Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial Fórmula para el cálculo del campo centrifugo desde g a rpm RCF = 1,12 x 10-5 x (rpm)2 x R (cm) Resultados: campo centrifugo relativo rpm (redondeado) 2800 9000 13800 42100 13600 radio medio en cm 7,75 xg 700 7000 17000 105000 ultracentrifuga 16000 radio de ultracentrifuga cm 4 Cálculo: Para la 1ª: rpm = √ (RCF/ (1,12 x 10 -5 x R (cm)) √ para valor de 700 x g entonces: rpm = (700/ (1,12x10-5 x 7,75) = 2839,8 ≈ 2800 rpm ya hemos redondeado porque la centrifuga va de 100 en 100 unidades de rpm. 7,75 es el radio medio determinado según el volumen de forma visual. Para el resto de las fraciones se calcúla igual. Ver tabla. Determinacion de proteínas Calculos para el procedimiento experimental: 1. 2. preparacion de la dilución 1/10 de la muestra primero hacemos la solución de 500 μl añadimos 450μl de agua destilada y 50μl de muestra; total 500μl. De esta solución se coge el vol. de muestra de tabla y se adiciona agua hasta completar 1ml. Muestra μl Agua destilada μl 25 975 50 950 100 900 preparacion de albumina partimos de 0,5mg /ml 500μg/ml tenemos que añadir una cantidad de albumina de 0, 50, 150, 250 μg de albumina en un volumen final de 1ml. Resultados: Cantidad de Albumina μg Vol de sol. Albumina μl Vol agua destilada μl 0 0 1000 50 100 900 150 300 700 250 500 500 Calculos: CV=C’V’ 500μg/ml x V= 50 μg/ml x 1ml; V = (50 μg/ml x 1ml)/ 500μg/ml = 0,1ml = 100μl de vol de sol. Albumina el agua destilada que hay que añadir hasta 1000μl es la resta. el resto de los calculos identicos. Las determinaciones colorimétricas se basan en la Ley de Lambert - Beer que relaciona la concentración con la absorbancia: ε 50 = (A50 / dc); datos patrón μg/ml 50 = 150 = (A150 / dc); ε 250 = (A250 / dc); A cd ab 0 50 150 250 ε ε ε ε 0 0,271 0,366 0,478 A dc c A d (A50 / dc) olun ε / dc) ε 150 = (A150 / dc) 150 = (0,366/1x150) = 2,44x10-3 250 = (A250 250 = (0,478/1x250) =1,912x10-3 la media obtenemos los dos últimos valores la media de ε = 2,176x10 para nuestra muestra calculamos la concentración, c = A / datos: s700 ab cit ab 25 0,06 25 0,035 50 0,112 50 0,07 100 0,213 100 0,137 -3 μg/ml 2,176 mg/ml ε d; micro 25 50 100 ab mit 0,017 0,035 0,065 ab 25 50 100 Fracción S 700: C25 = 0,06 / 2,176x10-3 x ( 10 x 1000 / 1000 x 25)= 11.02mg/ml; donde 0,4 sale del frato de transformar los gprot / 25 lfracion _ dilu en mgprot / mlfracion _ conc : ( x gprot / 25 lfracion _ dilu ) ( y gprot / 25 lfracion _ conc (10 " primerfact ordediluci ón " )) ( z gprot / 1mlfracion _ conc (1000 / 25 )) ( wmgprot / mlfracion _ conc ) Todos se calcula igual, con lo que se resumen en la tabla: media calculo de concentraciones en mg/ml S700 citosol microsomal mitocondrial 11,02 6,43 3,12 1,80 10,29 6,42 3,21 2,38 9,78 6,29 2,98 2,66 10,36 6,38 3,10 2,28 0,01 0,026 0,058 Gráfica : 0,6 absorbancia 0,5 y = 0,0021x R2 = 0,9631 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 50 100 150 200 250 concentracion de albumina (microg/ml) patron μg ab 0,00 50,00 150,00 250,00 0,00 0,27 0,37 0,48 s70'0 ab 25,00 50,00 100,00 Prot Prot mg/ml cit ab mg/ml 0,06 28,57 11,43 25,00 0,04 16,67 6,67 0,11 53,33 10,67 50,00 0,07 33,33 6,67 0,21 101,43 10,14 100,00 0,14 65,24 6,52 media 10,75 media 6,62 micro ab 25,00 50,00 100,00 Prot mg/ml mit ab 0,02 8,10 3,24 25,00 0,04 16,67 3,33 50,00 0,07 30,95 3,10 100,00 media 3,22 Prot mg/ml 0,01 4,76 1,90 0,03 12,38 2,48 0,06 27,62 2,76 media 2,38 300 Determinación de las enzimas marcadoras para calcular la actividad enzimatica especifica necesitamos Cuantificacion de la sporteinas en las diferentes fraciones Calculos: Fracion S700 Oxidasa y reductasa Factor de dilución= (10,37mg/ml)/(1mg/ml)= 10,37 Factor de dilución= vol. diluido/ 100μl = 10,37; vol. diluido= 1037μl; Vol.diluyente (TES0,25)= 1037-100= 937μl = 