Efeito da Quimioterapia em Altas Doses

Ribeirão Preto
2006
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
KAREN DE LIMA PRATA
Efeito da quimioterapia em altas doses sobre as célulastronco mesenquimais humanas
Ribeirão Preto
2006
KAREN DE LIMA PRATA
Efeito da quimioterapia em altas doses sobre as célulastronco mesenquimais humanas
Dissertação
apresentada à
Faculdade
de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade
de São Paulo para obtenção do titulo de Mestre
em Clínica Médica.
Área de Concentração: Clínica Médica
Orientador: Prof. Dr. Dimas Tadeu Covas
Ribeirão Preto
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO OU DE
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Prata, Karen de Lima
Efeito da quimioterapia em altas doses sobre as células-tronco
mesenquimais humanas.
Ribeirão Preto, 2006.
200 p. : il.; 30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto/USP
Área de concentração: Clínica Médica.
Orientador: Covas, Dimas Tadeu
1. Células-tronco mesenquimais. 2. Injúria pós-quimioterapia. 3.
CFU-F. 4. Expansão celular. 5. Imunofenotipagem. 6.Diferenciação
multipotencial. 7. Sustentação da hematopoese.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Kar en de Lima Pr ata
Efeito da quimioterapia em altas doses sobre as células-tronco mesenquimais humanas.
Dissertação apresentada a Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para a obtenção do título de Mestre.
Área de concentração: Clínica Médica
Aprovado em:
Banca examinadora:
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição: _________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição: _________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição: _________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Dedico est e t r a ba lh o a o m eu qu er ido a vô, o P r ofessor Dr .
Weller son Lou r en ço de Lim a , Livre-docen t e de An a t om ia da
Un iver sida de F eder a l de Min a s Ger a is.
Apesa r de você t er pa r t ido pou co t em po a pós o m eu n a scim en t o,
a su a pr esen ça foi u m a con st a n t e n a m in h a vida .
Muit os for a m os seu s exem plos e a qu i r essa lt o a lgu n s com o o
est udo e a per sever a n ça qu e fizer a m com qu e u m ga r ot o, ór fã o
de pa i e de m ã e a os 5 a n os de ida de, se t orn a sse um dos a lu n os
m a is br ilha n t es de su a época , n a nossa fa cu lda de.
Cit o t a m bém , o seu a m or pela pr ofissã o de m édico e pr ofessor .
Você en sin ou a os seu s a lu n os, por m eio de pa la vr a s e exem plos,
a cu ida r da s pessoa s, e, a cim a de t u do, a r espeit á -la s com o
ser es h u m a n os, est eja m ela s fisica m ent e viva s ou n os ceden do o
cor po pa r a est udo, a pós t er em pa r t ido.
F or a m m u it os os r ela t os sobr e você, t odos com m u it o ca r inh o e
a dm ir a çã o, t a n t o por pa r t e dos n ossos fa m ilia r es qua nt o de
m u it os de seu s ex-a lu n os, que, segu in do o seu exem plo, se
t or n a r a m m eus pr ofessor es n a F a cu lda de de Medicina .
Sei qu e espir it u a lm en t e, você m e a com pa n h ou em t odos os
m om en t os dest a jor n a da , m e incen t iva n do e da ndo for ça pa r a
qu e eu ven cesse t oda s a s ba r r eir a s.
Dedico a você m eu qu er ido a vô Weller son , m eu a m igo, m eu
exem plo, m eu espelh o: est a vit ór ia .
AGRADECIMENTOS
Agr adeço de cor ação a t odos que de alguma f or ma
cont r ibuír am com a r ealização dest a pesquisa.
Em especial, agr adeço aos pacient es, que de f or ma
alt r uíst a, submet er am-se à dor f ísica da punção da
medula óssea e pr incipalment e, à dor mor al, da
lembr ança da ocasião do diagnóst ico e de t oda a
t er apêut ica, com o único obj et ivo de aj udar a ciência a
melhor ar o t r at ament o de pessoas com doenças
semelhant es à suas.
Aos m eu s pa is, Lu iz Ca r los e Bea t r iz, m eu s et er n os
am igos e com pa n h eir os, m eus exem plos, por t er em me
en sin a do a ser qu em sou e m e a poia do em t odos os
m om en t os dest a vida .
Aos m eu s ir m ã os, Cyn t h ia , Dia n a , Lídia , P edr o
H en r iqu e, Da n iel, Ra ph a el e J oa n a , pela com pr een são,
a poio e ca r in h o
As m in h a s a vós Cor in a e J a r y e a o m eu a vô Gigi, pelo
exem plo de vida .
Ao m eu qu er ido a m igo, m a is qu e especia l, pela pr esen ça
const a n t e, pela for ça e in cen t ivo du r a n t e t odo est e
pr ojet o.
Ao m eu or ien t a dor , o P r ofessor Dr . Dim a s Ta deu Cova s,
qu e con fiou em m im e m e pr opor cion ou opor t u n ida des
qu e m u da r a m a m in h a vida .
Agr adeço a todos aqueles que de alguma for ma par ticipar am da elabor ação deste
tr abalho. Enumero alguns, aos quais homenageio em nome de todos:
Abel Dor iga n Net o
P r of. D r Adem ilson E spen cer Soa r es E gea
Adr ia n a Dispósit o F er r eir a
An a F lá via Gem br e
An a Ma r ia An selm e Dor iga n
An e Rose Lopes da Silva
P r of. D r a Apa r ecida Ma r ia F on t es
P r of. D r An t ôn io Dor iva l Ca m pos
Br u n o Ma r cos Ver beno Azevedo
F a bia n a Roset t o de Mor a is
P r of. D r Gil Cu n h a De Sa n t is
J a ir o de Sou za
P r of. D r J ú lio Césa r Volt a r elli
Ka r in a Rosa Sola n o
P r of. D r a Kellen Cr ist ina Ribeir o Ma lm egr im de F a r ia s
P r of. D r a Lu cia na Cor r êa Oliveir a de Oliveir a
Lu cien e Medeir os
P r of. D r Lucia n o Neder
Lu iz Alber t o Ma r t ins de An dr a de
Ma r ia Ber n a det e Gia con i
P r of. Ma r ist ela Delga do Or ella n a
P r of. D r Ma r co An t on io Za go
P a t rícia Via n n a Bon in i P a lm a
P r of. D r a Rit a de Cá ssia Viu Ca r r a r a
Sa n dr a Na va r r o Br escia n i
Sidn ey P or cin cu la
P r of. D ra Sim on e Ka sh im a H a dda d
Va lér ia Men des Mot t a
P r of. D r Va n der son Rocha
Agr adeço à Faculdade de Medicina de Ribeir ão Pr eto da
Universidade de São Paulo e à Faculdade de Medicina da
Univer sidade Feder al de Minas Ger ais, instituições de
assistência, ensino e pesquisa, responsáveis pela minha formação
profissional, com as quais compartilhei tantos anos da minha vida.
Agr adeço aos dir etor es e funcionár ios do Centr o Regional de
Hemoter apia do HC-FMRP-USP e do Centr o de Ter apia
Celular (CEPID da FAPESP) pela oportunidade, pelo auxílio e
apoio no desenvolvimento deste trabalho.
Às agencias financiador as FAPESP (Fundação de Ampar o a
Pesquisa do Estado de São Paulo), CNPq (Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e FINEP
(Financiador a de Estudos e Pr ojetos) por propiciarem a
realização deste trabalho.
“Nascer , viver , mor r er ,
r enascer ainda e
pr ogr edir cont inuament e,
est a é a lei. ”
Allan Kar dec
RESUMO
PRATA, K. L. Efeito da quimioter apia em altas doses sobr e as células-tronco
mesenquimais humanas. 2006. 200f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, SP, 2006
As células-tronco mesenquimais (CTMs) constituem um grupo de células com capacidade de
diferenciação multipotencial. São de fácil isolamento e expansão ex vivo e, portanto, atrativas
para utilização na terapia celular. A quimioterapia em altas doses (QAD) é comumente
utilizada no tratamento de doenças hematológicas e auto-imunes. Entretanto, os possíveis
efeitos da QAD nas CTMs ainda são desconhecidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar as
CTMs isoladas de pacientes previamente submetidos a este tratamento. Foram selecionados
para este estudo 12 pacientes portadores de linfoma de Hodgkin (DH) ou não-Hogkin (LNH),
sem infiltração medular da doença, com idade entre 18 e 60 anos. Todos os pacientes foram
submetidos
ao
protocolo
BEAM
(BCNU,
etoposide,
aracytin,
melfalan)
como
condicionamento para o transplante autólogo. Como controles, foram utilizadas amostras de
medula óssea (MO) de 6 doadores normais (DN). Os pacientes foram classificados em
subgrupos segundo a idade (< 40 vs ≥ 40 anos), doença de base (DH vs LNH) e tempo após o
transplante (< 180 dias vs ≥1280 dias). Células mononucleares da MO foram obtidas por
centrifugação em gradiente de Ficoll-Hypaque. As CTMs foram isoladas por aderência ao
plástico e expandidas ex vivo, pelo cultivo em garrafas de cultura com meio α-MEM
enriquecido com 15% de soro bovino fetal. Quando confluentes, as células foram
tripsinizadas e expandidas. Os seguintes parâmetros foram avaliados: a) caracterização
morfológica; b) quantificação das unidades formadoras de colônias fibroblastóides (CFU-F);
c) tempo necessário para a duplicação celular; d) número de dias que as células
permaneceram em cultivo; e) expansão celular; f) tamanho, viabilidade celular,
imunofenotipagem e ciclo celular (por citometria de fluxo); g) potencial de diferenciação
multipotencial; h) capacidade de sustentação da hematopoese e expansão de células CD34+,
isoladas ex vivo do sangue de cordão umbilical e placentário. Os dados obtidos foram
utilizados para comparações entre o grupo de DN e o grupo de pacientes e entre os doadores
normais e os subgrupos acima descritos. Foram isoladas células com características
morfológicas e imunofenotípicas compatíveis com as CTMs de todas as amostras de MO
coletadas para este estudo. Dentre as amostras testadas, todas se diferenciaram in vitro em
adipócitos, osteócitos e condrócitos, demonstrado pela morfologia, imuno-histoquímica
(marcação com anticorpo monoclonal anti-colágeno II) ou expressão dos genes PPARγ e
osteopontina por análises de RT-PCR. Os resultados encontrados são heterogêneos e sugerem
que as CTMs são qualitativa e quantitativamente lesadas pela quimioterapia em altas doses. A
primeira foi evidenciada pela menor expansão em cultura, duração do cultivo, velocidade de
duplicação celular entre a 1ª e a 2ª passagem e capacidade de sustentação da hematopoese
tardia e segunda, pela redução na freqüência das CFU-F. Entretanto, mais estudos são
necessários para definir o quanto esta lesão limitaria a expansão e, conseqüentemente, o
sucesso do uso destas células na terapia.
Palavr as chave: células-tronco mesenquimais; injúria pós-quimioterapia; CFU-F; expansão
celular; imunofenotipagem; diferenciação multipotencial; sustentação da hematopoese.
ABSTRACT
PRATA, K. L. High dose chemother apy effect on human mesenchymal stem cells. 2006.
200f. Master Dissertation – School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo,
SP, 2006
Mesenchymal stem cells (MSCs) constitute a group of cells with multipotencial
differentiation capacities. They are easier to isolate and expand ex vivo and attractive for use
on cell therapy. The high dose chemotherapy (HDCT) is commonly used to treat
hematological and auto-immunes diseases. However, the possible effects of HDCT on MSCs
are still unknown. The aim of this study was to evaluate the MSCs isolated from patients after
HDCT. Twelve lymphoma’s patients (LP) with Hodgkin disease (HD) or non-Hodgkin
lymphoma (NHL), free of disease in bone marrow (BM) and whose age varied between 18
and 60 years old were enrolled in the study. All of them were submitted to the BEAM’s
protocol (BCNU, etoposide, aracytin, melfalan) as the conditioning regimen for autologous
transplantation. Six normal bone marrow donors (ND) samples were used as controls. The
patients were classified on subgroups based on age (< 40 vs ≥ 40 years old), disease (HD
versus NHL) and time after transplantation (< 180 days vs ≥1280 days). BM mononuclear
cells were obtained by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation. The MSCs were isolated by
plastic adherence and expanded ex vivo by cultivation in culture flasks with α-MEM culture
medium with 15% of fetal bovine serum. At confluence, the MSCs were harvested with
trypsin and expanded. The following parameters were evaluated: a) morphologic
characterization; b) colony-forming unit-fibroblast (CFU-F) frequency; c) doubling time; d)
maximal life span (days); e) cell expansion; f) size, cell viability, phenotypic characteristics
and cell cycle status (by flow cytometry); g) multi-lineage differentiation capacity; h) ex vivo
hematopoiesis-supportive function and cord blood CD34+ cells expansion. The results were
used to compare the ND group with the patients groups and the ND group with the subgroups
previously described. There were isolated cells with typical MSC morphology and
phenotypical characteristics from all BM samples collected for this study. All the tested
samples were capable of differentiating in vitro along the adipogenic, osteogenic and
chondrogenic lineages, demonstrated by morphology, imunohistochemistry (staining with
antibody specific for type II collagen) or RT-PCR analyses of expression of the PPARγ and
osteopontin genes. The results are heterogeneous and indicate that the MSCs are qualitative
and quantitatively damage by HDCT. The first one was demonstrated by reduction in cell
expansion, maximal life span, doubling time between the 1st and the 2nd passages and capacity
to support late hematopoiesis. The second one was shown by the reduction in colony-forming
unit-fibroblast (CFU-F) frequency. However, additional studies are needed to determine how
much this damage could limit the expansion and consequently, the success of the use of this
cell on therapy.
