comportamiento tipo “lekking”
(Tomberlin et al., 2002).
1.2. Importancia económica de Hermetia illucens
Uno de los principales retos del siglo XXI es la búsqueda de una solución
en la gestión sostenible de los residuos orgánicos, especialmente en ambientes
urbanos y también en el ámbito agroalimentario. Como se ha mencionado
anteriormente, las larvas de H. illucens, pueden alimentarse en diversos tipos de
residuos orgánicos. Esta versatilidad puede ser empleada para obtener excelentes
resultados en la eliminación de residuos orgánicos (Lardé, 1989; Newton et al.,
2005a; St-Hilaire et al., 2007; Hem et al., 2008).
La gestión de restos orgánicos mediante insectos trasforma estos en
biomasa
reutilizable de diversas maneras, siendo una de las que presenta
mejores perspectiva como alimento animal. Las larvas de H. illucens pueden ser
utilizadas como fuente de alimento para aves de corral (Sheppard et al., 2002).
Su alta concentración proteica y otros nutrientes como: ácidos grasos, pigmentos,
vitaminas y/o minerales, permiten su inclusión en las dietas en avicultura,
ganadería y acuicultura. Sheppard y colaboradores (2002) evaluaron el uso de
larvas o harinas de larvas de H. illucens en ensayos con pollos, cerdos y peces,
- 16 -
Generalidades de Hermetia illucens
demostrando su utilidad como fuente de proteína cruda y lípidos altamente
deseables con cadenas medias de ácidos grasos monosaturados. Estudios con
harina de larvas de H. illucens para la alimentación de peces ha revelado
resultados prometedores en lo que respecta a la sustitución de la harina de
pescado (Hale, 1973; Newton et al., 1977; Bondari & Sheppard, 1987). Newton y
colaboradores (2005b) sustituyeron el 50% de la harina de pescado comercial con
harina de larvas de esta especie sin efectos negativos sobre el crecimiento de
alevines de la especie Ictalarus punctatus (bagre de canal o pez de gato
americano).
Otro interesante subproducto derivado de la utilización de larvas de H.
illucens procede de su exoesqueleto; la cutícula de los insectos se compone de
quitina además de lípidos y otros compuestos. La quitina es de interés comercial
(quitosano) debido a su alto porcentaje de nitrógeno (6,9%). Sin embargo, la
viabilidad económica de la extracción de quitina de prepupas de H. illucens
todavía debe ser evaluada.
Una ventaja adicional de H. illucens es su capacidad para repeler la
oviposición de Musca domestica (Bradley & Sheppard, 1984), un transmisor
mecánico de enfermedades especialmente importante en los países en desarrollo,
donde la falta de saneamiento y de agua corriente implican fuentes potenciales
de agentes patógenos (Graczyk et al., 2001). En este sentido el empleo de larvas
de mosca soldado en la conversión de bio-estiércol disminuyó los niveles de
Escherichia coli (Erickson et al., 2004; Liu et al., 2008); esta capacidad sin
embargo, está muy influenciada por la temperatura obteniendo una tasa de
reducción óptima entre 27 ° C y 31 ° C (Liu et al., 2008). Los autores observaron
que aunque la presencia de larvas disminuye los recuentos de bacterias, no las
elimina por completo (Liu et al., 2008).
- 17 -
Introducción general
Por otro lado, la actividad larvaria en conjunción con la actividad
bacteriana, no sólo reducen la masa seca, sino también otros componentes tales
como el nitrógeno o fósforo. Experimentos con estiércol de vaca mostraron una
reducción de 43% de nitrógeno y 67% de fósforo (Myers et al., 2008). La
combinación de la capacidad de tratamiento de residuos junto con la generación
de un producto de valor económico hace que esta especie sea una herramienta
muy prometedora para la gestión de residuos orgánicos.
1.3. Hermetia illucens como agente implicado en el cálculo del intervalo
postmortem (IPM) en entomología forense
Los cuerpos de los animales en descomposición son fuente de alimento
temporal para diversos organismos tales como hongos, bacterias, artrópodos e
incluso vertebrados (Smith, 1986). En este microhábitat, los artrópodos son los
principales colonizadores siendo los insectos sarcosaprófagos la fauna
predominante (Nuorteva, 1977). Así, la información acerca de los insectos, en
combinación con otros procedimientos forenses, generan datos que pueden ser
útiles en las investigaciones forenses cuyo objetivo principal es determinar el
intervalo postmortem (IPM), es decir, el tiempo transcurrido desde la muerte
hasta el descubrimiento del cuerpo, y las inferencias sobre la ubicación, el modo
o la causa de la muerte (Haskell & Catts, 1990; Catts & Goff, 1992). La
importancia de utilizar los insectos en investigaciones criminales reside en el
hecho de que a menudo son los primeros en llegar al cadáver después de la
muerte y pueden permanecer en todas las etapas de descomposición (Caravalho
& Ribeiro, 2000). Entre los muchos factores extrínsecos que influyen en el
proceso de descomposición están las condiciones ambientales tales como la
temperatura, la humedad, la disponibilidad de oxígeno, la ubicación y el estado
- 18 -
Generalidades de Hermetia illucens
del cuerpo, si están intactos o mutilados, etc (Ubelaker, 1997). También existen
factores intrínsecos como sustancias químicas (Guimarães et al., 1978).
Hermetia illucens puede clasificarse como necrófaga oportunista o
secundaria (Haskell & Catts, 1990; Lord et al., 1994). No obstante, se ha
demostrado que esta especie puede resultar muy útil para el cálculo del IPM
(Lord et al., 1994; Oliveira-Costa, 2003; Pujol-Luz et al., 2008), sobre todo para
muertes de más de 15 días. Son varios los trabajos que recientemente, han
demostrado la importancia forense de H. illucens en Europa (Turchetto et al.,
2001; Martínez-Sánchez et al., 2011).
2. Objetivos y estructura de la tesis
El objetivo general de esta tesis doctoral es el análisis de los principales
parámetros biológicos involucrados con la cría y producción masiva de H.
illucens en condiciones controladas así como su uso como indicador forense. El
conocimiento de su biología reproductiva así como la caracterización
morfológica de sus estadios preimaginales facilitarán el empleo de H. illucens en
diversos ámbitos de la investigación aplicada, como su uso en alimentación
animal o en el cálculo del intervalo posmortem (IPM) en entomología forense.
Para llevar a cabo este objetivo general se plantearon diversos objetivos
específicos que se desarrollaron en los siguientes capítulos de esta tesis:
• Capítulo I: Caracterización
morfológica y
variación en los
hidrocarburos cuticulares de H. illucens, durante su desarrollo
preimaginal. Mediante técnicas de microscopía óptica convencional y
microscopía electrónica, se analizaron los cambios morfológicos
- 19 -
Introducción general
acontecidos durante el desarrollo larvario. También se realizo el análisis
de la composición química del exoesqueleto cuticular de los estadios
larvarios en función de la edad de desarrollo y su utilidad en investigación
aplicada.
• Capítulo II: Cálculo de la suma térmica (growing-degree days = suma
de grados-día) durante el desarrollo preimaginal de H. illucens.
Estudio de la duración de las etapas preimaginales a diferentes
temperaturas y en medios de desarrollo larvario distintos.
• Capítulo III: Influencia del medio de desarrollo larvario en la eficacia
biológica de H. illucens. Evaluación del efecto de la alimentación y
desarrollo preimaginal en la mortalidad, fecundidad, tamaño y otros
parámetros biológicos de los imagos.
•
Capítulo IV: Identificación de cuellos de botella en la producción
masiva de huevos de H. illucens en condiciones controladas.
Determinación de los factores abióticos y bióticos clave que afectan al
desarrollo imaginal, determinando los límites de la producción masiva de
huevos de la especie.
- 20 -
3. BIBLIOGRAFÍA
BOOTH, D. C. & SHEPPARD, D. C. 1984. Oviposition of the black soldier fly,
Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae): eggs, masses, timing and site
characteristics. Environ. Entomol. 13:21-423.
BORROR, D. J.; TRIPLEHORN, C. A. & DELONG, D. M. 1976. An
introduction to the study of insects: Diptera. 4 ed. New york: Holt.
BRADLEY, S. W. & SHEPPARD, D. C. 1983. House fly oviposition inhibition
by larvae of Hermetia illucens, the black soldier fly. Journal of Chemical
Ecology. 10:853-859.
CALDERON-ARGUEDAS, O.; MURILLO BARRANTES, J. & SOLANO, M.
E. 2005. Miasis entérica por Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) en
una paciente geriátrica de Costa Rica. Parasitol. Latinoam. 60:162–164.
CARAVALHO, C. J. & RIBEIRO, P. B. 2000. Chave de identificao das especies
de Calliphoridae (Diptera) do sul do Brasil. Revista Brasilera de
Parasitología Veterinaria. 9(2):169-173.
CATTS, E. P. & GOFF, M. L. 1992. Forensic entomology in criminal
investigations. Annu. Rev. Entomol. 37:253-272.
COPELLO, A. 1926. Biologia de Hermetia illucens Latr. Rev. Sco. Entomol.
Argent. 1:23-27.
DEUTSCH, C. A.; TEWKSBURY, J. J.; HUEY, R. B.; SHELDON, K. S.;
GHALAMBOR, C. K. HAAK, D. C. & MARTIN, P. R. 2008. Impacts of
climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America.
105:6668-6672.
- 21 -
Introducción general
DREES, B. & JACKMAN, J. A. 1998. A field guide to common Texas insects.
Houston: Gulf Publishing Company.
ERICKSON, M.; ISLAM, M.; SHEPPARD, C.; LIAO, J. & DOYLE, M. 2004.
Reduction of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enteriaca Serovar
Enteritidis in Chicken manure by larvae of the Black Soldier Fly. Journal
of food protection. 67:685-690.
FURMAN, D. P.; YOUNG, R. D. & CATTS, E. P. 1959. Hermetia illucens
(Linnaeus) as a factor in the natural control of Musca domestica Linnaeus.
Journal of Economic Entomology. 52:917–921.
GRACZYK, T. K; MUDAKIKWA, A. B; CRANFIELD, M. R &
EILENBERGER, U. 2001. Hyperkerotic mange caused by Sarcoptes
scabiei (Acariformes: Sarcoptidae) in Juvenile human –habituated
mountain Gorillas (Gorilla gorilla berngei). Parasitology research.
87:1024.
GUIMARÃES, J. H., PRADO, A. P. & LINHARES, A. X. 1978. Three newly
introduced blowfly species in southern Brazil (Diptera: Calliphoridae).
Revista Brasilera de Entomología. 22:53-60.
GULLAN, P. J. & CRANSTON, P. S. 2000. The insects: an outline of
entomology. London, United Kingdom: Blackwell Science.
HALE, O. M. 1973. Dried Hermetia illucens larvae (Diptera: Stratiomyidae) as a
feed additive for poultry. J. Georgia Entomol. Soc. 8:16-20.
HALL, D. C. & GERHARDT, R. R. 2002. Flies (Diptera). In Mullen G, Durden
L. (editors). Medical and Veterinary Entomology. Academic Press. San
Diego, California. 127-161.
- 22 -
Generalidades de Hermetia illucens
HEM, S.; TOURE, S.; SAGBLA, C. & LEGENDRE, M. 2008. Bioconversion of
palm kernel meal for aquaculture: Experiences from the forest region
(Republic of Guinea). African Journal of Biotechnology. 7(8):1192-1198.
HASKELL, N. H. & CATTS E. P. 1990. Entomology and Death: A Procedurals
Guide, Joyce’s Print Shop, Clemson, SC. pp 52-97.
JAMES, M. T. 1935. The genus Hermetia in the United States (Diptera,
Stratiomyidae). Bulletin of the Brooklyn Entomological Society. 30:165170.
JAMES, M. T. 1947. The flies that cause myiasis in man. Misc. Publ. US Dept.
Agric. 631:146–148.
JAMES, M. T. 1981. Stratiomyidae. Chapter 36. In MCALPINE, J. F.; B. V.
PETERSON, B. V.; SHEWELL, G. E.; TESKEY, H. J.; VOCKEROTH,
J. R. & WOOD, D. M. Manual of Nearctic Diptera. Ottawa: Research
Branch, Agriculture Canada. 497–511.
KOVAC, D. & ROZKOSNY, R. 1995. Stratiomyidae (Insecta: Diptera) of
Temengor Forest Reserve, Hulu Perak, Malaysia. Malayan Nature
Journal. 48:281-285.
LARDÉ, G. 1989. Investigation on some factors affecting larval growth in a
coffee-pulp bed. Biological Wastes. 30:11-19.
LINNAEUS. C. 1758. Systema naturae per regna tria naturae. Ed. 10. Vol. 1, l
824 pp. Holmiae (=Stockholm).
- 23 -
Introducción general
LIU, Q. L.; TOMBERLIN, J. K.; BRADY, J. A.; SANFORD, M. R. & YU, Z. N.
2008. Black Soldier Fly (Diptera: Stratiomyidae) Larvae Reduce
Escherichia coli in Dairy Manure. Environmental Entomology. 37:15251530.
LORD, W. D.; GOFF, M. L.; ADKINS, T. R. & HASKELL, N. H. 1994. The
black soldier fly Hermetia illucens (Diptera, Stratiomyidae) as a potential
measure of human postmortem interval: observations and case histories. J
Forensic Sci. 39:215–22.
MARTÍNEZ-SÁNCHEZ, A.; MAGAÑA, C.; SALOÑA, M. & ROJO, S. 2011.
First record of Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) on human
corpses in Iberian Península. Forensic Science International. 206:76-78.
MYERS, H.; TOMBERLIN, J.; LAMBERT, B. & KATTES, D. 2008.
Development of Black Soldier Fly (Diptera: Stratiomyidae) Larvae Fed
Dairy Manure. Environ. Entomol. 37(1):11-15.
NUORTEVA, P. 1977. Sarcosaprophagous insects as forensic indicators. In CG
Tedeschi, WG Eckert & LG Tedeschi (eds), Forensic Medicine: a Study in
Trauma and Environmental Hazards, Vol. II, WB Saunders, New York.
p.1072-1095.
NEWTON, G, L; BOORAM, C. V.; BARKER, R. W. & HALE, O. M. 1977.
Dried Hermetia illucens larvae meal as a supplement for swine. J. Anim.
Sci. 44:395-400.
NEWTON, G. L.; SHEPPARD, D.C.; WATSON, D.W.; BURTLE, G. & DOVE,
R. (a) 2005. Using the black soldier fly, Hermetia illucens, as a valueadded tool for the management of swine manure. Animal and poultry
waste management center, North Carolina State University, Raleigh, NC.
17p.
- 24 -
Generalidades de Hermetia illucens
NEWTON, G. L.; SHEPPARD, D. C.; WATSON, D. W.; BURTLE, G. &
DOVE, R. (b) 2005. Using the black soldier, Hermetia illucens, as a
value-added
tool
for
the
management
of
swine
manure.
(http//www.p2pays.org/ref/37/36122.pdf).
OLIVEIRA-COSTA, J. 2003. Entomologia Forense – Quando os Insetos são
Vestígios. São Paulo, Millennium, 180 p.
PUJOL-LUZ, J. R.; FRANCEZ, P. A. C.; URURAHY-RODRIGUES, A. &
CONSTANTINO, R. 2008. The black soldier-fly, Hermetia illucens
(Díptera, Stratiomyidae), used to estimate the postmortem interval in a
case in Amapá state, Brazil. Journal of Forensic Science. 53:476–478.
ROZKOSNY, R. 1983. A Biosystematic Study of the European Stratiomyidae
(Diptera). Vol. 2. Clitellariinae, Hermetiinae, Pachygastrinae and
Bibliography. The Hague: Dr. W. JUNK.
SHEPPARD, C. 1983. House fly and lesser fly control utilizing the black soldier
fly in manure management systems for caged laying hens. Environmental
Entomology. 12:1439–1442.
SHEPPARD, D. C.; NEWTON, G. L. & THOMPSON, S. A. 1994. A value
added manure management system using the black soldier fly.
Bioresource. Tech. 50:275-279.
SHEPPARD, D. C. & NEWTON, G. L. 2000. Valuable byproducts of a manure
management system using the black soldier fly. A literature review with
some current results. Animal, Agricultural and Food Processing Wastes:
Proceedings of the 8th International Symposium. James A. Moore ed.
American Society of Agricultural Engineers, St. Joseph, Michigan. pp. 3539.
- 25 -
Introducción general
SHEPPARD, D. C.; TOMBERLIN, J. K.; JOYCE, J. A.; KISER, B. C. &
SUMNER, S. M. 2002. Rearing methods for the black soldier fly (Diptera:
Stratiomyidae). J. Med. Entomol. 39:695–8.
SMITH, K. G. 1986. A manual of forensic entomology. University Printing
House, London. 205 pp.
ST-HILAIRE, S.;
CRANFILL, K.; MCGUIRE, M.A.; MOSLEY, E.E.;
TOMBERLIN, J.K.; NEWTON, L.; SEALEY, W.C.; SHEPPARD, D.C.
& IRVING, S.
2007.
Fish offal recycling by the black soldier fly
produces a foodstuff high in omega-3 fatty acids. Journal of the World
Aquaculture Society. 38:309-313.
TINGLE, F. C.; MITCHELL, E. R. & COPELAND, W.W. 1975. The soldier fly,
Hermetia illucens, in poultry houses in North Central Florida. J. Ga.
Entomol. Soc. 10:179-183.
TOMBERLIN, J. K. & SHEPPARD, D. C. 2001. Lekking behavior of the black
soldier fly (Diptera: Stratiomyidae). Florida Entomologist. 84:729–730.
TOMBERLIN, J. K. & SHEPPARD, D. C. 2002. Factors influencing Mating and
Oviposition of Black Soldier Flies (Diptera: Stratiomyidae) in a Colony. J.
Entomol. Sci. 37(4):345-352.
TOMBERLIN, J. K.; SHEPPARD, D. C. & J. A. JOYCE, J. A. 2002. Selected
life-history traits of black soldier flies (Diptera: Stratiomyidae) reared on
three artiÞcial diets. Ann. Entomol. Soc. Am. 95: 379-386.
TURCHETTO, M.; LAFISCA, S. & CONSTANTINI, G. 2001. Postmortem
interval (PMI) determinedby study sarcophagous biocenoses: three cases
from the province of Venice (Italy). Forensic Sci. Int. 120:28–31.
- 26 -
Generalidades de Hermetia illucens
UBELAKER, D. H., 1997. Skeletal Biology of Humans Remains From la Tolita,
Esmeraldas Province, Ecuador; Washington D. C.: Smithsonian Institution
Press.
ÜSTÜNER, T.; HASBENLI, A. & ROZKOSNY, R. 2003. The first record of
Hermetia illucens (Linnaeus, 1758) (Diptera, Stratiomyidae) from the
Near East. Studia dipterologica. 10:181-185.
WIGGLESWORTH, V. B. 1984. Insect Physiology. Cambridge: University
Press.
WOODLEY, N. E. 2001. World Catalog of the Stratiomyidae (Insect: Diptera).
Leiden: Backhuys Publishers.
ZHANG, J.; HUANG, L.; HE, J.; TOMBERLIN, J. K.; LEI, C. & YU, Z. 2010.
An Artificial Light Source Influences Mating and Oviposition of Black
Soldier Flies (Diptera: Stratiomyidae). Journal of Insect Science. 10:15362442.
- 27 -
Introducción general
- 28 -
Capítulo I
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
Estudio de la morfología larvaria y análisis preliminar
de la variación de los hidrocarburos cuticulares,
durante el desarrollo preimaginal de Hermetia illucens
(L.) (Diptera, Stratiomyidae).
Resumen
El objetivo de este capítulo fue estudiar y determinar diferencias
morfológicas en las fases larvarias, así como analizar la composición de
hidrocarburos cuticulares con el fin de poder diferenciar los distintos estadios
preimaginales de H. illucens.
Entre los resultados obtenidos, destacan las diferencias en el tamaño de la
cápsula cefálica y de los espiráculos posteriores, así como el número de aberturas
espiraculares que permiten diferenciar los estadios larvarios. En el caso de los
espiráculos posteriores, es la primera vez que estas estructuras se utilizan para y
diferenciar los cinco estadios larvales de H. illucens. Por otro lado, el análisis
cuticular permitió observar cambios en la composición de hidrocarburos
cuticulares con la edad de las larvas. Se determinaron varios picos durante el
análisis, lo que indica que la cantidad de estas sustancias puede aportar
información muy útil sobre la edad de la larva. Aunque estos picos no han sido
asociados al componente, serán analizados en detalle en futuros trabajos
mediante el uso de patrones.
Tanto las caracterización morfológica como cuticular pueden ser
herramientas forenses para su aplicación en la Entomología forense,
concretamente en el cálculo del intervalo postmortem, así como en el control del
proceso de cría masiva de esta especie.
