VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de Microbiólogo Industrial PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. 2007 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ APROBADO ___________________________ Fernando Murcia, Microbiólogo. Director VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ APROBADO ___________________________ Fernando Murcia, Microbiólogo. Director _____________________________ María Clara Méndez, Microbióloga Jurado _______________________ Adriana Páez, Microbióloga Jurado VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ APROBADO __________________________ Angela Umaña Muñoz, M. Phil Decana Académica _______________________ David Gómez Méndez, Msc Director de carrera TABLA DE CONTENIDO Pág. RESUMEN 1 1. INTRODUCCIÓN 2 2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA 5 2.1 Generalidades de la validación 2.1.1 Validación 7 8 2.1.2 Validación Primaria 10 2.1.3 Validación secundaria 11 2.1.4 Tipos de validación 11 2.1.4.1 Validación prospectiva 11 2.1.4.2 Validación retrospectiva 12 2.1.4.3 Validación concurrente 12 2.1.4.4 Revalidación 13 2.1.5 Parámetros analíticos para la validación de una técnica o método 14 2.1.5.1 Precisión 14 2.1.5.2 Selectividad 15 2.1.5.3 Especificidad 15 2.1.5.4 Linealidad 16 2.1.5.5 Exactitud 16 2.1.5.6 Estabilidad 16 2.1.5.7 Limite de detección 16 2.1.5.8 Limite de cuantificación 16 2.2 Microorganismos de estudio 17 2.2.1 Bacillus cereus 17 2.2.2 Staphylococcus aureus 19 2.3 Toma de muestras y análisis microbiológico de alimentos 21 2.3.1 Toma de muestras 21 2.3.2 Análisis microbiológico de alimentos 23 2.4 Recuento y siembra en placa por superficie 24 2.4.1 Método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus 24 2.4.2 Método de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus coagulasa positiva 2.5 Control en la validación de los métodos 25 26 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 28 4. OBJETIVOS 29 4.1 Objetivo general 29 4.2 Objetivos específicos 29 5. MATERIALES Y METODOS 30 5.1 Control de calidad de los medios de cultivo 30 5.2 Verificación del control de equipos 32 5.3 Control de ambientes 32 5.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie 33 5.4.1 Dilución y homogeneización de las muestras 33 5.4.2 Recuento en placa en superficie de Bacillus cereus 34 5.4.3 Recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus coagulasa positiva 5.4.4 Evaluación de la validación 5.5 Informe de resultados 6. RESULTADOS Y DISCUSION 34 35 36 37 6.1 Control de calidad de los medios de cultivo 37 6.2 Verificación del control de equipos 43 6.3 Control de ambientes 44 6.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie 45 6.4.1 Ensayos de validación para Bacillus cereus 47 6.4.1.1 Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus 47 6.4.1.2 Ensayos de reproducibilidad de Bacillus cereus 53 6.4.2 Ensayos de validación para Staphylococcus aureus coagulasa positiva 64 6.4.2.1 Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva 64 6.4.2.2 Ensayos de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva 69 7. CONCLUSIONES 82 8. RECOMENDACIONES 84 9. REFERENCIAS 85 8.1 Recursos Electrónicos 10. ANEXOS 89 90 LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al inicio del estudio 39 Tabla 2. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al finalizar el estudio 40 Tabla 3. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al inicio del estudio 41 Tabla 4. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al finalizar el estudio 41 Tabla 5. Recuento del control de ambientes 45 Tabla 6. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca 48 Tabla 7. Análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca 50 Tabla 8. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca 50 Tabla 9. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca 51 Tabla 10. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido 51 Tabla 11. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 53 Tabla 12. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 55 Tabla 13. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Bacillus cereus en muestra de albahaca 55 Tabla 14. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 56 Tabla 15. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 57 Tabla 16. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 59 Tabla 17. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 60 Tabla 18. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Bacillus cereus en muestra de albahaca 61 Tabla 19. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 62 Tabla 20. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 63 Tabla 21. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 64 Tabla 22. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda 67 Tabla 23. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 67 Tabla 24. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad para Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 67 Tabla 25. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida 68 Tabla 26. Resultados recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda a las diferentes horas evaluadas (ensayo de reproducibilidad 1) 70 Tabla 27. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 71 Tabla 28. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda 72 Tabla 29. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 73 Tabla 30. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 74 Tabla 31. Resultados de los recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 76 Tabla 32. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 77 Tabla 33. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Staphylococcus aureus en leche cruda 78 Tabla 34. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 79 Tabla 35. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 80 LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (Prueba) 40 Figura 2. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (interferente) 40 Figura 3. Método ecométrico agar TSA (control) 40 Figura 4. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (Prueba) 41 Figura 5. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (interferente) 42 Figura 6. Método ecométrico agar TSA (control) 42 Figura 7. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca 48 Figura 8. Crecimiento de Bacillus cereus en la prueba de repetibilidad 49 Figura 9. Confirmación bioquímica de Bacillus cereus con BBL Crystal 49 Figura 10. Prueba repetibilidad en arroz cocido 52 Figura 11. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus a las diferentes horas analizadas 54 Figura 12. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 1 54 Figura 13. Prueba reproducibilidad 1 en arroz cocido 58 Figura 14. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus realizado por diferentes analistas 59 Figura 15. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 2 60 Figura 16. Prueba reproducibilidad 2 en arroz cocido 63 Figura 17. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda 65 Figura 18. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda en la prueba de repetibilidad 66 Figura 19. Confirmación de Staphylococcus aureus coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus 66 Figura 20. Confirmación bioquímica de Staphylococcus aureus con BBL Crystal 66 Figura 21. Prueba repetibilidad en carne cocida 69 Figura 22. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus a las diferentes horas analizadas 70 Figura 23. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 1 71 Figura 24. Prueba reproducibilidad 1 en carne cocida 75 Figura 25. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus realizado por diferentes analistas 76 Figura 26. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 2 77 Figura 27. Prueba reproducibilidad 2 en carne cocida 81 LISTA DE ANEXOS Pág. Anexo 1. Certificados de calidad de las cepas ATCC 90 Anexo 2. Certificados de calidad de los medios de cultivo 93 Anexo 3. Certificados de calibración de los equipos 95 Anexo 4. Confirmación bioquímica por medio del kit de identificación rápida de microorganismos Gram positivos BBL Crystal 111 AGRADECIMIENTOS A Biotrends Laboratorios Ltda., por la financiación total del proyecto, en especial a la doctora Maria Clara Méndez y al doctor Fernando Murcia, por su valiosa colaboración; a todo el personal de Biotrends Laboratorios por su ayuda; a la profesora Lorena Valencia por su asesoría y al profesor Miguel Pinzón por su asesoría estadística. A mis padres por todo el apoyo que me han dado siempre. A mis hermanos por su ayuda y tolerancia. A Ana Maria, y a mis amigos, You know who you are. RESUMEN Con el fin de brindar una mayor calidad a los consumidores, las empresas productoras de alimentos deben realizar análisis microbiológicos y fisicoquímicos para determinar la confiabilidad del producto y verificar si aprueban los niveles de calidad exigidos para que dichos productos puedan ser comercializados. Por esta razón, es necesario que los laboratorios que llevan a cabo dichos análisis se comprometan a realizar los respectivos análisis teniendo como objetivo principal proporcionar resultados altamente confiables, razón por la cual, el laboratorio debe controlar y asegurar la calidad de sus resultados, lo cual radica principalmente en la alineación con parámetros nacionales e internacionales, para así poder garantizar un buen desarrollo del procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de las técnicas más utilizadas en el laboratorio. En este estudio se llevó a cabo la validación secundaria del método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras de albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus en muestras de leche cruda y carne cocida, debido a que es una de las técnicas más frecuentemente utilizadas en Biotrends Laboratorios Ltda. De esta forma, se obtuvieron resultados que permitieron validar esta técnica y que fueron analizados estadísticamente, entre los cuales se encontró un alto grado de concordancia en los coeficientes de variación de los diferentes ensayos de repetibilidad y reproducibilidad realizados. 1 1. INTRODUCCIÓN Las empresas productoras de alimentos deben brindar una mayor calidad a los consumidores, ya que los productos que estas elaboran pueden comprometer la salud de los mismos, razón por la cual es necesario llevar a cabo análisis microbiológicos y caracterización físico química para determinar la confiabilidad del producto y verificar si aprueban los niveles de calidad exigidos para que dichos productos puedan ser comercializados. Es por esta razón que se ha visto la necesidad de crear laboratorios de análisis de alimentos que lleven a cabo dichos análisis para determinar la calidad de los productos de las empresas o personas que los elaboran, y que además brinden asesoría en los respectivos análisis y en la implementación de un sistema de calidad en estas empresas productoras de alimentos. Estos laboratorios se deben comprometer a realizar los respectivos análisis teniendo como objetivo principal proporcionar resultados altamente confiables, los cuales dependerán del programa que se haya implementado en el laboratorio para garantizar la confiabilidad de los resultados finales emitidos; razón por la cual, el laboratorio, debe controlar y asegurar la calidad de sus resultados, entendiéndose calidad como el grado en el que un conjunto de características inherentes cumplen con los requisitos, lo cual radica principalmente en la alineación con parámetros nacionales e internacionales. Los programas de control interno de un laboratorio incluyen evaluación continua y/o monitoreos de los principales materiales y objetos que se utilizan dentro de los análisis, como medios de cultivo, reactivos, equipos o instrumentos, además de la validación de procedimientos técnicos y del 2 personal, también debe incluir manuales de procedimientos y documentación en general, para así poder garantizar un buen desarrollo del procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de las técnicas más utilizadas en el laboratorio. La validación de una técnica, es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio si las características de desempeño del método analítico cumplen los requerimientos para la aplicación analítica propuesta, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos, en la cual se determinarán las posibles variaciones que se presentan entre diferente número de ensayos, para así disminuir las posibilidades de error dentro del método, generando un alto grado de confianza en los resultados finales. Para realizar la validación de un método microbiológico se debe tener en cuenta la evaluación de los medios de cultivo a utilizar para la recuperación de la microflora bacteriana presente en el producto; también se debe llevar a cabo la calibración y verificación de los equipos que se utilizan en este tipo de técnicas, tales como: balanzas, micropipetas, incubadoras, autoclaves, etc. Además de realizar la evaluación de los analistas que efectúan dichos procedimientos a diario, así como el conocimiento de las técnicas que se desarrollan y si se han presentado modificaciones o no de estas dentro del laboratorio, para así poder llevar a cabo un proceso de validación secundaria, en el que se verifique que la técnica que ha sido desarrollada en otra parte se está realizando adecuadamente en el laboratorio. Esta validación de técnicas microbiológicas es de gran importancia, ya que permite emitir resultados confiables que garanticen que el proceso planificado se efectuará uniformemente en conformidad con los resultados previstos especificados, que conlleven a la toma de decisiones 3 adecuadas; además ayuda a la regulación y el cumplimiento de la normatividad gubernamental, a la reducción de costos en el laboratorio y como requisito para dar cumplimiento a la norma NTC ISO/IEC 17025 “Requisitos Generales para la competencia de laboratorios de Prueba y calibración”, la cual es de vital cumplimiento en el proceso de acreditación del laboratorio. 4 2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA El consumo de algunos alimentos representa un riesgo por la presencia de microorganismos patógenos, de sus toxinas, metabolitos tóxicos o por la de microorganismos capaces de deteriorar la calidad del alimento hasta un estado inaceptable. Por lo tanto, deben tenerse muy en cuenta los tipos de microorganismos presentes en el alimento y su número. Ciertos microorganismos simplemente alteran el producto, algunos pueden causar enfermedades y otros indican la posibilidad de que los alimentos estén contaminados por patógenos. A menudo, el riesgo de enfermedad alimentaria es tanto más elevado, conforme el patógeno va multiplicándose en el alimento y, por tanto, su número aumenta; al contrario el riesgo será menor si el microorganismo se multiplica escasamente en el alimento. En algunos casos el alimento solo actúa como vehiculo de transmisión del organismo infeccioso. La manipulación sufrida por un alimento durante su distribución, almacenamiento y preparación para el consumo puede provocar la disminución, mantenimiento o aumento del número de microorganismos presentes, mientras que las toxinas más lábiles se desactivan y las más resistentes se mantienen (ICMSF, 1999). Es por esto que se hace necesario llevar a cabo un análisis microbiológico de los alimentos, que asegure que estos son aptos para el consumo humano y que poseen las condiciones de calidad necesarias para cumplir con la normatividad gubernamental y así poder ser comercializados. El análisis microbiológico de alimentos permite valorar la carga microbiana que se encuentra en los diferentes productos, por esta razón se debe determinar en la industria cuales son los puntos de riesgo de contaminación o multiplicación microbiana (los puntos críticos del proceso) y evitarlos, siguiendo un código estricto de Buenas Practicas de Manufactura (BPM) y distribución del alimento (Decreto 3075, 1997). 