Keywor ds: mesenchymal stem cell; post-chemotherapy damage; CFU-F; cellular expansion;
flow cytometry analysis; multilineage differentiation; hematopoiesis-supportive function
analysis
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figur a 1: Definição de células-tronco .............................................................................................................................. 29
Figur a 2: Diagrama esquemático representando os possíveis mecanismos e explicações para a
“plasticidade” observada nas células-tronco somáticas ....................................................................................... 39
Figur a 3: Processo de maturação e diferenciação das CTMs ........................................................................ 52
Figur a 4: Distribuição das idades (anos) dos doadores normais, pacientes e seus subgrupos
...........................................................................................................................................................................................................................
99
Figur a 5: Caracterização morfológica das CTMs ................................................................................................ 101
Figur a 6: Quantificação das unidades formadoras de colônias fibroblastóides (x10-5 CMN
plaqueadas) dos doadores normais, dos pacientes e seus subgrupos ....................................................... 102
Figur a 7: Tempo (horas) necessário à duplicação das CTMs entre a 1ª e a 2ª passagem dos
doadores normais, dos pacientes e seus subgrupos .............................................................................................. 104
Figur a 8: Duração (dias) do cultivo das CTMs dos doadores normais, dos pacientes e seus
subgrupos .............................................................................................................................................................................................. 106
Figur a 9: Expansão final das CTMs dos doadores normais, dos pacientes e seus subgrupos
........................................................................................................................................................................................................................
107
Figur a 10: Subpopulações de CTMs .............................................................................................................................. 109
Figur a 11: Porcentagem de CTMs dos doadores normais e dos pacientes em cada uma das
subpopulações celulares ............................................................................................................................................................ 109
Figur a 12: Imunofenotipagem das CTMs do paciente 12 em 3ª passagem ...................................... 111
Figur a 13: Expressão antigênica (porcentagem) das proteínas de superfície das CTMs dos
doadores normais e dos pacientes....................................................................................................................................... 112
Figur a 14: Viabilidade das CTMs dos doadores normais e dos pacientes ........................................ 113
Figur a 15: Viabilidade das subpopulações de células pequenas, médias e grandes das CTMs
do paciente 10 em 3ª passagem ............................................................................................................................................ 114
Figur a 16: Viabilidade celular das diferentes subpopulações de acordo com os parâmetros
tamanho e complexidade interna ........................................................................................................................................ 115
Figur a 17: Análise do ciclo celular das CTMs do paciente 8 em 4ª passagem .............................. 116
Figur a 18: Porcentagem de células dos doadores normais e dos pacientes nas fases G0G1,
G2M e S do ciclo celular ........................................................................................................................................................... 116
Figur a 19: Exemplos de CTMs diferenciadas ex vivo em adipócitos ................................................... 117
Figur a 20: Exemplos de CTMs diferenciadas ex vivo em osteócitos .................................................... 118
Figur a 21: Avaliação da expressão dos genes PPARγ e osteopontina por RT-PCR durante a
diferenciação ex vivo das CTMs em adipócitos e osteócitos ......................................................................... 119
Figur a 22: Exemplos de CTMs diferenciadas ex vivo em condrócitos ................................................ 120
Figur a 23: Fotos ilustrativas do co-cultivo das CTMs com as CTHs e do ensaio clonogênico
........................................................................................................................................................................................................................
121
Figur a 24: Expansão das CTHs na ausência (CD34+) e presença de citocinas (CD34+ + Cit)
após co-cultivo com as CTMs por 7 dias ..................................................................................................................... 122
Figur a 25: Expansão das CTHs na ausência (CD34+) e presença de citocinas (CD34+ + Cit) e
após co-cultivo com as CTMs por 28 dias .................................................................................................................. 123
Figur a 26: Expansão das CFU GM e BFU-E após 7 dias de co-cultivo ............................................. 124
Figur a 27: Expansão das CFU GM e BFU-E após 28 dias de co-cultivo .......................................... 125
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1: Vantagens e desvantagens das células embrionárias e das células tronco somáticas
...........................................................................................................................................................................................................................
35
Tabela 2: Análise da expressão antigênica das proteínas de superfície das CTMs por
imunofenotipagem ............................................................................................................................................................................ 50
Tabela 3: CTMs e a resposta celular imunológica alogênica ......................................................................... 58
Tabela 4: Características dos pacientes estudados ................................................................................................. 73
Tabela 5: Primers utilizados para a análise da expressão dos genes PPARγ e da osteopontina
...........................................................................................................................................................................................................................
91
Tabela 6: Características das amostras de medula óssea dos pacientes avaliados ...................... 100
Tabela A.1: Esquemas de quimioterapia utilizados durante o tratamento dos pacientes ....... 178
Tabela
A.2:
Sinonímia,
distribuição
e
fisiologia
dos
antígenos
avaliados
na
imunofenotipagem por citometria de fluxo das CTMs ...................................................................................... 180
Tabela A.3: Hemogramas dos pacientes e doadores normais ..................................................................... 185
Tabela A.4: Quantificação das unidades formadoras de colônias fibroblastóides ...................... 186
Tabela A.5: Quantificação do tempo necessário (horas) à duplicação das CTMs entre a 1ª e a
2ª passagem ......................................................................................................................................................................................... 187
Tabela A.6: Quantificação dos dias em que as CTMs permaneceram em cultivo ...................... 188
Tabela A.7: Quantificação da expansão celular final em cultura das CTMs ................................... 189
Tabela A.8: Porcentagem de células em cada uma das subpopulações celulares ........................ 190
Tabela A.9: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de
células totais dos pacientes ..................................................................................................................................................... 191
Tabela A.10: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de
Tabela A.11: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de
células médias dos pacientes ................................................................................................................................................. 192
Tabela A.12: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de
células grandes dos pacientes ................................................................................................................................................ 193
Tabela A.13: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de
células totais dos doadores normais ................................................................................................................................. 194
Tabela A.14: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de
células pequenas dos doadores normais ........................................................................................................................ 194
Tabela A.15: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de
células médias dos doadores normais ............................................................................................................................. 195
Tabela A.16: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de
células grandes dos doadores normais ............................................................................................................................ 195
Tabela A.17: Porcentagem de células viáveis encontrados para a população total e subgrupos
classificados pelos parâmetros tamanho e complexidade interna .............................................................. 196
Tabela A.18: Porcentagem de CTMs, dos pacientes e doadores normais, na diferentes fases
do ciclo celular ................................................................................................................................................................................. 197
Tabela A.19: Expansão das CTHs após 7 dias de co-cultivo com as CTMs ................................... 198
Tabela A.20: Expansão das CTHs após 28 dias de co-cultivo com as CTMs ................................ 198
Tabela A.21: Expansão das CFU-GM e BFU-E, após o co-cultivo por 7 dias com CTMs de
pacientes e doadores normais, na ausência de citocinas ................................................................................... 199
Tabela A.22: Expansão CFU-GM e BFU-E, após o co-cultivo por 7 dias com CTMs de
pacientes e doadores normais, na presença de citocinas ................................................................................... 199
Tabela A.23: Expansão das CFU-GM e BFU-E, após o co-cultivo por 28 dias com CTMs de
pacientes e doadores normais, na ausência de citocinas ................................................................................... 200
Tabela A.24: Expansão CFU-GM e BFU-E, após o co-cultivo por 28 dias com CTMs de
pacientes e doadores normais, na presença de citocinas ................................................................................... 200
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3´= região carboxi-terminal do ácido nucléico
5´= região amino-terminal do ácido nucléico
5’ NT = ecto -5’- nucleotidase
ABVD = adriamicina, bleomicina, vimblastina e dacarbazina.
ALCAM = do inglês “activated leukocyte cell adhesion molecule”
AMP = do inglês “adenosine monophosphate”
BCL-2 = do inglês “B-cell lymphoma 2”
BEAM = BCNU, etoposide, citarabina (aracytin) e melfalan
bFGF = do inglês “basic fibroblast growth factor”
BFU-E = do inglês “burst forming unit- erythroid”
BMP-4 = do inglês “bone morphogenetic protein-4”
CAP = célula apresentadora de antígeno
Cbfa-1 = do inglês “core binding factor alpha1”
CD = do inglês “cluster of differentiation”
cDNA= do inglês “complementary desoxiribonucleic acid”
CE = célula embrionária
CFU-F = do inglês “colony forming unit-fibroblast”
CFU-GEMM = do inglês “colony forming unit-granulocyte-eritrocyte-monocyte-macrophage”
CFU-GM = do inglês “colony forming unit-granulocyte-monocyte”
CHCM = concentração da hemoglobina corpuscular média
CHOP = ciclofosfamida, adriamicina (hidroxydaunomycin), vincristina (oncovin) e prednisona.
CHOP-Bleo = CHOP-bleomicina.
CIA = crista ilíaca anterior
CIP = crista ilíaca posterior
CMN = células mononucleares
C-MOPPABV = ciclofosfamida, vincristina (oncovin), procarbazina, prednisona, adriamicina,
bleomicina e vimblastina.