- 31 -
Capítulo I
1. Introducción
La familia Stratiomyidae incluye 12 subfamilias (Parhadrestriinae,
Chiromyzinae,
Beridinae,
Sarginae,
Raphiocerinae,
Clitelariinae,
Chrysochlorininae, Hermetiinae, Stratiomyinae, Antissinae, Nemotelinae y
Pachygastrinae) con más de 2650 especies repartidas en 375 géneros (Woodley,
2001).
Las larvas, asociadas normalmente a materia orgánica vegetal o animal en
descomposición (Pujol-Luz et al., 2004), presentan una gran diversidad de
formas y tamaños, pudiendo ser terrestres, acuáticas o semiacuáticas, y
diferenciándose por variaciones en la coloración y la quetotaxia (McFadden,
1967). Hermetia illucens es una especie de la familia Stratiomyidae que puede
ser identificada por la combinación de las siguientes características: cabeza
comprimida cuyo largo supera su anchura, quetotaxia dorsal y ventral de la
capsula cefálica, de los tres segmentos torácicos y de los ocho segmentos
abdominales, presencia del parche esternal en el sexto segmento abdominal y
morfología de los espiráculos anteriores y posteriores (Rozkošný, 1982).
En la subfamilia Hermetiinae la especie Hermetia illucens (Linneaus,
1758), presenta la mayor distribución geográfica dentro del género Hermetia
(Woodley, 2001). Es una especie neotropical cuya presencia en Europa se ha
constatado en diversos puntos de la cuenca mediterránea. Esta especie se registró
en Malta en 1926 (Lindner, 1936) y desde entonces se ha capturado en Albania,
Croacia, Francia, Italia, sur de Suiza, Portugal y España (Ustuner et al., 2003;
Rozkosny & Knutson, 2007; Martínez-Sánchez et al., 2011). Hermetia illucens
se registró por primera vez España en 1954 (Peris, 1962). Las larvas son
saprófagas, pasando por cinco estadios larvarios más la prepupa, determinados
difícilmente por las medidas de la cápsula cefálica (May, 1961). De hecho en la
- 32 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
actualidad es complicado determinar la edad de la larva, atendiendo a esta
característica, puesto que podría variar en función de la dieta, temperatura, etc.
En los últimos años, ha tomado protagonismo en la determinación de la
edad de los estados preimaginales las técnicas de análisis cuticular (Amendt et
al., 2004). Las larvas están constituidas por una fuerte cutícula formada por una
mezcla de lípidos diversos, entre ellos hidrocarburos insaturados y saturados,
ácidos grasos libres, alcoholes libres, glicéridos, esteroles y aldehídos (Lockey,
1988; Hackman, 1984; De Renobales de et al., 1988; Howard, 1993).
Los hidrocarburos cuticulares son un componente vital de la cutícula de
los insectos durante los estados inmaduros como en fase adulta y poseen diversas
funciones como por ejemplo:
• Proporcionar impermeabilización a los estados preimaginales y los
adultos (Hadley, 1981, Blomquist et al., 1993). También forman
parte de los oocitos, formando una barrera protectora para el
embrión y los primeros estadios larvarios (Gu et al., 1995).
• Actuar como mensajeros químicos entre insectos (Howard, 1993) o
entre insectos y plantas permitiendo las interacciones tróficas.
Como ejemplo, la composición química de la superficie de las
plantas, así como los hidrocarburos de la cutícula de los insectos
que sobre ellas se desarrollan determinan la aceptabilidad de los
insectos fitófagos y de los grupos parasitoides (Espelie & Payne,
1991).
A pesar de los grandes avances de los últimos años en la caracterización
química y biosíntesis de hidrocarburos (Blomquist et al., 1987; Lockey 1988;
Blomquist et al., 1993; Nelson & Blomquist, 1995), el almacenamiento, la
- 33 -
Capítulo I
movilización, el transporte y la caracterización de hidrocarburos, han recibido
poca atención.
La síntesis de hidrocarburos se ha estudiado en varios insectos
holometábolos, en particular en Lepidoptera, Coleoptera, y Diptera. Las fases
inmaduras sintetizan hidrocarburos mientras se alimentan y los almacenan para
su uso en etapas posteriores de desarrollo. En Lepidoptera, la síntesis de
hidrocarburos cuticular de las larvas se correlaciona con el período de
alimentación activa, seguido por un cese de este proceso durante la fase de la
crisálida (Dwyer et al., 1986; Guo & Blomquist, 1991). En insectos
hemimetábolos, como los Orthoptera, también se observa un patrón dependiente
de la edad en la síntesis de hidrocarburos (Cripps et al., 1988). En las hembras de
Blattella germanica (Blatodea), la síntesis de hidrocarburos se relaciona con el
ciclo gonotrófico, siendo alta durante la fase de alimentación, pero baja durante
el período de ayuno que se corresponde con la puesta de la ooteca (Schal et al.,
1994). Por otro lado, dado que la estructura de la cutícula de insectos cambia con
la edad de los mismos (Zhu et al., 2006), su análisis químico puede ser utilizado
como método de datación de la edad del los estadios preimaginales, lo que tiene
un gran interés aplicado en diversos ámbitos, como por ejemplo su uso en el
control de calidad de biofábricas de producción masiva de insectos o su empleo
en entomología forense. En este último caso la adecuada estimación de la edad
de la larva reviste de especial importancia para el cálculo del intervalo
postmorten, especialmente en el caso de los dípteros (Goff & Flynn, 1991).
El análisis de los lípidos cuticulares mediante cromatografía de gases y
espectrometría de masas, demuestran que existen distintas composiciones de
hidrocarburos no sólo entre diferentes especies, sino además entre sexos y en las
diferentes etapas del ciclo de vida de los insectos (Lockey, 1991). Incluso se han
- 34 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
encontrado diferencias cualitativas en la composición cuticular en poblaciones
con diferentes distribuciones geográficas, p.ej. en Blattodea: Blattella lituricollis
(Brenner et al., 1993), o en Diptera: Phormia regina (Byrne, 1995) y Chrysomya
bezziana (Brown et al., 1998).
Los estudios sobre la composición de hidrocarburos en la cutícula de
dípteros se iniciaron en el género Drosophila hace aproximadamente 25 años
(Jallon & David, 1987). Sin embargo, muy pocos estudios se han llevado a cabo
en las diferentes etapas de desarrollo de estos insectos (Goodrich, 1970;
Hebanowska et al., 1990; Espelie & Payne, 1991; Howard et al., 1995).
El objetivo de este capítulo es profundizar sobre las características
morfológicas larvarias de H. illucens, haciendo especial hincapié en la quetotaxia
y las estructuras espiraculares cuyas diferencias pudieran utilizarse para el
diagnosis de los distintos estadios larvales. Por otro lado, se buscaron cambios en
la composición cuticular de las larvas de diferentes edades, a nivel cualitativo, es
decir sin determinar el componente exacto pero determinando su abundancia y
analizando su variación durante el periodo de desarrollo larvario.
2. Material y Métodos
Los especímenes de H. illucens utilizados fueron recolectados de una
colonia de laboratorio mantenida desde 2008 en las instalaciones de la
Universidad de Alicante bajo condiciones constantes (25±5 ºC, 50±10 %HR, luz
natural). La colonia se originó a partir de pupas obtenidas comercialmente
(Empresa de Recursos Insect Science, Georgia, EEUU).
- 35 -
Capítulo I
2.1. Caracterización morfológica de las larvas
Para el estudio de la morfología externa larval, se recolectaron huevos que
fueron transferidos a una mezcla homogénea de pienso de gallina ponedora y
agua. Posteriormente se ubicaron en una cámara de cría (25 ºC, 60 %HR, 12:12
L:D) hasta la emergencia de las larvas. Diariamente se muestrearon 10 larvas
(±24hs), hasta la obtención de las primeras prepupas. Las prepupas o larvas de
sexto estadio no se analizaron ya que presentan estructuras que permiten
reconocer fácilmente su estadio (Rozkosny, 1982). Para su preservación, las
larvas fueron previamente sumergidas en agua destilada y hervidas a 70-80ºC
aproximadamente durante cinco minutos. Seguidamente fueron transferidas a
recipientes herméticos debidamente etiquetados conteniendo alcohol etílico al
70%.
Para determinar posibles diferencias en la morfología, en las larvas de
cada día se analizaron las diferentes estructuras como la quetotaxia, la
morfología de los espiráculos anteriores y posteriores, la morfología de la
capsula cefálica, el largo y ancho de la capsula cefálica, la hendidura anal y la
disposición de sensilios, papilas o espinas a lo largo de los segmentos torácicos y
abdominales. Para realizar este análisis se utilizó microscopia electrónica y
óptica de los Servicios Generales de Investigación de la Universidad de Alicante.
Se empleó la técnica de cryo-scanning, donde las larvas son congeladas con
nitrógeno líquido durante 3-4 minutos. Posteriormente, la muestra congelada es
transferida a la unidad de crio del microscopio electrónico de barrido (SEM)
S3000N Hitachi, donde se lleva a cabo la sublimación de la muestra de -150ºC a
-90 ºC. Una vez eliminado el hielo superficial de la muestra se realiza el
recubrimiento metálico con oro, llamado método de sputtering y se procede a
realizar las imágenes. Los espiráculos posteriores, previamente extraídos y
- 36 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
montados en un portaobjetos con glicerina, fueron observados y fotografiados
con microscopia óptica (Nikon, Eclipse E200) con cámara de adquisición de
imágenes marca Infinity 1. El análisis fue completado con fotografías tomadas en
el laboratorio de Dípteros del CIBIO (cámara Leica HD 0,5x en lupa Leica
IC80Hd).
Las larvas tienen forma esencialmente alargada (0,85 a 30 mm) con
extremo anterior ahusado y posterior redondeado (Figura 1A). El tegumento es
blanquecino a más oscuro y fuertemente esclerotizado según la edad, con una
apariencia de panal o de mosaico cuando se ve bajo un aumento moderado,
debido al depósito cuticular de carbonato cálcico (Figura 1B) (Müller, 1925).
El cuerpo se divide en tres regiones (Figura 1A), la capsula cefálica (CC),
tres segmentos torácicos (ST) y ocho segmentos abdominales (SA). Los
segmentos
del
cuerpo
son
más
anchos
que
largos,
y
aplanados
dorsoventralmente. La diferencia entre segmentos torácicos y abdominales se
encuentra en la quetotaxia.
- 37 -
Capítulo I
Lista de Abreviaturas utilizadas en las figuras
a=antena
abe=aberturas espiraculares
Ad=setas anterodorsales
am=área molar
an=ano
An=setas anales
cae=cámara espiracular
CC=cápsula cefálica
ce=cicatríz estigmática
Cf=setas clipeofrontales
cm/mx=complejo mandíbulo-maxilar
cmx=cepillos maxilares
D=setas dorsales
DL=setas dorsolaterales
esa=espinas anales
ea=espiráculos anteriores
ecf=esclerito clípeofrontal
esl=esclerito lateral
hea=hendiduras espiraculares
L=setas laterales
Lb=setas labrales
lbr=labro
lg=lóbulos genales
m=mandíbula
mx=maxila
O=ojos
Pa=setas preanales
pae=parche esternal
plg=pliegue
plv=placa ventral
pmx=palpos maxilares
prm=prementum
Pv=setas posteroventrales
SA=segmentos abdominales
Sa=segmento anal
se=sensilios
smx=setas maxilares
sec=sensilios
campaniformes
ST=segmentos torácicos
VL=setas ventrolaterales
- 38 -
V=setas ventrales
ep=espiráculos
posteriores
ve=vestigios
espiraculares
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
Cápsula cefálica
I
Segmentos
torácicos
II
III
1
2
3
4
Segmentos
abdominales
5
6
B
7
8
A
Figura 1. Apariencia general de la larva de Hermetia illucens mostrando la división de los
segmentos torácicos, abdominales y la capsula cefálica de la cara dorsal (A). Detalle de la
cutícula (B).
Cápsula cefálica
La cabeza es estrecha y larga, fuertemente esclerotizada y puede ser
retraída dentro del tórax. Dorsalmente se compone de un esclerito dorsomedial,
el clipeo o clipeofrontal (ecf), y un par de escleritos laterales (esl), los cuales por
lo general cubren la mayor parte de la cabeza hasta la región ventrolateral (Figura
2A). Las antenas (a) en posición anterolateral están formadas por tres segmentos
- 39 -
Capítulo I
generalmente conspicuos, el primero o basal presenta 3 sensilios campaniformes
(sec) distribuidos homogéneamente en la base (Figuras 2A, B). En posición
lateral encontramos un par de ojos simples u ocelos (o) (Figuras 2A, C).
En la región anterior, el clípeo se continúa hacia delante conformando el
labro (lbr) estrecho y cónico (Figuras 2A, E), a cuyos lados se sitúa el complejo
mandíbulo-maxilar (cm/mx) el cual se continua ventralmente (Figura 2D). Éste
es el único apéndice bucal y se forma por la fusión de las mandíbulas y maxilas
originales. A lo largo del borde interno anteroventral de los escleritos laterales se
observan los lóbulos genales (lg), estrechos y coriáceos (Figura 2E). Cada
complejo mandíbulo-maxilar consta de una parte basal (mandíbula original, m) y
una parte apical (maxila original, mx). Cada maxila presenta un palpo maxilar
(pmx) (Figura 2F,G) y una serie de setas y cepillos de barrido, denominados
cepillos maxilares (cmx) utilizados en la cavidad oral para la alimentación
(Figura 2F). Cerca de la base del palpo maxilar se forma una agrupación de setas
(setas maxilares, smx) poco desarrolladas (Figura 2F). Posteriormente en la
superficie ventral existe un área molar muy desarrollada (am) (Figura 2H). En la
región basal ventral, la placa ventral (plv), se extiende anteriormente en dos
proyecciones las cuales están conectadas en la zona media a un estrecho
esclerito, el prementum (prm) (Figura 2D).
Quetotaxia: En la región dorsal de la cápsula cefálica hay 4 pares de setas
dorsales, 2 pares llamadas setas labrales (Lb), y los otros 2 pares son las clipeofrontales (Cf). Además existe 1 par dorsolateral (DL) detrás de las prominencias
oculares (Figura 3A). En la región ventral hay 3 pares de setas ventrolaterales
(VL) y 3 pares ventrales (V) (Figura 3B).
- 40 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
A
lbr
B
a
ecf
esl
o
sec
C
D
cm/mx
plv
prm
Figura 2. Morfología de la cápsula cefálica de la larva de Hermetia illucens. Vista dorsal de la
cápsula cefálica (CC) (A). Detalle de la antena (a) (B). Detalle del ojo (o) (C). Vista ventral de
la CC (D). Esclerito lateral (esl), esclerito clípeofrontal (ecf), labro (lbr), sensilios
campaniformes (sec), placa ventral (plv), prementum (prm).
- 41 -
Capítulo I
E
lbr
F
cmx
pmx
smx
lg
G
H
am
Figura 2. Continuación. Detalle del complejo mandíbulo/maxilar (cm/mx) (E). Detalle de la
maxila (mx) (F). Detalle de los palpos maxilares (pmx) (G). Detalle de la área molar (am) (H).
Lóbulos genales (lg), cepillos maxilares (cmx), setas maxilares (smx).
- 42 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
VISTA DORSAL
VISTA VENTRAL
2 pares de setas
labrales
3 pares de setas
ventrales
2 pares de setas
clipeofrontales
3 pares de setas
ventrolaterales
B
A
1 par de setas
dorsolaterales
Figura 3. Quetotaxia de la cápsula cefálica de la cara dorsal (A) y ventral (B) del último estadio
larval de Hermetia illucens (modificado de Rozkosny, 1982).
Tórax
Se encuentra formado por 3 segmentos (I a III). Dorsalmente los
segmentos son densamente pilosos con varias hileras de pequeños sensilios (se)
bien desarrollados en la región anterior de los segmentos II y III (Figuras 4A y
5A). El primer segmento se caracteriza por presentar los prominentes espiráculos
anteriores (ea) (Figuras 4A, B y 5A), dispuestos lateralmente. Cada uno está
formado por una placa esclerotizada en cuyo centro se forma el área estigmática
de forma acorazonada con 2 hendiduras espiraculares en forma de V (hea) y en
su base la cicatriz estigmática (ce) (Figura 4B). A ambos lados del tercer
segmento, ubicadas dorsolateralmente, existen unas estructuras pequeñas y
redondas, los que se conocen como vestigios espiraculares (ve), probablemente
- 43 -
Capítulo I
no funcionales (Figura 5A). Anteroventralmente, los segmentos II y III se
caracterizan por poseer abundantes y pequeños sensilios (se) (Figura 4C y 5B).
Quetotaxia: Los tres segmentos torácicos (Figura 6A) presentan 3 pares de setas
dorsales (D) y 1 par de setas dorsolaterales (DL). En el primer segmento torácico
existe además 2 pares de setas anterodorsales (Ad). En la parte ventral se
presenta 1 par de setas ventrolaterales (VL) y 2 pares de setas ventrales (V)
(Figura 6B).
- 44 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
A
B
ea
hea
se
ce
C
se
Figura 4. Morfología de los segmentos torácicos. Vista dorsal de los segmentos I, II y III (A).
Espiráculo anterior (ea) (B). Vista ventral de los segmentos I, II y III (D). Sensilios (se),
hendiduras espiraculares (hae), cicatriz estigmática (ce).
- 45 -
Capítulo I
A
ea
se
ve
B
se
Figura 5. Vista dorsal (A) y ventral (B) de los segmentos torácicos de la larva de Hermetia
illucens. Detalle de los espiráculos anteriores (ea), los sensilios (se) y los vestigios espiraculares
(ve).
- 46 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
VISTA DORSAL
VISTA VENTRAL
2 pares de setas
anterodorsales
I
Segmentos
torácicos
1 par de setas
ventrolaterales
1 par de setas
dorsolaterales
II
3 pares de setas
dorsales
2 pares de setas
ventrales
III
1 par de setas
ventrolaterales
1
1 par de setas
dorsolaterales
2
3 pares de setas
ventrales
3 pares de setas
dorsales
3
2 pares de setas
laterales
4
Segmentos
abdominales
5
2 pares de setas
ventrales
6
1 par de setas
anales
1 par de setas
dorsales
7
2 pares de setas
preanales
8
A
2 pares de setas
dorsalaterales
B
2 pares de setas
posteroventrales
Figura 6. Quetotaxia dorsal (A) y ventral (B) de los segmentos torácicos y abdominales del
cuerpo del último estadio larval de Hermetia illucens (modificado de Rozkosny, 1982).
- 47 -
Capítulo I
Abdomen
El abdomen está formado por 8 segmentos. Dorsalmente los segmentos 1
al 7, están formados por placas, más o menos rectangulares cubiertas por
numerosas y pequeñas setas (Figura 7A). Anteriormente, en cada placa existe una
hilera de sensilios (se) en forma de espinas (Figuras 7A y 8A). Los segmentos 1 a
7 se caracterizan por presentar a ambos lados vestigios espiraculares (ve), igual
que los observados en el segmento torácico III (Figura 8A). Ventralmente, los
segmentos se caracterizan por la escasa presencia de pequeñas setas y por el
desarrollo de una hilera de fuertes sensilios (se) en la región anterior de cada
segmento (Figura 7B).
De los ocho segmentos abdominales, el último o segmento anal (Sa) tiene
una forma redondeada (Figuras 7C y 8A). En su ápice existe una abertura
rodeada de pequeñas setas que conduce a la cámara espiracular (cae) (Figuras
7C, D) en cuyo interior se encuentran en posición dorsal un par de espiráculos
posteriores (ep). Estos espiráculos están formados por numerosas aberturas
espiraculares (abe) dispuestas radialmente sobre la cicatriz ecdisial (ce) (Figura
8A). El ano (an) aparece como una hendidura longitudinal ventral en la mitad
ventral del segmento anal y sus bordes aparecen festoneadas por espinas cónicas
(es) cortas y fuertes (Figuras 7E, F y 8B). Por encima de la hendidura anal existe
un marcado pliegue convexo (plg) (Figura 7E).
Otra estructura abdominal interesante es el llamado parche esternal (pae),
presente en la zona medio ventral del segmento 6 (Figuras 7G, H y 8B). Es una
zona desprovista de setas tricoides, con forma alargada oval, donde se distingue
la presencia de facetas cuticulares notablemente pequeñas (área cuticular de
glándulas especializadas) y con una coloración diferente del resto del segmento.
- 48 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
A
B
se
C
se
D
cae
cae
Figura 7. Morfología de los segmentos abdominales de una larva de Hermetia illucens. Vista
dorsal (A). Vista ventral (B). Vista dorsal del segmento anal (C). Detalle de la cámara
espiracular (cae) (D). Sensilios (se).