5 La calidad del producto puede garantizarse, mediante la identificación y manejo de los diferentes puntos críticos de control que se dan en el proceso, de una correcta manipulación que dependerá de las buenas practicas de manufactura seguidas durante el proceso de producción, de un adecuado proceso de envasado o empaquetado, del transporte y de las características de almacenamiento del producto (Decreto 3075, 1997). Debido a la importancia de garantizar la calidad de los alimentos, es importante la verificación y validación de los procesos o técnicas de evaluación y diagnóstico de la calidad higiénica de estos, que proporcionen la confiabilidad de los productos de consumo, ya que los consumidores exigen cada vez más, atributos de calidad en los productos que adquieren para su consumo (Lightfoot & Maier, 2002). Estos atributos de calidad son los que el laboratorio debe demostrar mediante la implementación de un adecuado análisis microbiológico, en donde se verifiquen los procedimientos que se usan para tal fin, generando así confiabilidad por medio de técnicas reconocidas y validadas que se encuentren contempladas en las especificaciones técnicas propuestas por los entes reguladores, para así poder determinar si un producto es apto para salir o no al mercado, y si se encuentra bajo los más altos estándares de calidad; característica requerida para lograr mayor aceptación por parte del consumidor. El análisis microbiológico entonces, cobra gran importancia al ser un punto álgido en la elaboración y distribución de los alimentos, por esta razón el laboratorio encargado del análisis debe mantener estándares de calidad aceptables en el procesamiento de muestras y en los resultados que emitan sus técnicas para garantizar la seguridad e inocuidad de los alimentos que sus clientes producen y/o distribuyen (ICMSF, 2000). Sin embargo, la exactitud y precisión de los resultados microbiológicos no solo dependen de los métodos utilizados y de la competencia del personal 6 del laboratorio, sino también del correcto funcionamiento de los equipos empleados (Lightfoot & Maier, 2002). La garantía de calidad en un laboratorio debe tomarse como un programa para identificar el origen de las variaciones significativas y para minimizar o aminorar sus efectos sobre la fiabilidad de los resultados analíticos. Sus objetivos son: 1. Estandarizar los métodos y prácticas del laboratorio. 2. Lograr que su funcionamiento sea comparable, no solo entre analistas individuales dentro de un mismo laboratorio, sino también entre distintos laboratorios que realizan el mismo tipo de análisis y examinan la misma clase de alimentos. 3. Impedir que informes de laboratorio inexactos o en los que no se pueda confiar sean utilizados para decidir si un producto se ajusta a las especificaciones aplicables a la industria o cumple los requisitos legales (ICMSF, 2000). 2.1 Generalidades de la validación Un adecuado proceso de validación debe desarrollarse dentro del marco de buenas prácticas de manufactura, ya que garantizan la seguridad de los datos obtenidos para poder así juzgar sobre la seguridad de un producto, permitiendo obtener una documentación confiable y segura, además, la validación permite obtener una optimización y estandarización de procesos al disminuir el tiempo muerto, reducir costos y la probabilidad de fallas (Medina & Quintana, 2002). 7 2.1.1 Validación Es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada que un proceso específico producirá de forma consistente y permanente productos que poseerán las características de calidad predefinidas (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). Es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio que las características de desempeño del método analítico cumplen los requerimientos para la aplicación analítica propuesta (USP XXVI, 2003), es decir, para detectar o cuantificar grupos microbianos específicos como es el caso, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos. Para validar un proceso se deben realizar sistemáticamente los procedimientos de puesta a punto del mismo, mediante el seguimiento de las siguientes fases: Planificación: Se busca establecer programas temporales y listas de verificación, protocolos de la validación con criterios de aceptación/rechazo, necesidades de recursos, análisis de riesgos, etc. (European Commission, 2001). Calificación del diseño: El primer elemento de la validación es la evaluación de nuevas instalaciones, sistemas o equipos. Se deberá demostrar y documentar la adecuación del diseño a las normas de correcta fabricación (European Commission, 2001). Calificación de la instalación: La calificación de la instalación busca establecer por evidencia objetiva que todos los aspectos claves del equipo de proceso y la instalación de 8 sistemas auxiliares cumplan con las especificaciones aprobadas del fabricante y las recomendaciones del abastecedor del equipo para el correcto funcionamiento, y las exigencias de mantenimiento de este. Además de esto, también se incluyen requisitos de calibración y verificación de los materiales de construcción (European Commission, 2001). Calificación del funcionamiento: Esta calificación deberá realizarse tras la calificación de la instalación, y busca establecer por medio de evidencia objetiva los límites de control de proceso y los niveles de acción que resultan en un producto que cumpla con todos los requerimientos predeterminados. Debe incluir: (a) Ensayos que hayan desarrollado especialistas con conocimiento sobre procesos, sistemas y equipos. (b) Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que abarquen los límites máximos y mínimos de trabajo, condiciones denominadas como frecuencia “caso más desfavorable”. La finalización de forma satisfactoria de la calificación del funcionamiento permitirá terminar los procedimientos de calibración, fabricación y limpieza, la formación del operario y las exigencias de mantenimiento preventivo. Así, permitirá la aprobación formal de las instalaciones, sistemas y equipos (European Commission, 2001). Calificación de desempeño: La calificación de desempeño deberá efectuarse una vez realizadas satisfactoriamente la calificación de la instalación y de funcionamiento. Esta proveerá evidencia documentada, bajo condiciones anticipadas, que 9 se produce de manera consistente un producto que cumpla con las especificaciones y el criterio de diseño (European Commission, 2001). La calificación de la ejecución del proceso incluirá, entre otras cosas, lo siguiente: (a) Ensayos, empleando materiales de producción (o componentes sustitutivos calificados y/o simulaciones de productos), que se hayan desarrollado a partir del conocimiento especializado sobre los procesos y las instalaciones, sistemas o equipos. (b) Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que abarquen los límites máximos y mínimos de funcionamiento (European Commission, 2001). 2.1.2 Validación primaria La validación primaria es un proceso exploratorio que tiene como metas establecer los límites operacionales y las características de desempeño de un método nuevo, modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debe dar origen a especificaciones numéricas y descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y precisa del objeto de interés. Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de esquemas de ensayo especialmente diseñados. Los laboratorios que desarrollan un método “en casa” o una variante de una norma existente deben realizar los pasos de la validación primaria (GTC 84, 2003). 10 2.1.3 Validación secundaria La validación secundaria tiene lugar cuando un laboratorio procede a implementar un método desarrollado en otra parte. Esta validación se centra en la reunión de evidencia acerca de que el laboratorio está en capacidad de cumplir las especificaciones establecidas en la validación primaria. Suele llamarse verificación; y es la confirmación, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos establecidos (ISO 9000, 2000). Normalmente, la validación secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas de los mismos procedimientos empleados en la validación primaria, aunque posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el material de ensayo óptimo y el trabajo solo requiere tratar el procedimiento dentro de los límites operacionales establecidos por la validación primaria (GTC 84, 2003). Para un laboratorio de análisis es importante validar sus técnicas para así optimizar sus procesos, al mejorar el uso de equipos y de personal de laboratorio y eliminar los tiempos muertos, lo cual genera confiabilidad en los resultados, lo que a su vez implica reducción en los gastos (PDA Suggested Revision, 2000). Así mismo sirve para dar cumplimiento a las normas legales pertinentes o a normas internacionales de calidad, contribuyendo a la credibilidad del laboratorio y a obtener altos niveles de calidad que generen confianza dentro de sus clientes. 2.1.4 Tipos de validación 2.1.4.1 Validación prospectiva Este tipo de validación se basa en información obtenida antes de implantar el proceso de validación. Se debe realizar un análisis de riesgos para determinar si podrían conducir a situaciones críticas; se investigan 11 posibles causas y se determina la probabilidad de que suceda. Luego se efectúan los ensayos y se hace una valoración general; si los resultados son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva validación demuestre su carácter satisfactorio (European Commission, 2001). 2.1.4.2 Validación retrospectiva Este tipo de validación involucra la revisión y análisis de la información histórica del proceso para proveer de la evidencia documentada necesaria que el proceso está haciendo lo que debe hacer. Los pasos involucrados en este tipo de validación requieren la preparación de un protocolo específico, el reporte de los resultados de los datos analizados que conlleven a unas conclusiones y recomendaciones (PDA Suggested Revision, 2000), (WHO, 1997). Este tipo de validación solo es aceptable para procesos bien establecidos y sería inapropiado si recientemente se hubieran realizado cambios en la composición del producto, en los procedimientos de operación o en los equipos (PDA Suggested Revision, 2000), por lo tanto, nunca se debe aplicar a nuevos procesos o productos. Esta validación puede ser útil en el establecimiento de las prioridades en un programa de validación (WHO, 1997). Dentro de la validación retrospectiva es necesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles ambientales, controles microbiológicos, equipos, procedimientos, especificaciones y métodos analíticos (European Commission, 2001). 2.1.4.3 Validación concurrente Este tipo de validación sirve para demostrar y establecer evidencia documentada que un proceso hace lo que debe hacer basado en 12 información generada durante una implementación real del proceso. La validación concurrente es muy utilizada cuando se ha variado alguna etapa del proceso. Esta da una información muy valiosa para modificar y corregir el proceso. Podría considerarse como una evaluación continua del proceso, mientras se controla al máximo para procurar que el producto o resultado final sea correcto (ISO 14000, 1996). Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las variables críticas que demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en estado productivo. Sin embargo, cada aproximación tiene sus características y limitaciones y por lo tanto, antes de desarrollar una validación deberá evaluarse qué tipo de validación puede dar la mayor información sobre la seguridad y la estabilidad del proceso (García, 2001). 2.1.4.4 Revalidación Se aplica cuando se presenta el cambio de uno de los componentes críticos de la formulación, cambio o reemplazo de una pieza crítica en un sistema o equipo o cambio en instalaciones. La revalidación periódica se presenta cuando los procesos experimentan cambios graduales (European Commission, 2001). Es la repetición de un procedimiento de validación o un procedimiento del mismo. Esto no significa que el programa original deba ser repetido, pues la revalidación se efectúa para asegurar que los cambios intencionales o no intencionales en los procesos no afecten las características del proceso ni la calidad del producto (European Commission, 2001), (WHO, 1997). 13 2.1.5 Parámetros analíticos para la validación de una técnica o método Son las propiedades, características o capacidades del método que indican su grado de calidad en cuanto a exactitud, exactitud relativa, desviación, desviación positiva, desviación negativa, efecto matricial, repetibilidad, precisión intermedia, reproducibilidad, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, rango, sensibilidad, fortaleza y solidez y robustez, entre otras características (OGA-016, 2005). 2.1.5.1 Precisión Se relaciona con la dispersión de la medida alrededor de un valor medio o central, que puede ser expresada en términos de varianza, desviación estándar o coeficiente de variación. La precisión puede ser considerada a tres niveles: repetibilidad, reproducibilidad y solidez y robustez (OGA-016, 2005). - Repetibilidad Medida de la precisión del método cuando se realizan mediciones sucesivas por el mismo analista el mismo día, mismos reactivos, mismo instrumento y condiciones de medición (precisión dentro del ensayo). Por mediciones sucesivas se entiende aquellas mediciones repetidas dentro de un corto periodo de tiempo (OGA-016, 2005), (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). - Reproducibilidad Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo analito realizadas en diferentes condiciones de medición. Una declaración válida de reproducibilidad requiere que se especifiquen los cambios en las condiciones del análisis o calibración. Estos cambios pueden incluir: el principio en que se basa la medición, el método, analista/observador e 14 instrumento, material y patrones de referencia, ubicación, condiciones de uso y tiempo. La reproducibilidad puede ser expresada cuantitativamente en términos de los parámetros de dispersión de los resultados (desviación estándar, varianza, coeficiente de variación) (OGA-016, 2005). La reproducibilidad intra-laboratorio es uno de los principales objetivos de los programas internos de aseguramiento de la calidad. Garantiza que un laboratorio es capaz de producir resultados constantes a lo largo del tiempo (Lightfoot & Maier, 2002). - Solidez y robustez Busca demostrar la veracidad de un análisis con respecto a variaciones deliberadas en parámetros del método. Examina el efecto que las condiciones operacionales y del medio ambiente tienen sobre los resultados del análisis (diferentes temperaturas y porcentaje de humedad, analistas con diferente experiencia, instrumentos y reactivos de diferentes marcas). Se determina analizando muestras provenientes de un lote homogéneo por diferentes analistas y que el procedimiento analítico no se vea afectado por estas variaciones deliberadas (OGA-016, 2005). 