CT = células-tronco
CTHs = células-tronco hematopoéticas
CTMs = células-tronco mesenquimais
Cy = ciclofosfamida
DCs = do inglês “dendritic cells”
DECH = doença do enxerto contra o hospedeiro
DH = doença de Hodgkin
DHAP = dexametasona, citarabina (high dose aracytin) e cisplatina (platinum)
DHCM = doença de Hodgkin celularidade mista
DHEN = doença de Hodgkin esclerose nodular
DHPL = doença de Hodgkin predomínio linfocitário
DMEM = do inglês “Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium”
DMSO = dimetilsulfóxido
DN = doador normal
DNA = do inglês “desoxiribonucleic acid”
dNTP = desoxirribonucleotídeo trifosfato
DP = doador paciente
DTT = ditiotreitol
EDTA = ácido etilenodiaminoteracético
EGF = do inglês “epidermal growth factor”
EPO = do inglês “erythropoietin”
ESHAP = etoposide, metilprednisona (solumedrol), citarabina (high dose aracytin) e cisplatina
(platinum)
Fab = do inglês “fragment, antigen binding”
Fc = do inglês “fragment, crystalizable”
FISH = do inglês “fluorescence in situ hybridization”
FITC = do inglês “fluorescein isothiocyanate”
Flt-3 lig = ligante do Flt-3
FSC = do inglês “forward scatter”
GB = glóbulos brancos
G-CSF = do inglês “granulocyte colony-stimulating factor”
GM-CSF = do inglês “granulocyte macrophage colony-stimulating factor”
GP = glicoproteína
Gr = granulócitos
GV = glóbulos vermelhos
Gy = grays
Hb = hemoglobina
HC-FMRP-USP = Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo
HCM = hemoglobina corpuscular média
HCRP = Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto
HE = hematoxilina e eosina
HLA= do inglês “human leucocyte antigen”
Ht = hematócrito
hTeRT = do inglês “human telomerase reverse transcriptase”
HUVEC = do inglês “human umbilical vein endothelial cells”
ICAM = do inglês “intercellular adhesion molecule”
IgG = imunoglobulina G
IgM = imunoglobulina M
IL = interleucina
INFγ = interferon γ
ISCT = do inglês “International Society for Cellular Therapy”
J AK = do inglês “Janus kinase”
KDR = do inglês “kinase insert domain containing receptor”
LFA = do inglês “lymphocyte function-associated”
LGCBD = linfoma de grandes células B difuso
LGCBM = linfoma de grandes células B primário do mediastino
Li = linfócitos
LIF = do inglês “leukemia inhibitory factor”
LMA = leucemia mielóide aguda
LNH = linfoma não-Hodgkin
LPL = do inglês “lipoprotein lípase”
LPS = lipopolissacáride
LTC-IC = do inglês “long-term culture-initiating cell”
L-VAP-2 = do inglês “lymphocyte-vascular adhesion protein 2”
MAPC = do inglês “multipotent adult progenitor cell”
M-CSF = do inglês “macrophage colony-stimulating factor”
mCTMs = células mesenquimais grandes e granulares, ativamente engajadas no ciclo celular
MIAMI = do inglês, “ marrow-isolated adult multilineage inducible”
MIFAP = mitoxantrone, fludarabina, citarabina (aracytin) e cisplatina (platinum)
MINE = mesna, ifosfamida, mitoxantrone (novantrone) e etoposide
MMP = do inglês “matrix metalloproteinase”
MO = medula óssea
Mo = monócitos
MOPP = mostarda nitrogenada, vincristina (oncovin), procarbazina e prednisona
MPC = do inglês “mesodermal progenitor cell”
MSC = do inglês “mesenchymal stem cell”
NK = do inglês “natural killer”
OI = osteogenesis imperfecta
OSM = oncostatina M
OST = osteopontina
P25 = percentil 25
P75 = percentil 75
PBS = do inglês “phosphate buffered saline”
PCR = do inglês “polymerase chain reaction”
PDGF = do inglês “platelet-derived growth factor”
PE = do inglês “phycoeritrin”
PECAM = do inglês “platelet-endothelial cell adhesion molecule”
Per CP = do inglês “peridinin chlorophyll”
PG = população de células grandes
PI = do inglês “propidium iodide”
Plaq = plaquetas
PM = população de células médias
PP = população de células pequenas
PPARγ2 = do inglês “peroxisome proliferation-activated receptor”
PT = população de células totais
PTK = do inglês “protein tyrosine kinase”
PUVA = psoralenico ultravioleta-A
QT = quimioterapia
R = receptor
R1 = região ou janela 1 (representa a população de células pequenas)
R2= região ou janela 2 (representa a população de células médias)
R3= região ou janela 3 (representa a população de células grandes)
RDW = do inglês “red cell distribution width”
REX-1 = do inglês, “reduced expression”
RNA = do ingles “ribonucleic acid”
RPMI = meio “Roswell Park Memorial Institute”
RS = do inglês “recycling stem cell”
RT-PCR = do inglês “reverse transcription polymerase chain reaction”
Saf O = safranina O
SBF = soro bovino fetal
SCF = do inglês “stem cell factor”
SCID = do inglês “severe combined immunodeficiency”
SCUP = sangue de cordão umbilical e placentário
SSC = do inglês “side scatter”
SSEA-4 = do inglês “stage-specific embrionic antigens-4”
STC-IC = do inglês “short-term culture-initiating cell”
T25 = garrafas de cultivo com tamanho de 25cm3
T75 = garrafas de cultivo com tamanho de 75cm3
TCR = do inglês “T cell receptor”
TGF-β = do inglês “transforming growth factor – β”
TM = tricômico de Masson
TMO = transplante de medula óssea
TNF = do inglês “tumor necrosis factor”
TPO = do inglês “thrombopoietin”
USSC = do inglês “unrestricted somatic stem cells”
VCAM = do inglês “vascular celular adhesion molecule”
VCM = volume corpuscular médio
VEGF = do inglês “vascular endothelial growth factor”
VLA = do inglês “very late activation antigen”
vWF = do inglês “von Willebrand factor”
α-MEM = do inglês “minimal essential médium-alpha”
SUMÁRIO
Página
1 Introdução ....................................................................................................................................................................................27
1.1 Definição de célula-tronco e progenitora .............................................................................................. 28
1.2 Classificação ...................................................................................................................................................................... 30
1.2.1 Quanto ao potencial de diferenciação ................................................................................................... 30
1.2.2 Quanto à origem ..................................................................................................................................................... 31
1.2.2.1 As células-tronco embrionárias .................................................................................................... 31
1.2.2.2 As células-tronco somáticas ou do adulto ......................................................................... 31
1.3 Plasticidade .................................................................................................................................................................... 36
1.3.1 Existência de múltiplas células-tronco nos tecidos .................................................................... 36
1.3.2 Fusão celular .............................................................................................................................................................. 37
1.3.3 Trans des-/re-difereciação ou conversão ............................................................................................ 37
1.3.4 Pluripotencialidade ............................................................................................................................................... 38
1.4 Terapia celular ........................................................................................................................................................... 39
1.5 As células-tronco mesenquimais ................................................................................................................. 40
1.5.1 Histórico ........................................................................................................................................................................ 40
1.5.2 Denominações utilizadas ................................................................................................................................. 40
1.5.3 Ontogenia das CTMs .......................................................................................................................................... 41
1.5.4 Fontes ............................................................................................................................................................................... 42
1.5.5 Isolamento e cultivo das CTMs de MO ............................................................................................... 43
1.5.6 Características morfológicas e imunocitoquímicas .................................................................... 44
1.5.7 Quantificação das unidades formadoras de colônias fibroblatóides ............................ 45
1.5.8 Fases evolutivas do cultivo ex vivo das CTMs .............................................................................. 45
1.5.9 Cinética da expansão das CTMs ex vivo ............................................................................................. 46
1.5.10 Cinética da proliferação celular .............................................................................................................. 46
1.5.11 Capacidade de duplicação em cultura ................................................................................................ 47
1.5.12 Fatores que interferem no crescimento e expansão celulares ......................................... 48
1.5.12.1 Concentração de soro bovino fetal ......................................................................................... 48
1.5.12.2 Idade ................................................................................................................................................................ 48
1.5.12.3 Amostra ......................................................................................................................................................... 48
1.5.13 Imunofenotipagem das CTMs .................................................................................................................. 49
1.5.14 Ciclo celular ............................................................................................................................................................ 51
1.5.15 Diferenciação ......................................................................................................................................................... 51
1.5.16 Produção de fatores de crescimento, interleucinas e citocinas ...................................... 54
1.5.17 Importância das CTMs na hematopoese .......................................................................................... 57
1.5.18 Características imunológicas das CTMs .......................................................................................... 57
1.5.19 Lesão estromal pós-quimioterapia ........................................................................................................ 59
1.5.20 Transplantabilidade das CTMs ................................................................................................................ 62
1.5.20.1 Repopulação do microambiente estromal do receptor por células
estromais do doador .................................................................................................................................................. 63
1.5.21 Possíveis aplicações clínicas para as CTMs ................................................................................. 64
1.5.21.1 Resultados pré-clínicos .................................................................................................................... 64
1.5.21.2 Resultados clínicos .............................................................................................................................. 65
1.5.21.3 Terapia gênica .......................................................................................................................................... 68
2 Hipóteses ....................................................................................................................................................................................... 70
3 Objetivos ....................................................................................................................................................................................... 70
3.1 Objetivo geral .................................................................................................................................................................. 70
3.2 Objetivos específicos .................................................................................................................................................. 70
4 Material e Métodos ......................................................................................................................................................... 71
4.1 Seleção dos pacientes e dos controles .......................................................................................................... 72
4.1.1 Pacientes ................................................................................................................................................................... 72
4.1.2 Controles .................................................................................................................................................................. 74
4.1.3 Aspectos éticos .................................................................................................................................................... 74
4.2 Coleta e processamento das amostras de sangue periférico ................................................... 75
4.3 Coleta das amostras de medula óssea ......................................................................................................... 75
4.4 Processamento das amostras de medula óssea ................................................................................... 76
4.4.1 Isolamento das células mononucleares .............................................................................................. 76
4.4.2 Contagem celular em câmara de Neubauer .................................................................................... 77
4.4.3 Isolamento e cultivo das CTMs .............................................................................................................. 77
4.4.4 Quantificação das CFU-F ................................................................................................................................ 78
4.4.5 Tripsinização ......................................................................................................................................................... 79
4.4.6 Cultivo e Expansão das CTMs ................................................................................................................ 80
4.4.7 Congelamento e descongelamento ....................................................................................................... 81
4.4.8 Imunofenotipagem das CTMs .................................................................................................................. 81
4.4.8.1 Marcação direta ..................................................................................................................................... 84
4.4.8.2 Marcação indireta ................................................................................................................................. 84
4.4.9 Viabilidade celular ............................................................................................................................................ 85
4.4.10 Avaliação do ciclo celular ........................................................................................................................ 86
4.4.11 Diferenciação das CTMs em adipócitos, osteócitos e condrócitos ........................... 87
4.4.11.1 Adipócitos e osteócitos ................................................................................................................. 87
4.4.11.2 Condrócitos ............................................................................................................................................ 88
4.4.12 Avaliação da morfológica das células ............................................................................................. 89
4.4.13 Análise da expressão gênica para avaliação da diferenciação celular .................... 90
4.4.14 Sustentação da hematopoese .................................................................................................................. 92
4.4.14.1 Isolamento de células CD34+ de SCUP ............................................................................ 92
4.4.14.1.1 Marcação das células ........................................................................................................ 93
4.4.14.1.2 Separação pela coluna imunomagnética ............................................................. 93
4.4.14.2 Co-cultivo das CTMs e CTHs ................................................................................................. 94
4.4.14.3 Ensaio clonogênico .......................................................................................................................... 95
4.5 Análise estatística ......................................................................................................................................................... 96
5 Resultados ................................................................................................................................................................................... 97
5.1 Características dos pacientes estudados .................................................................................................. 98
5.2 Características das amostras de sangue periférico e medula óssea ................................. 99
5.3 Isolamento e cultivo das células-tronco mesenquimais ........................................................... 101
5.3.1 Caracterização morfológica .................................................................................................................... 101
5.3.2 Quantificação das unidades formadoras de colônias fibroblastóides ...................... 102
5.3.3 Quantificação do tempo de duplicação das CTMs ................................................................ 103
5.3.4 Quantificação dos dias que as CTMs permaneceram em cultivo ............................... 105
5.3.5 Expansão celular em cultura ................................................................................................................... 107
5.4 Avaliação do tamanho e complexidade interna das CTMs .................................................. 108
5.5 Imunofenotipagem das CTMs ........................................................................................................................ 110
5.6 Avaliação da viabilidade celular .................................................................................................................. 113
5.7 Avaliação do ciclo celular ................................................................................................................................... 115
5.8 Diferenciação das CTMs em adipócitos, osteócitos e condrócitos ................................. 117
5.9 Sustentação da hematopoese ........................................................................................................................... 120
6 Discussão ................................................................................................................................................................................... 126
6.1 São as mesenquimais células-tronco? ...................................................................................................... 127
6.2 Porque estudar as células-tronco somáticas? ................................................................................... 129
6.3 Características dos pacientes e das amostras estudadas ........................................................ 130
6.4 Isolamento, cultivo e expansão das CTMs .......................................................................................... 132
6.4.1 Isolamento e cultivo ...................................................................................................................................... 132
6.4.2 Cinética da expansão celular .................................................................................................................. 133
6.4.3 Tempo necessário à duplicação celular .......................................................................................... 134
6.4.4 Duração do cultivo e capacidade de expansão ex vivo das CTMs ............................ 135
6.5 Quantificação das CFU-F ................................................................................................................................... 138
6.6 Características das CTMs avaliadas por citometria de fluxo ............................................ 140
6.7 Potencial de diferenciação ................................................................................................................................. 143
6.8 Sustentação da hematopoese ........................................................................................................................... 147
6.9 Lesão estromal pós-quimioterapia ............................................................................................................. 152
6.10 Uso terapêutico das CTMs ............................................................................................................................. 154
7 Conclusões ............................................................................................................................................................................... 156
Referências ................................................................................................................................................................................... 158
Apêndices ....................................................................................................................................................................................... 173
APÊNDICE A - Termo de consentimento livre e esclarecido dos pacientes ......................... 174
APÊNDICE B - Termo de consentimento livre e esclarecido dos doadores normais ..... 176
APÊNDICE C - Esquemas de quimioterapia utilizados ........................................................................ 178
APÊNDICE D - Sinonímia, distribuição e fisiologia dos antígenos de superfície avaliados
...............................................................................................................................................................................................................
180
APÊNDICE E - Resultados dos hemogramas ............................................................................................... 185
APÊNDICE F - Quantificação das CFU-F ...................................................................................................... 186
APÊNDICE G - Tempo necessário à duplicação celular ...................................................................... 187
APÊNDICE H - Dias de cultivo das CTMs .................................................................................................... 188
APÊNDICE I - Expansão celular final das CTMs ..................................................................................... 189
APÊNDICE J - Análise do tamanho e complexidade interna das células ............................... 190
APÊNDICE L - Caracterização imunofenotípica das CTMs dos pacientes ........................... 191
APÊNDICE M - Caracterização imunofenotípica das CTMs dos doadores normais ..... 194
APÊNDICE N - Viabilidade celular .......................................................................................................... 196
APÊNDICE O - Análise do ciclo celular ............................................................................................... 197
APÊNDICE P - Expansão das células-tronco hematopoéticas ......................................................... 198
APÊNDICE Q - Expansão das GM-CSF e BFU-E no ensaio de STC-IC ............................... 199
APÊNDICE R - Expansão das GM-CSF e BFU-E no ensaio de LTC-IC ............................... 200
1 I NTRODUÇÃO
Introdução
28
Nos últimos anos, testemunhamos uma explosão de interesse no uso das células-tronco
(CT) como ferramenta para terapia celular e gênica. Isto tem sido impulsionado devido a
inúmeras descobertas, mas em especial, a de que estas são capazes de se diferenciar em
células de diversas linhagens.