Quetotaxia: Los segmentos abdominales 1 al 7 tienen setas muy similares,
aunque éstas a menudo se hacen más largas y fuertes caudalmente. Hay 3 pares
de setas dorsales (D) dispuestas como en los segmentos torácicos, además de 1
par dorsolateral (DL), 2 pares laterales, que diferencian estos segmentos de los
abdominales (Figura 6A). Ventralmente aparece 1 par ventrolateral (VL) y 3
pares de setas ventrales (V) (Figura 6B). El último segmento abdominal o
segmento anal muestra un sólo par de setas dorsales (D) más o menos
- 49 -
Capítulo I
desarrolladas y dos pares de setas dorsolaterales (DL) (Figura 6A); y en la región
ventral 2 pares ventrales (V), 2 pares posteroventrales (Pv), 1 par de setas anales
(An) y 2 pares de setas preanales (Pa), (Figura 6B) (modificado de Rozkosny,
1982; Woodley, 2009).
E
F
plg
an
esa
G
H
pae
Figura 7. Continuación. Vista ventral del segmento anal (E). Detalle del ano (an) (F). Detalle
del parche esternal (pae) (G, H). Pliegue (plg) y espinas anales (esa).
- 50 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
A
se
ep
ve
abe
ce
cae
B
pae
an
Figura 8. Vista dorsal (A) y ventral (B) de los últimos tres segmentos abdominales de la larva
de Hermetia illucens. Detalle de los espiráculos posteriores (ep), los sensilios (se), los vestigios
espiraculares (ve), el parche esternal (pae) y ano (an). Camara espiracular (cae), aberturas
espiraculares (abe) y cicatriz ecdisial (ce).
- 51 -
Capítulo I
2.2. Cuantificación de hidrocarburos cuticulares
Para la extracción de los hidrocarburos se utilizó hexano al 95% como
disolvente orgánico. El material de vidrio utilizado fue enjuagado con este
disolvente antes de ser utilizado. La metodología seguida fue la siguiente: cada
espécimen era cubierto durante 15 minutos con 200µl de hexano a temperatura
ambiente dentro de una campana extractora. Trascurrido este tiempo el
disolvente se evapora casi completamente. Posteriormente, los extractos crudos y
secos que permanecen en el vial son disueltos nuevamente con 20µl de
disolvente para su posterior análisis mediante cromatografía de gasesespectrometría de masas (CG-EM). Este proceso se replicó 48 veces (3 réplicas
para cada una de las larvas diarias).
La CG-EM es una técnica que combina las características de la
cromatografía gas-líquida y espectrometría de masas para identificar diferentes
sustancias en una muestra de ensayo. Para la realización de análisis cualitativo de
los hidrocarburos cuticulares se utilizó un cromatógrafo de gases Hewlett
Packard 6890 equipado con un capilar de 30µm, una columna HP-5 y un detector
de ionización de llama (FID). Se inyectaron 2µl de los hidrocarburos cuticulares
extraídos de las diferentes muestras (n=48) y los picos cromatográficos
resultantes se integraron mediante software (Hewlett Packard) para su
identificación con un cromatógrafo de gases Agilent 6890N conectado a un
detector de masas Agilent 5973 selectivo. Los análisis se realizaron en los
servicios generales de investigación de la Universidad de Alicante.
- 52 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
2.3. Análisis estadístico
Para determinar las posibles diferencias diarias entre el tamaño de la
capsula cefálica de las larvas o el tamaño del cuerpo (capsula cefálica=largo x
ancho de capsula; cuerpo=largo x ancho de cuerpo de larva), asi como para
realizar las comparaciones estadísticas de la abundancia de hidrocarburos de
todas las edades larvales, se utilizó el test no paramétrico de Kruskal-Wallis (H),
ya que los datos analizados no pasaron el test de normalidad KolmogorovSmirnov. El programa utilizado fue SigmaStat (versión 3.5 para Windows) y los
valores de p superior a 0,05 se descartaron.
3. Resultados
3.1. Análisis morfológico
En el análisis de microscopia electrónica, debido al gran tamaño de las
larvas, a partir del décimo día solo se estudió la cápsula cefálica, los espiráculos
anteriores y el segmento anal; el resto de estructuras fue analizado mediante lupa
binocular óptica, a excepción de los espiráculos posteriores que fueron
analizados diariamente mediante microscopia óptica. Los resultados obtenidos no
indicaron cambios en la quetotaxia de la cápsula cefálica en función de la edad de
las larvas (Figura 3). En cuanto a la quetotaxia de los segmentos torácicos y
abdominales tampoco se encontraron diferencias con respecto a la presencia o
ausencia de setas (Figura 6). Sí que se aprecian cambios en el parche esternal, los
espiráculos posteriores y el tamaño de la capsula cefálica. Al comparar el parche
esternal en los diversos especímenes muestreados se observa un aumento
marcado y progresivo de su tamaño (Figura 9).
- 53 -
Capítulo I
Los espiráculos posteriores fueron analizados a partir del quinto día,
debido a la imposiblidad de aislarlos en larvas de menor edad por su pequeño
tamaño (0,85 mm de longitud). A partir del octavo día (Figura 10) se diferencia
internamente en cada uno de los espiráculos una membrana que podría
interpretarse como la sutura ecdisial (sue). También se observa un aumento
progresivo del diámetro de los espiráculos, así como del tamaño del peritrema
(pm). A medida que aumenta la edad de las larvas, se da un aumento progresivo
en el número de aberturas espiraculares (abe), ajustandose a una línea de
tendencia logarítmica (Figura 11) (Tabla 1).
- 54 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
A
B
pae
C
D
pae
F
E
pae
Figura 9. Parche esternal (pae) de Hermetia illucens de las larvas muestreadas el día 4 (A, B),
el día 6 (C, D) y el día 9 (E, F) del experimento.
- 55 -
Capítulo I
A
B
pm
sue
abe
Figura 10. Morfología de los espiráculos posteriores (x40) de una larva de 6 días de edad (A) y
de una larva de 8 días de edad (x40) (B) de Hermetia illucens. Sutura ecdisial (sue), aberturas
espiraculares (abe), peritrema (pm).
- 56 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
Nº de aberturas espiraculares
80
70
60
y = 27,207ln(x) + 7,6005
R² = 0,9077
50
40
30
20
10
0
5
6
7
8
9
10
11
12
Edad larval (días)
13
14
15
16
Figura 11. Número de aberturas espiraculares de los espiráculos posteriores de larvas de
Hermetia illucens de 5 a 16 días de edad.
Finalmente, también el tamaño de la capsula cefálica se incrementa con el
tamaño y la edad de la larva (Figura 12A, B) (Tabla1). Al analizar el tamaño
(largo x ancho) de la cápsula cefálica y del cuerpo de los especímenes
muestreados, se encontraron diferencias significativas (H=145,454; p˂0,001;
H=155,63; p˂0,001; respectivamente).
- 57 -
Capítulo I
A
Longitud x anchura (mm²)
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1
2
3
4
5
6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Días muestreados
B
Longitud x anchura (mm²)
140
120
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Días muestreados
Figura 12. Largo por ancho (mm²) de la cápsula cefálica (A) y del cuerpo de la larva (B) de
Hermetia illucens durante los 16 días muestreados.
- 58 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
Tabla 1. Características potenciales para diferenciar los distintos estadios (L-I, L-II, L-III, L-IV,
L-V). Longitud de la capsula cefálica (media±DS), número de aberturas espiraculares y tamaño
del espiráculo posterior de las larvas de 1 a 16 días de edad [*: medidas observadas por May
(1961) y Oliveira-Costa (2003); **: medidas obtenidas en este estudio].
Diámetro
Edad y estadio
Cápsula cefálica
Cápsula cefálica
Nº aberturas
espiráculo
(mm) *
(mm) **
espiraculares **
posterior
(micras)**
0,20±0,0103
---
---
0,24±0,0063
---
---
0,27±0,0074
---
---
0,42±0,0191
---
---
0,67±0,0183
14
86,67
1,04±0,0421
15
86,67
Día 7 (L-III)
1,1±0,0294
30
146,67320
Día 8 (L-IV)
1,49±0,1066
52
320
Día 9 (L-IV)
1,64±0,0644
53
340
1,76±0,0777
69
386,67
Día 11 (L-IV)
1,84±0,0883
60
406,67
Día 12 (L-IV)
1,85±0,0782
61
406,67
Día 13 (L-IV)
1,94±0,0606
63
413,33
Día 14 (L-V)
1,99±0,0443
72
540
2,04±0,0681
73
540
2,08±0,2226
73
540
Dia 1 (L-I)
Día 2 (L-I)
0,28±0
Día 3 (L-I)
Día 4 (L-II)
0,46±0
Día 5 (L-II)
Día 6 (L-III)
Día 10 (L-IV)
Día 15 (L-V)
Día 16 (L-V)
0,68±0,09
1,26±0,09
2,02±0,36
- 59 -
Capítulo I
3.2. Análisis de hidrocarburos cuticulares
La composición cualitativa de los diferentes hidrocarburos cuticulares, así
como los distintos cromatogramas de las larvas de H. illucens analizadas durante
los 16 días de experimento, se muestran en la figura 13. Se observa que a medida
que aumenta la edad de las larvas aumenta la abundancia de los diferentes
compuestos hidrocarbonados (H=212,584; p≤0,001), siendo significativamente
mayor esta diversificación en las larvas de 7, 9 y 10 días. A los 8 minutos de
arrastre de los diferentes compuestos cuticulares aparece un pico de un
compuesto hidrocarbonado cuya abundancia aumenta progresivamente con la
edad de las larvas (H=35,87; p=0,002), siendo significativamente mayor su
abundancia en las larvas del día 16 (Figura 13) (Tabla 2). Este resultado permite
diferenciar las larvas de diferentes edades simplemente por la abundancia de este
compuesto (Tabla 2).
A medida que aumenta la edad de las larvas aumenta progresivamente la
abundancia de ciertos compuestos hidrocarbonados, destacándose algunos de
ellos que pueden utilizarse para diferenciar los distintos estadios larvales (Tabla
3).
- 60 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
Tabla 2. Abundancia media de compuestos hidrocarbonados y de los picos más destacados de
hidrocarburos (3, 8, 9-10 y 11 minutos de retención) en larvas de H. illucens de 1 a 16 días de
edad (*p≤0,05).
Abundancia Media
Edad Larva (días)
del total de
Tiempo de Retención (min)
Abundancia ± DS
hidrocarburos
1
2
3
4
5
6
7
8
110.899
3,22
105.561±5.290
8,22
190.900±992
---
111.503
113.431
172.794
11,22
88.502±6.516
3,28
115.942±8.502
8,23
318.536±1.807
9,45
151.844±1.019
11,22
85.872±1.519
3,44
222.573±0
8,21
359.374±14.171
9,45
43.112±8.353
11,22
156.523±8.400
3,98
229.084±1.029
8,21
388.419±2.389
---
177.867
60.886±0
3,97
248.956±1.000
8,30
425.156±3.171
406.495
---
11,22
89.790±0
3,70
201.571±2.316
8,20
689.123±2.871
---
399.060
---
11,22
---
196.951
---
---
11,23
70.222±0
3,99
360.854±0
8,31
955.606±1.414
9,45
995.253±1.698
11,37
454.104±3.433
3,50
726.979±2.994
8,22
979.595±10.058
9,65
962.446±4.509
- 61 -
Capítulo I
Tabla 2. Continuación.
9
10
11
408.957
410.708
413.852
11,27
977.389±1.218
3,56
999.494±0
8,22
993.280±1.414
9,65
974.411±6.258
11,25
990.346±1.646
3,35
706.563±0
8,22
1.009.405±527
9,65
535.619±4.969
11,25
999.276±3.212*
3,24
504.596±0
8,22
1.114.527±625
9,01
428.864±3.091
---
12
13
14
15
16
- 62 -
414.625
474.526
425.019
432.843
446.063
---
3,99
722.295±3.109
8,25
1290980±12.832
---
---
---
---
3,94
1.265.511±1.395
8,21
1.410.987±931
---
---
---
---
3,99
1.496.386±0
8,23
1.445.654±4.306
9,99
448.064±2.343
---
---
---
---
8,23
1.574.845±1.352
9,76
192.962±1.177
11,25
610.974±0
3,93
1.890.929±0*
8,25
2.786.003±2970*
9,75
235.752±0
11,26
1.669.414±0*
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
3,0E+06
DÍA 2
DÍA 1
2,5E+06
2,0E+06
1,5E+06
1,0E+06
5,0E+05
0,0E+00
0
4
8
12
16
3,0E+06
20
24
0
4
8
12
16
24
DÍA 4
DÍA 3
2,5E+06
20
2,0E+06
1,5E+06
1,0E+06
ABUNDANCIA
5,0E+05
0,0E+00
0
4
8
12
16
3,0E+06
20
24
0
4
8
12
16
20
24
DÍA 6
DÍA 5
2,5E+06
2,0E+06
1,5E+06
1,0E+06
5,0E+05
0,0E+00
0
4
8
12
16
3,0E+06
20
24
0
4
8
12
16
DÍA 7
20
24
DÍA 8
2,5E+06
2,0E+06
1,5E+06
1,0E+06
5,0E+05
0,0E+00
0
4
8
12
16
20
24
0
4
8
12
16
20
24
TIEMPO DE ARRASTRE (MIN)
Figura 13. Cromatogramas (media) de los hidrocarburos cuticulares de larvas de Hermetia
illucens muestreadas del día 1 al día 8.
- 63 -
Capítulo I
3,0E+06
DÍA 9
2,5E+06
DÍA 10
2,0E+06
1,5E+06
1,0E+06
5,0E+05
0,0E+00
0
4
8
12
16
3,0E+06
20
24
0
4
8
12
16
DÍA 11
2,5E+06
20
24
DÍA 12
2,0E+06
1,5E+06
ABUNDANCIA
1,0E+06
5,0E+05
0,0E+00
0
4
8
12
16
3,0E+06
20
24
0
4
8
12
16
24
DÍA 14
DÍA 13
2,5E+06
20
2,0E+06
1,5E+06
1,0E+06
5,0E+05
0,0E+00
0
4
8
12
16
3,0E+06
20
24
0
4
8
12
16
24
DÍA 16
DÍA 15
2,5E+06
20
2,0E+06
1,5E+06
1,0E+06
5,0E+05
0,0E+00
0
4
8
12
16
20
24
0
4
8
12
16
20
24
TIEMPO DE ARRASTRE (MIN)
Figura 13 (continuación). Cromatogramas (media) de los hidrocarburos cuticulares de larvas
de Hermetia illucens muestreadas del día 9 al día 16.
- 64 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
4. Discusión
Hermetia illucens parece ser una especie euriterma, es decir que puede
tolerar temperaturas extremas, y puede vivir en diferentes tipos de medios. Como
se ha visto las larvas son polífagas y se han criado a partir de diversos productos
orgánicos, frutas y verduras en descomposición, cadáveres animales y humanos y
hasta en letrinas (Rozkošný, 1982). Todas estas características hacen que se
considere una especie de gran importancia económica que necesita de más
estudios biológicos y morfológicos, para su óptima utilización.
A pesar de que existen varias características que determinan la morfología
de la especie, solo el tamaño de la cápsula cefálica puede considerarse como
característica que contribuye a determinar los seis estadios larvales) (May, 1961;
Oliveira-Costa, 2003). En este trabajo se aportan dos nuevas estructuras,
espiráculos posteriores y el parche esternal, que permiten la datación de la larva
ya que aumentan el tamaño progresivamente con la edad; lo mismo sucede con el
número de aberturas espiraculares, aumentando conforme aumenta la edad de la
larva. Sin embargo no es fácil establecer una relación con los diferentes estadios
larvales. Los datos aquí presentados confirman que la cápsula cefálica permite
diferenciar estadios, pero también el tamaño de los espiráculos y sus aberturas
respiractorias. Así la L-I duró los 3 primeros días y presentó una cápsula cefálica
menor de 0,30. Los espiráculos posteriores fueron visibles pero no se pudieron
analizar. La L-II presentó 2 días de duración (día 4-5) y la cápsula fue menor de
0,68 y mayor de 0,40, siendo los espiráculos medibles con poco más de una
docena de aberturas y difícilmente distinguibles del estadio siguiente. La L-III se
dió entre el día 6 y 7. La cápsula cefálica midió sobre un 1 mm y las aberturas
espiraculares rondan un máximo de 30. El diámetro se incrementa bruscamente.
La L-IV, entre el día 8 y 13, se caracteriza por ser el periodo más largo, con una
longitud de la cápsula cefálica entorno al 1,5-2 mm y aberturas entre 50 y 60. El
- 65 -
Capítulo I
diámetro se duplica con respecto al estadio anterior. Finalmente la L-V (día 14 al
16) presenta una cápsula cefálica de 2 mm o más y el número de aberturas (7273) y longitud de los espiráculos (540 micras) se estabiliza.
Las larvas de H. illucens han sido estudiadas y/o descritas por otros
autores como Báez (1975), Rozkošný (1982), Shremmer (1986) y Wontae
(2010). Sin embargo es la primera vez que los espiráculos posteriores han sido
aislados, analizados y utilizados para determinar los estadios larvarios.
Estos resultados preliminares aportan información importante de cuales
son las estructuras en las que se necesita profundizar, ya que podrían facilitar la
datación de la larva y colaborar en los estudios de índole forense (determinación
del intervalo post mortem) o en estudios de cría masiva logrando una cría
sostenida y controlada.
En cuanto al análisis de los hidrocarburos cuticulares los resultados
determina que el perfil de hidrocarburos cuticulares de las larvas de H. illucens
siguen un patrón con respecto a la edad. Por un lado, hay un aumento de la media
de su abundancia total al aumentar la edad de las larvas, y por otro lado la
composición de picos correspondientes a compuestos de máxima abundancia
diaria, próximos al 3, 9 y 11 minutos de retención, y la abundancia propia del
pico a los 8 minutos, pueden ser utilizados como marcadores fiables de la edad
de las larvas. Sin embargo, los resultados no indican en muchos casos diferencias
significativas. Resultados similares se encontraron en larvas de otros dípteros
(Zhu et al., 2006), así como en algunos insectos sociales (Monnin & Peeters,
1999) donde los hidrocarburos cuticulares diferenciados por la edad podrían
actuar como marcador importante en la alimentación y en la distribución de
edades de la colonia (Wagner et al., 1998).
- 66 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
Hermetia illucens suele intervenir como necrófago secundario en estudios
de entomología forense, pudiendo aportar información importante en el cálculo
del intervalo postmortem (Catts & Haskell, 1990; Lord et al., 1994; Pujol et al.,
2008). Esta estimación depende de la tasa de desarrollo de cada especie, que a su
vez depende de la temperatura y humedad del entorno. Para determinar la edad
de las larvas se utiliza con frecuencia la longitud de las mismas; sin embargo, la
longitud no es un criterio útil en la fase de post-alimentación larvaria pudiendo
representar una fuente de distorsión entre el crecimiento experimentado durante
los primeros estadios larvales y el último o prepupa (Greenberg, 1991). Por ello,
el análisis de hidrocarburos cuticulares puede ser un método útil para determinar
la edad de las larvas de H. illucens, debido a los cambios en las proporciones de
los picos de abundancia de los diferentes compuestos (Zhu et al., 2006). Este
hecho puede ser utilizado también como medida de control de calidad de un
sistema de producción masiva de insectos, especialmente en el caso de H.
illucens ya que puede permanecer durante largos periodos de tiempo sin recibir
alimento, de ahí una de sus denominaciones comerciales más comunes “gusano
Phoenix”.
Como conclusión, los resultados de este estudio demuestran que el tamaño
de la cápsula cefálica, el tamaño de los espiráculos posteriores, el número de
aberturas espiraculares y la composición de hidrocarburos cuticulares en larvas
de H. illucens cambia gradualmente con la edad. Sin olvidar que otros factores
distintos a la edad pueden influir en estas características, poseen un gran
potencial para su empleo en la datación de la edad de las larvas, aunque son
necesarios estudios complementarios sobre su variabilidad en función de la
temperatura o tipo de alimentación.
- 67 -
Capítulo I
Este estudio preliminar dará paso a futuros trabajos, entre ellos, aquellos
estudios que determinen cuales son los componentes específicos de los picos 3,
8, 9 y 11 y su variación no sólo a lo largo de la vida larvaria sino también de la
pupa y el adulto, o también su variación en función de diferentes variables.
- 68 -
5. BIBLIOGRAFÍA
AMENDT, J.; KRETTEK, R. & ZEHNER, R. 2004. Forensic entomology.
Naturwissenschaften. 91:51–65.
BAEZ, M. 1975. Presencia de Hermetia illucens (L.) en las Islas Canarias
(Diptera, Strutiomyidae). Vieraea. 4:173-179.
BLOMQUIST, G. J.; NELSON, D. R. & DE RENOABLES, M. 1987.
Chemistry, biochemistry and physiology of insect cuticular lipids.
Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 6:227–265.