2.1.5.2 Selectividad Se define un método selectivo como aquel que produce resultados exactos para todos los analitos de interés (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). 2.1.5.3 Especificidad Es la capacidad del método para diferenciar precisa y específicamente el compuesto de interés, en presencia de los demás componentes, que se espera estén presentes en la matriz de la muestra (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). La especificidad se puede estudiar agregando a la muestra algunas sustancias que se sospecha que reaccionan de la misma manera que el componente estudiado y comparar 15 estadísticamente los resultados analíticos con y sin agregado (OGA-016, 2005). 2.1.5.4 Linealidad Tiene que ver con la proporcionalidad entre la concentración del analito y su respuesta, es decir, si la técnica o método produce resultados directa o indirectamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito, dentro de un intervalo determinado (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). 2.1.5.5 Exactitud Es el grado de concordancia entre el valor aceptado como un valor verdadero convencional, o un valor de referencia, y el valor encontrado (OGA-016, 2005). Se conoce también como error sistemático o sesgo. 2.1.5.6 Estabilidad La estabilidad se considera adecuada si la desviación estándar relativa calculada en los resultados obtenidos en diferentes intervalos de tiempo, no excede el 20% del valor correspondiente de la precisión del sistema (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). 2.1.5.7 Límite de detección Concentración mínima del analito que puede detectarse en una muestra, pero no es necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas específicas (OGA-016, 2005). 2.1.5.8 Límite de cuantificación Corresponde a la concentración mínima del analito que puede ser cuantificada con una exactitud y precisión aceptable en una muestra bajo condiciones analíticas específicas (OGA-016, 2005). 16 2.2 Microorganismos de estudio El análisis rutinario de los alimentos para poner de manifiesto un amplio rango de bacterias patógenas resultaría poco práctico para la mayoría de las industrias. Es por esto que se ha convertido en práctica corriente investigar en los alimentos la presencia de grupos indicadores que determinen la posibilidad de la existencia de microorganismos causantes de intoxicaciones o de otros riesgos asociados con el crecimiento microbiano (Hayes, 1993). Entre los microorganismos que se usan como indicadores se encuentran las bacterias mesófilas esporuladas, de las cuales hace parte Bacillus cereus, que revelan un tratamiento térmico insuficiente de los alimentos enlatados o de un almacenamiento prolongado sin refrigeración de los alimentos cocinados, tales como la carne y el arroz. También se puede mencionar como indicador a Staphylococcus aureus, cuya presencia en los alimentos se interpreta como indicativo de contaminación a partir de la piel, la boca y las fosas nasales de los manipuladores de alimentos, ya que el material y equipo sucios y las materias primas de origen animal pueden ser también la fuente de la contaminación (ICMSF, 2000). 2.2.1 Bacillus cereus Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, móvil, esporoformador, aerobio. Común en el suelo, en los vegetales, en los alimentos crudos y procesados. Puede producir intoxicación alimentaria generalmente de curso leve, que no suele durar más de 12 - 24 horas (ICMSF, 2000). Bacillus cereus causa dos tipos diferentes de intoxicación por alimentos: el tipo diarreico y el tipo emético (Sarrías et al., 2002). El tipo diarreico de intoxicación alimentaria es causado por las enterotoxinas producidas durante el crecimiento vegetativo de B. cereus en el intestino delgado, y los alimentos asociados más frecuentemente a este tipo de enfermedad son los postres, carnes y los productos lácteos; mientras que la toxina 17 emética, que causa vómito, es producida por las células que crecen en el alimento. El arroz es el vehículo de intoxicación más común por este tipo de toxina. Para ambos tipos de intoxicaciones, los alimentos implicados usualmente han sido calentados, y las esporas sobrevivientes han sido la fuente de la enfermedad. Carlin et al. (2006), evaluaron los riesgos de la producción de la toxina emética en ciertos tipos de alimentos, encontrando que la poca habilidad de crecer a bajas temperaturas demuestra que las cepas de B. cereus productoras de la toxina emética representan un bajo riesgo en alimentos refrigerados. Por el contrario, la notable resistencia de sus esporas a altas temperaturas favorece su crecimiento en alimentos calentados cuando estos son dejados a temperatura ambiente por más de 2 horas. Las esporas de B. cereus son un factor importante en las enfermedades transmitidas por alimentos, ya que estas son mas hidrofóbicas que otras esporas de Bacillus spp., lo cual permite que estas se adhieran a varios tipos de superficies. De aquí que sean difíciles de remover de equipos durante la limpieza, pues estas poseen apéndices y/o pilis que están, en menor parte, involucrados en la adhesión. Estas propiedades de adherencia no solo permiten que las esporas resistan los procedimientos normales de saneamiento, y así contaminar los alimentos durante el procesamiento, sino que ayudan a que se unan a las células epiteliales (Doyle, 1997). B. cereus no es un microorganismo competitivo, pero crece bien después de cocinar el alimento y dejarlo enfriar (< 48° C). El tratamiento con calor causa la germinación de las esporas y, en ausencia de flora competitiva, B. cereus crece óptimamente (Doyle, 1997). B. cereus es un microorganismo común del suelo y se propaga fácilmente a muchos tipos de alimentos, especialmente los de origen vegetal, pero también es aislado normalmente de carne, huevos, leche cruda y productos lácteos debido a procesos de contaminación cruzada. Estos últimos, además del 18 arroz y las especias, están entre los alimentos que más frecuentemente se contaminan con B. cereus. Bacillus cereus produce intoxicaciones alimentarias solamente cuando el alimento ingerido contiene números muy elevados de células, generalmente superiores a 107 UFC/g o ml. Por ello, el recuento de B. cereus es el factor decisivo a la hora de evaluar el significado de este microorganismo en los alimentos (ICMSF, 2000). Sin embargo, las enfermedades causadas por B. cereus no son muy reportadas, pues ambos casos de intoxicaciones son relativamente poco agresivas y usualmente duran menos de 24 horas (Doyle, 1997). 2.2.2 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo, inmóvil que forma agrupaciones irregulares de células usualmente parecidas a los racimos de uvas. Son anaerobios facultativos, pero crecen mejor en presencia de aire, siendo su temperatura óptima de crecimiento los 37° C, pero desarrollándose hasta los 10° C o ligeramente menos (Hayes, 1993). La intoxicación alimentaria estafilocócica es un síndrome caracterizado por nauseas, vómitos, diarrea, malestar y debilidad general. Los síntomas comienzan a manifestarse de 1 a 6 horas después de consumido el alimento (ICMSF, 2000). S. aureus ha sido ampliamente caracterizado, ya que se sabe que este microorganismo produce una gran variedad de productos extracelulares. Muchos de ellos, como las enterotoxinas estafilococales (SE en inglés), son factores virulentos que han estado implicados en enfermedades de humanos y animales. Estas enterotoxinas elaboran un juego de propiedades biológicas que causan al menos dos enfermedades humanas comunes, síndrome de shock tóxico (TSS en inglés) e intoxicaciones 19 debidas a Staphylococcus en alimentos (Doyle, 1997). Si en un alimento asociado a un brote es identificado S. aureus, también se debe estudiar la producción de enterotoxinas, lo cual incrementa la complejidad del ensayo, ya que es usual que S. aureus produzca una o más toxinas simultáneamente. Comúnmente, las SE han sido divididas en cinco grandes clases serológicas (SE A, SE B, SE C, SE D, SE E) debido a sus propiedades antigénicas, pero en los últimos años se han identificado nueve clases más (SE G hasta SE O). Siendo la SE A la enterotoxina más comúnmente recuperada de brotes de enfermedades transmitidas por alimentos (Aznar et al., 2005). Las intoxicaciones debidas a Staphylococcus en alimentos están clasificadas como unas de las causas más prevalentes de gastroenteritis en el mundo. Esto se debe a la ingestión de una o más enterotoxinas estafilocócicas preformadas en alimentos contaminados por miembros del género Staphylococcus, en donde predomina Staphylococcus aureus (Doyle, 1997). La principal fuente de contaminación de los alimentos por Staphylococcus se debe a la manipulación de estos por parte de personas contaminadas, ya que los humanos son el principal reservorio de este microorganismo. Si bien muchas especies del género Staphylococcus se consideran habitantes normales del cuerpo humano, S. aureus es el patógeno más destacado. En los humanos, las fosas nasales son los sitios de colonización predominantes, aunque se pueden encontrar células de S. aureus en diferentes sitios de la piel. La diseminación de S. aureus entre humanos y de los humanos a los alimentos puede ocurrir por contacto directo o indirectamente por fragmentos de piel (Doyle, 1997). Algunas propiedades únicas de resistencia de S. aureus facilitan la contaminación y crecimiento en alimentos. Afuera del cuerpo humano, 20 S. aureus es uno de los patógenos humanos no esporoformador más resistente, pues puede sobrevivir por extensos periodos de tiempo. Es por esto que para algunos alimentos procesados o tratados, S. aureus es un buen indicador del grado de contacto humano, o con alimentos naturales no tratados de origen animal dentro de la fábrica de alimentos (ICMSF, 2000). Por tal razón, se debe realizar la búsqueda de S. aureus; pues su presencia indica insuficiencia en los tratamientos con calor como pasteurización de la leche o cocción de la carne y en el uso de agentes químicos sanitizantes que generalmente destruyen a este microorganismo (Ingham & Schoeller, 2001). Los factores que originan las enfermedades transmitidas por alimentos debido a la contaminación de estos por S. aureus son: a) Refrigeración inadecuada. b) Poca higiene personal (no lavar las manos o los instrumentos apropiadamente o no usar tapabocas). c) Cocción o calentamiento inadecuados de los alimentos. d) Uso prolongado de platos para calentar cuando se sirven los alimentos, una práctica que promueve el crecimiento del microorganismo y la producción de enterotoxinas (Doyle, 1997). 2.3 Toma de muestras y análisis microbiológico de alimentos 2.3.1 Toma de muestras La calidad del informe final emitido por un laboratorio dependerá directamente de la calidad de la muestra recogida y analizada. Los análisis se solicitan para obtener una respuesta a una demanda específica, por lo que deben ser realizados sobre muestras recogidas de forma correcta y aplicando las técnicas más adecuadas para obtener resultados representativos. Para cumplir este objetivo se debe seguir un 21 adecuado plan de toma de muestras (Lightfoot & Maier, 2002). Los criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento porque son diferentes los microorganismos patógenos y alterantes de cada tipo de alimento (Romero, 2005). El factor más importante en el análisis es el muestreo, el cual incluye: a) evaluación de la muestra necesaria para evitar la distorsión producida por los microorganismos presentes en las diferentes partes de la superficie (canales, máquinas, platos, etc.); b) determinación del modo óptimo de remoción del microorganismo de la muestra o lugar de muestro y c) eliminación del riesgo de la contaminación ambiental durante la toma o transporte de muestras (Romero, 2005). En cuanto al transporte de muestras, es importante evitar que durante el tiempo que este va a durar se produzca una multiplicación de los microorganismos presentes o por el contrario, inactivación de algún microorganismo (Romero, 2005). Para conseguir este objetivo, la muestra debe ser protegida de los rayos ultravioletas, luz visible y las altas temperaturas. Esto se consigue utilizando recipientes isotérmicos refrigerados con bolsas de hielo o cualquier otro sistema adecuado (Lightfoot & Maier, 2002). En el momento de tomar las muestras es muy importante evitar sesgos y propensiones, y obtener un número suficiente de unidades de muestra para poder confiar en el juicio derivado de su análisis. El muestreo aleatorio es el método más reconocido para evitar subjetividades y proporciona mejores resultados que intentar recoger, de forma consciente, unidades de muestra de varias partes de un lote. Aunque no hay garantía de que la muestra elegida con los números aleatorios tenga las mismas características que el lote, es más probable que las tenga, que si las muestras no se hubieran tomado aleatoriamente (ICMSF, 1999). 22 2.3.2 Análisis microbiológico de alimentos El análisis microbiológico en la industria de alimentos, se constituye en una herramienta básica para el control de materias primas, procesos, productos y manipuladores, ya que permite establecer el grado de contaminación biológica de estos, por esta razón el control microbiológico es parte fundamental de todo el proceso (Carrascal, et al., 2003). Los principales objetivos del análisis microbiológico son: - Asegurar que el alimento cumpla con las normas estatutarias. - Que se ajuste a normas internas establecidas por la empresa que los procesa y a las que exige el comprador. - Que las materias alimenticias que llegan a la fábrica para ser procesadas cumplan las normas exigidas y las pactadas con el productor. - Que se mantenga el control del proceso y la higiene de la línea de fabricación (Hayes, 1993). Los métodos de examen microbiológico utilizados para controlar la calidad del alimento son en sí mismos muy variados y dependientes, en gran parte del alimento que va a ser analizado (Soler, 2006). Para el análisis microbiológico se debe tomar un peso conocido del alimento (10 o 25 g). El alimento se debe adicionar en un diluyente como agua peptonada al 0.1%. El tratamiento implica una homogenización mecánica o en el Stomacher. El volumen de diluyente utilizado generalmente es nueve veces mayor que la muestra; para 25 g se utilizan 225 ml de diluyente de forma que se obtenga un homogeneizado de dilución 10-1, a partir de la cual se preparan las correspondientes diluciones seriadas en base 10, dependiendo de la calidad microbiológica del producto objeto de análisis (Hayes, 1993). 23 2.4 Recuento y siembra en placa por superficie Cada tipo de recuento de microorganismos viables es potencialmente útil para fines específicos. Los recuentos de bacterias viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas de agar que han sido previamente inoculadas con cantidades conocidas del alimento diluido e incubadas en condiciones ambientales predeterminadas. Tales recuentos se denominan, en algunos casos con evidente error, recuentos totales en placa, cuando en realidad únicamente pueden contarse aquellas bacterias que pueden crecer en las condiciones ambientales elegidas; pues se pueden cambiar las condiciones ambientales, las de incubación, la composición del medio de cultivo (añadiendo inhibidores selectivos al medio o agentes con actividad de superficie o colorantes) favoreciendo así el crecimiento de unos u otros microorganismos (ICMSF, 1999). 