Presentes nos mais diversos tecidos e responsáveis pela regeneração destes no decorrer
da vida, células-tronco como as hematopoéticas, as mesenquimais, as endoteliais, as neurais,
dentre muitas outras, das mais diversas origens e com diferentes potenciais de diferenciação e
proliferação, vêm sendo amplamente estudadas.
Com isto, a medicina regenerativa desponta na atualidade como uma modalidade
terapêutica promissora e a terapia celular como possibilidade de tratamento de diversas
doenças, até o presente momento, consideradas incuráveis, tais como a doença de Parkinson,
o diabetes, a insuficiência cardíaca crônica, a insuficiência hepática, dentre muitas outras.
Todas, doenças cuja recuperação da função dos tecidos lesados é necessária.
1.1 Definição de célula-tr onco e pr ogenitor a:
Muitas são as especulações a respeito do conceito de célula-tronco. Parker et al. (2004)
descreveram a opinião de diversos autores sobre o tema e concluem que o consenso sobre o
assunto é pequeno ou mesmo inexistente.
Classicamente, as CT são definidas com base em três de suas principais características:
a) capacidade de auto-renovação, ou a habilidade de gerar no mínimo uma célula-filha com
características similares às da célula mãe; b) capacidade de uma única célula de se diferenciar
em múltiplas linhagens celulares; c) capacidade de reconstituir funcionalmente, in vivo, um
tecido lesado (VERFAILLIE, 2002). Estas características foram demonstradas nas célulastronco hematopoéticas (CTHs) e nas embrionárias (CE), mas com o avanço da ciência, outras
células foram isoladas e conceituadas como células-tronco, mesmo sem compartilhar todas
Introdução
29
estas propriedades, como por exemplo as células-tronco mesenquimais (CTMs). A Figura 1
ilustra estes critérios.
(a) Auto-renovação
Células-tronco
(c) Repopulação
funcional
Leucócitos
Proliferação
celular
Radioterapia
(b) Potencial de diferenciação em
múltiplas linhagens
Figur a 1: Definição de células-tr onco. As células-tronco são definidas como aquelas com: a)
capacidade de divisão assimétrica; b) habilidade de uma única célula se diferenciar em
diferentes linhagens celulares; c) competência em reconstituir um tecido funcionalmente
in vivo (Adaptado de VERFAILLIE, 2002).
Outros autores definem as CT como populações de células que se auto-renovam por
divisão simétrica ou assimétrica ou que são capazes de se diferenciar em múltiplos tipos de
células especializadas, sem serem tão rigorosos quanto aos critérios de auto-renovação
ilimitada e substancial contribuição para o tecido em desenvolvimento (CAI; WEISS; RAO,
2004).
Fica claro que os conceitos expostos por Verfaillie (2002) e Cai et al. (2004) são
distintos e esbarram em um outro conceito importante a ser esclarecido, mesmo que
parcialmente: o de célula progenitora ou precursora. Simplificadamente, estas seriam as
células comprometidas com uma determinada linhagem celular. Portanto, possuem
capacidade de auto-renovação limitada ou ausente e habilidade de se diferenciar apenas em
tipos celulares previamente definidos (LAKSHMIPATHY; VERFAILLIE, 2005), ou seja, em
células especializadas da linhagem celular em questão.
Introdução
30
O ponto de conflito nestas definições está no limite a partir do qual a célula deixa de ser
considerada como tronco e passa a ser considerada como progenitora. Este limite está longe
de ser definido e, portanto, dependendo do rigor a ser aplicado (mais liberal ou restritivo), a
mesma célula pode ser considerada por alguns autores como tronco e por outros, como
progenitora.
Fato é que a busca pelo entendimento sobre as propriedades destas células, sejam elas
relacionadas à sua assinatura molecular ou às suas características biológicas, é uma constante
e ainda há muito que se aprender sobre o assunto.
1.2 Classificação:
1.2.1 Quanto ao potencial de difer enciação:
As células-tronco podem ser subclassificadas de acordo com o seu potencial de
diferenciação e/ou origem. São totipotentes quando, em condições propícias (suporte
materno) diferenciam-se nas membranas e tecidos extra-embrionários, no embrião e em todos
os tecidos e órgãos fetais, ou seja, originam um novo indivíduo. As plur ipotentes têm a
habilidade de originar as células dos três folhetos embrionários (ectoderma, endoderma e
mesoderma), ou seja, qualquer célula do organismo, mas são incapazes de gerar um novo
indivíduo (VERFAILLIE; PERA; LANSDORP, 2002). Já as multipotentes originam quatro
ou mais linhagens celulares (ex.: CTMs e CTHs). Também podem ser tr i, bi ou unipotentes
se originarem três, dois ou apenas um tipo celular, respectivamente (YOUNG; BLACK Jr.,
2004).
Classicamente, as células toti ou pluripotentes são de origem embrionária enquanto as
células multi ou unipotentes são encontradas no feto, na criança e no adulto.
Introdução
31
1.2.2 Quanto à or igem:
1.2.2.1 Células-tr onco embr ionárias:
Considera-se como célula embrionária aquela que constitui a massa interna do
blastocisto (embrioblasto) e que pode ser removida e cultivada em laboratório. Esta pode se
proliferar indefinidamente, mantendo o seu potencial de diferenciação em todos os tecidos do
organismo em desenvolvimento (DALEY; GOODELL; SNYDER, 2003).
Atualmente, não há estudos de terapia celular utilizando as CE em humanos. Contudo,
estas representam uma fonte extraordinária de células, com aplicação potencial em inúmeras
doenças. Três características tornam estas células mais atrativas que as CT do adulto: a)
podem crescer indefinidamente em cultura; b) podem ser geneticamente manipuladas mais
facilmente, o que permite a correção, pela introdução de transgenes, da perda de genes
funcionais; c) podem gerar quase todos os tipos celulares (WOBUS; BOHELER, 2005).
Estudos ex vivo e em modelos animais estão sendo realizados buscando entre outros, a
regeneração cardíaca e neural, a diferenciação em células β das ilhotas pancreáticas
funcionantes e em células endoteliais capazes de originar estruturas vasculares, além da
clonagem terapêutica, o que possibilitaria não só a terapia celular mas também a gênica.
Estes estudos, porém, se encontram em fases iniciais e dificuldades como a
diferenciação ineficiente, a imuno e tumorogenicidade em adição a questões éticas complexas
demonstram que ainda há muito que se discutir, estudar e aprender sobre estas células antes
de seu uso terapêutico (WOBUS; BOHELER, 2005).
1.2.2.1 Células-tr onco somáticas ou do adulto:
Populações de CT somáticas podem ser encontradas na maioria dos tecidos do adulto, e,
em geral, o seu potencial de diferenciação reflete a população celular local. Já foram descritas,
dentre outras, as CT hematopoéticas (SPANGRUDE; HEIMFELD; WEISSMAN, 1988), as
Introdução
32
hepáticas (BRILL et al., 1993), as epidermais (JONES; HARPER; WATT, 1995), as neurais
(GAGE; RAY; FISHER, 1995) e as mesenquimais (FRIEDENSTEIN; PIATETZKYSHAPIRO; PETRAKOVA, 1966; CAPLAN, 1991; PITTENGER et al., 1999).
O desenvolvimento de um organismo multicelular está acompanhado de uma série de
eventos pré-programados pelo genoma. Estes eventos englobam a proliferação celular, o
comprometimento, a expressão e inibição de genes relacionados com as linhagens celulares e
a regulação da apoptose. A progressão seqüencial por estes eventos resulta na formação das
diferentes células, tecidos e órgãos que constituem o indivíduo. Apesar de, a maioria das
células seguir esta seqüência durante o desenvolvimento, um pequeno número não o faz,
tornando-se assim um reservatório de células indiferenciadas que permanecem no indivíduo
adulto e que estão diretamente envolvidas na manutenção da integridade e no reparo dos
órgãos e tecidos por toda a vida (YOUNG; BLACK Jr., 2004).
Até recentemente, acreditava-se que todas as células-tronco somáticas eram limitadas a
originar células de linhagens específicas. Esta limitação seria imposta pela restrição da
expressão de genes críticos, porém fundamentais para a manutenção da integridade tecidual
durante o turnover normal das células e o reparo tissular (VERFAILLIE; PERA;
LANSDORP, 2002).
Atualmente, estudos têm demonstrado a presença de duas categorias principais de
células-tronco somáticas: as comprometidas e as não-comprometidas com as linhagens
celulares. As células-tronco comprometidas podem ser multi, tri, bi ou unipotentes e possuem
as seguintes características: a) perfil de expressão das proteínas de superfície, que
caracterizam estas células à imunofenotipagem; b) limite de proliferação celular em até 50 a
70 divisões, conforme o limite de Hayflick (1965), antes de a célula ser direcionada para
senescência e apoptose; c) falta de resposta a agentes indutores à diferenciação em outras
linhagens, distintas daquela com a qual a célula encontrava-se previamente comprometida; d)
Introdução
33
resposta aos agentes indutores à proliferação celular, como os fatores de crescimento; e)
resposta aos agentes de progressão, isto é, que diminuem o tempo mínimo necessário para a
expressão de marcadores fenotípicos de diferenciação; f) quiescência em cultivo em meio sem
soro ou sem agentes de progressão, proliferação ou inibitórios.
As CTs não-comprometidas, ou seja, as pluripotentes, compartilham com as
comprometidas a quiescência nas mesmas condições de cultivo e a resposta aos agentes de
proliferação celular. Diferenciam-se na capacidade de auto-renovação sem perda da
capacidade pluripotencial ultrapassando, em muito, o limite de Hayflick. Além disso, são
telomerase-positivas e não são responsivas aos fatores de progressão (YOUNG; BLACK Jr.,
2004).
Reyes et al. (2001), isolaram, da medula óssea (MO) de doadores normais voluntários, e
expandiram, extensivamente ex vivo, células com potencial de diferenciação individual, não
apenas em osteoblastos, condrócitos, adipócitos, estroma de sustentação da hematopoese e
mioblastos esqueléticos, mas também em células endoteliais de origem mesodermal. Esta
célula foi denominada pelos autores como MPC (do inglês, mesodermal progenitor cell).
Posteriormente, este mesmo grupo descreveu a MAPC (do inglês, multipotent adult
progenitor cell). Após cultivo em meio indutor específico, a MAPC se diferenciou, ex vivo,
em células que expressavam marcadores de origem endo-, meso- ou neuro-ectodermal. Esta
capacidade pluripotente também foi observada in vivo quando a MAPC foi injetada em um
blastocisto murino ou transplantada em camundongos imunodeficientes irradiados subletalmente. Além disso, esta célula se prolifera extensivamente, duplicando-se mais de 80x
sem senescência óbvia e ou perda do potencial de diferenciação (JIANG et al., 2002). A
MAPC foi isolada em humanos, ratos e camundongos, na MO, cérebro e tecido muscular. Ela
possui algumas características similares às CTMs como, por exemplo, a capacidade de aderir
ao plástico, contudo, a correlação entre estas células ainda não está clara. A MAPC pode ser a
Introdução
34
precursora da CTM, mas também, pode representar uma população celular gerada
artificialmente em laboratório e que, portanto, não possui correspondente celular in vivo
(DAZZI et al., 2006). Além disso, o isolamento da MAPC é um desafio para os pesquisadores
e ainda necessita de ser reproduzido em outros laboratórios (HORWITZ, 2003).