BLOMQUIST, G. J.; TILLMAN-WALL, J. A.; GUO, L.; QUILICI, D. R.; GU,
P. & SCHAL, C. 1993. Hydrocarbons and hydrocarbon derived sex
pheromones in insects: biochemistry and endocrine regulation. In D. W.
Stanley-Samuelson and D. R. Nelson [eds.], Insect lipids: chemistry,
biochemistry and biology. University of Nebraska Press, Lincoln. pp. 318351.
BRENNER, R. J.; CARLSON, D. A.; ROTH, L. M. & PATTERSON, R. S.
1993. Morphological and chemotaxonomic identification of Blattella
cockroaches (Blattaria: Blattellidae) from Taiwan and selected South
Pacific basin locations. Invertebr. Taxon. 7:1205-1219.
BROWN, W. V.; MORTON, R.; LACEY, M. J.; SPRADBERY, J. P. &
MAHON, R. J. 1998. Identification of the geographical source of adults of
the Old World screw-worm fly, Chrysomya bezziana villeneuve (Diptera:
Calliphoridae) by multivariate analysis of cuticular hydrocarbons.
Comparative Biochemistry and Physiology B Comparative Biochemistry.
119:391–399.
Capítulo I
BYRNE, A. L. 1995. Forensic implications of biochemical differences among
geographic populations of the black blow fly, Phormia regina (Meigen). J.
Foren. Sci. 40:372–377.
CATTS, E. P. & HASKELL, N. H., editors. 1990. Entomology and death: a
procedural guide. Clemsom, SC: Joyce’s Print Shop.
CRIPPS, C.; BLOMQUIST, G. J. & DE RENOBALES, M. 1988. Changes in
lipid biosynthesis during development of the house cricket, Acheta
domesticus (Orthoptera: Gryllidae). Bull. Entomol. Soc. Am. 34:127-131.
DE RENOBALES, M.; NELSON, D. R.; MACKAY, M. E.; ZAMBONI, A. C.
& BLOMQUIST, G. J. 1988. Dynamics of hydrocarbon biosynthesis and
transport to the cuticle during pupal and early adult development in the
cabbage looper Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae). Insect Biochem.
18:607-613.
DWYER, L. A.; ZAMBONI, A. C. & BLOMQUIST, G. J. 1986. Hydrocarbon
accumulation and lipid biosynthesis during larval development in the
cabbage looper, Trichoplusia ni. Insect Biochem. 16:463–69.
ESPELIE, K. E. & PAYNE, J. A. 1991. Characterization of the cuticular lipids of
the larvae and adults of the pecan weevil, Curculio caryae. Biochemical
Systematics and Ecology. 19:127–132.
GOFF, M. L. & FLYNN, M. M. 1991. Determination of postmortem interval by
arthropod succession: A case study from the Hawaiian Islands. J. Forensic
Sci. 36:607–614.
GOODRICH, B. S. 1970. Cuticular lipids of adults and puparia of the Australian
sheep blowfly Lucilia cuprina. Journal of Lipids Research. 11:1–6.
- 70 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
GREENBERG, B. 1991. Flies as forensic indicators. Journal of Medical
Entomology. 28:56 –577.
GU, X.; QUILICI, D.; JUAREZ, P.; BLOMQUIST, G. J. & SCHAL, C. 1995.
Biosynthesis of hydrocarbons and contact sex pheromone and their
transport by lipophorin in females of the German cockroach (Blattella
germanica). J. Insect Physiol. 41:257-267.
GUO, L. & BLOMQUIST, G. J. 1991. Identification, accumulation and
biosynthesis of the cuticular hydrocarbons of the southern armyworm
Spodoptera eridania (Lepidoptera: Noctuidae). Arch. Insect Biochem.
Physiol. 16:19–30.
HACKMAN, R. H. 1984. Cuticle: Biochemistry. In J. Bereiter-Hahn, A. G.
Matoltsy, and K. S. Richards (eds.), Biology of the integument, Vol. 1, pp.
583-610. Spring-Verlag, Berlin.
HADLEY, N. F. 1981. Cuticular lipids of terrestrial plants and arthropods: a
comparison of their structure, composition, and waterproofing function.
Biol. Rev. 56:23-47.
HEBANOWSKA, E.; MALINSKI, E. & LATOWSKA, A. 1990. A comparison
of cuticular hydrocarbons of larvae and beetles of the Tribolium
destructor. Comparative Biochemistry and Physiology B Comparative
Biochemistry. 96:815–820.
HOWARD, R. W. 1993. Cuticular hydrocarbons and chemical communication.
In D. W. Stanley-Samuelson and D. R. Nelson [eds.], Insect lipids:
chemistry, biochemistry and biology. University of Nebraska Press,
Lincoln. 179-226.
- 71 -
Capítulo I
HOWARD, R. W.; HOWARD, C. D. & COLQUHOUN, S. 1995. Ontogenetic
and environmentally induced changes in cuticular hydrocarbons of
Oryzaephilus surinamensis (Coleoptera). Annals of the Entomological
Society of America. 88:485–495.
JALLON, J. M. & DAVID, J. R. 1987. Variations in cuticular hydrocarbons
among the eight species of the Drosophilia melanogaster subgroup.
Evolution. 41:294-302.
LINDNER, E. 1936. Dieamerikanische Hermetia illucens L. im Mittelmeergebiet
(Stratiomyidae, Dipt.). Zool. Anz. 113:335–336.
LINNAEUS, C. 1758. Systema naturae per regnatri a naturae. Ed. 10. 1:1-824.
Holmiae (=Stockholm).
LOCKEY, K. H. 1988. Lipids of the insect cuticle: origin, composition and
function. Comparative Biochemistry and Physiology B Comparative
Biochemistry. 89:595–645.
LOCKEY, K. H. 1991. Insect hydrocarbon classes: implications for
chemotaxonomy. Insect Biochem. 21:91-97.
LORD, W. D.; GOFF, M. L.; ADKINS, T. R. & HASKELL, N. H. 1994. The
black soldier fly Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) as a potential
measure of human postmortem interval: observations and case histories. J.
Forensic Sci. 39(1):215-22.
MARTÍNEZ-SÁNCHEZ, A.; MAGAÑA, C.; SALOÑA, M. & ROJO S. 2011.
First record of Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) on human
corpses in Iberian Peninsula. Forensic Sci Int. 20:206: 76-80.
- 72 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
MAY, B. M. 1961. The occurrence in New Zealand and the life-history of the
soldier fly Hermetia illucens (L.) (Diptera: Stratiomyidae). New Zealand
J. Sci. 4: 55-65.
MCFADDEN, M. W. 1967. Soldier fly larvae in America North of Mexico.
Proceedings of the United States National Museum. 121(3569):1-72.
MONNIN, T. & PEETERS, C. 1999. Dominance hierarchy and reproductive
conflicts among subordinates in a monogynous queenless ant. Behav.
Ecol. 10:323–332.
MÜLLER, G. W. 1925. Kalk in der Haut der Insekten und die Larve von Sargus
cuprarius L. Z. Morph. Ök. d. Tiere. 3:542-566.
NELSON, D. R. & BLOMQUIST, G. J. 1995. Insect waxes in R. J. Hamilton
(ed.). Waxes: Chemistry, Molecular Biology and Functions. The Oily
Press, Dundee, Scotland. pp. 1-90.
OLIVEIRA-COSTA, J. 2003. Entomologia Forense – Quando os Insetos são
Vestígios. São Paulo, Millennium, 180 p.
PERIS, S. V. 1962. Hermetia illucens (L) por primera vez en España (Diptera,
Stratiomyidae). P. Inst. Biol. Apl. 33:51-56.
PUJOL-LUZ, J. R. & GALINKIN, J. 2004. Um novo gênero de Pachygastrinae
(Diptera: Stratiomyidae) do Brasil. Neotrop. Entomol. 33:35-38.
PUJOL-LUZ, J. R.; FRANCEZ, P. A. C.; URURAHY-RODRIGUES, A. &
CONSTANTINO, R. 2008. The black soldier-fly, Hermetia illucens
(Díptera, Stratiomyidae), used to estimate the postmortem interval in a
case in Amapá state, Brazil. Journal of Forensic Science. 53:476–478.
- 73 -
Capítulo I
ROZKOSNY, R. 1982. A biosystematic study of the European Stratiomyidae
(Diptera). Vol. 1. The Hague, Boston, London: Dr. W. Junk. ed. I-VIII, 1401.
ROZKOSNY, R. & KNUTSON, L. 2007. Fauna Europaea: Stratiomyidae, in: T.
Pape (Ed.), Fauna Europaea: Diptera Brachycera, Fauna Europea Versión
1.3, http:// www.faunaeur.org.
SCHAL, C.; GU, X.; BURNS, E. L. & BLOMQUIST, G. J. 1994. Patterns of
biosynthesis and accumulation of hydrocarbons and contact sex
pheromone in the female German cockroach, Blattella germanica. Arch.
Insect Biochem. Physiol. 23:375-391.
SCHREMMER, V. F. 1986. The polymetabol development of the soldier fly
larva Hermetia illucens. A contribution to the Metamorphosis of the
Stratiomyidae. Ann. Naturhist. Mus. Wien. 88/89:405-429.
USTUNER, T.; HASBENLI, A. & ROZKONY, R. 2003. The first record of
Hermetia illucens (Linnaeus, 1758) (Diptera Stratiomyidae) from the Near
East. Stud. Dipter. 10:181–185.
WAGNER, D.; BROWN, M. J. F.; BROUN, P.; CUEVAS, W.; MOSES, L. E.;
CHAO, D. L. & GORDON, D. M. 1998. Task-related differences in the
cuticular hydrocarbon composition of harvester ants, Pogonomyrmex
barbatus. J. Chem. Ecol. 24:2021–37.
WONTAE,
K.;
SUNGWOO,
B.;
HAECHEOL,
P.;
KWANHO,
P.;
SANGBEOM, L.; YOUNGCHEOL, C.; SANGMI, H. & YOUNG-HO, K.
2010. The Larval Age and Mouth Morphology of the Black Soldier Fly,
- 74 -
Caracterización larvaria de Hermetia illucens
Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae). Int. J. Indust. Entomol.
21:185-187.
WOODLEY, N. E. 2001. A world catalogue of the Stratiomyidae (Insecta:
Diptera). Myia 11: VII-473p.
WOODLEY, N. E. 2009. Stratiomyidae (Soldier Fly). 521-549p. In: BROWN,
B. V.; A. BORKENT, A.; CUMMING, J. M.; WOOD, D. M;
WOODLEY, N. E; ZUMBADO, M. A. (Eds). Manual of Central
American Diptera. Ottawa, Canada. Vol. 1. Ed. NRC-CARC: XI-714p.
ZHU, G. H.; YE, G. Y.; HU, C.; XU, X. H. & LI, K. 2006. Development changes
of cuticular hydrocarbons in Chrysomya rufifacies larvae: potential for
determining larval age. Medical and Veterinary Entomology. 20:438–444.
- 75 -
Capítulo I
- 76 -
Capítulo II
Growing curves of Hermetia illucens
Growing curves of the Black Soldier Fly, Hermetia
illucens (Diptera: Stratiomyidae) in two different
larvae media.
Abstract
Recently Hermetia illucens (Linnaeus, 1758) (Diptera: Stratiomyidae) has
been found in human corpses in Europe then, this species need to be considered
as a forensic indicator to estimate the post-mortem interval (PMI). The species
also shown a high potential related with its mass-production related with its use
as animal feed. Study of growing-degree days is a key factor on applied research
in entomology.
Life cycle of this species has been studied at three constant temperatures:
25 ºC, 30 ºC and 35 ºC. Larvae were measured and weighed, and individualized
pupae were weighed until adult emergence. The variation in development time
and size of larva and pupa were recorded in two different diets: mixed meat (pig)
and hen feed. We also calculated the minimum development time, the degreedays accumulated and isomorphic diagrams.
Gobbi, P.; Martínez-Sánchez, A. & Rojo, S. 2012 (November). Growing curves of the Black Soldier
Fly, Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) in two different larvae media. Journal of Forensic
Science International. Submitted.
- 79 -
Capítulo II
1. Introduction
The Black Soldier Fly (BSF), Hermetia illucens (Linnaeus, 1758)
(Diptera: Stratiomyidae) is originally a New World species, but human activity
established this species in all regions (Ustuner et al., 2003; Martínez-Sánchez et
al., 2011). The BSF is a generalist detritivore species, which colonizes a wide
variety of decomposing plant and animal matter (Sheppard et al., 2002; Puyol et
al., 2008). Similar to other stratiomyids of the subfamilies Hermetiinae and
Sarginae, H. illucens can be classified as opportunistic or secondary
necrophagous and may be important for forensic entomology, especially in
estimation of the postmortem interval (PMI) (Catts & Haskell, 1990; Lord et al.,
1994; Puyol et al., 2008).
To estimate the period of time since death (PMI) two methods can be
used: calculation based on development of individual species and use of
succession studies (Centeno, 2002). In the succession of insects, BSF is
considered a late colonizer (Dunn, 1916; Lord et al., 1994, Tomberlin et al.,
2005). Both methods can be applied separately or together depending on the
analysis performed. The first method is used during the early stages of
decomposition, which involves a few species of insects, particularly flies. The
estimates are based in the degree of species development involved and their
comparison with curves growth obtained in similar climatic and geographical
conditions. The second method is used in advanced stages of decomposition, is
based on the comparison of fauna found in the body with typical faunal
succession patterns habitat where the body was found. In order to this, the
identification of species, the knowledge of their life cycles, the duration of each
stage depending and other factors abiotic data are needed to determine the PMI
(Centeno, 2002).
- 80 -
Growing curves of Hermetia illucens
For calculating PMI is important to know how environmental factors
influence the development of insects. Within many extrinsic factors that
influence in the development of the insects are the environmental conditions such
as temperature, humidity and food. The different larval instars have different
temperature optima and limits (Howe, 1967). Most techniques for predicting an
age on insects, is based on the relationship between development rate and
temperature. One method used is the calculation of ADH (accumulated degreehours) or ADD (accumulated degree days), defined as the amount of heat
required by an organism to complete the various stages of development in its life
cycle (Greenberg, 1991; Goff, 1993). Therefore, knowing insects development
thresholds and data daily temperatures registered, can be calculate the minimum
time from ovo/larviposicion of the insect.
Although Hermetia illucens biology has been studied by several authors
(Dunn, 1916; Booth & Sheppard, 1984, Sheppard et al., 2002; May, 1961; Tingle
et al., 1975; Tomberlin et al., 2005) some aspects of their development, as study
of growing-degree days are unknown. For this reason, the main objective is study
will be the development of growing curves of BSF at different temperatures and
with different larval diets. These data will be useful for both forensic and other
applied research on this species.
2. Methodology
The BSF specimens used in this experiment were originated from pupae
commercially available (Insect Science Resource Company, Georgia, USA). The
adults were placed in colony cages of 3 m³ and kept in a glass greenhouse
module under controlled conditions (25±5 °C, 50±10 % RH and natural light).
Adults were fed sugar and water. Approximately 7 days after emergence, a
mixture of water and hen feed (500 gr diluted in 800 ml of water) was offered for
- 81 -
Capítulo II
oviposition. The medium with eggs was transferred to a climatic chamber (25 °C,
60 % RH, 12:12) to optimize hatching. Later, hen feed medium was supplied ad
libitum as larvae media. When larvae reach prepupal stage, they left the rearing
medium to pupate in a sand tray placed at the bottom of the container. The pupae
were filtered and transferred to the adult cages again.
Eggs in oviposition medium (±12 h) were introduced into a climatic
chamber at different temperatures (25-30-35 ºC and 60 % RH) to be studied full
development of BSF. Eggs were observed every 12 hours until hatching, which
has considered the day of the first larva. Since pig liver produced high mortality
in the initial probes, 600 larvae (±12 h) were selected and arranged in two
different diets in small pots, an optimal diet of hen feed (500 gr diluted in 800 ml
of water) and a similar carrion diet composted by a mixed of swine meat (200 gr
swine liver+200 gr bacon+200 gr swine pig lean meat). Subsequently, every diet
pot was introduced into other, with sand on the background to pupa. For each
temperature and diet 5 replicates were performed.
Each day, 10 larvae were collected from each replicate in each diet until
the first 10 pupae were observed. The larvae were weight in a precision balance
(±0.0001 gr) and then boiled for 5 minutes; subsequently, its length was
measured with a calliper digital (±0.01 mm) and preserved in alcohol 70 %.
Then, the first 10 pupae from each replicate were individualized, leaving at the
same temperature of the experiment and weighing daily until adults emerged,
when they were sexed. To calculate accumulated degree days (ADD) the
following formulates was using: ADD=y (t-t0) being y development time in days,
t breeding temperature (ºC) and t0 the minimum threshold of development of the
species, which had to be calculated by the representation of the breeding
temperature (X axis) versus 1/development time (Y axis). Finally, a diagram
isomorphic was developed to results in swine meat of H. illucens, since this
- 82 -
Growing curves of Hermetia illucens
figure is a representation to apply in forensic entomology, mainly. In the diagram
from oviposition, larval and pupal time in each temperature was represented.
To determine the duration of the life cycle was used the minimum
duration of larvae, when the first larvae of each replicate pupated. The duration
of the pupal period was calculated from the first 10 pupae observed per replicate.
To construct the growth curves was plotted on a graph the average maximum
length and weight of 10 larvae daily measurements for each temperature.
For all statistical analyses, when data did not meet the assumption of
normality non-parametric test Kruskal-Wallis (H) and Mann-Whitney (U),
followed by Tukey test for post hoc multiple comparisons were performed. Data
were considered significant when p value was ≤ 0.05. All analysis performed
using the SigmaStat 3.5 program.
3. Results
When both diets were compared, H. illucens had higher development rate
in hen feed than in swine meat (U=50; p=0.001) (Table 1). The total life cycle of
BSF decreased when the temperature increases in hen feed (H=12.5; p=0.002)
and in swine meat (H=12.52; p=0.002). Moreover, statistically significant
differences were found in the duration of larval at different temperatures, in both
diets, and in the pupal stage in swine meat (Larva: hen feed H=12.57, swine meat
H=12.52; p=0.002; Pupa: hen feed H=5.58; p=0.061, swine meat H=8.70;
p=0.013). So, the larva and pupa stages were shorter when temperature increased,
except in pupae reared at 35 °C where increased (Table 1). However significant
differences only were observed between 25 ºC and the rest of temperatures,
therefore the results indicate that larval stage is shorter at temperatures higher
than 25 ºC.
- 83 -
Capítulo II
Table 1. Minimum period (mean±SD) of the egg, larval and pupal stage and complete period
(mean ± SD) of Hermetia illucens at constant temperatures and different diets (* indicate
significant differences at p <0.05 in each diet).
Diet
Hen Feed
Swine
Meat
Tª
(ºC)
Egg Stage
(days)
Larval Stage
(days)
Pupal Stage
(days)
Life Cycle
(days)
25
3±0
34.56±0.51*
6.79±0.22
44.36±0.42*
30
3±0
31.2±0.34
6.19±0.34
40.39±0.16
35
2±0
20.12±0.39
8.42±1.66
30.54±1.70
25
3±0
46.22±0.23*
7.84±0.25*
57.06±0.18*
30
3±0
37.44±0.50
7.29±0.74
47.73±0.62
35
2±0
26.3±0.55
8.36±0.27
36.66±0.58
In order to application in Forensic Entomology, ADD and isomorphic
diagram were realized. To calculate ADD (Table 2), the minimum threshold of
development (t0) in BSF had to be calculated in hen feed and swine meat (Figure
1); in both equations of regression when y was zero, x was 3.9 and 7.3
respectively. The ADDs were higher in larvae stage, then in prepupa, pupae and
finally in egg stage (Table 2). Results indicated higher value at 30 ºC and the
lowest 25 ºC, in both diets. However differences in ADDs from stages in base to
temperature were observed (Table 2). In both diets, egg and larva stage need
more ADD than prepupa or pupa at 30ºC, and prepupa and pupa stages need
more ADD at 35 ºC. The isomorphic diagram (Figure 2), allows calculate age of
the eggs, larvae, prepupa and pupae of BSF at different temperatures between 25
to 35 ºC, by extrapolation.
- 84 -
Growing curves of Hermetia illucens
hen feed
swine meat
Development index (1/days)
0.045
0.040
y = 0.001x - 0.0039
R² = 0.9034
0.035
0.030
0.025
0.020
y = 0.001x - 0.0073
R² = 0.9713
0.015
0.010
0.005
0.000
0
10
20
30
Temperature (ºC)
40
50
Figure 1. Relationship between the development index and development temperature of
Hermetia illucens in hen feed and swine meat.
Table 2. Accumulated Degree Days (ADD) in every stage and prepupa install. calculated from
average data of development in different conditions (diets and temperature) and minimum
thresholds (3.9 from hen feed and 7.3 from swine meat).