2.4.1 Método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus -Sembrar por triplicado 0.1 ml de muestra líquida o 0.1 ml de dilución madre a placas de Agar Bacillus cereus. -Extender con un asa estéril sobre el agar. -Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales. -Tapar y dejar absorber durante unos 15 minutos a temperatura ambiente. -Incubar a 35° C ± 2° C durante 18 h – 24 h (+ 24 horas si es necesario). Recuento: Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que no fermentan manitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado) (Holguín et al., 1998), (Allaert & Escolá, 2002). 24 Además de Bacillus cereus, otras especies dan reacciones positivas o débilmente positivas en medios con yema de huevo. La actividad hemolítica no es exclusiva de Bacillus cereus. Por estas razones, deben someterse a confirmación colonias representativas procedentes del medio (ICMSF, 2000). 2.4.2 Método de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus coagulasa positiva Sembrar por triplicado 0.1 ml de la muestra líquida o 0.1 ml de dilución madre en placas de petri con medio Baird Parker. Extender con un asa estéril sobre el agar. Repetir esta operación con 0.1 ml de cada una de las siguientes diluciones decimales. Tapar y dejar absorber durante 15 minutos a temperatura ambiente. Incubar a 37° C ± 2° C durante 18 h – 24 h. Recuento: Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias características (de 1 a 1.5 mm de diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara). Incubar durante 24 h ± 2 h más. Marcar las colonias características (de 1.5 a 2.5 mm de diámetro; parte de la zona clara puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias), y también las colonias no características (estas pueden no tener zona clara). Retener las placas que tengan un máximo de 300 colonias, con 150 colonias características y no características al nivel de dos diluciones sucesivas (Holguín et al., 1998), (Allaert & Escolá, 2002). 25 A las colonias presuntivas de S. aureus, realizarles el test de confirmación de coagulasa por medio del kit Slidex Staph plus, el cual es una prueba para evidenciar la rápida combinación de látex y eritrocitos; desarrollado para detectar el factor de aglutinamiento, proteína A y un inmunógeno específico de superficie para S. aureus (Wichelhaus, 1999). 2.5 Control en la validación de los métodos El método de recuento y siembra en placa provee un estimado de la posible contaminación de un alimento, este estimado tiene sus bases en principios científicos, que involucran la incorporación de controles de cada uno de los lotes y de todas las pruebas (Akers, 1998). Estos controles son los estipulados en las buenas prácticas de laboratorio (BPL) e incluyen medio ambiente, analista y condiciones de esterilización empleadas durante la elaboración, ensayo o análisis. Los controles en las pruebas de siembra en placa son: Control positivo del medio de cultivo: verificar la capacidad del medio de cultivo de recuperación del microorganismo para el cual esta diseñado. Control negativo del medio de cultivo: probar la esterilidad del medio. Controles específicos: control de ambientes, analista, empaques, agua peptonada, etc. (Romero, 2005). Por lo anterior y como norma general conviene probar experimentalmente los medios usados para determinar su selectividad y su productividad; así como no debe usarse un medio diseñado para un producto en otro producto diferente porque las condiciones ecológicas pueden ser diferentes dando lugar a una distorsión de los resultados (Romero, 2005). Dada la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los medios de cultivo, tanto los generales como los selectivos, es necesario hacer controles periódicos que permitan comprobar tanto que las bacterias a diagnosticar crecen incluso a partir de células aisladas, como 26 que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas. Este tipo de control de los medios de cultivo se denomina ensayo ecométrico (Doyle, et al., 1997). El medio de cultivo debe proveer los requerimientos nutricionales básicos para el crecimiento de los microorganismos, por lo tanto, debe cumplir con dos características fundamentales: la selectividad y la productividad. La selectividad hace referencia a la composición básica del medio que favorece el crecimiento de la cepa esperada con las características propias de su especie, además permite evaluar el equilibrio nutricional pertinente para cada especie, mientras que la productividad se ocupa de la formulación del medio con respecto a los inhibidores del crecimiento de flora acompañante, indeseable en un análisis especifico y que obedezca a factores externos al análisis del alimento. El fundamento de la técnica es establecer la eficiencia con la cual un medio de cultivo sirve para recuperar una cepa, mediante la comparación que se realiza entre un microorganismo que crece fácilmente en un medio (de referencia) y un microorganismo que se espera no crezca debido a la composición del medio (interferente) (Romero, 2005). 27 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN Los laboratorios de análisis microbiológico buscan realizar procedimientos e implementar técnicas que permitan generar resultados altamente confiables, para satisfacer las necesidades de los clientes, autoridades reglamentarias u organizaciones que otorgan reconocimiento, mediante procesos de planificación, que se efectuarán uniformemente en conformidad con los resultados previstos, y originarán una reducción de tiempo y de costos, para poder así cumplir con las especificaciones del cliente, con los requisitos exigidos por la normatividad nacional y con aquellas normas internacionales que les pueden dar un reconocimiento, como la norma NTC ISO/IEC 17025. Debido a lo anterior, se debe tener en cuenta una variedad de procedimientos a seguir, dentro de los que se encuentra la estandarización, documentación y validación de técnicas y/o métodos que se llevan a cabo dentro del laboratorio de análisis microbiológico Biotrends Laboratorios Ltda., para verificar que estos cumplen los requerimientos para la aplicación analítica propuesta, es decir, para detectar o cuantificar grupos microbianos específicos, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos. Por tal razón, es necesario implementar una validación de los métodos analíticos utilizados más frecuentemente en Biotrends Laboratorios Ltda., como lo son los análisis de detección de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en muestras de alimentos por medio del método de recuento en placa en superficie, ya que son análisis que se llevan a cabo diariamente en el laboratorio para evaluar la calidad de los alimentos, materias primas, productos en proceso, producto terminado; o en análisis de operarios y superficies de acuerdo a la especificación técnica de cada producto o análisis. 28 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo General Realizar la validación secundaria concurrente del método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en muestras de albahaca, arroz cocido, leche cruda y carne cocida. 4.2 Objetivos Específicos • Evaluar la repetibilidad y reproducibilidad (estudio r y R) de la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras de albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus en muestras de leche cruda y carne cocida, mediante repeticiones sucesivas realizadas en diferentes condiciones de medición. • Realizar la evaluación de selectividad y especificidad de la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus. • Evaluar los parámetros estadísticos de la validación de la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus. • Evaluar la calidad de los medios de cultivo a utilizar en el análisis, por medio de pruebas de esterilidad, pruebas de selectividad y productividad (ensayo ecométrico) y control de pH. • Realizar un análisis de control de datos de los resultados obtenidos durante el estudio. 29 5. MATERIALES Y MÉTODOS Para llevar a cabo la validación secundaria del método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en muestras de alimentos, fue necesario realizar un control de la calidad de los medios de cultivo que se trabajaron y se realizó la verificación del estado de los equipos. A los productos analizados (albahaca, arroz cocido, leche cruda y carne cocida) se les realizó el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus de acuerdo con la propuesta por Holguín et al., (1998). De la misma forma, se evaluó la repetibilidad y reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en superficie de estos microorganismos, además de evaluar la selectividad, la especificidad y los demás parámetros estadísticos de la validación. Este proyecto se realizó en las instalaciones de Biotrends Laboratorios Ltda., ubicado en la ciudad de Bogotá D.C. 5.1 Control de calidad de los medios de cultivo A los medios de cultivo utilizados en el estudio se les realizaron diferentes controles para asegurar que estuvieran en óptimas condiciones. Estos controles fueron: control de esterilidad, control de pH a 25° C, control macroscópico y un control para medir la productividad y selectividad por medio del método ecométrico. • Control de esterilidad: de cada lote disponible se eligió al azar un 2% de la totalidad de las cajas servidas con el medio de cultivo y se llevaron a incubación durante 48 horas a 35 ± 1° C, para verificar que no se presentara crecimiento de ningún tipo en las cajas (Allaert & Escolá, 2002). 30 • Control de pH a 25° C: se tomó una muestra del medio de cultivo y con un pH-metro se realizó una medición del medio a una temperatura de 25° C. El valor de pH obtenido para los medios de cultivo debe corresponder con el indicado en la ficha técnica del medio, donde se da un intervalo de aceptación de ± 0.2 (Allaert & Escolá, 2002). • Control macroscópico: se realizó un examen visual para poder descartar cualquier error importante en la preparación del medio. Se observó si su consistencia (sólida), su color o aspecto corresponden con los que indica la ficha técnica de estos (Allaert & Escolá, 2002). • Método ecométrico: este control se realizó para comprobar la eficacia del medio de cultivo. Para realizar este método se preparó una suspensión de un microorganismo blanco y otro interferente a una concentración igual al tubo 1 de Mc Farland (3 x 108 UFC/ ml). Para lo cual se tomó una asada de los microorganismos de prueba (Bacillus cereus ATCC 11778 y Staphylococcus aureus ATCC 6538) y el microorganismo interferente (Escherichia coli ATCC 8739) (anexo 1) previamente crecidos en un medio de cultivo nutritivo y resuspendidos en solución salina, hasta alcanzar un patrón de turbidez igual al mencionado. Posteriormente se tomaron los medios para evaluar a los microorganismos de prueba (agar Bacillus cereus y agar Baird Parker), y al microorganismo interferente (en los mismos medios de cultivo) y como control se sembraron los microorganismos de prueba en agar Tripticasa Soya, para verificar su crecimiento. Luego se dividieron en cuatro cuadrantes y con un asa calibrada se tomó el microorganismo indicado y se trazaron cinco estrías en la superficie del medio de forma paralela por cuadrante y una central sin voltear ni retomar 31 muestra sobre el medio de prueba, interferente y de control para cada microorganismo (Lightfoot & Maier, 2002). Se realizaron dos repeticiones del método ecométrico para evaluar los medios de cultivo (mismos lotes), una al comienzo y otra al finalizar el estudio Se realizó además una revisión de la fecha de caducidad de cada uno de los medios de cultivo utilizados. Después de la preparación, cada caja con el medio se etiquetó con la fecha y hora de preparación, además de la persona encargada y estas se almacenaron a 4° C por periodos no mayores a 8 días. 5.2 Verificación del control de equipos Se revisó el historial de los equipos involucrados en el estudio incluyendo certificados de calibración, mantenimiento y registros de su uso en los últimos meses. 5.3 Control de ambientes Empleando la técnica de sedimentación, se colocaron cajas abiertas con medio de cultivo para microorganismos mesófilos (TSA) y para hongos y levaduras (Sabouraud) en diferentes puntos del cuarto de siembra durante un periodo de 15 minutos. Posteriormente las cajas se llevaron a incubar a una temperatura de 35 ± 2° C durante 48 horas para mesófilos y a 22 ± 2° C durante 5 días para hongos y levaduras. Este control se llevó a cabo durante todas las pruebas realizadas. 32 5.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie La metodología para realizar los análisis de alimentos en el laboratorio se llevó a cabo de acuerdo al protocolo descrito por Holguín et al., (1998). Se tomaron muestras de alta influencia en el laboratorio y las más susceptibles a contaminación por S. aureus (leche cruda) y por B. cereus (albahaca). Además, se tomaron dos muestras que se sabe que presentan bajos recuentos de S. aureus y B. cereus, tales como carne cocida y arroz cocido, respectivamente. Se realizó la evaluación de repetibilidad, reproducibilidad intralaboratorio, especificidad, selectividad y los demás parámetros estadísticos de la validación. Para esto, se tuvo en cuenta lo descrito por el comité de expertos de la OMS (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). 5.4.1 Dilución y homogeneización de las muestras • La muestra se agitó manualmente antes de iniciar la prueba • Se verificó que el recipiente de la muestra se encontrara limpio y en buenas condiciones antes de abrirlo, para luego abrirlo de forma aséptica. • Se pesaron las muestras (albahaca, leche cruda, arroz cocido y carne cocida) y se agregaron a recipientes con agua peptonada (obteniendo la dilución 10-1). Posteriormente se homogenizaron en el stomacher. • Se realizaron diluciones seriadas en base 10 (obteniendo así las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, etc.) (Holguín et al., 1998). 33 5.4.2 Recuento en placa en superficie de Bacillus cereus • Luego de realizar las diluciones, se tomó 0.1 ml de cada dilución y se agregó en la superficie de la caja de petri con agar Bacillus cereus, este procedimiento se realizó por triplicado. • Se extendió la muestra con un asa estéril sobre el agar. • Se taparon las cajas y se dejó absorber la muestra durante unos 15 minutos a temperatura ambiente. • Se invirtieron las cajas y se llevaron a incubar a 35° C ± 2° C durante 18 h – 24 h. • Se realizó el recuento de UFC/g o ml de las colonias características de Bacillus cereus. • Se sometieron a confirmación colonias representativas procedentes del medio por medio de coloración de Gram (Holguín et al., 1998). • Posterior a esto, se realizó una modificación de la técnica que consistió en realizar la confirmación bioquímica por medio del kit de bioquímicas rápidas Crystal BBL. 5.4.3 Recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus coagulasa positiva • Se tomó 0.1 ml de cada dilución y se agregó en la superficie de la caja de petri con agar Baird Parker, este procedimiento se realizó por triplicado. • Se extendió la muestra con un asa estéril sobre el agar. • Se taparon las cajas y se dejó absorber la muestra durante unos 15 minutos a temperatura ambiente. • Se invirtieron las cajas y se llevaron a incubar a 37° C ± 2° C durante 18 h – 24 h. • Después de 24 h ± 2 h de incubación, se marcaron en la placa las colonias características (de 1 a 1.5 mm de 34 diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara). • Posteriormente se incubaron durante 24 h ± 2 h más. • Se realizó el recuento de UFC/g o ml de la muestra (Holguín et al., 1998). • Se realizó una modificación a la técnica para evaluar S. aureus coagulasa positiva, debido a que resulta ser más práctica y además se encuentra validada por la AOAC; la cual consiste en realizar la confirmación de S. aureus coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus. Para llevar a cabo esta prueba se debe depositar una gota del reactivo anti - S. aureus y una gota del reactivo control sobre la lámina. Luego, se deben tomar una o dos colonias sospechosas y emulsificar en los reactivos. La aglutinación (combinación de látex y células rojas sanguíneas) dentro de 30 segundos indica la presencia de S. aureus (http://www.biomerieuxusa.com/clinical/microbiology/slidex/sl idex_staph.htm) (2006). • Además de esto, se realizó una confirmación bioquímica por medio del kit de bioquímicas rápidas BBL Crystal (GramPositive ID System) a las colonias características. 