D’Ippolito et al. (2004) isolaram da MO vertebral de homens e mulheres com idade
entre 3 e 72 anos de idade, células com potencial de diferenciação em múltiplas linhagens. Os
pesquisadores cultivaram as células aderentes e as não-aderentes, sem separação prévia por
gradiente de densidade ou imunosseleção, em uma densidade constante de 105 células/cm2,
em frascos recobertos por fibronectina, no meio de cultivo DMEM (do inglês, Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium) com baixo teor de glicose, enriquecido com 5% de soro bovino
fetal (SBF) sem citocinas e em ambiente com baixa tensão de oxigênio (3% O2, 5% CO2 e 2%
N2). Estas condições de cultivo selecionaram/expandiram células CD34- e CD45- e que
expressavam por RT-PCR (do inglês, reverse transcription polymerase chain reaction),
marcadores de células primitivas como o Oct-4 (do inglês, octamer-4), Rex-1 (do inglês,
reduced expression), SSEA-4 (do inglês, stage-specific embrionic antigens-4) e o hTeRT (do
inglês, human telomerase reverse transcriptase) mesmo após 30 duplicações celulares. Estas
células foram também diferenciadas em osteoblastos, condrócitos, adipócitos, células neurais
e em colônias de células esféricas, que expressavam genes associados às ilhotas pancreáticas.
Além disso, as MIAMIs proliferaram extensivamente sem evidência de senescência ou de
perda do potencial de diferenciação.
Kogler et al. (2004), descreveram uma população de células pluripotentes do sangue de
cordão umbilical e placentário (SCUP) humano, que não expressavam o marcador CD45
(CD45-) as quais foram denominadas USSCs (do inglês, unrestricted somatic stem cells). Esta
rara população de células cresce aderente ao plástico e pode ser expandida por inúmeras
vezes, sem perda da pluripotencialidade. Elas se diferenciam ex vivo em osteoblastos,
Introdução
35
condroblastos, adipócitos, células neurais e hematopoéticas e, in vivo, em células das
linhagens mesodérmica e endodérmica, sem a formação de tumores.
Um outro grupo isolou e descreveu uma célula-tronco mesenquimal do SCUP humano,
obtida por seleção negativa e diluição limitante, que após expansão clonal, apresentou
potencial de diferenciação nas linhagens óssea, cartilaginosa, adipocítica, neuroglial e
hepática. O imunofenótipo foi consistente com o da CTM isolada da MO (LEE, O. et al.,
2004).
Como demonstrado pelos diversos autores acima citados, existem no organismo humano
adulto e no SCUP, células-tronco somáticas com capacidade irrestrita de diferenciação,
representando assim, fontes alternativas às células embrionárias, para o tratamento de doenças
crônico-degenerativas e genéticas. A Tabela 1 sumariza as vantagens e desvantagens da
utilização das CE e das CT somáticas.
Tabela 1: Vantagens e desvantagens das células embr ionár ias e das células-tr onco somáticas:
Vantagens
CE
humana
Teoricamente pode originar todos os
tecidos;
Alguns tecidos são mais fáceis de
serem gerados (ex: cardiomiócito);
Podem propagar-se indefinidamente;
Sensíveis à manipulação genética?
Autóloga ou alogênica;
CT
somática Maioria com diferenciação em
humana linhagens pré-definidas;
Algumas com grande capacidade de
auto-renovação;
Muitos tipos e fontes;
Não tumorogênica;
Passível de manipulação gênica;
Métodos potenciais de infusão
atrativos;
Sem questões éticas complexas.
Desvantagens
As condições de diferenciação ainda
necessitam ser estabelecidas;
Alguns tecidos são difíceis de serem
gerados (ex: sangue);
Somente uso alogênico: pode induzir
à rejeição ou a DECH;
Formação de teratomas e
teratocarcinomas;
Questões éticas.
Uso autólogo (incomodo e caro);
Raras células com capacidade de
diferenciação em outras linhagens;
Maioria tem capacidade de autorenovação limitada;
Introdução
36
1.3 Plasticidade:
Vários estudos sugerem que as CT somáticas podem ter a habilidade de atravessar as
barreiras das linhagens celulares e adotar um perfil de expressão gênica, função e fenótipo de
células de outros tecidos (HERZOG; CHAI; KRAUSE, 2003). Isto ocorreria por um
mecanismo conhecido por plasticidade, mas que ainda está longe de ser esclarecido
(VERFAILLIE, 2005). A falta de uma definição clara sobre este processo vem acarretando no
uso errôneo desta terminologia, principalmente quando utilizado em estudos com células não
purificadas.
Lakshmipathy e Verfaillie (2005) definiram a plasticidade celular com base nos
seguintes critérios: a) uma única célula pode diferenciar-se em múltiplas linhagens celulares;
b) as células diferenciadas são funcionais in vivo e ex vivo; c) a enxertia é robusta e
persistente.
Existem no mínimo quatro teorias possíveis para explicar a “plasticidade” celular
(VERFAILLIE, 2002; HORWITZ, 2003; HERZOG; CHAI; KRAUSE, 2003; WAGERS;
WEISSMAN, 2004; LAKSHMIPATHY; VERFAILLIE, 2005):
1.3.1 Existência de múltiplas células-tr onco nos tecidos:
A teoria de que existem, mesmo em tecidos não relacionados, múltiplas células-tronco
comprometidas com diferentes linhagens celulares, foi elegantemente demonstrada pela
presença da CTH no músculo esquelético (MCKINNEY-FREEMAN et al., 2002). A coinfusão destas células acarretaria na enxertia de diversos órgãos. Não constitui plasticidade
celular verdadeira e pode ser a explicação para estudos baseados na infusão de células não
purificadas.
Introdução
37
1.3.2 Fusão celular :
A fusão celular é um fenômeno biológico já amplamente conhecido. Ocorre in vivo e ex
vivo, principalmente nas células cuja poliploidia é comumente vista, incluindo hepatócitos,
células musculares esqueléticas, cardíacas e de purkinje. A fusão das células transplantadas
com as do hospedeiro acarretaria na transferência do material genético gerando uma célula
tetraplóide.
Lagasse et al. (2000) demonstraram que a infusão CTHs purificadas da MO em
camundongos fumarilacetoacetato hidrolase (-/-), modelo animal da tirosinemia tipo I, não só
evitava a morte dos animais, mas também resgatava a função bioquímica do fígado. Este
mesmo grupo demonstrou anos depois, que os hepatócitos que repopularam o fígado eram
heterozigotos para os alelos do doador da MO, em contraste com as células originais
homozigotas. Além disso, estudos de citogenética indicaram que os hepatócitos derivados da
MO se originaram da fusão celular e não da diferenciação das CTHs (WANG et al., 2003).
Estes dados sugerem que a aparente plasticidade de um determinado tipo de célulatronco pode ser resultante da fusão celular, que, portanto, deve ser cuidadosamente excluída
pelos autores, como explicação de seus achados.
1.3.3 Tr ans des-/r e-diferenciação ou conver são:
A transdiferenciação ou conversão refere-se à habilidade de uma célula comprometida
com uma linhagem celular em alterar a sua expressão gênica para a de uma linhagem celular
completamente diferente. Este fenômeno representa a verdadeira plasticidade e ocorre
fisiologicamente em plantas e anfíbios.
Os supostos mecanismos envolvidos incluem a transdiferenciação indireta e a direta. A
primeira requer a des-diferenciação em uma CT mais primitiva, seguida da re-diferenciação
em uma via alternativa, enquanto que na segunda há uma transição direta de uma via para a
Introdução
38
outra, após a ativação de um programa de diferenciação latente. Assim, as células-tronco, as
progenitoras ou quem sabe, as especializadas, quando removidas do seu nicho usual e
introduzidas em um outro diferente, poderiam receber uma nova programação, influenciada
pelos fatores existentes neste novo microambiente.
Contudo, a des-diferenciação das células-tronco somáticas ainda não foi clara e
inequivocadamente documentada. Assim, ainda não existem indícios que sustentem a
conversão como exemplo de plasticidade in vivo.
1.3.4 Plur ipotencialidade:
A teoria da pluripotencialidade baseia-se na existência de células não-comprometidas e,
portanto, com capacidade de diferenciação em células derivadas dos três folhetos
embrionários, nos diversos tecidos, mesmo no indivíduo adulto. Nestas células, a via
preferencial de diferenciação celular seria direcionada por fatores ambientais, pelo genoma e
por mecanismos estocásticos. As células pluripotentes são raras e podem ser caracterizadas a
nível molecular pela presença dos fatores transcripcionais Oct-4 e Rex-1 e da telomerase, a
qual permite que as células dividam-se indefinidamente.
Esta idéia tem ganhado apoio após o isolamento de células como a MPC, a MAPC, a
USSC, a MIAMI, dentre outras, capazes de, como anteriormente descrito, originar células de
múltiplas linhagens. Contudo, ainda é necessário demonstrar que estas células existem in vivo
e que o seu grande potencial de diferenciação não é induzido pelo cultivo.
A Figur a 2 ilustra estas teorias.
Introdução
39
(a) Múltiplas células-tronco
(b) Fusão celular
(c) Trans des-/re-diferenciação
(d) Pluripotencialidade
Figur a 2: Diagr ama esquemático r epr esentando os possíveis mecanismos e explicações
par a a “plasticidade” obser vada nas células-tr onco somáticas: a) células-tronco
de um determinado tecido podem existir em outro órgão; b) as células podem se fundir
acarretando na transferência do material genético da célula transplantada para a célula do
hospedeiro; c) a plasticidade pode ocorrer via trans des-/re-diferenciação como visto nos
anfíbios; d) células com características multipotentes podem permanecer viáveis mesmo
no adulto (Adaptado de VERFAILLIE, 2002).
1.4 Ter apia celular :
A habilidade de purificar, cultivar e manipular CT somáticas multipotentes fornece aos
pesquisadores células de valor inestimável, que podem servir para o estudo e o
desenvolvimento do reparo tissular com o objetivo de corrigir lesões provocadas por doenças
congênitas ou degenerativas.
A terapia celular compreende um conjunto de técnicas ou métodos que visam substituir
as células doentes ou disfuncionais por células sadias. Compreende a medicina regenerativa,
os transplantes com CTHs, a imunoterapia, a aférese, a criobiologia, a imunoseleção e a
terapia gênica. A terapia com células-tronco é um ramo da terapia celular.
Introdução
40
Campo emergente da medicina regenerativa, a terapia celular baseia-se na promessa de
tratamento de uma variedade de doenças degenerativas ou relacionadas com a idade, para as
quais ainda não existe tratamento específico ou efetivo. As células-tronco somáticas,
autólogas ou alogênicas, têm vasta aplicabilidade clínica e podem ser utilizadas para tratar
tecidos lesados e múltiplas doenças por infusão local ou sistêmica.
As células-tronco mesenquimais, devido ao seu fácil isolamento e cultivo, potencial de
diferenciação e produção de fatores de crescimento e citocinas, têm se tornado as candidatas
ideais para os protocolos da medicina regenerativa (KASSEM; KRISTIANSEN;
ABDALLAH, 2004; LE BLANC; PITTENGER, 2005).
1.5 As células-tr onco mesenquimais:
1.5.1 Histór ico:
A presença de células precursoras não-hematopoéticas na MO foi inicialmente sugerida
por um patologista alemão, Julius Cohnheim em 1867 (revisado por PROCKOP, 1997;
FEHRER; LEPPERDINGER, 2005). Contudo, sua existência só foi confirmada na década de
60 por Danis
(1960)
e
Friedenstein (FRIEDENSTEIN;
PIATETZKY-SHAPIRO;
PETRAKOVA, 1966). Na década seguinte, foi identificada como sendo uma célula
fibroblastóide, presente não só na MO, mas também no baço (FRIEDENSTEIN;
CHAILAKHJAN; LALYKINA, 1970). Nos últimos anos as CTMs têm despertado grande
interesse devido ao seu possível potencial de envolvimento no processo de reparo tissular.
1.5.2 Denominações utilizadas:
Desde a sua descrição original, estas células receberam diferentes nomes. Inicialmente
foram chamados de unidades formadoras de colônias fibroblastóides (CFU-F, do inglês
colony forming unit fibroblast), devido à capacidade de aderir ao plástico das garrafas de
Introdução
41
cultivo e formar colônias de células similares aos fibroblastos (OWEN; FRIEDENSTEIN,
1988). Também foram denominadas células-tronco ou progenitoras mesenquimais, pois,
diferenciavam-se em uma grande variedade de células não-hematopoéticas (CAPLAN, 1991)
e de células estromais da MO, porque pareciam originar-se das estruturas de suporte da MO e
podiam ser utilizadas como feeder layer para o crescimento das CTHs em cultura
(PROCKOP, 1997). Em 2005, a sociedade internacional para terapia celular (ISCT – do
inglês, International Society for Cellular Therapy) propôs uma nova nomenclatura para
designar a população de células fibroblastóides que crescem aderentes ao plástico, isoladas
dos mais diversos tecidos e com capacidade de diferenciação multipotencial in vitro: células
mesenquimais estr omais multipotentes. Esta sociedade propõe ainda, que o termo célulatronco mesenquimal fique reservado para àquelas que indubitavelmente, preencham as
características de células-tronco. A ISCT ressalta que estas células-troco provavelmente
existem e possivelmente compõem uma subpopulação das células aderentes ao plástico. A
sigla CTM (MSC – do inglês, Mesenchymal Stem Cell) pode ser utilizada para estas duas
situações, mas deve ser corretamente identificada (HORWITZ et al., 2005).