Diet
Hen Feed
Swine
ADD
ADD
ADD
ADD
ADD
egg
larve
prepupa
pupa
Life cycle
25
63.3
464.2
265.02
143.48
935.95
30
78.3
522
292.32
161.56
1054.33
35
62.2
311
314.73
261.86
949.79
25
53.1
566.4
251.69
138.77
1009.96
30
68.1
590.2
259.68
165.48
1083.47
35
55.4
443.2
285.31
231.57
1015.48
T (ºC)
Meat
- 85 -
Capítulo II
35
Hen Feed
34
Swine meat
Temperature (ºC)
33
32
31
A
30
A
29
28
27
L
E
E
26
L
Pr
P
P
Pr
25
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Time from oviposition (days)
45
50
55
60
Figure 2. Isomorphic diagram of Hermetia illucens showing the different morphological stages:
eggs (E), larval (L), prepupal (Pr), pupal (P) and adult (A), at 25, 30 and 35 º C in swine meat
(black) and hen feed (red).
The length and weight of larvae every day was reporting. The last days in
the life of the larvae (from the 11th day or more, depend of temperature and
diets), the prepupa install begins and the length remains constant (Figure 3) and
decrease the weight seemed more or less pronounced depending on temperature
and diet (Figure 4). Both variables increase when temperature increase in the two
diets (Figures 3 to 6), at least in the first 15-20 days. With the increasing of the
length, weight increases too (Figure 5) in both diets, observed a positive
relationship between the two variables, exponential o polynomial in hen feed and
swine meat respectively.
- 86 -
Growing curves of Hermetia illucens
35
25 ºC
A
30 ºC
30
Larval length (mm)
35 ºC
25
20
15
10
5
0
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
31
33
Larval development time (days)
35
25 ºC
B
30 ºC
30
Larval length (mm)
35 ºC
25
20
15
10
5
0
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Larval development time (days)
Figure 3. Larval length curve of H. illucens to 25 ºC, 30 ºC and 35 ºC in hen feed (A) and swine
meat (B).
- 87 -
Capítulo II
0.5
25 ºC
A
30 ºC
Larval weight (g)
0.4
35 ºC
0.3
0.2
0.1
0
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
31
33
Larval development time (days)
0.5
25 ºC
30 ºC
35 ºC
Larval weight (g)
0.4
B
0.3
0.2
0.1
0
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Larval development time (days)
Figure 4. Larval weight curve of H. illucens to 25 ºC, 30 ºC and 35 ºC in hen feed (A) and
swine meat (B).
- 88 -
Growing curves of Hermetia illucens
0.4
0.35
B
y = 0.0002e0.2909x
R² = 0.8889
0.35
0.0001e0.2897x
y=
R² = 0.8969
0.3
0.3
0.25
0.25
Weigth (g)
Weigth (g)
0.4
A
0.2
0.2
0.15
0.15
0.1
0.1
0.05
0.05
0
0
0
10
20
Length (mm)
0
30
10
20
Length (mm)
30
Figure 5. Relationship between the weigth and the length of larvae of Hermetia illucens in hen
feed (A) and swine meat (B).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
25 ºC
30 ºC
Hen feed
35 ºC
25 ºC
30 ºC
35 ºC
Swine meat
Figure 6. Mortality percent (mean±SD) at constant temperatures (* indicate differences in
treatments with p<0.05).
- 89 -
Capítulo II
When adults emerged, mortality rate was obtained in both diets, being
greater in swine diet, however these differences were not significant (p=0.4)
(Figure 6).
In both diets, hen feed (H=12.33; p=0.002) and swine meat
(H=10.33; p=0.006), mortality increased when temperature did, being significant
at 35 °C (p<0.05). There were no differences in the weight of females or males
pupae in both diets (Table 3). When comparing, significant differences were
found in the weight of pupae reared in hen feed and swine meat at different
temperatures (H=53.54; p˂0.001), being lighter when larvae are rearing in swine
meat. In pupae developed in the hen feed there was a reduction of the weight of
pupae when temperature decreased (H=33.92; p˂0.001) being the lightest pupae
reared at 25 ºC (Figure 7). However in swine meat the differences between
weights were not significant at three temperatures. In both diets was observed a
decreasing in the weight with the development of pupa (Figure 7).
Table 3. Weigth (gr) of female and male pupae (mean±SD) of Hermetia illucens at the different
temperatures in hen feed and swine meat.
Hen Feed
Temperature
(ºC)
- 90 -
Female
Swine Meat
Male
Female
Male
25
0.12±0.01
N=17
0.12±0.01
N=31
0.12±0.02
N=17
0.11±0.02
N=23
30
0.18±0.02
N=13
0.17±0.02
N=21
0.10±0.01
N=8
0.11±0.03
N=16
35
0.16±0.02
N=9
0.15±0.02
N=16
0.11±0.03
N=9
0.12±0.03
N=12
Growing curves of Hermetia illucens
0.18
0.16
A
Pupal wegith (g)
0.14
0.12
0.1
0.08
25 ºC
30ºC
35ºC
0.06
0.04
0.02
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Larval development time (days)
0.18
0.16
B
Pupal wegith (g)
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
25ºC
30ºC
35ºC
0.04
0.02
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Larval development time (days)
9
10
11
12
Figure 7. Pupal weigth curve of H. illucens to 25 ºC, 30 ºC and 35 ºC in hen feed (A) and swine
meat (B).
- 91 -
Capítulo II
4. Discussion
In the calculation of age or development time in BSF, an important factor
is the ambient temperature in the different stages. The BSF is very sensitive to
changes in temperature. The rate of development, as other ectothermic insects, is
directly related to temperature. As temperature increases, the rate of development
increases and durations of the individual stages in the life cycle of become
shorter. Tomberlin et al. (2009) reported a strong influence of environmental
temperature on the development of BSF immature stages reared under laboratory
conditions.
The results indicate life cycle of Hermetia illucens decreases with
increasing temperature. This occurs mainly by decreasing in the development of
larvae. However, pupae reared at 35ºC needed more time to complete develop.
Other authors have studied the life cycle of BSF at constant temperature but in
particular conditions. So May (1961) concluded that the life cycle is completed in
50 days at 27.8 ºC (average), similar to our result in swine meat. However pupal
period spent 9.10 days and 31 larval periods. The differences with our results
could be in the inclusion of prepupa install time in pupal period. Tomberlin et al
(2005) obtained similar results in pig liver, where Hermetia larvae reared at 27
°C needed over 40 days to complete its cycle. Goff & Lord (1994) observed in a
forensic case that H. illucens takes approximately 50 days in complete the life
cycle at 27.8 ºC. Other references, as Tingle (1975) or Booth & Shepard (1984),
provide less information about the time of stages and differ from results present
here.
In general the length and weight of larvae breeding at 25ºC show a slower
growth than higher temperatures. A relation between weight and length of larvae
was observed, as other authors have found in other Diptera (Boatright &
Tomberlin, 2010; Clark et. al., 2006). In prepupa install the larvae leave the
- 92 -
Growing curves of Hermetia illucens
trophic medium and migrate to find a quite place to pupa. In this phase, the size
of individuals usually decreased (Boatright & Tomberlin, 2010), as confirmed
our results to BSF. In the case of pupa, the weight shows the same trend, being
the pupae lighter at 25ºC than at higher temperatures. However in swine meat
this behaviour changed and the lighter pupae were obtained at 30ºC.
The number of degree-days necessary to complete development can vary
with available resources (Trudgill et al., 2005). Insects developing on high
quality resources require fewer degree-days to develop than those on lower
quality resources (Amalraj et al., 2005; De Haas et al., 2006). In this study, H.
illucens need more ADDs to complete the life cycle in swine meat than hen feed.
This may be because less quantity of energy necessary for the formation of the
adult with is accumulated with swine meat. This happens with other Diptera,
such has be seen that the larvae of Calliphora vicina and Lucilia sericata
(Calliphoridae) grow significantly faster on lung or heart tissue than on pig
organs or than the cow organs (Kaneshrajah & Turner, 2004; Clark et al., 2006;
Tomberlin et al., 2009). Hermetia illucens uses a variety of decaying organic
matter in the development of their larvae, from dung and crop residues to animal
tissues (Newton et al., 2005a; Hem et al., 2008; Myers et al., 2008). It is seen
that the larvae of this species can be adapted to a variety of foods, however larval
growth depends on the quality of the diet as well as the temperature. Moreover,
the minimum thresholds calculated varied in base to the substrate used to feed to
larvae. In hen feed was 3.9 and in swine meat was 7.3, this last more similar to
the value of 10, used by other authors than have published ADDs for H. illucens
(see in Oliveira-Costa, 2011). Probably, this is the reason so the ADD of life
cycle obtained in this study would be higher than obtained by May (1961) or
Tingle (1975) (890 and 733.9 respectively).
- 93 -
Capítulo II
Regarding to the sex ratio, in the first 10 pupae analysed in each replicate,
over 50% of the emerged adults were males. These BSF females need more time
to feed and consequently weigh more than males, though our results show similar
weights in both sexes (perhaps number of sample was insufficient). The adults do
not feed, and they depend exclusively on the accumulated reserves during the
larval stage. For this reason is very important for females achieve a healthy
weight, because it will determine its reproductive fitness (Tomberlin et al.,
2009).
In terms of mortality, it increments when temperature does it. In both diets
was obtained highest mortality at 35 ºC, this is expected since increasing the
temperature increases the metabolism and growth by preventing the
accumulation of energy necessary for the formation and emergence adult
(Tomberlin et al., 2009). Also mortality was great in swine meat than hen feed.
We have seen that the hen feed is an ideal diet for growing H. illucens because
provides calcium necessary for larval development, larva ingests calcium and
convert it to calcium carbonate which is secreted through the hypodermis and
covers the larval integument (Johannsen, 1922). Also the calorie of pupae content
accumulated vital energy source for adults, this provided energy that result in
increased longevity of the adults (Tomberlin et al., 2002).
These results contribute to the use of the Black Soldier Fly as forensic
indicator and will allow estimate the PMI in numerous forensic cases (Lord et al.,
1994; Oliveira-Costa, 2003; Pujol-Luz et al., 2008; Martínez-Sánchez et al.,
2011), demonstrating the great otential of this species in the forensic studies,
especially for calculating intervals over 15 days when most of specimens of
Calliphoridae, Sarcophagidae or Muscidae fully developed, leaving the corpse
(Ferrari et al., 2009). For this reason an isomorphic diagram and ADD help to
resolve new forensic cases. However the substrate is a fundamental factor in this
- 94 -
Growing curves of Hermetia illucens
species, mainly to applying ADD. Therefore, it is necessary to more detailed
information about development rate to other diets and temperatures, and the
minimum threshold of development in H. illucens, which will provide key
background for future cases in forensic investigations and also applied studies of
mass-rearing and production of this species.
- 95 -
5. BIBLIOGRAPHY
AMALRAJ, D. D.; SIVAGNANAME, N. & DAS, P. K. 2005. Effect of food on
immature development, consumption rate, and relative growth rate of
Toxorhynchites splendens (Diptera: Culicidae), a predator of container
breeding mosquitoes. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 100:893-902.
BOATRIGHT, S. A. & TOMBERLIN, J. K. 2010. Effects of temperature and
tissue type on the development of Cochliomyia macellaria (Diptera:
Calliphoridae). J. Med. Entomol. 47:917–923.
BOOTH, D. C. & SHEPPARD, D. C. 1984. Oviposition of the black soldier fly,
Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae): eggs, masses, timing and site
characteristics. Environ. Entomol. 13:21-423.
CATTS, E. P. & HASKELL, N. H., editors. 1990. Entomology and death: a
procedural guide. Clemsom, SC: Joyce’s Print Shop.
CENTENO, N. 2002. La sinantropía de Calliphoridae (Insecta: Diptera) en
Hudson, Argentina. Resúmenes V Congreso Argentino de Entomología,
Buenos Aires, p. 433.
CLARK, K.; EVANS, L. & WALL, R. 2006. Growth rates of the blowßy,
Lucilia sericata, on different body tissue. Forensic Sci. Int. 156:145-149.
DE HAAS, E. M.; WAGNER, C.; KOELMANS, A. A.; KRAAK, M. H. S. &
ADMIRAAL, W. 2006. Habitat selection by chironomid larvae: fast
growth requires fast food. J. Anim. Ecol. 75:148-155.
Growing curves of Hermetia illucens
DUNN, L. H. 1916. Hermetia illucens breeding in a human cadaver. Entomol.
News. 27:59-61.
FERRARI, A. C.; SOARES, T. C. A.; AMORIM, S. D.; THYSSEN, J. P. &
GUIMARÃES, A. M. 2009. Comparação dos padrões de atratividade de
Hermetia illucens (Diptera, Stratiomyidae) associada a carcaças de Rattus
norvergicus enterradas e tratadas com hormônios esteróides. Revista
Brasileira de Entomologia. 53(4):565–569.
GOFF, M. L. 1993. Estimation of postmortem interval using arthropod
development and successional patterns. Forensic Sci. Review. 5(2):81-94.
GOFF, M. L. & LORD, W. D. 1994. Entomotoxicology: A new area for forensic
investigation. Am. J. Forensic Med. Pathol. 15:51–57.
GREENBERG, B. 1991. Flies as forensic indicators. Journal of Medical
Entomology. 28:56 –577.
HEM, S.; TOURE, S.; SAGBLA, C. & LEGENDRE, M. 2008. Bioconversion of
palm kernel meal for aquaculture: Experiences from the forest region
(Republic of Guinea). African Journal of Biotechnology. 7(8):1192-1198.
HOWE, R. W. 1967. Temperature effects on embryonic development in insects.
Rev. Entomol. 12:15-42.
JOHANNSEN, O. A. 1922. Stratiomyiid Larvæ and Puparia of the North Eastern
States. Journal of the New York Entomological Society. 30(4):141-153.
KANESHRAJAH, G. & TURNER, B. 2004. Calliphora vicina larvae grow at
different rates on different body tissues. Int. J. Legal Med. 118:242-244.
LINNAEUS, C. 1758. Systema naturae per regnatri a naturae. Ed. 10. 1:1-824.
Holmiae (=Stockholm).
- 97 -
Capítulo II
LORD, W. D.; GOFF, M. L.; ADKINS, T. R. & HASKELL, N. H. 1994. The
black soldier fly Hermetia illucens (Diptera, Stratiomyidae) as a potential
measure of human postmortem interval: observations and case histories. J.
Forensic. Sci. 39:215–22.
MARTÍNEZ-SÁNCHEZ, A.; MAGAÑA, C.; SALOÑA, M. & ROJO, S. 2011.
First record of Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) on human
corpses in Iberian Peninsula. Forensic Science International. 206:76-78.
MAY, B. M. 1961. The occurrence in New Zealand and the life-history of the
soldier fly Hermetia illucens (L.). New Zealand Journal Sci. 4:55–65.
MYERS, H.; TOMBERLIN, J.; LAMBERT, B. & KATTES, D. 2008.
Development of Black Soldier Fly (Diptera: Stratiomyidae) Larvae Fed
Dairy Manure. Environ. Entomol. 37(1):11-15.
NEWTON, G. L.; SHEPPARD, D.C.; WATSON, D.W.; BURTLE, G. & DOVE,
R. (a) 2005. Using the black soldier fly, Hermetia illucens, as a valueadded tool for the management of swine manure. Animal and poultry
waste management center, North Carolina State University, Raleigh, NC.
17p.
OLIVEIRA-COSTA, J. 2003. Entomologia Forense – Quando os Insetos são
Vestígios. São Paulo, Millennium, 180 p.
OLIVEIRA-COSTA, J. 2011. Entomologia Forense – Quando os Insetos são
Vestígios. São Paulo, Millennium, 3ª edicao. 502 p
- 98 -
Growing curves of Hermetia illucens
PUJOL-LUZ, J. R.; FRANCEZ, P. A. C.; URURAHY-RODRIGUES, A. &
CONSTANTINO, R. 2008. The black soldier-fly, Hermetia illucens
(Diptera, Stratiomyidae), used to estimate the postmortem interval in a
case in Amapá state, Brazil. Journal of Forensic Science. 53:476–478.
SHEPPARD, D. C.; TOMBERLIN, J. K.; JOYCE, J. A.; KISER, B. C. &
SUMNER, S. M. 2002. Rearing methods for the black soldier fly (Diptera:
Stratiomyidae). J. Med. Entomol. 39:695–8.
TINGLE, F. C.; MITCHELL, E. R. & COPELAND, W.W. 1975. The soldier fly,
Hermetia illucens, in poultry houses in North Central Florida. J. Ga.
Entomol. Soc. 10:179-183.
TOMBERLIN, J. K. & D. C. SHEPPARD, D. C. 2001. Lekking behavior of the
black soldier fly (Diptera: Stratiomyidae). Florida Entomologist. 84:729–
730.
TOMBERLIN, J. K.; SHEPPARD, D. C. & JOYCE, J. A. 2002. Selected lifehistory traits of black soldier flies (Diptera: Stratiomyidae) reared on three
artificial diets. Ann Entomol. Soc. Am. 95:379–86.
TOMBERLIN, J. K.; SHEPPARD, D.C. & JOYCE, J. A. 2005. Black soldier
flies (Diptera: Stratiomyidae) colonization of pig carrion in south Georgia.
J. Forensic Sci. 50:152–3.
TOMBERLIN, J. K.; ADLER, H. P. & MYERS, M. H. 2009. Development of
the Black Soldier Fly (Diptera: Stratiomyidae) in Relation to Temperature.
Environ. Entomol. 38(3):930-934.
TRUDGILL, D. L.; HONEK, A.; LI, D. & VAN STRAALEN, N. M. 2005.
Thermal time-concepts and utility. Ann. Appl. Biol. 146:1-14.
- 99 -
Capítulo II
USTUNER, T.; HASBENLI, A. & ROZKO, R. 2003. The first record of
Hermetia illucens (Linnaeus, 1758) (Diptera, Stratiomyidae) from the
Near East. Stud. Dipter. 10:181–185.
- 100 -
Capítulo III
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
The effects of larval diet on adult life-history traits of
the Black Soldier Fly, Hermetia illucens (L.) (Diptera,
Stratiomyidae).
Abstract
Larvae of Hermetia illucens feed on different types of decomposing
organic matter, and their development depends on the quality and quantity of
food ingested. In this study three artificial diets were analyzed, namely hen feed,
meat meal and a mixture of meat meal and hen feed. The effects of diet on
ovarian development, size, mortality, larva/pupa stages and sex ratio were
studied. Results showed more biological disadvantages rearing adults using a
meat meal diet than with the other two diets; both mortality rate and the duration
of larvae/pupae were higher, and ovarian development and size of the adults were
lower; in contrast, hen diets were the best. We conclude that food ingested by the
Black Soldier Fly larvae acts as a determining factor in both physiological and
morphological development of adults.
Gobbi, P.; Martínez-Sánchez, A. & Rojo, S. 2012. The effects of larval diet on adult life-history traits
of the Black Soldier Fly, Hermetia illucens (L.) (Diptera, Stratiomyidae). European Journal of
Entomology. Submitted and accepted.
- 103 -
Capítulo III
1. Introduction
Use of Hermetia illucens larvae (Linnaeus, 1758) (Diptera: Stratiomyidae)
have clear advantages for the treatment of organic waste, as they process a wide
variety of organic matter, from vegetable residues to decaying animal tissue
(Newton et al., 2005a, Hem et al., 2008, Myers et al., 2008, Martínez-Sánchez et
al., 2011). This versatility has been demonstrated by numerous studies carried
out on different types of residues, such as coffee chaff, hen or swine manure,
palm oil or fish processing waste (Lardé, 1989; Newton et al., 2005a; St-Hilaire
et al., 2007; Hem et al., 2008). This species, known as the Black Soldier Fly
(BSF), is able to reduce 42-56 % of the volume of organic matter, by consuming
and accumulating it as protein (40 % or more) in its body (Newton et al., 2005b).
Due to the fact that adults do not need to feed (Tomberlin et al., 2002),
depending on the quantity and quality of food supplied to larvae, variations can
take place in their development and formation, as well as in their biological cycle
(Liu et al., 2008). It is known that the quality of food affects growth and survival
rate of insects. Therefore, under optimal conditions, BSF larvae take two weeks
to reach the prepupa stage, although this period can be extended to four months if
food is limited (Furman et al., 1959).