5.4.4 Evaluación de la validación La evaluación de repetibilidad se realizó por medio de tres repeticiones para cada producto, y cada repetición se hizo por triplicado. La reproducibilidad se evaluó por medio de tres repeticiones para cada producto, por triplicado, variando las condiciones de realización del método (diferentes analistas y diferentes horas). 35 5.5 Informe de resultados Mediante la evaluación de los parámetros estadísticos, tales como media, desviación estándar, varianza y coeficiente de variación, se analizaron los respectivos datos obtenidos durante el estudio, para determinar la homogeneidad y los niveles de repetibilidad y reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras de albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus en muestras de leche cruda y carne cocida. 36 6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 Control de calidad de los medios de cultivo Control de esterilidad: de cada lote disponible se eligió al azar un 2% de la totalidad de las cajas servidas con el medio de cultivo y se llevaron a incubación durante 48 horas a 35 ± 1° C. Posteriormente se observó el aspecto y se comprobó la esterilidad, ya que no hubo crecimiento de ningún microorganismo en las cajas de los respectivos medios de cultivo, permitiendo utilizar satisfactoriamente las cajas de petri con los medios de cultivo. Este control se realizó cada vez que se preparaban medios para las diferentes pruebas llevadas a cabo. Control de pH a 25° C: el control del pH de los medios de cultivo preparados después de la esterilización es esencial, esta única comprobación podría ser suficiente, siempre y cuando el proceso de esterilización esté bajo control (Lightfoot & Maier, 2002). Para esto, se tomó una muestra del medio de cultivo estéril y con un pH-metro se realizó una medición del medio a una temperatura de 25° C. El valor de pH obtenido para el medio de cultivo agar Bacillus cereus de la casa comercial Scharlau con lote 14800, fue de 6.82 (anexo 2), el cual corresponde con el indicado en la ficha técnica del medio, donde se da un intervalo de aceptación de ± 0.2. El valor de pH obtenido para el medio de cultivo agar Baird Parker de la casa comercial Oxoid con lote 464615, fue de 6.62 (anexo 2), que corresponde con el indicado en la ficha técnica del medio donde se da un intervalo de aceptación de ± 0.2 (Allaert & Escolá, 2002). Control macroscópico: se realizó un examen visual para poder descartar cualquier error importante en la preparación de los medios. Se observó que su consistencia (sólida), su respectivo color y aspecto corresponden con los que indica la ficha técnica de estos (Allaert & Escolá, 2002). La 37 caducidad y las condiciones de conservación forman parte de la documentación que acompañe a la preparación de los medios de cultivo (Lightfoot & Maier, 2002). Para esto, se revisó la fecha de caducidad de los medios de cultivo utilizados, y después de la preparación, cada caja con el medio se etiquetó adecuadamente y estas se almacenaron a 4° C por periodos no mayores a 8 días. Método ecométrico: el control de la calidad rutinario de medios de cultivo ya preparados suele ser considerado como superfluo dado que los lotes de medios de cultivo deshidratados se controlan en fábrica y el proceso de preparación también suele estar perfectamente controlado. Sin embargo, dada la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de medios de cultivo, es recomendable realizar un control antes de la utilización de un lote de medio de cultivo, el cual puede efectuarse mediante el método ecométrico (Lightfoot & Maier, 2002). Se considera valida cualquier estría que crezca más del 25% de la línea. Cada estría tiene un valor de 0.2 y la estría central un valor de 1, es decir, que el crecimiento máximo que se puede presentar es de 5 ((0.2 * 20) + 1 = 5), por lo que se debe multiplicar el número de estrías que presentaron crecimiento por 0.2 y sumar 1 en caso de que se haya presentado crecimiento en la estría central, obteniendo así, el índice de crecimiento absoluto (ICA) (Tortora, 1993). El ICA va a determinar el grado de selectividad y productividad del medio según el caso. El ICA obtenido del medio prueba (caja 1) va a determinar la productividad del medio: ICA = 4.5 – 5, medios altamente productivos, ICA = 2.5 – 4.5, medios medianamente productivos, ICA < 2.5, medios poco productivos, ICA = 0, medios no productivos (Tortora, 1993). El ICA resultante del interferente (caja 2) evalúa la selectividad, por lo que a mayor selectividad, menor será el ICA: ICA = 0, medios altamente 38 selectivos, ICA = 0 – 2.5, medios medianamente selectivos, ICA > 2.5, medios no selectivos (Tortora, 1993). Se debe llevar a cabo un control en un medio nutritivo o enriquecido para determinar que el microorganismo de estudio no tiene ningún problema para crecer. Por otra parte el ICA obtenido en la caja 3 o de control debe ser muy similar al ICA de la caja 1, lo cual quiere decir que el microorganismo de prueba, no presenta ningún problema de crecimiento y la cepa resulta viable para el estudio, dándole así validez a la prueba (Tortora, 1993). El índice de crecimiento relativo (ICR) determina la capacidad que tiene el medio de prueba de recuperar la flora de una muestra determinada, frente a un medio nutritivo como lo es el del control. El ICR se obtiene de la división del ICA prueba / ICA control y al ser crecimientos similares el valor debe estar por encima de 0.95 a 1, es decir, la prueba solo tiene validez si existe por lo menos un crecimiento del 95 – 100% (Tortora, 1993). Este control se efectuó para comprobar la eficacia del medio de cultivo luego de someter las cajas a su respectivo periodo de incubación y se observó el crecimiento en cada una de las líneas sembradas. Al inicio del estudio se realizó la evaluación de productividad y selectividad para el medio de cultivo agar Bacillus cereus Scharlau lote batch 14800 y se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 1): Tabla 1. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al inicio del estudio. MEDIO DE CULTIVO Prueba ecométrico Medio de cultivo Agar Bacillus cereus Prueba Interferente Agar Bacillus cereus Control Agar Tripticasa soya Microorganismo Bacillus cereus ATCC 11778 Escherichia coli ATCC 8739 Bacillus cereus ATCC 11778 Fuente: Autor 39 ICA 3.8 ICR 0 0.95 4 Como prueba complementaria, al finalizar el estudio se realizó una evaluación de productividad y selectividad del mismo medio de cultivo, y se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 2): Tabla 2. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al finalizar el estudio. MEDIO DE CULTIVO Prueba ecométrico Medio de cultivo Agar Bacillus cereus Prueba Interferente Agar Bacillus cereus Control Agar Tripticasa soya Microorganismo Bacillus cereus ATCC 11778 Escherichia coli ATCC 8739 Bacillus cereus ATCC 11778 ICA 5 ICR 0 1.0 5 Fuente: Autor Figura 1. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (Prueba). Fuente: Autor Figura 2. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (Interferente). Fuente: Autor Fuente: Figura 3. Método ecométrico agar TSA (control). Fuente: Autor 40 También se realizó la evaluación de productividad y selectividad mediante método ecométrico para el medio de cultivo agar Baird Parker Oxoid lote 464615 y se obtuvieron los siguientes resultados al iniciar el estudio (tabla 3): Tabla 3. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al inicio del estudio. MEDIO DE CULTIVO Prueba ecométrico Medio de cultivo Prueba Agar Baird Parker Interferente Control Agar Baird Parker Agar Tripticasa soya Microorganismo Staphylococcus aureus ATCC 6538 Escherichia coli ATCC 8739 Staphylococcus aureus ATCC 6538 ICA ICR 4.6 0 1.0 4.6 Fuente: Autor Igualmente, se realizó una evaluación de productividad y selectividad del mismo medio de cultivo al finalizar el estudio, y se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 4): Tabla 4. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al finalizar el estudio. MEDIO DE CULTIVO Prueba ecométrico Medio de cultivo Prueba Agar Baird Parker Interferente Control Agar Baird Parker Agar Tripticasa soya Microorganismo Staphylococcus aureus ATCC 6538 Escherichia coli ATCC 8739 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Fuente: Autor Figura 4. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (Prueba). Fuente: Autor 41 ICA ICR 5 0 5 1.0 Figura 5. Método ecométrico Agar Baird Parker Oxoid (Interferente). Fuente: Autor Figura 6. Método ecométrico agar TSA (control). Fuente: Autor El medio de cultivo agar Bacillus cereus para detectar Bacillus cereus en muestras de alimentos de Scharlau, demostró ser al inicio del estudio un medio medianamente productivo ya que presentó un ICA de 3.8. Sin embargo, es un medio altamente selectivo ya que presentó un ICA de interferencia de 0, lo que quiere decir que se presentó inhibición del microorganismo interferente. Por otra parte, el valor de ICR fue de 0.95, lo cual refleja la capacidad que tiene el medio de recuperar la flora y la viabilidad del microorganismo (Tortora, 1993). Por otro lado, en el ensayo realizado al finalizar el estudio se demostró que este medio de cultivo es altamente productivo (ICA = 5) y altamente selectivo (ICA = 0), además se obtuvo un ICR = 1, lo cual confirma lo descrito anteriormente sobre la capacidad de este medio para recuperar el microorganismo evaluado. 42 Según los resultados obtenidos en el método ecométrico realizado al iniciar el estudio, se encontró que el agar Baird Parker de Oxoid es un medio de cultivo altamente productivo, pues presentó un ICA de 4.6. Así mismo, este medio presentó un ICA de interferencia de 0, demostrando que es altamente selectivo, ya que se logró la inhibición del microorganismo aquí evaluado. De la misma manera, se obtuvo un ICR de 1, valor que demuestra la capacidad que tiene este medio de recuperar los microorganismos, además de demostrar que el microorganismo de prueba no presenta ningún problema de crecimiento y la cepa resulta viable para el estudio, dándole así validez a la prueba (Tortora, 1993). Por otro lado, con el método ecométrico realizado al finalizar el estudio se demostró que este medio de cultivo es altamente productivo (ICA = 5) y altamente selectivo (ICA = 0), además se obtuvo un ICR = 1, lo cual confirma lo descrito anteriormente sobre la capacidad de este medio para recuperar el microorganismo evaluado. 6.2 Verificación del control de equipos Para el presente estudio es de relevancia considerar que los equipos de medida y ensayo utilizados a diario en el laboratorio, y que tengan un efecto sobre la exactitud o validez de los ensayos, se deberán encontrar calibrados, además de poseer un adecuado mantenimiento. Es importante que el laboratorio emplee métodos y procedimientos apropiados para todos los ensayos y/o calibraciones, ya que el laboratorio debe equiparse con todos los elementos que garanticen un margen de trazabilidad en las medidas que se realizan durante su utilización dentro de la ejecución del análisis o método microbiológico y así avalar los resultados de las pruebas (Romero, 2005), (Soler, 2006). El laboratorio debe en este caso, tener presente programas de mantenimiento y calibración; calibrar y revisar el equipo antes de ponerse 43 en servicio con el fin de establecer si reúne los requisitos de las especificaciones del laboratorio y si cumple las especificaciones de normatividad pertinentes; plantear un programa de revisión periódica de dichos equipos de conformidad con las disposiciones del laboratorio, acorde con la normatividad vigente (Soler, 2006). Todos los procedimientos para la calibración y uso de los equipos deben estar en orden, asimismo se especificará cada verificación que se deba efectuar antes de su empleo en el laboratorio. Igualmente, todos los equipos deben ser registrados con la indicación de la frecuencia de mantenimiento así como de las operaciones que comporta este y el responsable de su realización (Lightfoot & Maier, 2002). Al iniciar el proceso de validación se revisó el historial de los equipos involucrados en el estudio incluyendo certificados de calibración, mantenimiento y registros de su uso en los últimos meses, en los que se verificó que presentaran características apropiadas para su utilización como las descritas anteriormente (anexo 3). 6.3 Control de ambientes Para llevar a cabo el control de ambientes, se empleó la técnica de sedimentación en placa, colocando cajas abiertas con medio de cultivo para microorganismos mesófilos (TSA) y para hongos y levaduras (Sabouraud) en diferentes puntos del cuarto de siembra durante un periodo de 15 minutos. Estas cajas se llevaron a incubar a una temperatura de 35 ± 2° C durante 48 horas para mesófilos y a 22 ± 2° C durante 5 días para hongos y levaduras. Este control se realizó durante todas las pruebas realizadas, encontrando los siguientes recuentos de mesófilos y de hongos y levaduras (tabla 5): 44 Tabla 5. Recuento del control de ambientes. Recuento de Mesófilos en UFC / 15 min. de exposición Control de calidad de medios de cultivo Prueba de repetibilidad Prueba de reproducibilidad (diferentes horas) 0 Recuento de Hongos y levaduras en UFC / 15 min. de exposición 0 3 0 8:00 a.m. 0 0 12:00 m 1 0 4:00 p.m. Prueba de reproducibilidad (diferentes analistas) 4 1 1 4 Prueba realizada Fuente: Autor Los resultados obtenidos para el control de ambientes del área de siembra en donde se llevaron a cabo las diferentes pruebas indican la baja carga de microorganismos presentes en el ambiente, lo que permite deducir que se realizó una correcta limpieza de esta área, que no permitió la proliferación de microorganismos en el ambiente que pudieran aportar contaminación alguna a las diferentes pruebas realizadas. 6.