1.5.3 Ontogenia das CTMs:
A ontogenia das CTMs ainda não é bem conhecida. Acredita-se que a CTM
multipotente descenda de uma célula pluripotente ou mesmo de uma outra multipotente
presente durante a vida fetal em uma freqüência muito maior.
São pontos interessantes de serem relatados: a) a presença de uma camada de células
estromais que daria sustentação a hematopoese na região aorto-gônoda-mesonéfrica em
murinos; b) a observação de que o sangue humano fetal contém, durante as primeiras
semanas, grande quantidade de CTHs e de células estromais; c) o encontro de células fetais na
circulação e nos tecidos maternos, mesmo décadas após a gravidez, que parecem participar na
Introdução
42
reparação tissular. Em combinação, estas observações apóiam a hipótese da existência de uma
CT multi- ou pluripotente que existe desde a idade gestacional precoce e que pode persistir
por toda a vida do adulto (JAVAZON; BEGGS; FLAKE, 2004).
Além disso, a correlação inversa entre a presença de CTMs no cordão umbilical e a
idade gestacional, também observada para as CTHs, sugere que as células mesenquimais
viagem, precocemente durante o desenvolvimento, dos seus sítios primários para outros
tecidos fetais (MINGUELL; ERICES; CONGET, 2001). Contudo, a real identidade desta
célula e a sua correlação com as CTMs expandidas in vitro ainda necessitam de ser definidas.
1.5.4 Fontes:
No ser humano, a medula óssea é a sua principal fonte. Mas, as CTMs também já foram
isoladas de outros órgãos e tecidos, tais como o tecido muscular esquelético e a derme
(YOUNG et al., 2001), o tecido adiposo (ZUK et al., 2001), a membrana sinovial (DE BARI
et al., 2001), o endotélio e subendotélio da veia umbilical (COVAS et al., 2003) e da veia
safena (COVAS et al., 2005), o rim (ALMEIDA-PORADA et al., 2002), o sangue de cordão
umbilical e placentário (LEE, M. et al., 2004; LEE, O. et al., 2004; YU et al., 2004), a medula
óssea vertebral (AHRENS et al., 2004), a cartilagem articular (ALSALAMEH et al., 2004), a
vilosidade coriônica da placenta (IGURA et al., 2004), o ligamento periodontal (SEO et al.,
2004), e o pulmão (SABATINI et al., 2005), dentre outros.
Se as CTMs circulam ou não no sangue periférico, ainda é uma questão em aberto.
Fernandes et al. (1997) foram os primeiros a reportarem a presença de células “estromais” no
sangue periférico mobilizado, mas não no sangue não-mobilizado. Já Zvaifler et al. (2000) e
Kuznetsov et al. (2001) demonstraram que as CTMs circulam no sangue periférico do adulto,
mas que são extremamente raras. Outros autores, em condições semelhantes de cultivo, não
Introdução
43
conseguiram isolar estas células no sangue periférico, mobilizado ou não (OJEDA-URIBE et
al., 1993; LAZARUS et al., 1997; WEXLER et al., 2003).
As desigualdades encontradas entre os estudos podem ser decorrentes dos diferentes
métodos de isolamento e cultivo utilizados pelos diversos autores. Achados apóiam a hipótese
de que exista uma rara população de células progenitoras mesenquimais circulantes,
particularmente após a mobilização das células da medula óssea por citocinas (revisado por
ROUFOSSE et al., 2004). Tal achado foi recentemente reforçada por Kassis et al. (2006), que,
com o auxílio de microesferas de fibrina, isolaram CTMs de 8 das 11 amostras de sangue
periférico mobilizado, coletado por aférese, de doadores normais.
1.5.5 Isolamento e cultivo das CTMs da MO:
Atualmente existem diversos
métodos
de
isolamento
das
CTMs
da MO.
Tradicionalmente, estas células são isoladas utilizando-se o método originalmente descrito por
Friedenstein (FRIEDENSTEIN; GORSKAJA; KULAGINA, 1976), que se baseia na
capacidade que estas células têm de aderir ao plástico. Este método tem como principal
desvantagem a heterogeneidade das CTMs isoladas e a contaminação da cultura por células
hematopoéticas, contudo, podem ser consideradas relativamente isentas de CTHs após a 2ª ou
3ª passagem (COLTER et al., 2000).
Sumariamente, o aspirado de MO é processado utilizando-se um gradiente de
centrifugação como, por exemplo, o ficoll ou o percoll. As células com menor densidade são
coletadas e plaqueadas em meio sem desoxi ou ribonucleotideos como o DMEM ou o α-MEM
(do inglês, Minimal Essential Médium Alpha), enriquecido com soro fetal bovino ou de
cavalo, penicilina, estreptomicina e L-glutamina (COLTER et al., 2000; DEANS;
MOSELEY, 2000; BARRY, 2003). Após 24h (DIGIROLAMO et al., 1999) a 72h
(PITTENGER et al., 1999; DEANS; MOSELEY, 2000; TONDREAU et al., 2004), todo o
Introdução
44
meio de cultivo é trocado com o objetivo de remover as células não-aderentes. As células
restantes são cultivadas em câmara úmida, a 37º C com 5% de CO2 e metade do meio de
cultivo é trocado a cada 3 a 4 dias até atingir confluência em torno de 70 a 90%, o que ocorre
por volta de 14 dias, quando as células são tripsinizadas e expandidas por passagens
subseqüentes (PITTENGER et al., 1999).
Outros métodos de isolamento das CTMs já foram descritos como a separação por meio
do citômetro de fluxo (SIMMONS; TOROK-STORB, 1991; GRONTHOS et al., 2003), a
seleção positiva (CAMPIONI et al., 2003; BARRY et al., 1999) ou negativa (ALHADLAQ;
MAO, 2004; LEE, O. et al., 2004; TONDREAU et al., 2004) em colunas, dentre outros, mas
ainda são pouco utilizados se comparados ao método clássico.
1.5.6 Caracter ísticas mor fológicas e imunocitoquímicas:
À microscopia de luz ou em contraste de fase, as CTMs apresentam-se como células
fibroblastóides alongadas, fusiformes e pontiagudas, com núcleo eucromático, oval, grande e
central e citoplasma abundante. Também podem ser observados, à microscopia eletrônica,
cisternas do reticulo endoplasmático rugoso dilatadas, vacúolos lipídicos cheios ou vazios,
corpos lisossomais e grande quantidade de poli-ribossomos e ribossomos livres
citoplasmáticos, além de filamentos de actina bem organizados em suas extremidades
(TAGAMI et al., 2003). Quando senescentes, as CTMs são grandes, largas, achatadas,
proliferam lentamente e expressam uma β-galactosidade associada à senescência (FEHRER;
LEPPERDINGER, 2005). Células com morfologia intermediária são observadas no decorrer
do cultivo (DIGIROLAMO et al., 1999).
As CTMs indiferenciadas coram-se pela fosfatase alcalina, sudan-black, colágeno IV,
fibronectina e não se coram pela esterase. A matriz que contorna as CTMs contém colágeno
do tipo I e laminina da membrana basal. Além disso, um grupo de colônias pode também,
Introdução
45
sintetizar um antígeno associado ao fator VIII, o que indicaria uma provável origem endotelial
(ALHADLAQ; MAO, 2004).
1.5.7 Quantificação das unidades for mador as de colônias fibr oblastóides:
As CTMs originam colônias após cultivo celular em baixa densidade ou sorting de uma
única célula (JAVAZON; BEGGS; FLAKE, 2004). Presume-se que estas colônias sejam
derivadas de uma única célula precursora (DEANS; MOSELEY, 2000). As colônias com
mais de 50 células, quando contadas após 10 a 14 dias de cultivo das células mononucleares
(CMN) da MO, são chamadas de CFU-F (TONDREAU et al., 2004). Na literatura, a
freqüência das CFU-F descrita nos diversos trabalhos variou entre 3,4 x10-3 a 10-6 CMN da
MO plaqueadas (DEANS; MOSELEY, 2000; GUTIERREZ-RODRIGUEZ; REYESMALDONADO; MAYANI, 2000; SHORT et al., 2003; WEXLER et al., 2003; DAZZI et al.,
2006).
1.5.8 Fases evolutivas do cultivo ex vivo das CTMs:
A vida das CTMs pode ser dividida em 3 fases dependendo da sua idade in vitro: a) fase
1, quando completa menos de 50% da vida celular; b) fase 2, ou de crescimento lento, na qual
conclui 50 a 80% da sua existência; c) fase 3, ou de senescência, durante a qual há uma
parada na proliferação celular. No campo da biogerontologia, baseado em características
morfológicas, bioquímicas e nas características moleculares, as células na fase 1 são
consideradas jovens e na fase 3 senescentes (STENDERUP et al., 2003).
Após o seu cultivo moderado, as CTMs mantêm seu cariótipo normal e não perdem a
atividade da telomerase. Contudo, no cultivo extenso, ou seja, quando a célula é cultivada até
próximo ao limite proposto por Hayflick, as funções celulares diminuem, fato evidenciado
pelos sinais evidentes de senescência e/ou apoptose (MINGUELL; ERICES; CONGET, 2001;
Introdução
46
LE BLANC; RINGDÉN, 2005). A senescência replicativa é um fenômeno característico do
cultivo de células comprometidas ex vivo. Há uma parada na proliferação celular o que limita
a geração de um grande número de células. Ocorre secundariamente a vários fatores,
incluindo o progressivo encurtamento do telômero, secundário à perda progressiva da
atividade telomerase (KASSEM; KRISTIANSEN; ABDALLAH, 2004).
1.5.9 Cinética da expansão das CTMs ex vivo:
A cinética da expansão em cultura das CTM pode ser dividida em 3 fases: a) inicial,
com duração de 3 a 4 dias, ocorre logo após o plaqueamento das CMN da MO e o
crescimento celular é muito lento; b) logarítmica, durante as primeiras passagens, apresenta
um crescimento acelerado; c) plateau: inicia-se quando a célula atinge a senescência e perde a
capacidade de expansão (BRUDER; JAISWAL; HAYNESWORTH, 1997; COLTER et al.,
2000).
1.5.10 Cinética da pr olifer ação celular :
Colter et al. (2000) classificaram as CTMs isoladas da MO em três subtipos de acordo
com o tamanho e a complexidade interna à citometria de fluxo. Todas eram células viáveis e a
análise com o antígeno Ki-67, específico do ciclo celular, indicou que as pequenas e
agranulares não ciclavam, enquanto que as células granulares, pequenas ou grandes
encontravam-se ativamente engajadas no ciclo celular. Denominaram as células pequenas e
agranulares de RS-1 (do inglês, recycling stem cell), as pequenas e granulares de RS-2 e as
grandes e moderadamente granulares de CTMs maduras (mCTM).
Demonstraram que as células RS-2 eram as primeiras a aparecer e expandiam-se na
primeira fase do cultivo. Na segunda fase, de crescimento logarítmico, diminuíam em número
enquanto que as mCTMs proliferavam rapidamente. Ao final desta fase, as células RS-2
Introdução
47
desapareciam, enquanto que as células RS-1 se expandiam. Sugeriram, então, que havia uma
grande correlação entre o número de células RS-1 e RS-2 (progenitoras) e o de colônias de
células mesenquimais (COLTER et al., 2000).
Esse estudo demonstrou ainda que as CTMs podem ser expandidas por mais de 50 vezes
quando plaqueadas em diluições muito baixas como 1,5 células/cm2. Contudo, se expandiam
por apenas 15 vezes quando plaqueadas em concentrações de 5000 células/cm2. Os autores
concluíram que é possível expandir e obter mais de 1013 CTMs de apenas 20 mL de MO
(COLTER et al., 2000).
1.5.11 Capacidade de duplicação em cultur a:
Stenderup et al. (2003) avaliaram 2 grupos de doadores normais com idades que
variavam entre 18 e 29 e 66 a 81 anos e encontraram uma capacidade de duplicação da
população celular significativamente menor (p < 0,05) para as células do grupo mais velho
(24 ± 11x, máximo de 36x, após 570 dias de cultivo) comparado com o grupo mais jovem (41
± 10x, máximo de 56x em 535 dias de cultivo). Concluíram que as CTMs apresentam
características típicas do modelo de senescência celular proposto por Hayflick e que as células
obtidas dos doadores mais idosos, apesar de manterem a capacidade de diferenciação em
adipócitos e osteócitos, exibem uma diminuição do potencial de proliferação, assim como,
uma aceleração no processo de senescência, se comparadas às dos doadores jovens.