0,937ml CPC = VMC x CPM = 25x10-3 x 1= 0,025 Deshidrogeneasa Factor de dilución= (10,37mg/ml)/(0,1mg/ml)= 103,7 Factor de dilución= vol. diluido/ 25μl = 103,7; vol. diluido= 2592,5μl; Vol.diluyente (TES0,25)= 2592,5-25= 2567,5μl = 2,567ml CPC = VMC x CPM = 25x10-3 x 0,1= 0,25 VR= 1000μl = 10-3 l Así con todas la fraciones, ver tabla. s700 concentracion (mg/ml) 10,37 factor d edilución 10,37 vol. diluyente 0,937 CPM (mg/ml) 1 CPC 0,025 mit 103,7 2,567 0,1 0,25 micro 2,29 2,29 0,129 1 0,025 22,9 0,547 0,1 0,25 cit 3,1 3,1 0,21 1 0,025 31 0,75 0,1 0,25 6,38 6,38 0,539 1 0,025 63,8 1,572 0,1 0,25 Variación de absorbancia por minuto Calculos: Para S700 ΔA/min1 = A60 – A 0 = -0,023 – (- 0,039)= 0,016 ΔA/min2 = A70 – A 10 = -0,021 – (- 0,037)= 0,016 ΔA/min3 = A80 – A 20 = -0,023 – (- 0,035)= 0,009 ΔA/min4 = A90 – A 30 = -0,023 – (- 0,035)= 0,012 Idem para el resto de las fraciones subcelulares. Resultados: tiempo 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 absorbancia reductasa s700 mit cit micro ΔA/min -0,039 -0,036 -0,061 -0,015 -0,037 -0,039 -0,051 -0,012 -0,032 -0,044 -0,058 -0,01 -0,035 -0,046 -0,056 -0,008 -0,033 -0,048 -0,052 -0,002 media en valor -0,028 -0,049 -0,054 0 absoluto -0,023 -0,051 -0,054 0,003 -0,021 -0,052 -0,052 0,006 -0,023 0,053 -0,052 0,01 -0,023 -0,055 -0,052 0,012 1 2 3 4 s700 mit cit micro 0,016 -0,015 0,007 0,018 0,016 -0,013 -0,001 0,018 0,009 0,097 0,006 0,02 0,012 -0,009 0,004 0,02 0,01325 0,015 0,004 0,019 -0,01256 -0,0225 -0,00325 -0,01925 tiempo 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 absorbancia oxidasa s700 mit cit micro ΔA/min 1,196 1,175 1,21 1,163 1,185 1,159 1,208 1,164 1,144 1,145 1,208 1,163 1,127 1,131 1,209 1,162 1,112 1,116 1,209 1,163 media en valor 1,102 1,098 1,208 1,165 absoluto 1,099 1,081 1,21 1,161 1,096 1,061 1,209 1,162 1,095 1,041 1,208 1,163 1,094 1,021 1,208 1,164 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Cálculos de la actividad enzimatica específica: AEE nmol min 1 mgprot 1 Calculo para la DH A / min 10 3 10 9 6 , 22 10 1 0 . 25 3 Cálculo para la reductasa y oxidasa AEE A / min 10 3 10 9 29 , 5 10 1 0 . 025 3 Ejemplo S700 para la oxidasa AEE 1 2 3 4 mit -0,097 -0,089 -0,049 -0,033 -0,067 -0,094 -0,098 -0,104 -0,11 -0,1015 0,0595 0,103375 cit 0 0,001 0 -0,001 0 micro -0,002 -0,002 0 0,002 -0,0005 0 0,000125 Deshidroabsorbancia geneasa s700 mit cit micro ΔA/min s700 mit cit micro 0,495 0,44 0,493 0,467 1 -0,028 -0,007 -0,042 -0,006 0,491 0,437 0,485 0,469 2 -0,03 -0,005 -0,043 -0,009 0,486 0,437 0,481 0,467 3 -0,031 -0,006 -0,048 -0,009 0,481 0,435 0,471 0,468 4 -0,031 -0,005 -0,046 -0,011 0,476 0,436 0,464 0,464 media -0,03 -0,00575 -0,04475 -0,00875 en valor 0,472 0,433 0,456 0,463 absoluto 0,0305 0,005438 0,045438 0,009437 0,467 0,433 0,451 0,461 0,461 0,432 0,442 0,46 0,455 0,431 0,433 0,458 0,45 0,43 0,425 0,457 tiempo AEE s700 0 , 067 10 3 10 9 29 , 5 10 1 0 . 025 3 90 ,84 A / min VR 10 M d CPC 9 s700 Citocromo c oxd. NADPH citocromo c Red Lactato DH mit micro Σ de fraciones cit 90,84 136,94 0,67 0 137,61 17,62 14,91 25,76 5,42 46,09 19,29 3,21 nmol/min*mg prot 5,14 28,74 37,09 Cálculo del porcentaje de cada enzima marcadora en las distintas fraciones: Porcentaje de marcadora en cada fracción = [ AEE de la marcadora en la fracción / Σ AEE de la marcadora en las 3 fraciones] x 100 Para la fracion mitocondrial porcentaje = (90,84/ 137,61) x 100 = 99,53 % resto de los caluculos son identicos, los resultados se expresan en la tabla. mit Citocromo c oxd. NADPH citocromo c Red Lactato DH micro cit 99,53% 0,47% 0% 32,35% 55,89% 11,76% 8,65% 13,85% 77,50% Existencia de contaminación: En F mitocondrial F microsomal F citosolica F mitocondrial -----------------------------+ + F microsomal ------------------------------+ F citosolica -+ ------------------------------