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie Para llevar a cabo el proceso de validación de las técnicas de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus se evaluaron los parámetros de repetibilidad y reproducibilidad intralaboratorio de estas técnicas que se realizan a diario en el laboratorio para el análisis de alimentos que puedan contener estos microorganismos indicadores, que determinen la posibilidad de la existencia de microorganismos causantes de intoxicaciones o de otros riesgos asociados con el crecimiento microbiano (Hayes, 1993). Para la evaluación de repetibilidad, se realizaron los respectivos métodos bajo igualdad de condiciones, en cuatro diferentes tipos de alimentos; teniendo en cuenta que la repetibilidad es el parámetro que evalúa el 45 grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo elemento, realizadas bajo las mismas condiciones (GTC 84, 2003). Para la evaluación de reproducibilidad intra-laboratorio, se realizaron los respectivos métodos variando las condiciones de realización del método (hora de realización y analistas), en cuatro diferentes tipos de alimentos, ya que la reproducibilidad se define como el grado de concordancia entre los resultados de las mediciones en el mismo elemento bajo condiciones de medición alteradas (GTC 84, 2003), garantizando que el laboratorio es capaz de producir resultados constantes a lo largo del tiempo (Lightfoot & Maier, 2002). Para reconocer el grado de concordancia de los métodos validados, se llevó a cabo el estudio mediante estadística deductiva en la que se evaluó tanto la repetibilidad como la reproducibilidad de las técnicas, y esto se realizó mediante el análisis de coeficientes de variación y mediante el análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo. La metodología para realizar los análisis de alimentos en el laboratorio se llevó a cabo de acuerdo al protocolo descrito por Holguín et al., (1998). Se tomaron muestras de alta influencia en el laboratorio y las más susceptibles a contaminación por S. aureus (leche cruda) y por B. cereus (albahaca). Además, se tomaron dos muestras que se sabe que presentan bajos recuentos de S. aureus y B. cereus, tales como carne cocida y arroz cocido, respectivamente, con las cuales se realizó el estudio de validación secundaria del método de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus y Bacillus cereus. Por otro lado, para realizar cada uno de los recuentos se usó lo estipulado en la NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para el análisis microbiológico (NTC 4092, 1997). N= ∑C V [(n1+0.1*n2)*d] 46 Donde: ∑C: es la suma de las colonias contadas en todas las cajas de petri que contienen dos diluciones sucesivas. V: es el volumen del inóculo aplicado a cada caja, en mililitros. n1: es el número de cajas retenidas en la segunda dilución. n2: es el número de cajas retenidas en la segunda dilución. d: es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución retenida. Una vez ha sido obtenido el recuento, se hace su equivalencia redondeando el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto, si la última cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica, si la última cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad, y se muestra el resultado en forma exponencial. 6.4.1 Ensayos de validación para Bacillus cereus 6.4.1.1 Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus • Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra que presenta un alto recuento (albahaca). En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra de albahaca, se obtuvieron los siguientes recuentos (tabla 6): 47 Tabla 6. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca. Repetición 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio 1/100000 1/100000 1/100000 Promedio Recuento Según NTC 4092 1 10 9 13 11 2 1 2 2 1121212 11 x 105 2 9 9 11 10 1 1 2 1 1000000 10 x 105 3 13 14 12 13 2 3 1 2 1363636 14 x 105 Fuente: Autor La dispersión de un conjunto de observaciones se refiere a la variedad que muestran estas. Una medida de dispersión conlleva información respecto a la cantidad total de variabilidad presente en el conjunto de datos. Si todos los valores son iguales, no hay dispersión, pero si no todos son iguales, entonces existe dispersión en los datos. La magnitud de la dispersión es pequeña cuando los valores, aunque diferentes, son cercanos entre sí (Daniel, 1996). Según los datos presentados en la tabla 6, se presenta una dispersión aunque es de pequeña magnitud, ya que los resultados que arrojaron las repeticiones realizadas se encuentran dentro de un rango similar que oscila entre las 10 x 105 y 14 x 105 UFC / g-ml de Bacillus cereus, lo que permite ver la homogeneidad de los datos obtenidos entre repeticiones de una misma prueba (figura 7). Dispersión prueba repetibilidad Bacillus cereus UFC / g-ml 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Num ero de repeticiones Figura 7. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca. Fuente: Autor 48 En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus se obtuvo un considerable crecimiento de este microorganismo aislado a partir de una muestra de albahaca sobre el agar Bacillus cereus, en donde se evidenció la morfología típica de las colonias (figura 8), que luego fue confirmada por medio de una coloración de Gram, en la cual se obtuvieron bacilos Gram positivos, comprobando así la presencia de este microorganismo en la muestra de albahaca analizada. Asimismo, se realizó una confirmación bioquímica de estas colonias por medio del kit de identificación rápida de microorganismos Gram positivos BBL Crystal, con el cual se confirmó, con un 99% de confianza (anexo 4), de que se trataba de Bacillus cereus (figura 9). Figura 8. Crecimiento de Bacillus cereus en la prueba de repetibilidad. Fuente: Autor Figura 9. Confirmación bioquímica de Bacillus cereus con BBL Crystal. Fuente: Autor 49 Por otra parte, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación para este ensayo, y se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 7; además, se realizó un análisis de varianza en donde se establecieron los limites para un intervalo de confianza de 95% (tabla 8). Tabla 7. Análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca. Repetición Promedio 1/10000 Promedio 1/100000 Recuento 1 11 3 1121212 2 10 3 1000000 3 13 5 1363636 X V SD CV Según NTC 4092 11 x 105 12 x 105 3,86111111 185154,574 15,9393937 10 x 105 14 x 105 Fuente: Autor El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos presentados para la prueba de repetibilidad realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca. Dicho coeficiente de variación (16%) muestra que hay un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos en las tres repeticiones, ya que se presenta en un porcentaje inferior al 20%, demostrando así la varianza relativa presentada entre las dos mediciones. Tabla 8. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca. N Media 3 1161616 Desviación estándar 185154,5735 Intervalo de confianza para la media al 95% Limite inferior Limite superior 739791 1660209 Fuente: Autor Se realizó el análisis de distribución para construir intervalos de confianza y se obtuvieron los datos presentados en la tabla 9: 50 Tabla 9. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca. Variable 1 11,11111111 Media Varianza Variable 2 1,666666667 3,861111111 0,5 9 0 9 Observaciones Diferencia hipotética de las medias Grados de libertad 10 Estadístico t 13,56747704 P(T<=t) una cola 4,56821E-08 Valor crítico de t (una cola) 1,812461102 P(T<=t) dos colas 9,13642E-08 Valor crítico de t (dos colas) 2,228138842 Fuente: Autor En la tabla anterior se presenta el valor de t (coeficiente de confiabilidad), que es 4,56821 x 10-8, y se puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-4 es mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-5 (P<0,005) (P = 4. 56821 x 10-8), aceptando así la hipótesis alternativa, para concluir que se presenta repetibilidad para la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus. • Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra que presenta un bajo recuento (arroz cocido). En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido, se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 10): Tabla 10. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido. Repetición 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento Según NTC 4092 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 Fuente: Autor 51 Para llevar a cabo las pruebas de evaluación de los parámetros de repetiblidad y reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en superficie de B. cereus se realizó el ensayo con una muestra de arroz cocido, en donde no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual confirma lo que se esperaba para la muestra de arroz cocido analizada, ya que este microorganismo no debe encontrarse en este alimento, pues la presencia de B. cereus indica puntos críticos de contaminación que pueden ir desde las materias primas que fueron utilizadas, errores de manipulación durante el proceso de producción, hasta errores en el proceso de cocción, un tratamiento térmico insuficiente o un almacenamiento prolongado sin refrigeración, factores que pueden causar intoxicaciones y otros riesgos asociados con el crecimiento microbiano (Hayes, 1993). Se presentaron datos homogéneos para las pruebas realizadas y la evaluación de los parámetros establecidos, en la que la constante fue la obtención en cada prueba de 0 UFC en la muestra (figura 10) y un resultado de <100 UFC / g de Bacillus cereus a causa de las diluciones trabajadas. Figura 10. Prueba repetibilidad en arroz cocido. Fuente: Autor 52 6.4.1.2 Ensayos de reproducibilidad de Bacillus cereus • Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra que presenta un alto recuento (albahaca) en diferentes tiempos (ensayo de reproducibilidad 1). En el ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de albahaca, se obtuvieron los siguientes recuentos a las diferentes horas analizadas (tabla 11): Tabla 11. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1). Tiempo Repetición 1 8:00 a.m. Repetición 2 8:00 a.m. Repetición 3 8:00 a.m. Repetición 1 12:00 p.m. Repetición 2 12:00 p.m. Repetición 3 12:00 p.m. Repetición 1 4:00 p.m. Repetición 2 4:00 p.m. Repetición 3 4:00 p.m. 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio 1/100000 1/100000 1/100000 Promedio Recuento Según NTC 4092 24 22 25 24 2 2 4 3 2393939 24 x 105 26 22 24 24 3 2 2 2 2393939 24 x 105 20 22 21 21 2 1 1 1 2030303 20 x 105 22 27 25 25 2 4 2 3 2484848 25 x 105 25 25 23 24 3 2 2 2 2424242 24 x 105 25 21 23 23 3 2 1 2 2272727 23 x 105 23 21 24 23 2 2 3 2 2272727 23 x 105 22 20 20 21 2 1 1 1 2000000 20 x 105 20 25 23 23 1 3 2 2 2242424 22 x 105 Fuente: Autor Según los valores presentados en la tabla 11, se presenta una dispersión aunque es de pequeña magnitud, ya que los resultados que arrojaron las repeticiones realizadas a las diferentes horas se encuentran dentro de un rango similar que oscila entre las 20 x 105 y 25 x 105 UFC / g de Bacillus cereus lo que permite ver la homogeneidad de los datos obtenidos (figura 11). 53 Dispersión prueba reproducibilidad diferentes horas Bacillus cereus Recuentos UFC / g-ml 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 0,5 1 1,5 2 Repeticiones 08:00 a.m. 12:00 m 2,5 3 3,5 04:00 p.m. Figura 11. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus a las diferentes horas analizadas. Fuente: Autor En el ensayo de reproducibilidad 1 se obtuvo un notable crecimiento de Bacillus cereus, el cual fue aislado a partir de una muestra de albahaca y se evidenció la morfología típica de las colonias de este microorganismo (figura 12), que posteriormente se confirmó mediante coloración de Gram, en donde se obtuvieron bacilos Gram positivos, confirmando así la morfología del microorganismo aislado. Figura 12. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 1. Fuente: Autor Igualmente, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 12; además, se realizó el análisis de la 54 prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los datos presentados en la tabla 13. Tabla 12. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1). Tiempo Repetición 1 8:00 a.m. Repetición 2 8:00 a.m. Repetición 3 8:00 a.m. Repetición 1 12:00 p.m. Repetición 2 12:00 p.m. Repetición 3 12:00 p.m. Repetición 1 4:00 p.m. Repetición 2 4:00 p.m. Repetición 3 4:00 p.m. Promedio 1/10000 Promedio 1/100000 Recuento 24 3 2393939 24 2 2393939 21 1 2030303 20 x 105 25 3 2484848 25 x 105 24 2 2424242 23 2 2272727 23 x 105 23 2 2272727 23 x 105 21 1 2000000 23 2 2242424 X V SD CV Según NTC 4092 24 x 105 23 x 105 3,86111111 24 x 105 22 x 105 3,5 3,5 209945,342 9,23759618 109259,02 4,56398514 149481,149 6,88308603 24 x 105 24 x 105 20 x 105 22 x 105 Fuente: Autor El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos presentados para la prueba de reproducibilidad a diferentes horas realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca. Se obtuvieron coeficientes de variación de 9.23% a la primera hora analizada (8:00 a.m.), 4.56% a la segunda hora analizada (12:00 m) y 6.88% a la tercera hora analizada (4:00 p.m.). Estos coeficientes de variación demuestran que hay un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos en las diferentes horas analizadas, ya que presentan un porcentaje inferior al 20%. Tabla 13. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Bacillus cereus en muestra de albahaca. Repeticiones Variable 1 Observaciones 9 Grados de libertad 8:00 a.m. Estadístico t 11 28,68449058 P(T<=t) una cola Valor crítico de t (una cola) 55 5,43E-12 1,795884814 Variable 1 Observaciones 9 Grados de libertad 12:00 m. 11 Estadístico t 31,52963125 P(T<=t) una cola 1,94019E-12 Valor crítico de t (una cola) 1,795884814 Variable 1 Observaciones 9 Grados de libertad 4:00 p.m. 11 Estadístico t 29,7562167 P(T<=t) una cola 3,64281E-12 Valor crítico de t (una cola) 1,795884814 Fuente: Autor En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de reproducibilidad a las 8:00 a.m. (5,43 x 10-12), a las 12 m. (1,94019 x 10-12) y a las 4:00 p.m. (3,64281 x 10-12), en donde se puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-4 es mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-5 (P<0,005) aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que existe una reproducibilidad para la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus. Adicional a esto, se realizó un análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo y se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 14. Tabla 14. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo. RESUMEN dil 10-4 dil 10-5 Total 08:00 a.m. Cuenta 3 3 6 Suma 71 8 79 Promedio 23,6666667 2,66666667 13,1666667 Varianza 2,33333333 1,33333333 133,766667 12:00 m. Cuenta 3 3 6 Suma 74 8 82 Promedio 24,6666667 2,66666667 13,6666667 Varianza 6,33333333 1,33333333 148,266667 04:00 p.m. Cuenta 3 3 6 Suma 68 7 75 Promedio 22,6666667 2,33333333 12,5 Varianza 2,33333333 0,33333333 125,1 56 Total Cuenta 9 9 213 23 23,6666667 2,55555556 3,5 0,77777778 Suma Promedio Varianza Fuente: Autor • Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra que presenta un bajo recuento (arroz cocido) en diferentes tiempos (ensayo de reproducibilidad 1). En el ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido, se obtuvieron los siguientes recuentos a las diferentes horas analizadas (tabla 15): Tabla 15. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1). Tiempo Repetición 1 8:00 a.m. Repetición 2 8:00 a.m. Repetición 3 8:00 a.m. Repetición 1 12:00 p.m. Repetición 2 12:00 p.m. Repetición 3 12:00 p.m. Repetición 1 4:00 p.m. Repetición 2 4:00 p.m. Repetición 3 4:00 p.m. 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento Según NTC 4092 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 Fuente: Autor 57 En este ensayo tampoco se encontró crecimiento de B. cereus, lo cual confirma lo que se esperaba para la muestra de arroz cocido analizada, pues, como se mencionó anteriormente, este microorganismo no debe encontrarse en este alimento porque puede causar graves intoxicaciones. Se presentaron datos semejantes para las pruebas realizadas y la evaluación de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada prueba 0 UFC en la muestra (figura 13) y un resultado de <100 UFC / g de Bacillus cereus. Figura 13. Prueba reproducibilidad 1 en arroz cocido. Fuente: Autor • Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2). En el ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de albahaca, se obtuvieron los siguientes recuentos para los diferentes analistas (tabla 16): 58 Tabla 16. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2). Analista 2 Repetición 1 Analista 2 Repetición 2 Analista 2 Repetición 3 Analista 3 Repetición 1 Analista 3 Repetición 2 Analista 3 Repetición 3 1/10000 1/10000 Promedio 1/100000 1/100000 1/100000 Promedio Recuento Según 4092 18 16 15 16 2 1 1 1 1606060 16 x 105 15 17 15 16 1 2 1 1 1545454 15 x 105 10 14 16 13 1 1 2 1 1333333 13 x 105 12 14 9 12 1 2 2 2 1212121 12 x 105 11 10 14 12 1 1 2 1 1181818 12 x 105 15 16 10 14 1 2 1 1 1363636 14 x 105 13 14 10 12 1 2 1 1 1242424 12 x 105 12 13 15 13 1 3 2 2 1393939 14 x 105 18 15 12 15 2 2 1 2 1515151 15 x 105 Fuente: Autor De acuerdo con los valores presentados en la tabla 16, se presenta una dispersión aunque es de pequeña magnitud, ya que los resultados que arrojaron las repeticiones realizadas a las diferentes horas se encuentran dentro de un rango similar que oscila entre 12 x 105 y 16 x 105 UFC / g de Bacillus cereus, lo que permite ver la homogeneidad de los datos obtenidos (figura 14). Dispersión prueba de reproducibilidad diferentes analistas Bacillus cereus 1800000 1600000 Recuentos UFC /g - ml Analista 1 Repetición 1 Analista 1 Repetición 2 Analista 1 Repetición 3 1/10000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0 0,5 1 1,5 2 Repeticiones Analista 1 Analista 2 2,5 3 3,5 Analista 3 Figura 14. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus realizado por diferentes analistas. Fuente: Autor 59 En el ensayo de reproducibilidad 2 se observó el crecimiento de Bacillus cereus, aislado a partir de una muestra de albahaca, en donde se logró evidenciar la morfología típica de sus colonias (figura 15), las cuales fueron sometidas a coloración de Gram, y se confirmó la presencia de este microorganismo, pues se observaron bacilos Gram positivos. Figura 15. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 2. Fuente: Autor También, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 17; además, se realizó el análisis de prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los datos presentados tabla 18: Tabla 17. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2). Analista 1 Repetición 1 Analista 1 Repetición 2 Analista 1 Repetición 3 Analista 2 Repetición 1 Analista 2 Repetición 2 Analista 2 Repetición 3 Promedio 1/10000 Promedio 1/100000 Recuento 16 1 1606060 16 1 1545454 13 1 1333333 13 x 105 12 2 1212121 12 x 105 12 1 1181818 14 1 1363636 X V SD CV Según NTC 4092 16 x 105 15 x 105 12 x 105 5,11111111 6,25 143206,391 97410,5163 9,57934959 7,7771315 15 x 105 12 x 105 14 x 105 60 Analista 3 Repetición 1 Analista 3 Repetición 2 Analista 3 Repetición 3 12 1 1242424 13 2 1393939 15 2 1515151 12 x 105 14 x 105 5,27777778 136643,795 9,8742624 14 x 105 15 x 105 Fuente: Autor El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos presentados para la prueba de reproducibilidad con diferentes analistas realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca. Se obtuvieron coeficientes de variación de 9.57% (analista 1), 7.77% (analista 2) y 9.87% (analista 3). Estos coeficientes de variación demuestran que hay un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos entre los diferentes analistas, ya que presentan un porcentaje inferior al 20%. Tabla 18. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Bacillus cereus en muestra de albahaca. Analistas Variable 1 Observaciones 9 Grados de libertad 1 Estadístico t 9 17,85143062 P(T<=t) una cola 1,23394E-08 Valor crítico de t (una cola) 1,833112923 Variable 1 Observaciones 9 Grados de libertad 2 Estadístico t 9 12,78563023 P(T<=t) una cola 2,23918E-07 Valor crítico de t (una cola) 1,833112923 Variable 1 Observaciones Grados de libertad 3 Estadístico t 9 10 14,83823025 P(T<=t) una cola 1,94005E-08 Valor crítico de t (una cola) 1,812461102 Fuente: Autor En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de reproducibilidad variando los analistas. Analista 1 (1,23394 x 10-8), analista 2 (2,23918 x 10-7) y analista 3 (1.94005 x 10-8), en donde se puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-4 es 61 mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-5 (P<0,005), aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que existe una reproducibilidad intra-laboratorio para la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus. Adicional a esto, se realizó un análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo y se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 19. Tabla 19. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo. dil 10-4 RESUMEN dil 10-5 Total Analista 1 Cuenta 3 3 6 Suma 49 4 53 Promedio 16,33333333 1,333333333 8,833333333 Varianza 2,333333333 0,333333333 68,56666667 Analista 2 Cuenta 3 3 6 Suma 35 5 40 Promedio 11,66666667 1,666666667 6,666666667 Varianza 6,333333333 0,333333333 32,66666667 Analista 3 Cuenta 3 3 6 Suma 37 4 41 Promedio 12,33333333 1,333333333 6,833333333 Varianza 4,333333333 0,333333333 38,16666667 Total Cuenta Suma 9 9 121 13 Promedio 13,44444444 1,444444444 Varianza 8,027777778 0,277777778 Fuente: Autor • Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2). En el ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido, al realizarse por diferentes analistas, se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 20): 62 Tabla 20. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2). Analista 1 Repetición 1 Analista 1 Repetición 2 Analista 1 Repetición 3 Analista 2 Repetición 1 Analista 2 Repetición 2 Analista 2 Repetición 3 Analista 3 Repetición 1 Analista 3 Repetición 2 Analista 3 Repetición 3 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento Según 4092 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 Fuente: Autor En esta prueba no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual confirma lo que se esperaba para la muestra de arroz cocido analizada, pues, como se ha mencionado, este microorganismo no debe poder aislarse de este alimento ya que puede causar graves intoxicaciones. Se presentaron los mismos valores en las pruebas realizadas y la evaluación de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada prueba 0 UFC en la muestra (figura 16) y un resultado de <100 UFC / g de Bacillus cereus. Figura 16. Prueba reproducibilidad 2 en arroz cocido. Fuente: Autor 63 6.4.2 Ensayos de validación para Staphylococcus aureus coagulasa positiva 6.4.2.1 Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva • Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en una muestra que presenta un alto recuento (leche cruda). En el ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda, se obtuvieron los siguientes recuentos (tabla 21): Tabla 21. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. Repetición 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio Recuento Según NTC 4092 1 5 6 8 6 1 0 0 0 60606 60 x 103 2 5 5 7 6 0 1 1 1 57575 57 x 103 3 4 5 6 5 1 0 2 1 54545 54 x 103 Fuente: Autor La estadística se ocupa de la dispersión de la distribución, es decir, si los datos aparecen sobre todo alrededor de la media o si están distribuidos por todo el rango. Una medida de dispersión conlleva información respecto a la cantidad total de variabilidad presente en el conjunto de datos. Si todos los valores son iguales, no hay dispersión, pero si no todos son iguales, entonces existe dispersión en los datos. La magnitud de la dispersión es pequeña cuando los valores, aunque diferentes, son cercanos entre si (Daniel, 1996). Acorde con los resultados presentados en la tabla 21, se puede deducir que existe dispersión en los datos ya que todos los valores no son iguales, y tampoco son muy parecidos; por lo tanto, no existe una homogeneidad de los datos obtenidos entre repeticiones de una misma prueba (figura 17). 64 Dispersión prueba repetibilidad Staphylococcus aureus 63000 UFC / g-ml 62000 61000 60000 59000 58000 57000 56000 55000 54000 53000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Num ero de repeticiones 3 3,5 Figura 17. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda. Fuente: Autor En el ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus se obtuvo un apropiado crecimiento de este microorganismo aislado a partir de una muestra de leche cruda sobre el agar Baird Parker, en donde se evidenció la morfología típica de las colonias (figura 18), que posteriormente fueron confirmadas por medio de coloraciones de Gram, en las cuales se encontraron cocos Gram positivos, demostrando así la presencia de este microorganismo en la muestra de leche cruda estudiada. Por otro lado, se realizó la confirmación de S. aureus coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus, depositando una gota del reactivo anti - S. aureus y una gota del reactivo control sobre la lámina, luego se tomó una colonia sospechosa y se emulsificó en los reactivos. Pasados aproximadamente 30 segundos se observó la aglutinación mediante combinación de látex y células rojas sanguíneas, confirmando así la reacción positiva de coagulasa. Esta confirmación se realizó a todas las colonias presuntivas de S. aureus en los diferentes ensayos llevados a cabo durante el estudio (figura 19). Igualmente, se realizó una confirmación bioquímica de las colonias presuntivas de S. aureus por medio del kit de identificación rápida de microorganismos Gram positivos BBL Crystal, con el cual se confirmó, con un 99% de confianza (anexo 4), de que se trataba de Staphylococcus aureus (figura 20). 65 Figura 18. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda en la prueba de repetibilidad. Fuente: Autor Figura 19. Confirmación de Staphylococcus aureus coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus. Fuente: Autor Figura 20. Confirmación bioquímica de Staphylococcus aureus con BBL Crystal. Fuente: Autor Se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 22; además, se realizó un análisis de varianza en donde se establecieron los limites para un intervalo de confianza de 95% (tabla 23). 66 Tabla 22. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda. Repetición Promedio 1/1000 Promedio 1/10000 Recuento 1 6 0 60606 2 6 1 57575 3 5 1 54545 X V SD CV Según NTC 4092 60 x 103 57 x 103 3030,50001 1,5 5,26353881 57 x 103 54 x 103 Fuente: Autor El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos presentados para la prueba de repetibilidad realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. Dicho coeficiente de variación (5.3%) muestra que hay un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos en las tres repeticiones, ya que se presenta en un porcentaje inferior al 20%. Tabla 23. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. N Media Desviación estándar 3 57575 3030,50001 Intervalo de confianza para la media al 95% Limite inferior Limite superior 49468 64532 Fuente: Autor Se realizó el análisis de distribución para construir intervalos de confianza y se obtuvieron los datos presentados en la tabla 24: Tabla 24. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad para Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. Variable 1 5,666666667 Media Varianza Observaciones Diferencia hipotética de las medias Grados de libertad Variable 2 0,666666667 1,5 0,5 9 0 9 13 Estadístico t 10,60660172 P(T<=t) una cola 4,52372E-08 Valor crítico de t (una cola) 1,770933383 P(T<=t) dos colas 9,04745E-08 Valor crítico de t (dos colas) 2,160368652 Fuente: Autor 67 En la anterior tabla se presenta el valor de t (4,52372 x 10-8), en la cual se puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-3 es mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005) (P = 4,52372 x 10-8), aceptando así la hipótesis alternativa, para concluir que se presenta repetibilidad para la técnica de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus. • Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en una muestra que presenta un bajo recuento (carne cocida). En el ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida, se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 25): Tabla 25. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida. Repetición 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento Según NTC 4092 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 Fuente: Autor Para llevar a cabo las pruebas de evaluación de los parámetros de repetiblidad y reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en superficie de S. aureus coagulasa positiva se realizó el ensayo con una muestra de carne cocida, en la cual no se encontró crecimiento alguno de este microorganismo, lo cual confirma lo esperado para la muestra de carne cocida analizada, ya que este microorganismo no debe encontrarse en este alimento, pues su presencia se interpreta como indicativo de contaminación a partir de la piel, la boca y las fosas nasales de los manipuladores de alimentos, y cuya intoxicación alimentaria estafilocócica es un síndrome caracterizado por nauseas, vómitos, diarrea, malestar y 68 debilidad general, que comienzan a manifestarse de 1 a 6 horas después de consumido el alimento (ICMSF, 2000). Se presentaron datos homogéneos para las pruebas realizadas y la evaluación de los parámetros establecidos, en la que la constante fue la obtención en cada prueba de 0 UFC en la muestra (figura 21) y un resultado de <100 UFC / g de Staphylococcus aureus a causa de las diluciones trabajadas. Figura 21. Prueba repetibilidad en carne cocida. Fuente: Autor 6.4.2.2 Ensayos de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva • Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en una muestra que presenta un alto recuento (leche cruda) en diferentes tiempos (ensayo de reproducibilidad 1). En el ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda, se obtuvieron los siguientes recuentos a las diferentes horas analizadas (tabla 26): 69 Tabla 26. Resultados recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda a las diferentes horas evaluadas (ensayo de reproducibilidad 1). Repetición 1 8:00 a.m. Repetición 2 8:00 a.m. Repetición 3 8:00 a.m. Repetición 1 12:00 p.m. Repetición 2 12:00 p.m. Repetición 3 12:00 p.m. Repetición 1 4:00 p.m. Repetición 2 4:00 p.m. Repetición 3 4:00 p.m. 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio Recuento Según NTC 4092 4 3 5 4 1 1 0 1 42424 42 x 103 5 6 4 5 1 1 1 1 54545 54 x 103 3 5 2 3 1 1 1 1 39393 40 x 103 4 3 7 5 0 2 1 1 51515 51 x 103 3 3 5 4 1 1 1 1 42424 42 x 103 6 5 4 5 1 0 0 0 48484 48 x 103 5 3 5 4 1 0 1 1 45454 45 x 103 4 6 5 5 1 2 0 1 54545 54 x 103 7 3 6 5 0 1 0 0 51515 51 x 103 Fuente: Autor Según los resultados presentados en la tabla 26, se presenta una dispersión, en los valores ya que los resultados que arrojaron las repeticiones realizadas a las diferentes horas no son iguales y tampoco parecidos; por lo tanto, no existe una semejanza de los datos obtenidos entre repeticiones de una misma prueba (figura 22). Dispersión prueba reproducibilidad diferentes horas Staphylococcus aureus 60000 Recuento UFC / g-ml Tiempo 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 0,5 1 1,5 2 Repeticiones 08:00 a.m. 12:00 m. 2,5 3 3,5 04:00 p.m. Figura 22. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus a las diferentes horas analizadas. Fuente: Autor 70 En el ensayo de reproducibilidad 1 se obtuvo un notable crecimiento de Staphylococcus aureus, el cual fue aislado a partir de una muestra de leche cruda y se evidenció la conformación típica de las colonias de este microorganismo (figura 23). Posteriormente se realizó una coloración de Gram a las colonias características de S. aureus, obteniendo cocos Gram positivos agrupados en racimos, lo que confirma así la morfología del microorganismo aislado. Figura 23. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 1. Fuente: Autor Por otro lado, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación para el ensayo de reproducibilidad 1, en donde se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 27; además, se realizó el análisis de la prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los datos presentados en la tabla 28: Tabla 27. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1). Tiempo Repetición 1 8:00 a.m. Repetición 2 8:00 a.m. Repetición 3 8:00 a.m. Repetición 1 12:00 p.m. Repetición 2 12:00 p.m. Repetición 3 12:00 p.m. Promedio 1/1000 Promedio 1/10000 Recuento 4 1 42424 5 1 54545 3 1 39393 40 x 103 5 1 51515 51 x 103 4 1 42424 5 0 48484 X V SD CV Según NTC 4092 42 x 103 45 x 103 47 x 103 1,61111111 2,02777778 8017,57139 4628,8379 17,6388687 9,75019043 54 x 103 42 x 103 48 x 103 71 Repetición 1 4:00 p.m. Repetición 2 4:00 p.m. Repetición 3 4:00 p.m. 4 1 45454 5 1 54545 5 0 51515 45 x 103 50 x 103 1,86111111 4628,947 9,16538472 54 x 103 51 x 103 Fuente: Autor El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos presentados para la prueba de reproducibilidad a diferentes horas realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. Se obtuvieron coeficientes de variación de 17.63% a la primera hora analizada (8:00 a.m.), 9.75% a la segunda hora analizada (12:00 m) y 9.16% a la tercera hora analizada (4:00 p.m.). Estos coeficientes de variación demuestran que hay un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos en las diferentes horas analizadas, ya que presentan un porcentaje inferior al 20%. Tabla 28. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Repeticiones Variable 1 Observaciones 9 Grados de libertad 8:00 a.m. 9 Estadístico t 7,36600737 P(T<=t) una cola 2,1271E-05 Valor crítico de t (una cola) 1,83311292 Variable 1 Observaciones 9 Grados de libertad 12:00 m. Estadístico t 11 6,99598601 P(T<=t) una cola 1,1408E-05 Valor crítico de t (una cola) 1,79588481 Variable 1 Observaciones 9 Grados de libertad 4:00 p.m. Estadístico t 12 8,2433574 P(T<=t) una cola 1,3815E-06 Valor crítico de t (una cola) 1,78228755 Fuente: Autor 72 En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de reproducibilidad a las 8:00 a.m. (2,1271 x 10-5), a las 12 m. (1,1408 x 10-5) y a las 4:00 p.m. (1,3815 x 10-6), en donde se puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-3 es mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005) aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que existe una reproducibilidad para la técnica de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus. Adicional a esto, se realizó un análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo y se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 29). Tabla 29. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo. dil 10-3 RESUMEN dil 10-4 Total 08:00 a.m. Cuenta 3 Suma 12 3 6 2 14 Promedio 4 0,666666667 2,333333333 Varianza 1 0,333333333 3,866666667 12:00 m. Cuenta 3 3 6 Suma 14 3 17 Promedio 4,666666667 1 2,833333333 Varianza 4,333333333 1 6,166666667 04:00 p.m. Cuenta 3 3 6 Suma 13 2 15 Promedio 4,333333333 0,666666667 2,5 Varianza 1,333333333 0,333333333 4,7 Cuenta 9 9 Suma 39 7 4,333333333 0,777777778 1,75 0,444444444 Total Promedio Varianza Fuente: Autor 73 • Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra que presenta un bajo recuento (carne cocida) en diferentes tiempos (ensayo de reproducibilidad 1). En el ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida, se obtuvieron los siguientes recuentos a las diferentes horas analizadas (tabla 30): Tabla 30. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1). Tiempo Repetición 1 8:00 a.m. Repetición 2 8:00 a.m. Repetición 3 8:00 a.m. Repetición 1 12:00 p.m. Repetición 2 12:00 p.m. Repetición 3 12:00 p.m. Repetición 1 4:00 p.m. Repetición 2 4:00 p.m. Repetición 3 4:00 p.m. 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento Según NTC 4092 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 Fuente: Autor En este ensayo tampoco se encontró crecimiento de Staphylococcus aureus, lo cual confirma lo que se esperaba para la muestra de carne cocida examinada, ya que este microorganismo produce una gran cantidad de productos extracelulares, muchos de ellos enterotoxinas. La diseminación de S. aureus entre humanos y de los humanos a los alimentos puede ocurrir por contacto directo o indirectamente por fragmentos de piel (Doyle, 1997). 74 Se presentaron datos semejantes para las pruebas realizadas y la evaluación de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada prueba 0 UFC en la muestra (figura 24) y un resultado de <100 UFC / g de S. aureus. Figura 24. Prueba reproducibilidad 1 en carne cocida. Fuente: Autor • Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2). En el ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda, se obtuvieron los siguientes recuentos para los diferentes analistas (tabla 31): 75 Tabla 31. Resultados de los recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2) Analista 1 Repetición 1 Analista 1 Repetición 2 Analista 1 Repetición 3 Analista 2 Repetición 1 Analista 2 Repetición 2 Analista 2 Repetición 3 Analista 3 Repetición 1 Analista 3 Repetición 2 Analista 3 Repetición 3 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio Recuento Según NTC 4092 3 4 5 4 1 1 1 1 45454 45 x 103 4 4 3 4 1 1 0 1 39393 40 x 103 4 5 5 5 0 1 2 1 51515 51 x 103 5 6 5 5 1 1 1 1 57575 57 x 103 4 4 6 5 1 1 1 1 51515 51 x 103 4 3 5 4 1 2 1 1 48484 48 x 103 3 5 6 5 1 0 1 1 48484 48 x 103 5 7 6 6 1 1 1 1 54545 54 x 103 5 5 3 4 2 1 1 1 51515 51 x 103 Fuente: Autor Según los resultados presentados en la tabla 31, se presenta una dispersión en los valores, ya que los resultados que arrojaron las repeticiones realizadas por los distintos analistas son diferentes entre si; variando en un rango que se encuentra entre 40 x 103 y 57 x 103 UFC / ml de Staphylococcus aureus, por lo tanto, la semejanza en los datos obtenidos entre repeticiones de una misma prueba no es muy uniforme (figura 25). Sin embargo, es lógico que se presenten estos resultados debido a que se está tratando con microorganismos que varían según las condiciones de crecimiento a las que fueron sometidos. Dispersion prueba reproducibilidad diferentes analistas Staphylococcus aureus Recuentos UFC / g-ml 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 0,5 1 1,5 2 Repeticiones Analista 1 Analista 2 76 2,5 3 Analista 3 3,5 Figura 25. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus realizado por diferentes analistas. Fuente: Autor En el ensayo de reproducibilidad 2 se obtuvo un notable crecimiento de Staphylococcus aureus, aislado a partir de una muestra de leche cruda, en donde se observó la morfología típica de las colonias de este microorganismo (figura 26), a las cuales se les realizó una coloración de Gram, para confirmar posteriormente las características propias de tinción de S. aureus, pues se observaron cocos Gram positivos agrupados en forma de racimos. Figura 26. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 2. Fuente: Autor Por otro lado, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 32; además, se realizó el análisis de prueba t para obtener la distribución, obteniendo los datos presentados en la tabla 33: Tabla 32. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado por diferentes analistas (Ensayo de reproducibilidad 2). Analista 1 Repetición 1 Analista 1 Repetición 2 Analista 1 Repetición 3 Promedio 1/1000 Promedio 1/10000 Recuento 4 1 45454 4 1 39393 5 1 51515 X V SD CV Según NTC 4092 45 x 103 45 x 103 0,61111111 6061 13,33436 40 x 103 51 x 103 77 Analista 2 Repetición 1 Analista 2 Repetición 2 Analista 2 Repetición 3 Analista 3 Repetición 1 Analista 3 Repetición 2 Analista 3 Repetición 3 57 x 103 5 1 57575 5 1 51515 4 1 48484 48 x 103 5 1 48484 48 x 103 6 1 54545 4 1 51515 52 x 103 51 x 103 1 1,75 4628,8379 3030,50001 8,81269353 5,88279069 51 x 103 54 x 103 51 x 103 Fuente: Autor El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos presentados para la prueba de reproducibilidad con diferentes analistas realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. Se obtuvieron coeficientes de variación de 13.33% (analista 1), 8.81% (analista 2) y 5.88% (analista 3). Estos coeficientes de variación demuestran que hay un alto grado de concordancia en los resultados obtenidos entre los diferentes analistas, ya que presentan un porcentaje inferior al 20%. Tabla 33. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Staphylococcus aureus en leche cruda. Analistas Variable 1 Observaciones 9 Grados de libertad 1 Estadístico t P(T<=t) una cola Valor crítico de t (una cola) Observaciones Estadístico t P(T<=t) una cola Valor crítico de t (una cola) Observaciones 10 10,11928851 7,12846E-07 1,812461102 Variable 1 9 Grados de libertad 3 3,24058E-08 1,753050325 Variable 1 9 Grados de libertad 2 15 9,803789355 Estadístico t P(T<=t) una cola Valor crítico de t (una cola) Fuente: Autor 78 10 8,485281374 3,50212E-06 1,812461102 En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de reproducibilidad variando los analistas. Analista 1 (3,24058 x 10-8), analista 2 (7,12846 x 10-7) y analista 3 (3,50212 x 10-6), en donde se puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-3 es mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005), aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que existe una reproducibilidad intra-laboratorio para la técnica de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus. Para este ensayo también se realizó un análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo y se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 34. Tabla 34. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo. dil 10-4 RESUMEN dil 10-5 Total Analista 1 Cuenta 3 3 6 Suma 12 3 15 Promedio 4 1 2,5 Varianza 1 0 3,1 Analista 2 Cuenta 3 3 6 Suma 16 3 19 Promedio 5,333333333 1 3,166666667 Varianza 0,333333333 0 5,766666667 Analista 3 Cuenta 3 3 6 Suma 14 2 16 Promedio 4,666666667 0,666666667 2,666666667 Varianza 2,333333333 0,333333333 5,866666667 Total Cuenta Suma Promedio 9 9 42 8 4,666666667 0,888888889 Varianza 1,25 0,111111111 Fuente: Autor 79 • Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2). En el ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida, al realizarse por diferentes analistas, se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 35): Tabla 35. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2). Analista 1 Repetición 1 Analista 1 Repetición 2 Analista 1 Repetición 3 Analista 2 Repetición 1 Analista 2 Repetición 2 Analista 2 Repetición 3 Analista 3 Repetición 1 Analista 3 Repetición 2 Analista 3 Repetición 3 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento Según NTC 4092 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100 Fuente: Autor En esta prueba no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual confirma lo que se esperaba para la muestra de carne cocida analizada, ya que, como se ha mencionado, este microorganismo no debe poder aislarse de este alimento porque puede causar graves intoxicaciones debido a las enterotoxinas que produce. La principal fuente de contaminación de los alimentos por Staphylococcus se debe a la manipulación de estos por parte de personas contaminadas, ya que los humanos son el principal reservorio de este microorganismo. 80 Se presentaron datos iguales para las pruebas realizadas y la evaluación de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada prueba 0 UFC en la muestra (figura 27) y un resultado de <100 UFC / g de S. aureus. Figura 27. Prueba reproducibilidad 2 en carne cocida. Fuente: Autor 81 7. CONCLUSIONES • Para los laboratorios de análisis microbiológico es importante desarrollar técnicas que produzcan confiabilidad de resultados, lo cual se logra a través de la validación secundaria de dichos métodos, ya que de esta forma se consigue emitir resultados exactos, que permiten al laboratorio mantener altos estándares de calidad. • La metodología ejecutada permitió evaluar la repetibilidad y reproducibilidad de la validación secundaria concurrente del método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras de albahaca y arroz cocido, la cual arrojó coeficientes de variación con altos grados de concordancia para los diferentes ensayos realizados; lo que significa que entre ensayos existe una variación menor al 20%. • La validación secundaria concurrente del método de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en muestras de leche cruda y carne cocida, arrojó coeficientes de variación con altos grados de concordancia para los diferentes ensayos realizados; lo que significa que entre ensayos existe una variación menor al 20%, logrando así evaluar la repetibilidad y reproducibilidad de esta técnica. • La evaluación de la repetibilidad y la reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras de albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus en muestras de leche cruda y carne cocida, mostró valores que aseguran la estandarización de la técnica. 82 • El análisis estadístico permitió corroborar que las técnicas de recuento en placa en superficie tanto para el análisis de Bacillus cereus como para Staphylococcus aureus en muestras de alimentos son repetibles y reproducibles. • Mediante la realización del método ecométrico a los medios utilizados en los ensayos de validación se pudo evidenciar la alta productividad y selectividad del agar Bacillus cereus y del agar Baird Parker, lo que permite confiar en los resultados obtenidos en cada uno de los ensayos llevados a cabo en el proceso de validación. • La demostración de los parámetros de calidad de los medios de cultivo, tales como esterilidad, selectividad, productividad y pH arrojó altos grados de confiabilidad para el estudio realizado. • El sistema de aseguramiento de calidad en lo concerniente a instalaciones, equipos y controles minimiza las desviaciones y deficiencias en la obtención de resultados. 83 posibles 8. RECOMENDACIONES 1. Mediante el desarrollo de la validación secundaria dar continuidad a la validación de otras técnicas como, recuento de esporas anaerobias de sulfito reductores, Vibrio cholera, Listeria monocytogenes, entre otras. 2. Realizar pruebas interlaboratorios nacionales e internacionales para dar una mayor confiabilidad a los resultados obtenidos. 3. Implementar esta metodología para realizar una evaluación de analistas, para lograr estandarizar este método, de manera que el personal nuevo la conozca y la ejecute siempre de la misma forma. 84 9. REFERENCIAS Allaert, C., Escolá, M. 2002. Métodos de análisis microbiológicos de los alimentos. Editorial Díaz de Santos. S.A. Madrid, España. Carlin, F., Fricker, M., Pielaat, A., Heisterkamp, S., Shaheen, R., Salonen, M. S., Svensson, B., Nguyen-the, C., Ehling-Schulz, M. 2006. Emetic toxin-producing strains of Bacillus cereus show distinct characteristics within the Bacillus cereus group. 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