Outros autores encontraram valores de capacidade de duplicação em cultura com
variação de 4 a 50x (BRUDER; JAISWAL; HAYNESWORTH, 1997; DIGIROLAMO et al.,
1999; PITTENGER et al., 1999; JAVAZON; BEGGS; FLAKE, 2004; LAKSHMIPATHY;
VERFAILLIE, 2005).
Introdução
48
Quanto às horas necessárias para a duplicação celular durante a fase de crescimento
logarítmico, Conget e Minguell (1999) encontraram um valor de 33 horas, enquanto que Stute
et al. (2004) de 24 horas.
1.5.12 Fator es que inter fer em no cr escimento e expansão celulares:
1.5.12.1 Concentr ação do sor o bovino fetal:
A proliferação das CTMs parece ser mais rápida em altas concentrações de SBF, porém,
a velocidade de crescimento diminui com o aumento da confluência (STUTE et al., 2004).
1.5.12.2 Idade:
Fehrer e Lepperdinger (2005) revisaram o efeito da idade sobre as CTMs. Relataram que
estas, quando isoladas de doadores mais velhos, apresentam um menor número de células RS
e de CFU-F, assim como um maior número de células com aparência de senescentes, o que
implicaria na diminuição do potencial de proliferação e da capacidade de diferenciação no
decorrer do processo de envelhecimento.
1.5.12.3 Amostr a:
DiGirolamo et al. (1999) avaliaram o potencial de duplicação das CTMs de doadores
normais, com idade de 19 a 49 anos. A variação encontrada não se correlacionava com o sexo
ou com a idade. Concluíram que seus achados aparentemente refletiam variações da amostra,
já que as do mesmo doador, colhidas na mesma ocasião, porém, de locais diferentes,
apresentavam diferenças.
Introdução
49
1.5.13 Imunofenotipagem das CTMs:
Em contraste com outras células que expressam marcadores celulares específicos como
as hematopoéticas (CD14, CD34, CD45) e as endoteliais (CD31, KDR), a identidade
fenotípica das CTMs não é única e a mesma compartilha antígenos expressos por múltiplas
linhagens celulares (ALHADLAQ; MAO, 2004).
Classicamente, as CTMs expressam em níveis variados os marcadores CD73, CD105,
CD166 e Stro-1, mas não o fazem para os marcadores de células hematopoéticas ou
endoteliais (BARRY; MURPHY, 2004; DAZZI et al., 2006). As diferenças quanto à
intensidade de expressão dos diversos antígenos podem ser explicadas devido às variações no
método de cultivo e na fase evolutiva em que as células foram avaliadas (KASSEM;
KRISTIANSEN; ABDALLAH, 2004; DAZZI et al., 2006).
Majumdar et al. (2003) caracterizaram as interações entre as CTMs e CTHs. Analisaram
sistematicamente, por citometria de fluxo, a expressão de várias moléculas de adesão das
superfamílias de integrinas e imunoglobulinas. Quanto às integrinas, o CD29 foi o que
apresentou a maior expressão, seguido do CD49a e do CD49e. Os marcadores CD49b,
CD49c, CD49f, CD51, CD61 e CD104 expressaram-se fracamente e não foi detectada
expressão antigênica dos CD49d, CD11a e CD18. Em relação à superfamília das
imunoglobulinas foi evidenciada a expressão dos CD102, CD106, CD58, mas não do CD50 e
do CD54. Contudo, a expressão deste último pode ser induzida. Estes autores também
avaliaram as selectinas CD62E, CD62L e CD62P e os antígenos HLA-ABC (do inglês,
human leucocyte antigen) e HLA-DR e demonstraram altos níveis de expressão do HLAABC mas não detectaram a expressão do HLA-DR ou das selectinas acima citadas. Pittenger
et al. (1999) também avaliaram os antígenos de superfície das CTMs. Seus resultados
encontram-se sumarizados na Tabela 2.
Introdução
50
Tabela 2: Análise da expr essão antigênica das pr oteínas de super fície das CTMs por
imunofenotipagem. (Modificado de PITTENGER et al., 1999).
Positivos
Integr inas
α1
CD49a
α2
CD49b
α3
CD49c
aα
CD49e
αv
CD51
β1
CD29
β3
CD61
β4
CD104
Receptor es de citocinas
IL-1R
CD121a
IL-3Rα
CD123
IL-4R
CDw124
IL-6R
CD126
IL-7R
CDw127
Receptor es de Fator es
INFγR
CDw119
TNFIR
CD120a
TNFIIR
CD120b
TGFβIR
TGFβIIR
bFGFR
PDGFR
CD140a
Transferrina
CD71
Receptor es de Matr iz
ICAM-1
CD54
ICAM-2
CD102
VCAM-1
CD106
L-Selectina
CD62L
LFA-3
CD58
ALCAM
CD166
Hialuronato
Endoglina
CD44
CD105
Negativos
Integr inas
α4
CD49D
αL
CD11a
Cβ2
CD18
Mar cador es Hematopoéticos
T4
CD4
Mo2
CD14
CD34
Ag-leucocitário
CD45
Receptor es de citocinas
IL-2R
CD25
Receptor es de Fator es
EGFR-3
Outr os
Ligante Fas
T4
CD4
Receptor es de Matr iz
ICAM-3
CD50
E-Selectina
CD62E
P-Selectina
CD62P
PECAM-1
CD31
vWF
Caderina 5
Lewisx
CD15
Outr os
CD9
Thy-1
CD90
*CD = do inglês, cluster of differentiation; INFγR = do inglês, interferon γ receptor; TNFR = do inglês, tumor
necrosis factor receptor; TGFβIR = do inglês, transforming growth factor – β receptor; bFGFR = do inglês,
basic fibroblast growth factor receptor; PDGFR = do inglês, platelet-derived growth factor receptor; ICAM =
do inglês, intercellular adhesion molecule; VCAM = do inglês, vascular celular adhesion molecule; LFA = do
ingles, lymphocyte function-associated; ALCAM = do inglês activated leukocyte cell adhesion molecule; EGFR
= do inglês, epidermal growth factor receptor; PECAM = do inglês, platelet-endothelial cell adhesion
molecule; vWF = do inglês, von Willebrand factor
Introdução
51
1.5.14 Ciclo celular :
Estudos de ciclo celular revelaram que, enquanto uma pequena fração das CTMs está
ativamente engajada na proliferação (aproximadamente 10% das células se encontram nas
fases S + G2 + M), a maioria das células se encontra na fase G0-G1 do ciclo celular
(CONGET; MINGUELL, 1999), o que sugere uma alta competência destas células em se
diferenciar (MINGUELL; ERICES; CONGET, 2001). Entretanto, estudos que distinguem as
células em crescimento das quiescentes evidenciam que apenas 20% destas encontram-se na
fase G0 (não-ciclantes) do ciclo celular (CONGET; MINGUELL, 1999).
1.5.15 Difer enciação:
As CTM são capazes de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos, condrócitos,
tenócitos, células musculares e células do estroma de sustentação da hematopoese se sob
condições específicas ex vivo ou in vivo (PITTENGER et al., 1999; CAPLAN; BRUDER,
2001; LE BLANC; PITTENGER, 2005). Outros autores induziram a diferenciação de CTMs
na via neuronal e endotelial, assim como em células musculares lisas, pericitos e
cardiomiócitos (revisado por BARRY; MURPHY, 2004).
Baksh et al. (2004) descreveram um modelo teórico de diferenciação das CTMs no qual
as células indiferenciadas passariam por duas fases antes de adquirir um fenótipo específico.
Na primeira, a CTM originaria por divisão assimétrica uma população de células menos
indiferenciadas e uma outra, de células precursoras com potencial de auto-renovação e
diferenciação mais restritos. Os precursores tri- ou bipotentes morfologicamente semelhantes
às CTMs, mas, diferentes quanto à expressão gênica, originariam os progenitores unipotentes
que continuariam a se dividir simetricamente (segunda fase) passando por vários estágios de
maturação até a célula especializada, ou de diferenciação terminal, caracterizada pelo fim da
Introdução
52
capacidade proliferativa e pela síntese de marcadores tissulares específicos, incluindo
componentes da matriz extracelular.
A transição do compartimento de células-tronco para o das comprometidas ocorreria
com a divisão simétrica das células progenitoras tri- ou bipotentes, o que originaria os
progenitores unipotentes. Este processo é bem controlado e envolve uma alteração no perfil
de secreção de citocinas e de fatores de crescimento, assim como, uma alteração na estrutura
tridimensional da matriz extracelular, além da ativação e inativação de fatores transcripcionais
e a conseqüente expressão de genes relacionados a esta via de diferenciação (BAKSH;
SONG; TUAN, 2004). A Figura 3 ilustra esta teoria.
Figur a 3: Processo de matur ação e difer enciação das CTMs. A célula-tronco multipotente se
divide assimetricamente, originando células com as mesmas características e outras já
mais comprometidas com uma determinada linhagem. Este processo ocorre
progressivamente até a célula progenitora unipotente, que por divisão simétrica, origina
células de apenas uma linhagem. Estas se proliferam em células intermediárias cada vez
mais especializadas, com morfologia e expressão antigênica características da linhagem
celular em questão, até se tornarem células maduras.
Introdução
53
Banfi et al. (2000) avaliaram a cinética de proliferação e o potencial de diferenciação
das células estromais da MO. Encontraram a expressão em baixos níveis, por PCR (do inglês,
polymerase chain reaction) semiquantitativo, de marcadores específicos como a osteocalcina,
o colágeno II e a LPL (do inglês lipoprotein lípase) nas células indiferenciadas, mesmo antes
de estimuladas, o que indicaria um possível comprometimento de algumas destas células em
se diferenciar nestas três linhagens ainda no estágio de cultura primária. Demonstraram ainda,
uma perda do potencial de diferenciação em paralelo com a velocidade de proliferação, o que
sugere um progressivo comprometimento das células ou uma inabilidade das condições de
cultivo em manter a auto-renovação e a expansão das CT, assim como a sua capacidade de
diferenciação pluripotencial.
Esta visão linear e convencional da progressão hierárquica das CT vem sofrendo
modificações baseadas na plasticidade das mesmas. Os eventos celulares e moleculares
associados às vias de diferenciação celular ainda não estão bem entendidos e a análise do
nível da expressão gênica por RT-PCR demonstra que as CTMs diferenciam-se in vitro de
acordo com o estímulo aplicado, na linhagem à qual foi induzida, mas não em células que
expressam múltiplas linhagens (MINGUELL; CONGET; ERICES, 2000).
A diferenciação em adipócitos é iniciada por fatores agonistas que incluem a insulina, a
isometilbutilxantina, a indometacina e os glicocorticóides. A diferenciação é acompanhada
não só por alterações na morfologia celular, mas também pela ativação transcripcional de
muitos genes como o LPL e o PPARγ2 (do inglês, peroxisome proliferator activated receptor
γ2). Este último é membro da superfamília de receptores de ligantes de fatores
transcripcionais ativados e é reconhecido como um receptor nuclear hormonal específico do
adipócito. Ele tem um papel chave na regulação do aumento das células gordurosas e a sua
expressão é estimulada pela dexametasona (TAGAMI et al., 2003).
Introdução
54
A diferenciação em condrócitos ocorre quando as CTMs são cultivadas em condições
específicas, que incluem o cultivo em formato tri-dimensional, meio nutritivo sem SBF e a
adição de um dos membros da família do TGF-β (do inglês, transforming growth factor – β),
sendo que o TGF-β2 e o TGF-β3 são mais efetivos que o TGF-β1 na promoção da
condrogênese. Quando cultivadas nestas condições, as células rapidamente perdem a sua
morfologia fibroblastóide e começam a expressar os componentes da matriz extracelular,
específicos da cartilagem como os glicosaminoglicanos. Durante a diferenciação na presença
de TGF-β3, as CTMs sintetizam o agregan, a fibromodulina, a proteína matriz oligomérica da
cartilagem, a decorina, o colágeno II e a condroaderina, todos componentes normais da matriz
cartilaginosa articular (BARRY; MURPHY, 2004).
O ácido ascórbico, a dexametasona, o β-glicerolfosfato e o SBF são necessários para a
ativação da diferenciação em osteócitos. Esta via requer a expressão de genes como o Cbfa-1
(do inglês, core binding factor alpha1), fosfatase alcalina, osteopontina (OST), osteocalcina e
colágeno I (MINGUELL; CONGET; ERICES, 2000). Quando cultivadas em monocamadas
na presença de meio indutor específico, as células adquirem morfologia de osteoblastos, após
14 a 21 dias (LEE, O. et al., 2004), com aumento da atividade da fosfatase alcalina e
deposição de uma matriz extracelular rica em cálcio mineralizado (BARRY; MURPHY,
2004) e hidroxihapatita (BARRY, 2003).