To analyse effect of larval food quality in Diptera, adult wing size is the
most widely used method for studying geometric morphometrics. This technique
provides biological information using a few variables from the anatomical
structure and provides greater statistical power to evaluate analytical and visual
differences in biological structures (Rohlf, 1993). Geometric morphometric
methods based on wings landmarck structure are a great tools to use for the study
of variability in laboratory strains of flies, such as: the influence of larval density
or diet, discrimination of different populations, etc. (Jirakanjanakit & Dujardin,
2005; Jirakanjanakit et al., 2007). It is assumed that larger specimens produce
more eggs then, size of the ovary and basal oocyte were analyzed. Ovary size
- 104 -
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
indicates greater development of ovarioles, which are responsible for producing
the eggs, which in the first stage of development are called basal oocytes
(Salmon et al., 1992). The development of the ovaries and number of ovarioles
in insects is genetically determined in most species, nevertheless, the quantity of
ovarioles and their body size can vary depending on the quantity and quality of
food obtained and stored during the life cycle of individuals (Magnarelli et al.,
1982; Engelman, 1984; Salmon et al., 1992).
The main aim of this study was to determine how larval diet affects the
development of H. illucens and fecundity of females. If larval diet affects the
process of mass rearing, it could be hypothesized that larger specimens produce
females with larger ovaries that lay more eggs. Alternatively size does not affect
the ovaries and the number of eggs produced is related to the quality of food. In
order to test this hypothesis and determine new biological parameters for the
Black Soldier Fly, we established the following specific objectives: a) to
determine how larval feeding affects survival b) to analyse wing size from adults
feeding on different diets, c) to know the life cycle for various larval diets and d)
to analyze the development of ovaries and oocytes in relation to female feeding.
2. Materials and Methods
This study was carried out at the University of Alicante (Alicante
province, SE Spain). A colony of Black Soldier Fly was established in 2008 from
pupae commercially available (Insect Science Resource Company, Georgia,
USA). Emerged adults were placed in colony cages of 3 m³ and kept in a glass
greenhouse module under controlled conditions (25±5 °C, 50±10 % RH and
natural light). Adults were provided with water and sugar ad libitum and
approximately 7 days after emergence, a mixture of water and hen feed (500 gr
diluted in 800 ml of water) was offered for oviposition. The medium was
- 105 -
Capítulo III
prepared in a small container (8.5 x 8.5 cm), with surface covered with strips of
cardboard with holes along the edge, to let females lay the eggs. Every day the
container was substituted, and the medium with eggs was transferred to a
climatic chamber (25 °C, 60 % RH, 12:12) to optimize hatching. Later, hen feed
medium was supplied ad libitum to developing larvae. When larvae reach
prepupal stage, they left the rearing medium to pupate in a sand tray placed at the
bottom of the container. The pupae were filtered and transferred to the adult
cages in the greenhouse.
2.1. Experimental design
Three different diets were prepared for larval feeding: hen feed (H) (500
gr diluted in 800 ml of water), a mixture of hen feed and meat meal (H+M) (250
gr hen feed+250 gr meat meal diluted in 800 ml of water) and meat meal (M)
(500 gr diluted in 800 ml of water). Five replicates with 600 first instar larvae
(younger than 24 hours) were deposited in each diet and then they were placed in
a chamber (25 °C, 60 % RH and 12:12). Once all larvae pupated, as commented
above, they were transferred to experimental adult boxes (40x40x40 cm)
containing sugar and water ad libitum. The dates of pupation and adult
emergence, sex ratio and residue weight were registered; morphometics of 30
males and 30 females, and rate of larval, pupal and adult mortality were also
calculated.
To analyze their morphometric data, length of adults was measured with a
digital caliper (±0.01 mm) and wings were removed for measurement. The pair
of wings from each specimen was glued to a transparent film, noting the replica
and diet reference. They were then scanned and measured using the tps software
that is based on three different programs: tps file utility program (tpsUtil), with
which tps files were created to minimize any bias; tps digitize landmarks &
- 106 -
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
outlines from image files, scanner or video (tpsDig), which allowed selection of
morpho-geometrical points (landmarks) from the images (in this study 21 points
were used (Figure 1); to thereby capture the configuration of each wing and
convert those points into two-dimensional coordinates; and finally, tps relative
warps analysis (tpsRewl), the principal component of the program that processes
the coordinate matrix by calculating the centroid size (values that reflect the
measure image size). In all cases the right wing was measured, but in some cases
where this was impossible the left one was used.
To know the effect of larval diet on the ovarian development of females
and size of individuals, females were analyzed at day 1 (90% emerged adults),
day 5, day 10, day 15 and day 20. Ten females were individualized and frozen in
each replica for 72 hours. Then, their abdomens were opened and ovaries stained
with blue toulidina and orange G (0.03 gr in 6 ml of distilled H2O; one minute).
Maximum width (MWO) and length (MLO) of the ovary and maximum width
(MWob) and length (MLob) of the largest basal oocyte were measured with a
micrometre (magnification 0.63 and 6, respectively). The length of females was
measured with a digital caliper (±0.01 mm) and wings were extracted also to
undertaking morphometric analysis.
- 107 -
Capítulo III
6
4
2
3
1
19
5
7
18
17
14
13
15
20
16
8
21
9
10
12
11
Figure 1. Hermetia illucens wing with the 21 landmarks used to perform morphometric analysis
wing.
2.2. Statistical analysis
To determine possible differences in wing size, mortality and duration of
period stages the non-parametric Kruskal-Wallis (H) test and Mann-Whitney (U)
test was used. To establish the possible relationships that may exist between wing
size and measurements of MWO, MLO, MWob and MLob, Pearson correlation
analysis was applied, and the non-parametric Mann-Whitney (U) test was used to
determine possible differences between MWO, MLO, MWob and MLob for
different diets. The program used was SigmaStat (v3.5 for Windows) and values
of p greater than 0.05 were discarded.
- 108 -
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
3. Results
3.1. Mortality, duration of stages and sex-ratio
Larvae were maintained under the same conditions for the three types of
diet, so the only parameters influencing larval/pupal mortality were the quantity
and quality of food ingested. Quantitative analysis of the remains of the medium
for each type of diet demonstrated that in meat meal larvae ingested an average
of 167.6±67.80 gr (dry weight), in hen feed this was 354.8±27.78 gr (dry weight)
and for the mixture the value was intermediate, 290.6±34.79 gr (dry weight).
Maximum larval/pupal mortality was observed in the meat meal diet, where
values reached 60±3 % and 80±2.66 %, respectively. In contrast, using hen feed,
survival was the highest with 7±3% of mortality rate in larvae and 1±0.6 % at the
pupal stage (Figure 2). In all cases the sex ratio showed more females than males,
but no significant differences were found for any of the three diets (Table 1).
H
M+H
M
100
*
Percentage (%)
80
*
60
40
*
20
0
Larvae mortality
Pupae mortality
Dry residue consumed
Figure 2. Larvae and pupae mortality (±SD) and total dry residue consumed (±SD) of Hermetia
illucens in hen feed (H), meat meal + hen feed (M+H) and meat meal (M) diets (*p <0.05
significant differences).
- 109 -
Capítulo III
Table 1. Average (±SD) adult size (males and females) and sex ratio in base to larval diets (H:
hen feed, M+H: hen feed + meat meal and M: meat meal).
Diets
H
M+H
M
Replica
Male Lenght (mm)
Female Lenght
Sex Ratio
(mm)
% Female
% Male
A
15.57±1.02
15.66±1.20
62
38
B
16.08±1.01
16.22±1.16
55
45
C
15.78±1.17
15.95±1.32
58
42
D
15.61±1.20
15.89±1.29
56
44
E
15.47±0.95
15.77±1.05
56
44
A
15.89±1.03
16.27±0.88
55
45
B
15.64±1.19
16.83±0.75
55
45
C
16.02±1.08
16.10±1.31
60
40
D
15.97±1.11
16.08±0.90
58
42
E
16.01±1.08
16.46±1.20
54
46
A
8.06±0.87
9.45±0.63
58
42
B
8.34±0.86
9.26±0.74
54
46
C
8.51±0.86
9.19±0.77
53
47
D
8.32±0.92
9.79±1.96
63
38
E
8.24±0.86
9.38±0.69
58
42
The duration of larval and pupal stages in the three treatments showed
significant differences (larva: H=12.77, p<0.005 and pupa: H=12.23, p<0.005)
(Figure 3). The larval period was similar in hen diets (H: 15±0.55 days and
M+H: 19±1 days) and was approximately 15 days shorter than in the meat meal
diet (M: 33±1.09 days). The pupal period showed less variation than the larvae,
16±0 days for hen feed and 16±0.45 days for hen+meat meal feed, with the
maximum for meat meal, 19±0.55 days. It was noted that for both hen diets (H
and M+H), it took significantly less time (30.6±0.55 days and 35.2±1.46 days,
respectively) to complete the life cycle than for meat meal, which took almost
twice as long (52.4±1.64 days) (H=12.68, p<0.005) (Figure 3).
- 110 -
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
H
M+H
M
60
*
50
Days
40
*
30
*
20
10
0
Larval stage duration
Pupal stage duration
Total duration
Figure 3. Larval, pupal and total period (median±SD) of the life cycle of Hermetia illucens in
hen feed (H), meat meal+hen feed (M+H) and meat meal (M) diets (*p<0.05 significant
differences).
3.2. Adult size and ovarian development
Wing size was used for morphometric analysis, as it is a good indicator of
the body size of Black Soldier Fly adults (r=0.99; p=0.0001). Wing size was
studied separately according to sex of individuals because significant differences
between males and females were found for the three diets (diet H: U=9740,
p<0.05; diet M+H: U=8814.5, p˂ 0.001; M: U=1458, p˂ 0.001). In all cases, the
wing size of females was larger than that of males (Figure 4). There were
variations in wing size in males (H=233.40, p˂0.001) and females (H=200.87,
p˂0.001) for each type of treatment. Results showed significant differences
between wing sizes for the different diets, except among males fed with both hen
diets, where the differences were not significant (Figure 4). Anyway, the hen
feed mixed with meat meal diet was the best medium to obtain large females, and
specimens developed using the single meat meal were smaller-sized when
compared to individuals fed with hen diets (Figure 4; see also adult size in Table
1).
- 111 -
Capítulo III
2000
1800
*
*
1600
Centroid size
1400
1200
1000
*
*
800
600
400
200
0
H
M+H
M
H
Female
M+H
M
Male
Diets
Figure 4. Box plot showing the relative size of the centroid of females and males wings in the
three treatments (-- : Mean,
: SE, T : SD) (*p<0.05 significant differences).
The mixed diet (M+H) had females with larger ovaries and basal oocytes
than females fed on hen feed or meat meal on all of the days sampled, except on
the first day when oocytes in hen diet were larger (Table 2). The maximum ovary
area was observed from the fifth day in hen diets, and the maximum development
of basal oocytes took place from the fifth day too in both diets (except tenth day
in hence diet) (Figure 5 A-B). In females obtained from meat meal diet, only
ovaries and oocytes were slightly developed on the first day after emergence. In
Figure 6 it was observed that in the mixed diet the specimens were larger, but
sometimes when females with similar size and breeding in different diets were
compared, females that emerged from hen+meat meal showed similar or larger
basal oocytes (day 10) than those on hen feed diet. In contrast, the females
developed in meat meal showed the smallest ovaries and basal oocytes only on
- 112 -
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
the first day sampled, due to very high mortality on the other days and there were
no females (MLO 54.11±4.31; MWO 14.55±1.42, MLob 14.43±0.39, MWob
14.43±0.39). When performing Pearson correlation analysis, a positive
relationship between adult size, wing size and ovary and basal oocyte size was
observed for all the treatments (Table 3; Figure 6). The highest coefficient values
were observed in the relation between wing size and length and not the width of
ovary and basal oocytes.
- 113 -
- 114 23.06
±2.22*
24.88±5.
46*
29.92 ±9*
±6.95*
07*
MWob
98.08
26.4±12.
29.92 ±9*
±1.91
79*
MLob
24.5
19.82±4.
15 ±3.58*
±7.65*
±5.70*
±7.90*
99.44
83.08
66.14
H
M+H
1
H
MWO
MLO
Diets
days
Sampling
5
±1.82*
24.12
±6.44*
105.18
±2.06
24.90
±5.82*
105.34
M+H
±2.01*
23.5
±8.18*
79.16
±2.36*
22.78
±7.18*
97.6
H
10
±2.13*
24.5
±6.17*
105.18
±2.14*
24.9
±5.69*
104.72
M+H
±2.14*
23.76
±6.17*
98.02
±2.33*
23.18
±6.11*
97.64
H
15
±2.14
23.96
±5.18*
105.22
±1.83*
25.38
±4.87*
105.24
M+H
meal+hen feed (M+H) (*p˂0.05) [females breeding in meat meal alone develop ovaries in the first day (see text)]
±2.10*
23.54
±8.16*
98.7
±2.73*
23.04
±7.18*
98.12
H
20
±1.73*
24.6
±5.47*
105.82
±1.89*
25.14
±5.26*
105.22
M+H
Table 2. Ovary (length MLO and width MWO) and basal oocyte development (mean±SD) of Hermetia illucens in hen feed (H) and meat
Capítulo III
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
Area of the ovary (mm²)
H
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
M+H
M
A
1
2
3
Days after emergence
H
M+H
4
5
4
5
M
Area of basal oocyte (mm²)
0.16
0.14
B
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
1
2
3
Days after emergence
Figure 5. Ovary (A) and basal oocyte (B) area of Hermetia illucens female in three different
diets (H: hen feed, M+H: meat meal+hen feed and M: meat meal).
- 115 -
Capítulo III
MLO-H-Day 1
10
8
6
4
2
0
1300
1500
SIZE OF THE OVARY (mm)
MLO-H-Day 5
10
8
6
4
2
0
1300
1500
MLO-H-Day 10
10
8
6
4
2
0
1300
1500
MLO-H-Day 15
10
8
6
4
2
0
1300
1500
MLO-H-Day 20
10
8
6
4
2
0
1300
1500
MLO-M+H-Day 1
1700
1900
MLO-M+H-Day 5
1700
1900
MLO-M+H-Day 10
1700
1900
MLO-M+H-Day 15
1700
1900
MLO-M+H-Day 20
1700
1900
MLob -H-Day 1
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1300
1500
MLob-H-Day 5
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1300
1500
MLob-H-Day 10
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1300
1500
MLob-H-Day 15
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1300
1500
MLob-H-Day 20
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1300
1500
MLob-M+H-Day 1
1700
1900
MLob-M+H-Day 5
1700
1900
MLob-M+H-Day 10
1700
1900
MLob-M+H-Day 15
1700
1900
MLob-M+H-Day 20
1700
1900
CENTROID SIZE
Figure 6. Relationship between wing size and MLO and MLob of the females during
experiment in hen feed (H) and meat meal + hen feed (M+H). No enough females were obtained
in diet meat meal (M) for carry on this analysis.
- 116 -
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
Table 3. Correlation coefficient (r) of linear equation between wing size and female size with
the maximum length (MLO), width of the ovary (MWO), the maximum length (MLob) and
width of the basal oocyto (MWob) in the three diets (*p˂0.001).
Centroid Size
Diets
H
H+M
M
Female Size
Day
MLO
MWO
MLob
MWob
MLO
MWO
MLob
MWob
1
0.981*
0.845*
0.948*
0.948*
0.823*
0.824*
0.799*
0.799*
5
0.874*
0.801*
0.878*
0.768*
0.821*
0.737*
0.796*
0.749*
10
0.978*
0.933*
0.951*
0.822*
0.832*
0.858*
0.855*
0.801*
15
0.930*
0.857*
0.925*
0.789*
0.761*
0.777*
0.827*
0.739*
20
0.983*
0.920*
0.919*
0.889*
0.848*
0.757*
0.752*
0.749*
1
0.920*
0.836*
0.981*
0.981*
0.887*
0.845*
0.732*
0.732*
5
0.982*
0.880*
0.930*
0.883*
0.916*
0.928*
0.743*
0.738*
10
0.996*
0.913*
0.962*
0.879*
0.928*
0.895*
0.747*
0.721*
15
0.996*
0.952*
0.981*
0.878*
0.943*
0.935*
0.787*
0.754*
20
0.878*
0.776*
0.925*
0.693*
0.823*
0.889*
0.784*
0.720*
1
0.995*
0.957*
0.998*
0.998*
0.921*
0.916*
0.846*
0.846*
- 117 -
Capítulo III
4. Discussion
The larvae of the Black Soldier Fly feed on a wide variety of organic
substrates derived from plants and animals, which results in waste reduction and
transformation of these organic materials (Diener et al., 2009). The feeding phase
of the species occurs only in the larval stage, because the great fat storage
provided by the larvae appears to reduce or eliminate the need for adult feeding
(Sheppard et al., 2002). For this reason the quality of food offered to the larvae is
extremely important because the energy they store will have an important role in
the formation and subsequent development of the adult. According to Parra
(1990), during the larval stage the insects tend to choose appropriate food in
balanced proportions, so that its use promotes growth and development, giving
rise to reproductively competitive adults. In this study we found that females
obtained from larvae fed exclusively on meat meal have high mortality, long
developmental time, low wing size, and less ovarian development than those fed
with hen feed diets. This may be because the nutritional value of meat meal and
the quantity ingested by the larvae is so low that larvae spend more time feeding
in the medium, but adults do not accumulate the energy required for normal
development and reproduction. Many factors, such as body size (Livdahl, 1982;
Carpenter, 1983; Briegel, 1990a; Broadie & Bradshaw, 1991; Akoh et al., 1992;
Bradshaw & Holzapfel, 1992; Clements, 1992) and the number and size of the
ovaries of insects (Hawley, 1988; Clements, 1992) are determined by the
conditions in which the larvae develop, and this strongly affects population
growth. Numerous studies using mosquitoes have shown a positive relationship
between wing size (or other measurements of body size) and fecundity (Livdahl
& Sugihara, 1984; Packer & Corbet, 1989; Briegel, 1990a-b; Reeves, 1990;
Bradshaw & Holzapfel, 1992; Clements, 1992; Renshaw et al., 1994). Our data
show that females with larger wing size correspond to large values for body size
and are more fertile than females with smaller wing size and small body size.
- 118 -
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
This result is observed for hen diets, and concretely in the mixed diet where hen
feed, based on vegetable protein mainly, and meat meal with animal protein
provides nutrients to produce the largest females with larger ovaries and basal
oocytes. This is expected because lower body size reduces the abdominal cavity,
minimizing the maximum space required for ovarian development (Honek,
1993). As a conclusion, a reduction in the size of females produced a significant
effect on population dynamics (Salmon et al., 1992). The larger size of ovaries
and eggs was observed from day five to emergence in hen diets, but eggs did not
develop until the fifteenth day in the case of mixed diet.
There are many factors that limit the body size of insects, therefore it is
very important to research the history of their life (Blanckenhorn, 2000; Gotthard
et al., 2007; Pastor et al., 2011). Studies in Muscidae and other insects have
shown that a decrease in nutritional quantity and quality during the larval stage
reduces the size of adults (Black & Krafsur, 1987; Honek, 1993). Wing length is
often used as an indicator for body size in many insects. In our study we found
that BSF larvae fed on single meat meal only gave rise to adults with
significantly reduced wing size (small body size) compared to those fed with hen
feed and meat meal+hen feed; in all cases the females were significantly larger
than males.
The morphology of insects, such as wing size may be influenced by
numerous genetic and environmental variables; these variations provide relevant
information on many aspects of insect biology, mortality, fertility and sex ratio.
In this study there is a higher mortality rate in the diet of single meat meal, as
well as longer duration of larval and pupal stages. This is expected because a
decrease in the nutritional quality of the larvae significantly increases mortality
rate in the preimaginal stages (Shepherd et al., 1994). According to Roper et al.
(1996), the increase in larval development of Chrysomya megacephala (Diptera,
Calliphoridae) found in meat meal diet may be due to a delay of individuals in
- 119 -
Capítulo III
assimilating the nutrients needed to obtain the indispensable minimum weight for
pupation.
Some morphological and biological traits of insects, such as fertility,
mortality and wing size can be affected drastically by the quantity and quality of
the food stored during the juvenile stages (Magnarelli & Anderson, 1979). This
factor and others play an important role in research on the natural history of BSF
because information about them is limited. For this reason it is important to know
the effectiveness of different artificial diets and their micronutrient deficiencies.
These factors may affect the production of body mass and size of individuals,
minimizing and/or eliminating the production of eggs necessary for the
continuity of the species under laboratory conditions. However, other factors
such as larval density, adult density and environmental conditions (light,
temperature etc.) are determining factors that must be studied in depth to improve
mass-rearing and applied use of BSF. Our results show that there are important
differences on larval developmental time, mortality and ovarian development in
relation to larval feeding substrate.
- 120 -
5. BIBLIOGRAPHY
AKOH, J. I.; AIGBODION, F. I. & KUMBAK, D. 1992. Studies on the effect of
larval diet, adult body weight, size of blood-meal and age on the fecundity
of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Insect Sci. Appl. 13:177181.
BLACK, W. C. & KRAFSUR, E. S. 1987. Fecundity and size in the housefly:
investigations of some environmental sources and genetic correlates of
variation. Med. Vet. Entomol. 1:369–382.
BLANCKENHORN, W. U. 2000. The evolution of body size: what keeps
organisms small?. Q. Rev. Biol. 75:385–407.
BRADSHAW, W. E. & HOLZAPFEL, C. M. 1992. Reproductive consequences
of density-dependent size variation in the pitcherplant mosquito,
Wyeomyia smithii (Diptera: Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 85:274281.
BRIEGEL, H. 1990a. Fecundity, metabolism, and body size in Anopheles
(Diptera: Culicidae), vectors of malaria. J. Med. Entomol. 27:839-850.
BRIEGEL, H. 1990b. Metabolic relationship between female body size, reserves,
and fecundity of Aedes aegypti. J. Insect. Physiol. 36:165-172.
CARPENTER, S. R. 1983. Resource limitation of larval treehole mosquitoes
subsisting on beech detritus. Ecology. 64:219-223.
CLEMENTS, A. N. 1992. The Biology of Mosquitoes, Development, Nutrition,
and Reproduction. Chapman & Hall, London. Vol.1, 509 pp.
Capítulo III
DIENER, S.; ZURBRUGG, C. & TOCKNER, K. 2009. Conversion of organic
material by black soldier fly larvae: establishing optimal feeding rates.
Waste Manage. Res. 27:603–610.
ENGELMAN, F. 1984. Reproduction in insects. pp: 113 - 147 in HUFFAKERC .
B. & R. L. RABB (Eds.), Ecological Entomology. John Wiley and Sons,
New York. 844 pp.
FURMAN, D. P.; YOUNG, R. D. & CATTS, E. P. 1959. Hermetia illucens
(Linnaeus) as a Factor in the Natural Control of Musca domestica
(Linnaeus). Journal of Economic Entomology. 52:917-921.
GOTTHARD, K.; BERGER, D. & WALTERS, R. 2007. What keeps insects
small? Time limitation during oviposition reduces the fecundity benefit of
female size in a butterfly. Am. Nat. 169:768–779.
HAWLEY, W. A. 1988. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Control
Assoc. 4:1-40.
HEM, S.; TOURE, S.; SAGBLA, C. & LEGENDRE, M. 2008. Bioconversion
of palm kernel meal for aquaculture: Experiences from the forest region
(Republic of Guinea). African Journal of Biotechnology. 7:1192-1198.
HONEK, A. 1993. Intraspecific variation in body size and fecundity in insects: a
general relationship. Oikos. 66:483–492.
JIRAKANJANAKIT, N. & DUJARDIN, J. P. 2005. Discrimination of Aedes
aegypti (Diptera: Culicidae) laboratory lines based on wing geometry.
Southeast Asian J Trop Med Public Health. 36(4):858-61.
- 122 -
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
JIRAKANJANAKIT, N.; LEEMINGSAWAT, S.; THONGRUNGKIAT, S.;
APIWATHNASORN, C.; SINGHANIYOM, S.; BELLEC, C. &
DUJARDIN, J.P. 2007. Influence of larval density or food variation on the
geometry of the wing of Aedes aegypti (Stegomyia). Trop. Med. & Intl.
Health. 12(11):1354-1360.
LARDÉ, G. 1989. Investigation on some factors affecting larval growth in a
coffee-pulp bed. Biological Wastes. 30:11-19.
LINNAEUS. C. 1758. Systema naturae per regna tria naturae. Ed. 10. Vol. 1, l
824 pp. Holmiae (=Stockholm).
LIVDAHL, T. P. 1982. Competition within and between hatching cohorts of a
treehole mosquito. Ecology. 63:1751-1760.
LIVDAHL, T. P. & SUGIHARA, G. 1984. Non-linear interactions of
populations and the importance of estimating per capita rates of change. J.
Anim. Ecol. 53:573-580.
MAGNARELLI, L. A. & ANDERSON, J. F. 1979. Oviposition, fecundity and
fertility of the salt marsh deer fly Chrysops fuliginosus (D:T). J. Med.
Entomol. 15(2):176-179.
MAGNARELLI, L. A.; LEPRINCE, D. J.; BURGER, J. F. & BUTLER, J. F.
1982. Oviposition behavior and fecundity in Chrisops cincticornis (D:T).
J. Med. Entomo1. 19(5):597-600.
MARTÍNEZ-SÁNCHEZ, A.; MAGAÑA, C.; SALOÑA, M. & ROJO S. 2011.
First record of Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) on human
corpses in Iberian Peninsula. Forensic Sci Int. 20:206(1-3):76-8.
- 123 -
Capítulo III
MYERS, H. M.; TOMBERLIN, J. K.; LAMBERT, B. D. & DAVID, K. 2008.
Development of black soldier fly (Diptera: Stratiomyidae) larvae fed dairy
manure. Environmental Entomology. 37:11-15.
NEWTON, L.; SHEPPARD, C.; WATSON, D.W.; BURTLE, G. & DOVE, R.
2005a. Using the black soldier fly, Hermetia illucens, as a value-added
tool for the management of swine manure. Animal and Poultry Waste
Management Center, North Carolina State University, Raleigh, NC, pp.
17.
NEWTON, G. L.; SHEPPARD, D. C.; WATSON, D. W.; BURTLE, G. J.;
DOVE, C. R.; TOMBERLIN, J. K. & THELEN, E. E. 2005b. The black
soldier fly, Hermetia illucens, as a manure management/resource recovery
tool. Symposium on the State of the Science of Animal Manure and Waste
Management. January 5–7, 2005, San Antonio, Texas, USA.
PACKER, M. J. & CORBET, P. S. 1989. Size variation and reproductive success
of female Aedes punctor (Diptera: Culicidae). Ecol. Entomol. 14:297-309.
PARRA, J. R. P. 1990. Consumo e utilização de alimentos por insetos. In:
PANIZZI, A. R.; PARRA, J. R. P. (Ed.). Ecologia nutricional de insetos e
suas implicações no manejo de pragas. São Paulo: Manole. p.9-57.
PASTOR, B; IKOVÁ, H.; KOZÁNEK, M.; MARTÍNEZ-SÁNCHEZ, A.;
TAKÁ, P. & ROJO, S. 2011. Effect of the size of the pupae, adult diet,
oviposition substrate and adult population density on egg production in
Musca domestica (Diptera: Muscidae). Eur. J. Entomol. 108:587–596.
REEVES, W. C. 1990. Epidemiology and Control of Mosquito-Borne
Arboviruses in California, 1943-1987. California Mosquito and Vector
Control Association, Sacramento, CA, 508 pp.
- 124 -
Effect of larval diet on adults of Hermetia illucens
RENSHAW, M.; SERVICE, M. W. & BIRLEY, M. H. 1994. Size variation and
reproductive success in the mosquito Aedes cantans. Medical and
Veterinary Entomology. 8:179–186.
ROHLF, F. J. 1993. Relative warp analysis and an example of its application to
mosquito wings. In MARCUS, L. F.; BELLO, E. & GARCÍAVALDECASAS, A. (eds). Contribution to Morphometrics.
Madrid:
CSIC. 131-159.
ROPER, C.; PIGNATELLI, P. & PARTRIDGE, L. 1996. Evolutionary responses
of Drosophila melanogaster life history to differences in larval density.
Journal of Evolutionary Biology. 9:609-622.
SALMON, B. F.; MARTÍNEZ, C. C. & OCA, B. A. 1992. El tamaño del cuerpo
como factor diferenciador de la fecundidad de Haematopota ztalzca Meig.
(Diptera, Tabanidae). Anales de Biología. 18(7):47-52.
SHEPPARD, D. C.; NEWTON, G. L. & THOMPSON, S. A. 1994. A value
added manure management system using the black soldier fly.
Bioresource Tech. 50:275-279.
SHEPPARD, D. C.; TOMBERLIN, J. K.; JOYCE, J.; KISER, B. C. &
SUMNER, S. M. 2002.
Rearing methods for the black soldier fly
(Diptera: Stratiomyidae). J. Med. Entomol. 39:695–698.
ST-HILAIRE, S.; CRANFILL, K.; MCGUIRE, M. A.; MOSLEY, E. E.;
TOMBERLIN, J. K.; NEWTON, L.; SEALEY, W. C.; SHEPPARD, D. C.
& IRVING, S. 2007. Fish offal recycling by the black soldier fly produces
a foodstuff high in omega-3 fatty acids. Journal of the World Aquaculture
Society. 38:309-313.
- 125 -
Capítulo III
TOMBERLIN, J. K.; SHEPPARD, D. C. & JOYCE, J. A. 2002. A comparison of
selected life history traits of the black soldier fly (Diptera: Stratiomyidae)
when reared on three diets. Ann. Entomol. Soc. Am. 95:379-387.
- 126 -
Capítulo IV
Mass rearing of Hermetia illucens
Mass
rearing
Stratiomyidae):
of
Hermetia
identifying
illucens
bottlenecks
(Diptera:
in
egg
production.
Abstract
Hermetia illucens or the Black Soldier Fly (BSF) is an insect of great
economic importance, due to its potential at larval stage for degrading a wide
variety of organic by-products and wastes. The transformation of organic matter
results in a highly nutritious product for feeding a wide variety of animals. This
paper provides information about some of the main bottlenecks related to mass
rearing of this species on an industrial scale. Two experiments were conducted to
explore biological parameters related to mass production of eggs: 1)
Density/housing colony experiment with four treatments, treatment A (colony
box 40x40x40 cm with 1000 adults), treatment B (40x40x40 cm box colony with
2000 adults), treatment C (80x60x80 cm box with 1000 adults) and treatment D
(80x60x80 cm box with 2000 adults) and 2) Mass rearing experiment with four
cases, treatment 1 (colony box with no periodic introduction of pupae), treatment
2 (colony box with fortnightly introduction of Hermetia pupae) treatment 3
(colony box with weekly introduction of pupae) and treatment 4 (colony box
with a weekly introduction of double the quantity of pupae in treatment 3). In
both cases it was observed that biotic and abiotic conditions, such as solar
radiation, temperature, humidity, density of adults and box colony size, are
important for optimal development of BSF.
Gobbi, P.; Martínez-Sánchez, A. & Rojo, S. 2012. Mass rearing of Hermetia illucens (Diptera:
Stratiomyidae): identifying bottlenecks in egg production. Entomologia Experimentalis et Applicata.
Submitted.
- 129 -
Capítulo IV
1. Introduction
Over 50 % of waste production belongs to organic types (Ojeda-Benitez et
al., 2003, Henry et al., 2006; Sharholy et al., 2006) and therefore can be
processed by specific techniques such as composting and other live technologies.
In most cases, organic by-products can be biologically transformed under
controlled conditions. Traditionally, saprophytic organisms such as fungi,
bacteria and earthworms were commonly used for treatment of organic wastes,
which transform the by-product or waste into a usable protein product of high
value (Burns, 2005; Diener et al., 2009). However, it is also known that some
insect larvae can perform this process, with Hermetia illucens L. (Diptera,
Stratiomyidae) being one of the most promising, especially in urban, industrial
and agricultural environments. The potential of BSF is related to the biological
characteristics of its larval stage, which can develop in a variety of fresh or
decomposed organic matter (Tomberlin et al., 2002). The Black Soldier Fly can
be used to remove between 60-90% of the volume of organic matter, as some
authors have shown experimentally (Tingle et al., 1975; Sheppard et al., 1994).
Moreover, the last stage of larval development of this species has great potential
for use as animal feed for pets (eg. reptiles, birds, etc.), or for use in aquaculture
or livestock feeding (Tomberlin et al., 2009). Preliminary studies suggest that the
larvae have a nutritional balance of calcium and phosphorus and high levels of
lauric acid with excellent antimicrobial and antiviral functions. Erickson et al.
(2004) and Liu et al. (2008) determined that the Black Soldier Fly larvae could
reduce Escherichia coli bacteria from chicken manure; a similar effect was found
in Salmonella populations. However, it is not known whether these bacteria serve
as food for the larvae or are suppressed to reduce infection and potential death of
the larvae (Erickson et al., 2004; Liu et al., 2008).
- 130 -
Mass rearing of Hermetia illucens
It has been shown that adults of H. illucens can survive for some time
without feeding, as they use energy reserves stored during the larval stage for
their development, but they can increase their longevity with the presence of
water (Tomberlin et al., 2002). When biotic and abiotic conditions are suitable
for their life cycle, it has been shown that sunlight stimulation and optimum
ranges of temperature and humidity (Tomberlin & Sheppard, 2002; Zhang et al.,
2005) are necessary for the reproduction of adults and for the successful
generation of progeny.
Insects are ectothermic organisms that regulate their physiological
functions according to environmental conditions (McGavin, 2001). In nature,
environmental conditions regularly affect an insect’s development, so that its
growth slows down or halts in what is called diapause (Deutsch et al., 2008). It is
therefore essential to know and understand the effects of biotic and abiotic
factors in the development of the Black Soldier Fly to identify their influence on
the life history of the species (Gullan & Cranston, 2000) and to understand main
bottlenecks related to mass egg production. The BSF is considered a beneficial
insect, and is of great economic importance (Yu et al., 2009). This species is
distributed in tropical and subtropical regions around the world (James, 1935;
Kovac & Rozkosny, 1995), however there is little information on its biology in
Europe where it has been known since the decade of the 60s (James, 1935; May,
1961; Booth & Sheppard, 1984; Sheppard et al., 1994).
The main objective of this work is to increase the knowledge of BSF
reproductive biology significantly, determining the biological conditions
necessary to improve mass rearing under controlled conditions and mass egg
production.
- 131 -
Capítulo IV
2. Materials and Methods
The study was conducted in a glass greenhouse located in the Scientific
Park of the University of Alicante (SE, Spain), where the temperature and
humidity were under control conditions (25±5 °C, 50±10 % RH). To undertake
experiments, pupae were obtained from a colony of H. illucens established at the
facilities of the University of Alicante in 2008, obtained from commercial larvae
(Insect Science Resource Company, Georgia, USA).
In each experiment, the pupae were placed in a colony box (3m3),
consisting of a metal structure and covered with a white mesh (Figure 1).
Emerged adults were provided with water and sugar ad libitum. A proportional
mix of water and hen feed was placed in a recipient covered with cardboard
strips (Gobbi et al., submitted). The eggs were transferred to another recipient
with a mix of water and hen feed, and deposited in a growth chamber (25 °C, 60
% RH, 12:12 L:D) to optimise the emergence of larvae. The medium with larvae
was situated in a container with a thin layer of sand in the bottom for pupation
until pupae formed.
- 132 -
Mass rearing of Hermetia illucens
Figure 1. Hermetia illucens adult mating boxes (length 220 cm, 140 cm width and 110 cm
height).
2.1. Adult density experiment
Colony boxes of two different sizes were used to undertake four different
treatments, each with five replicates. All experiments were carried out in the
greenhouse under controlled conditions (25±5 ºC, 60±10 % RH), global solar
radiation was registered each day from 17/12/2010 to 13/01/2011. The first
treatment (A) consisted of a colony box of 40x40x40 cm (small cages) with 2000
adults of Black Soldier Fly (32 dm³ per adult). In the second treatment (B) 1000
adults were introduced in a small cage (64 dm³ per adult). In the third treatment
(C) 2000 adults were introduced in a colony box of 80x60x80 cm (medium
cages) (192 dm³ per adult) and in the final treatment (D), in the same type of
cage, 1000 adults were introduced (384 dm³/adult). In each treatment the space
- 133 -
Capítulo IV
for flies increased, from 32 dm³ to 384 dm³, by increasing the space by x2, x6 or
x12, in each new treatment.
2.2. Mass rearing experiment
Four colony boxes of about 3 m³ (Figure 1) with each used for four
different treatments from 18/02/2010 to 18/08/2010. In each treatment the
number of pupae initially introduced was 5.78±0.63 kg. In the first treatment
[T0], no pupae were introduced periodically in the box. In the second treatment
[TF], 1.48±0.33 kg of pupae were introduced in the colony box fortnightly. In the
next treatment [TW], together with the initial quantity of pupae, a similar
quantity was introduced weekly (an average of 1.88±0.46 kg of pupae), and in
the last treatment [TDW], weekly introduction of double the quantity of pupae
(3.01±1.05 kg). We tried to introduce a similar initial amount in all treatments;
however, in some cases this was not possible. Due to the experiment taking place
on different dates, temperature, humidity and global solar radiation were
registered for each day of treatment (Figure 2).
2.3. Data analysis and statistic
Sex ratio and number of eggs were recorded in each experiment. In the
case of the mass rearing experiment, dead adults were removed every two weeks,
and the mortality rate was calculated as the initial number of pupae minus the
dead adults collected in two weeks, dividing the initial adult concentration in this
period. Sex ratio was performed dividing the females/males number by the total
number of individuals. In order to determine the average number of eggs, 30 egg
masses were counted , and then this average was used to count eggs per clutch (1
mass = 541.8±42.15 eggs). Moreover, 1 kg of pupae was estimated as
14102.56±2790.29 pupae (1 pupa = 0.07±0.02).
- 134 -
Mass rearing of Hermetia illucens
In both experiments the results were analysed under the assumption of
non-normal data, as they failed the Kolmogorov-Smirnov normality test. To
analyse the egg production from different treatments in both experiments and the
mortality rate for different treatments in the mass rearing experiment, we used
the non-parametric Kruskal-Wallis (H) test. For the density experiment to
calculate solar radiation and egg masses number correlation for the different
treatments the Pearson Correlation analysis was used. In both cases possible
differences in the sex ratio were determined with the non-parametric MannWhitney (U) test. In all cases the statistical program chosen was SigmaStat
(version 3.5 for Windows), discriminating values of p greater than 0.05.
- 135 -
Capítulo IV
W/m²
Maximum Global Radiation
1800
1400
1000
600
200
RH (%)
Average Humidity (RH)
90
75
60
45
30
T (ºC)
Average Temperature
35
30
25
20
15
TF
T0
TW
TDW
Date of treatments
Figure 2. Maximum radiation, average relative humidity and average temperature recorded in
the treatments with Hermetia illucens. [T0: without introduction of pupae (22/02//201014/04/2010), TF: fortnightly introduction of pupae (18/02/2010-04/04/2010), TW: weekly
introduction of pupae (08/03/2010-12/08/2010) and weekly double introduction of pupae
(15/04/2010-18/08/2010)].
- 136 -
Mass rearing of Hermetia illucens
3. Results
3.1. Effect of density on the production of eggs
Temperature and humidity were constant during the experiment, but
global radiation was not, which fluctuated sharply daily. Figure 3 shows how
maximum daily radiation affects BSF oviposition. When sunlight intensity
increased egg numbers incremented in all cases, whereas when solar radiation
decreased by 600-700 W/m2 fewer egg numbers were obtained. However, from
approximately day 15 of the experiment, all treatments showed a decrease in
daily oviposition regardless of subsequent radiation increases. In all treatments
the correlation between egg mass numbers and radiation was positive, at least in
the period of maximum egg production, i.e. in the first 15 days (Table 1;
treatment A: r=0.69, p=0.004, treatment B: r=0.53, p = 0.04; treatment C:
r=0.53, p<0.04 and treatment D: r=0.58, p=0.02).
Table 1. Value of correlation between daily egg production and radiation in the first 15 days of
Adult Density Experiment and total eggs and average production of eggs per female in each
treatment of this experiment (*Sex-ratio considered as 1:1; **p<0.05).
Size Colony Box
(cm)
40x40x40
40x40x40
80x60x80
80x60x80
Adults
Density
Space by Adult
(dm³)
Total Eggs
Production
Nº Eggs/Female*
2000
32
56780±4270
14.19±2.39
1000
64
69350±3498
34.67±3.91**
2000
192
96223±6815**
24.5±3.81
1000
384
58080±5642
29.04±6.31
- 137 -
Capítulo IV
Small cage 2000 adults
Maximum radiation
20
1000
16
800
12
600
8
4
400
200
0
0
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
20
16
12
8
4
0
1000
800
600
400
200
0
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
Median cage 2000 adults
20
16
12
8
4
0
1000
800
600
400
200
0
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
Median cage 1000 adults
20
16
12
8
4
0
1000
800
600
400
200
0
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
Days
Figure 3. Average number of egg production in relation to maximum radiation (W/m²) in each
treatment during Adult Density Experiment.
- 138 -
MAXIMUM RADIATION (W/m²)
AVERAGE NUMBER OF EGG MASS
Small cage 1000 adults
Mass rearing of Hermetia illucens
Egg production increased as density decreased and the space per fly
increased in the cages. The highest egg production was observed in the medium
cage with 2000 adults (192 dm3/fly) (H=15.06, p=0.002), while the lowest egg
number was obtained in the small colony box with 2000 adults of the Black
Soldier Fly (32 dm3/fly) (Figure 4). When the density was very low and space per
fly was maximum, medium cages with 1000 adults, production was similar to
that obtained in small cages (Figure 5). However, Table 1 shows that higher egg
production per female occurs significantly in the treatment where small cages
and 1000 flies were disposed (H=55.40, p=0.001). Regarding the adults
introduced in boxes, after they died sex ratio was studied and the proportion
between males and females was similar in all treatments, i.e. 1:1 (p<0.05).
- 139 -
Capítulo IV
Small cage 2000 adults
200
Small cage 1000 adults
200
64 dm3/fly
3
AVERAGE DAYLY EGGS ACCUMULATED
32 dm /fly
160
160
120
120
80
80
40
40
0
0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28
Day
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28
Day
Median cage 1000 adults
Median cage 2000 adults
200
200
384 dm3/fly
3
192 dm /fly
160
160
120
120
80
80
40
40
0
0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28
Day
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28
Day
Figure 4. Average daily eggs accumulated (± SD) in every treatment during the adult density
experiment (small cage: 40x40x40 cm and median cage: 80x60x80 cm) of Hermetia illucens.
- 140 -
Mass rearing of Hermetia illucens
1000 adults
2000 adults
Total egg number
120000
100000
80000
60000
40000
Small colony box
Median colony box
Figure 5. Total number of egg in small and median cages colonies at different adults densities.
Different letters indicate significant differences (p˂0.05).
3.2. Experiment mass rearing with different protocols
Comparing egg production with the number of live adults at intervals of
15 days according to different treatments, it is observed that in treatment T0 the
difference between egg numbers collected and the quantity of adults is much
higher. We interpret that egg production is greater than in the other treatments
where these quantities do not differ much (Figure 6). In all treatments the highest
egg production of BSF females was between days 1-30 of the experiment. After
this point, even though the number of adults alive remained constant or increased
in all treatment, egg production decreased generally, except for T0 treatment.
- 141 -
Capítulo IV
1000
250
1000
200
800
200
800
150
600
150
600
100
400
100
400
50
200
50
200
0
0
1-15
15-30
Days
0
30-45
0
1-15
15-30
Days
30-45
Treatment TDW
Treatment TW
250
1000
250
1000
200
800
200
800
150
600
150
600
100
400
100
400
50
200
50
200
Days
75-90
60-75
45-60
30-45
0
15-30
0
1-15
120-135
105-120
90-105
75-90
60-75
45-60
30-45
0
15-30
0
1-15
NUMBER OF ACUMULATED LIVE ADULTS
250
Days
Figure 6. Eggs production at intervals of 15 days during of the experiment of mass rearing.
(Treatments T0: no pupae introduced, TF: pupae introduced fortnightly, TW: pupae introduced,
weekly and TDW: double amount of pupae than in TW introduced weekly) (Black point: adults
alive, White point: eggs collected).
- 142 -
TOTAL Nº OF EGGS ( in thousands)
Treatment TF
Treatment T0
Mass rearing of Hermetia illucens
When the number of eggs had been compared in all treatments, correction
by individuals and time of treatment took place. This ratio (eggs/day/adult)
showed significant differences between some treatments (H=56.48, p˂0.001),
with the colony boxes without and fortnightly introduction of pupae (T0 and TF)
showing significantly higher values (Table 2). This result contrasts with the
number of adults and the total number of eggs, due to the fact that in treatment
T0 and TF there were far fewer adults than in the rest of treatments, and the
number of eggs in treatment TW was twice that of treatment T0, where the adults
introduced were more than twice those of T0. As a conclusion, increasing adult
numbers does not implicate a proportional increase in egg production.
Table 2. Total number of adults introduced, total egg production and eggs per adult per day in
each treatments (*p ˂ 0.05). (T0: no pupae introduced, TF: pupae introduced fortnightly, TW:
pupae introduced, weekly and TDW: double amount of pupae than in TW introduced weekly).
Treatment T0
Experiment
Days
45
Nº Total Adults
Nº Total Eggs
49028
1358610
Eggs
(Nº/adult/day)
0.61*
Treatment TF
45
106818
1093914
0.22*
Treatment TW
135
320909
2824456
0.06
Treatment TDW
90
434564
1812600
0.05
As regards mortality rate, the values were lower than 0.5 in treatments TW
and TDW, except when the number of adults introduced was sporadically very
high, due to an increase in mortality. In both treatments, the mortality rate
follows a sine curve, increasing and decreasing according to adult age or its
incorporation in the boxes (Figure 7). This ratio was lower than 0.5 in T0 during
the first 45 days, but later mortality increased suddenly. In the TF treatment the
mortality rate was very low during the first 30 days, but then mortality increased
- 143 -
Capítulo IV
to 0.6 and continued to grow exponentially. In any case significant differences
were found (H=11.33, p=0.01) among the treatments, with the mortality rate of
treatment TDW being higher than treatment T0.
120
Treatment T0
100
0.8
1
120
Treatment TF
100
0.8
80
0.6
80
0.6
60
0.4
40
PROPORTION OF ADULTS
0.2
20
0
0
1-15
1
15-30 30-45
Days interval
60
0.4
40
0.2
0
45-60
Treatment TW
0.8
20
0
1-15
120
1
100
0.8
80
0.6
15-30 30-45
Days interval
45-60
120
Treatment TDW
100
80
0.6
60
60
0.4
0.4
40
40
Days interval
20
90-105
75-90
60-75
0
45-60
0
30-45
90-105
105-120
120-135
135-155
0
1-15
15-30
30-45
45-60
60-75
75-90
0
0.2
15-30
20
1-15
0.2
Days interval
Figure 7. Mortality proportion in relation to the added adults number during the different
treatments [T0: no pupae introduced, TF: pupae introduced fortnightly, TW: pupae introduced,
weekly and TDW: double amount of pupae than in TW introduced weekly]. (Bars: aggregate
number of adults; line: mortality proportion).
- 144 -
AGGREGATE NUMBER OF ADULTS
1
Mass rearing of Hermetia illucens
4. Discussion
Insects and other arthropods can play an important role in our human
economy, including the pharmaceutical industry and agriculture (GuzmánMendoza, 2010). However these roles are related to the knowledge of the biology
and development of species (Peters & Barbosa, 1977).
The Black Soldier Fly has a high potential for use in different fields
related to humans (as food and feed, degradation of organic wastes, new sources
of bio-components, etc.). However to know the main biological parameters and
bottlenecks related to mass rearing and mass-production at industrial scale is
fundamental. In this study it was observed that daily global radiation played a
more important role in the BSF’s oviposition than other abiotic parameters such
as temperature and relative humidity. Our results indicate that radiation higher
than 600 W/m² is enough to increase production of eggs in H. illucens. Zhang et
al. (2010) found that with 500 W/m², mating and eggs were observed, and when
light was removed a reduction in mating and adult oviposition occured.
Incontrast, Tomberlin & Sheppard (2002) found that light intensity has a higher
influence on mating than on egg laying. In the present study oviposition and the
number of viable eggs were the only factors taken into consideration.
It is known that temperature and humidity affect the physiology,
development, longevity and oviposition of the species (Gullan & Cranston,
2000). During our experiments temperature and humidity were kept between 25
and 30 ºC, as they are considered optimal ranges for Black Soldier Fly breeding.
Both & Sheppard (1984) reported that mating and oviposition occurred between
ranges from 27.5 to 37.5 º C and 30-90 % of relative humidity. So, in this study
these factors did not significantly influence the results.
Concerning the size of colony boxes, Tingle et al. (1975) analysed
reproductive behaviour of H. illucens adults in cages of 38x46x38 cm with bad
- 145 -
Capítulo IV
space for adult mating, however they were unable to establish a culture with
multiple generations (Sheppard et al., 2002). In our study females laid high
numbers of eggs in smaller cages of 40x40x40 cm (1000 adults) and in cages of 3
m³ (50000 adults).
The density influence on adult insects being reared under laboratory
conditions is very important, but has rarely been investigated (Peters & Barbosa,
1977). It has been seen that size, growth rate, metabolism, and fertility behaviour
of different insect populations are affected by density (Peters & Barbosa, 1977).
In both experiments (adult density and mass rearing experiment) it was observed
that there is a density appropriate for each colony box size where H. illucens
development is optimal; if this limit (small colony box [40x40x40 cm] with 1000
adults, medium colony box [80x60x80 cm] with 1000 adults and colony box of
3m³ with 50000 adults) is exceeded, adult mortality increases and the egg laying
number per female per day decreases. In the first experiment the maximum
oviposition per female was recorded in small cages with 1000 adults, i.e. 0.064
m3 per fly. When this space increases 3 or 6 times or is reduced by half,
oviposition per female is lower or similar, respectively. However, we observed
that 1000 flies in small or medium cages produce similar quantities of eggs per
female. However space optimisation for mass rearing decreases if medium cages
are used. In medium cages with 2000 flies, total egg production was significantly
higher than for the rest of treatments, but lower than the double quantity with the
twice the number of flies. In the mass rearing study, treatment T0 (without
introduction of pupae) and treatment TF (fortnightly introduction of pupae) have
significantly higher fertility per female than treatments TW (weekly introduction
pupae) and TDW (weekly introduction of double pupae amount), with the last
one having a significantly higher mortality rate. In most insects, when population
density increases, offspring per female per day decreases; this has been attributed
to a reduction in fertility, as well as to an increase in mortality (Boyce, 1946).
- 146 -
Mass rearing of Hermetia illucens
Crombie (1942) showed that the fertility decrease of some beetle females was
due to competition from gravid females for oviposition sites. However, when H.
illucens breeding does not occur under optimal biological conditions, the
reproductive capacity of females decreases, resulting in the death of individuals
(Tomberlin & Sheppard, 2002; Tomberlin et al., 2002).
The Black Soldier Fly can be applied to solve some important problems
related to the accumulation of organic waste (odour removal, elimination and/or
reduction of other flies, elimination of microorganisms harmful to human health).
It can also be used as a substitute or complement in the food diet for different
animals, as well as intervening and helping to resolve cases of a judicial nature in
the calculation of the postmortem interval (PMI) (Erickson et al., 2004; Newton
et al., 2005; Hem et al., 2008; Myers et al., 2008; Diener et al., 2009; MartínezSánchez et al., 2011). It is for this reason that the present study solves many
unknowns regarding biological parameters that may affect their breeding and
development. However, deeper studies are therefore needed to expand artificial
rearing methods for this species.
- 147 -
5. BIBLIOGRAPHY
BOOTH, D. C. & SHEPPARD, D. C. 1984. Oviposition of the black soldier by,
Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae): eggs, masses, timing and site
characteristics. Environ. Entomol. 13:421-423.
BOYCE, J. M. 1946. The Influence of Fecundity and Egg Mortality on the
Population Growth of Tribolium confusum Duval. Ecology. 27(4):290302.
BURNS, R. 2005. Grubby research promises environmental/economic benefits.
Innovations report, Forum for Science, Industry and Business. Disponible
en: http://www.innovationsreport.com/html/reports/agricultural_sciences/r
eport-41281.html.
CROMBIE, A. C. 1942. The effect of crowding upon the oviposition of graininfesting insects. Jour. Expert. Biol. 19(3):311-340.
DEUTSCH, C. A.; TEWKSBURY, J. J.; HUEY, R. B.; SHELDON, K. S.;
GHALAMBOR, C. K.; HAAK, D. C. & MARTIN, P. R. 2008. Impacts of
climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America.
105:6668-6672.
DIENER, S.; ZURBRUGG, C. & TOCKNER, K. 2009. Conversion of organic
material by black soldier fly larvae: establishing optimal feeding rates.
Waste Manage. Res. 27:603-610.
Mass rearing of Hermetia illucens
ERICKSON, M. C.; ISLAM, M.; SHEPPARD, C.; LIAO, J. & DOYLE, M. P.
2004. Reduction of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica
serovar Enteritidis in chicken manure by larvae of the black soldier by. J.
Food Protect. 67:685-690.
GULLAN, P. J. & CRANSTON, P. S. 2000. The insects: an outline of
entomology. London, United Kingdom: Blackwell Science.
GUZMÁN-MENDOZA, R. 2010. Los insectos: antiguos constructores del
mundo.
Benemérita
Universidad
Autónoma
de
Puebla,
México.
Elementos: Ciencia y Cultura. 17(79):29-33.
HEM, S.; TOURE, S.; SAGBLA, C. & LEGENDRE, M. 2008. Bioconversion of
palm kernel meal for aquaculture: Experiences from the forest region
(Republic of Guinea). African Journal of Biotechnology. 7(8):1192-1198.
HENRY, R. K.; ZHAO, Y. & DONG, J. 2006. Municipal solid waste
management challenges in developing countries–Kenyan case study.
Waste Management. 26:92–100.
JAMES, M. T. 1935. The genus Hermetia in the United States (Diptera:
Stratiomyidae). Bull. Brooklyn Entomol. Soc.
KOVAC, D. & ROZKOSNY, R. 1995. Stratiomyidae (Insecta: Diptera) of
Temengor Forest Reserve, Hulu Perak, Malaysia. Malayan Nature
Journal. 48:281-285.
LIU, Q. L.; TOMBERLIN, J. K.; BRADY, J. A.; SANFORD, M. R. & YU, Z. N.
2008. Black Soldier Fly (Diptera: Stratiomyidae) Larvae Reduce
Escherichia coli in Dairy Manure. Environmental Entomology. 37:15251530.
- 149 -
Capítulo IV
MARTÍNEZ-SÁNCHEZ, A.; MAGAÑA, C.; SALOÑA, M. & ROJO, S. 2011.
First record of Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) on human
corpses in Iberian Peninsula. Forensic Science International. 206:76-78.
MAY, B. M. 1961. The occurrence in New Zealand and the life-history of the
soldier Hermetia illucens (L.) (Diptera: Stratiomyidae). N.Z. J. Sci. 4:5565.
MCGAVIN, G. C. 2001. Essential Entomology: An Order-by-order Introduction.
Oxford: Oxford University Press.
MYERS, H. M.; TOMBERLIN, J. K.; LAMBERT, B. D. & KATTES, D. 2008.
Development of black soldier fly (Diptera: Stratiomyidae) larvae fed dairy
manure. Environmental Entomology. 37:11-15.
NEWTON, G. L.; SHEPPARD, D. C.; WATSON, D. W.; BURTLE, G. &
DOVE, R. 2005. Using the black soldier, Hermetia illucens, as a valueadded
tool
for
the
management
of
swine
manure.
(http//www.p2pays.org/ref/37/36122.pdf).
OJEDA-BENITEZ, S.; ARMIJO DE VEGA, C. & RAMIREZ-BARRETO, M.
E. 2003. Characterization and quantification of household solid wastes in
a Mexican city. Resources, Conservation and Recycling. 39:211–222.
PETERS, T. M. & BARBOSA, P. 1977. Influence of population density on size,
fecundity, and developmental rate of insects in culture. Ann. Rev. Entomb.
22:431-50.
SHARHOLY, M.; AHMAD, K.; VAISHYA, R. C. & GUPTA, R. D. 2006.
Municipal solid waste characteristics and management in Allahabad,
India. Waste Management. 27:490–496.
- 150 -
Mass rearing of Hermetia illucens
SHEPPARD, D. C.; NEWTON, G. L. & THOMPSON, S. A. 1994. A value
added manure management system using the black soldier fly.
Bioresource. Tech. 50:275-279.
SHEPPARD, D. C.; TOMBERLIN, J. K.; JOYCE, J. A.; KISER, B. C. &
SUMNER, S. M. 2002. Rearing methods for the black soldier (Diptera:
Stratiomyidae). J. Med. Entomol. 39:695-698.
TINGLE, F. C.; MITCHELL, E. R. & COPELAND, W. W. 1975. The soldier
fly, Hermetia illucens, in poultry houses in North Central Florida. J. Ga.
Entomol. Soc. 10:179-183.
TOMBERLIN, J. K. & SHEPPARD, D. C. 2002. Factors influencing Mating and
Oviposition of Black Soldier Flies (Diptera: Stratiomyidae) in a Colony. J.
Entomol. Sci. 37 (4):345-352.
TOMBERLIN, J. K.; SHEPPARD, D. C. & JOYCE, J. A. 2002. Selected lifehistory traits of black soldier fly (Diptera: Stratiomyidae) reared on three
artificial diets. Ann. Entomol. Soc. Am. 95:379-386.
TOMBERLIN, J. K.; ADLER, P. H. & MYERS, H. M. 2009. Development of
the Black Soldier Fly (Diptera: Stratiomyidae) in Relation to Temperature.
Environ. Entomol. 38(3):930-934.
YU, G. H.; CHEN, Y. H.; YU, Z. N. & CHENG, P. 2009. Research progression
on the larvae and prepupae of black soldier fly Hermetia illucens used as
animal feedstuff. Chin. Bull. Entomol. 46:41-45. (in Chinese).
- 151 -
Capítulo IV
ZHANG, S. Q.; ZHANG, F. D.; LIU, X. M.; WANG, Y. J.; ZOU, S. W. & HE,
X. S. 2005. Determination and analysis on main harmful composition in
excrement of scale livestock and poultry feedlots. Plant Nutri. Fert. Sci.
11:822-829. (in Chinese).
ZHANG, J.; HUANG, L.; HE, J.; TOMBERLIN, J. K.; LEI, C. & YU, Z. 2010.
An Artificial Light Source Influences Mating and Oviposition of Black
Soldier Flies (Diptera: Stratiomyidae). Journal of Insect Science. 10:15362442.
- 152 -
CONCLUSIONES
A continuación se detallan los principales resultados y conclusiones de la tesis,
referidos a los objetivos planteados en la misma.
1.- Se presenta por vez primera la quetotaxia preimaginal característica de
Hermetia illucens que, sin embargo, no presenta valor diagnóstico para la
diferenciación de los estadios larvarios.
2.- El tamaño de la cápsula cefálica de Hermetia illucens, así como la morfología
y el tamaño de los espiráculos posteriores, pueden utilizarse como indicadores de
la edad de las larvas; a medida que incrementa la edad larval aumenta el tamaño
de la cápsula cefálica, de los espiráculos posteriores y el número de aberturas
espiraculares. Estas estructuras permiten no solo datar las larvas sino también
establecer diferencias entre los estadios larvarios.
3.- El análisis cuticular de los diferentes hidrocarburos de las larvas de H.
illucens siguen un patrón con respecto a la edad. La media de la abundancia de
los hidrocarburos aumenta con la edad y la abundancia de los hidrocarburos más
destacados, correspondientes a los tiempos de retención de 3, 8, 9 y 11 minutos
aproximadamente, pueden ser a priori utilizados en su conjunto para diferenciar
la edad de las larvas.
- 153 -
4.- La tasa de desarrollo preimaginal de Hermetia illucens, así como su tamaño
en longitud y peso, está directamente relacionada con la temperatura y la dieta,
disminuyendo con el incremento de la temperatura o con dietas no óptimas,
como las cárnicas frente a las granívoras. Sin embargo, el periodo de pupa
presenta unos patrones distintos. La duración es más o menos estable, salvo en
pupas dispuestas a 35 ºC que necesitaron más tiempo para completar su
desarrollo que a temperaturas inferiores. El peso es menor a temperaturas
inferiores que superiores, sin mostrar un patrón bien diferenciado. El aumento de
la temperatura durante desarrollo preimaginal aumenta el metabolismo y la tasa
de crecimiento, sin embargo implica una mayor mortalidad.
5.- El número de grados-días necesarios para el desarrollo completo de Hermetia
illucens varía con la calidad del medio larvario disponible y con la temperatura.
Las larvas desarrolladas sobre pienso compuesto (recurso de alta calidad)
requirieron un menor número de grados-día que las desarrolladas en carne de
cerdo (recurso de menor calidad). En cuanto a la temperatura, los grados-días
necesarios para completar el desarrollo o bien un estadio determinado es mayor a
30ºC que a 25ºC o 35ºC, salvo en las pupas, donde es mayor a 35ºC.
6.- Los imagos del sexo femenino, procedentes de larvas alimentadas
exclusivamente sobre harinas cárnicas poseen alta mortalidad, tiempo de
maduración elevado, un menor tamaño alar y menor desarrollo ovárico que los
alimentados con dietas a base de pienso compuesto. El desarrollo ovárico se
optimiza con una dieta combinada de pienso compuesto y harinas cárnicas,
mientras que el máximo tamaño y menor mortalidad se da en la dieta de pienso
compuesto.
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7.- La radiación global diaria, de origen natural, juega un papel muy importante
en la ovoposición de H. illucens; valores superiores a 600 W/m2 son necesarios
para optimizar la producción de huevos de los imagos.
8.- La densidad de imagos y el tamaño de las cajas de cría influyen en su
potencial de cría y producción masiva. Las relaciones óptimas para maximizar la
producción de huevos fueron cajas de cría de 40x40x40 cm (con 1.000 adultos) y
cajas de cría de 3 metros cúbicos (con 50.000 adultos). La optimización de dichas
cajas se consigue mediante el reemplazo de individuos quincenalmente, frente a
la introducción constante de individuos en periodos semanales, quincenales o
mensuales.
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