1.5.16 Pr odução de fator es de cr escimento, inter leucinas e citocinas:
As CTMs produzem um grande número de citocinas, as quais mantêm as CTHs em
quiescência ou promovem a sua auto-renovação, em detrimento da diferenciação. Dentre elas,
podemos citar o LIF (do inglês, leukemia inhibitory factor), o SCF (do inglês, stem cell
factor), SDF-1 (do inglês, stromal derived factor), a oncostatina M (OSM), a BMP-4 (do
inglês, bone morphogenetic protein-4), o ligante Flt-3 da tirosina kinase (Flt-3 lig) e o TGFβ.
Introdução
55
Também produzem uma grande variedade de interleucinas (IL), como: IL-1, IL-6, IL-7, IL-8,
IL-11, IL-12, IL-14 e IL-15. Quando cultivadas na presença da IL-1α, as CTMs produzem
citocinas que agem nos progenitores hematopoéticos mais maduros, como a TPO (do inglês,
thrombopoietin), o GM-CSF (do inglês, granulocyte macrophage colony-stimulating factor),
o G-CSF (do inglês, granulocyte colony-stimulating factor), o M-CSF (do inglês, macrophage
colony-stimulating factor) (DEVINE; HOFFMAN, 2000; MINGUELL; ERICES; CONGET,
2001; DAZZI et al., 2006).
As CTMs expressam também receptores (R) para diversas citocinas e fatores de
crescimento, como: IL-1R, IL-3R, IL-4R, IL-6R, IL-7R, LIF-R, SCF-R, G-CSF-R, INFγ-R
(do inglês, interferon γ receptor), TNF1-R e TNF2-R (do inglês, tumor necrosis factor
receptor), TGFβ2-R, TGFβ3-R, bFGF-R (do inglês, basic fibroblast growth factor receptor),
PDGF-R (do inglês, platelet-derived growth factor receptor) e o EGF-R (do inglês, epidermal
growth factor receptor) (DEVINE; HOFFMAN, 2000; MINGUELL; ERICES; CONGET,
2001).
Estes dados em conjunto sugerem que as CTMs contribuem para a formação e o
funcionamento do microambiente estromal, o qual produz sinais indutores regulatórios não só
para as CTMs, mas também para o desenvolvimento dos progenitores hematopoéticos e outras
células estromais presentes na MO (DEVINE; HOFFMAN, 2000; MINGUELL; ERICES;
CONGET, 2001; DAZZI et al., 2006).
1.5.17 Impor tância das CTMs na hematopoese:
A hematopoese requer um microambiente estromal intacto e funcionante. Seu estroma
de sustentação é composto por um grupo heterogêneo de células de origem hematopoética
(macrófagos), endotelial (células endoteliais) ou mesenquimal (células reticulares,
fibroblastos, adipócitos e osteoblastos) e seus respectivos progenitores. Juntas, estas células
Introdução
56
regulam a auto-renovação, proliferação, sobrevivência, migração e diferenciação das CTHs
por vários mecanismos, incluindo as interações célula-célula e célula-matriz ou a produção da
matriz extracelular e dos fatores de crescimento e quimiocinas necessários (GALOTTO et al.,
1999; DEANS; MOSELEY, 2000; BACIGALUPO, 2004, DAZZI et al., 2006). Estudos
indicam que as CTMs são as principais responsáveis pela promoção deste microambiente
(DEVINE; HOFFMAN, 2000; MAJUMDAR et al., 2000; MINGUELL; ERICES; CONGET,
2001; KADEREIT et al., 2002).
A noção de que o microambiente estromal pode sustentar a hematopoese foi
primeiramente descrita por Dexter (DEXTER; ALLEN; LAJTHA, 1977). Neste sistema, uma
cultura de células aderentes derivadas da MO mantêm as CTHs viáveis e capazes de originar
colônias de granulócitos – macrófagos e colônias eritróides, por um período de semanas a
meses.
Tal hipótese foi comprovada em vários trabalhos utilizando CTMs derivadas da MO,
SCUP e placenta, os quais demonstram que as CTMs, quando utilizadas como feeder layer,
são capazes de manter as células CD34+ viáveis e de expandi-las mesmo na ausência de
citocinas suplementares, sendo que, na presença de ambas, este processo é sinérgico
(BACIGALUPO, 2004; ZHANG et al., 2004; JANG et al., 2006).
Além disso, Kadereit et al. (2002) demonstraram uma maior expressão citoplasmática de
proteínas inibitórias do ciclo celular como a p21 (cip1/waf1) e anti-apoptóticas como a BCL-2
(do inglês, B-cell lymphoma 2) nas CTHs cultivadas na presença de CTMs, quando
comparadas com as expandidas apenas em citocinas. Estas proteínas são críticas na regulação
da sobrevivência e manutenção da capacidade auto-replicativa das CTHs, sugerindo uma
manutenção do estado indiferenciado destas, quando expandidas na presença das CTMs. O
retardo da diferenciação das células CD34+ CD38low/neg expostas a citocinas, por ação das
CTMs, também foi relatado por Bacigalupo (2004).
Introdução
57
Juntos, estes dados sugerem que a adição de CTMs como feeder layer pode melhorar as
condições de expansão das células CD34+ CD38-, servindo como inibidor de sua
diferenciação e diminuindo a apoptose durante a expansão in vitro.
1.5.18 Car acter ísticas imunológicas das CTMs:
O conhecimento das propriedades imunológicas das CTMs aumenta o seu potencial
terapêutico. Estudos demonstram que as CTMs de humanos expressam antígenos
leucocitários, HLA-ABC ou de classe I, mas não o HLA de classe II. Contudo, as CTMs
derivadas da MO contêm moléculas intracelulares de HLA de classe II, as quais são
translocadas à superfície celular após a exposição ao INF-γ (revisado por MINGUELL;
ERICES, 2006).
Antígenos tipicamente imunológicos como o B7-1, B7-2, CD40, CD40L, CD80 e CD86
não são expressos pelas CTMs, enquanto outros, que participam das interações com as células
T (ex CD106, CD50, CD58) o são. Acredita-se que a reatividade imunológica das CTMs seja
regulada pelo microambiente em que se encontra, já que a expressão destas moléculas é
modulada pela IL1-α (revisado por MINGUELL; ERICES, 2006).
Os mecanismos moleculares envolvidos nas propriedades imunossupressoras das CTMs
ainda não foram completamente elucidados. Sabe-se que os efeitos imunológicos destas
células são mediados pelas interações com os linfócitos, o que resulta na inibição, tanto da
proliferação, quanto da expressão de marcadores de ativação pelos linfócitos ativados. Estas
interações também envolvem a diferenciação das células T CD4+ em um fenótipo regulatório
e a secreção de citocinas pelas células T efetoras e células NK (do inglês, Natural Killer).
Estes efeitos também são mediados por fatores solúveis como o IL-10, o TGF-β, HGF (do
inglês, hepatocyte growth factor) e a prostaglandina E2. Em adição, as CTMs inibem
fortemente as primeiras etapas da diferenciação dos monócitos em células dendríticas (DCs –
Introdução
58
do inglês, dendritic cells) e quando esta ocorre, induzem as DCs a exibir um fenótipo
associado à tolerância ou antiinflamatório (revisado por MINGUELL; ERICES, 2006).
Além disso, as CTs parecem induzir uma imunossupressão geral e antígeno específica.
Tal hipótese é sugerida pela a inibição das células T alorreativas, da diferenciação das DCs
induzida por aloantígenos e da ativação preferencial de células T com fenótipo
regulatório/supressor. Finalmente, as CTMs também promovem imunossupressão por meio da
produção de indoleamina 2,3 dexoxigenase, e pela formação concomitante de um
microambiente destituído de triptofano (revisado por MINGUELL; ERICES, 2006). A
Tabela 3 sumariza o papel da resposta celular imunológica das CTMs.
Tabela 3: CTMs e a r esposta celular imunológica alogênica. (Modificado de MINGUELL;
ERICES, 2006).
Tipo de r eação
Comentár ios sobr e o envolvimento das CTMs
Segurança do transplante com
CTMs autólogas ou alogênicas
As células migram e sobrevivem nos receptores.
Sem reações adversas à infusão.
Aloreatividade linfocítica
Suprimem a proliferação de linfócitos alogênicos e de
células B e T aloreativas, pela secreção de fatores solúveis e
ativação da apoptose.
Funções das CAP
Inibem:
- a maturação das CAP e das DCs;
- a diferenciação e função das DCs derivadas de monócitos;
- a diferenciação das DCs induzidas por aloantígenos.
Diminuem:
- a secreção de citocinas pelas DCs, células T efetoras ou
naive e células NK;
- a habilidade aloestimulatória das DCs tratadas com CTMs.
Induzem:
- a formação de células CD34+ T regulatórias e supressoras.
Lise pelas células T citotóxicas e
NK
Inibem a formação de linfócitos citotóxicos;
Escapam da lise, mas não interferem com a capacidade
lítica dos linfócitos T citotóxicos e células NK.
Indução de tolerância em resposta a
tecidos alogênicos
Prolongam a sobrevivência de enxertos de pele alogênicos
DECH após transplantes com CTHs
de MO
Diminuem a severidade da DECH aguda após o cotransplante com CTHs HLA compatíveis
Crescimento tumoral
Potenciam a proliferação de células do melanoma
* CTMs = células-tronco mesenquimais; CAP = célula apresentadora de antígenos; DCs = células dendríticas;
Células NK = células Natural Killer; DECH = doença do enxerto contra o hospedeiro; CTHs = células-tronco
Introdução
59
Recentemente, Spaggiari et al. (2006) demonstraram que as células NK, previamente
ativadas pela IL-2, lisam de maneira eficiente as CTMs autólogas ou alogênicas. Tal ativação
pode ser inibida pela exposição das CTMs ao INF-γ, que resulta em uma maior expressão das
moléculas de HLA classe I na superfície das CTMs. Por outro lado, as CTMs podem, por
mecanismos ainda não elucidados, inibir a indução de proliferação das células NK latentes e
não ativadas. Todavia, este efeito é apenas parcial nas células NK no estágio proliferativo.
Em um outro estudo, Corcione et al. (2006) avaliaram o efeito das CTMs sobre as
células B e demonstraram que, pela secreção de fatores solúveis inibitórios após sinalização
parácrina, as CTMs inibem, in vitro, a proliferação, a quimiotaxia e a diferenciação das
células B em células secretoras de anticorpos.
Como acima exposto, as CTMs parecem ser efetivas na indução da tolerância.
Entretanto, a maioria das análises foi realizada com CTMs cultivadas e não in vivo
(JAVAZON; BEGGS; FLAKE, 2004). Todavia, experimentos com modelos animais, também
apóiam esta hipótese (revisado por BACIGALUPO, 2004).
1.5.19 Lesão estr omal pós-quimioter apia:
Nos últimos anos, o uso de altas doses de quimioterapia (QT) seguido de resgate com
células-tronco hematopoéticas autólogas de sangue periférico tem sido utilizado, cada vez
mais, para o tratamento de doenças hematológicas ou auto-imunes. Ultimamente, o número de
sobreviventes vem aumentando, e, muitos deles, encontram-se curados. Portanto, maior
atenção deve ser dada aos efeitos colaterais tardios deste procedimento, como os efeitos da
quimioterapia em altas doses sobre o microambiente estromal.
Carlo-Stella et al. (1997) avaliaram o efeito da quimioterapia sobre as CTHs e os
progenitores estromais da MO de pacientes portadores de leucemia mielóide aguda (LMA),
após a indução da remissão (idarrubicina, citarabina e etoposide) e a consolidação
Introdução
60
(mitoxantrone e citarabina). Seus experimentos evidenciaram uma lesão estromal qualitativa,
demonstrada pela diminuição da capacidade de proliferação, de diferenciação, além da
capacidade de sustentar a hematopoese, apesar da contagem normal de CFU-F.
Domenech et al. (1998) avaliaram a capacidade das células estromais da MO em
sustentar a hematopoese e secretar fatores de crescimento, tais como: G-CSF, GM-CSF, IL-3
e SCF, 90 dias após o transplante de medula óssea (TMO) autólogo em comparação com
dados pré-transplante. Seus resultados sugerem que o micro-ambiente permanece
qualitativamente lesado após o TMO e envolve uma diminuição da capacidade de secretar o
SCF.
Schwartz et al. (1998) avaliaram as células estromais de pacientes previamente
submetidos a esquemas de quimioterapia e demonstraram que estas células são deficientes em
sustentar a hematopoese in vitro.
Galotto et al. (1999) analisaram as conseqüências de altas doses de quimioterapia e
radioterapia em 61 pacientes com idade entre 2 meses e 63 anos, previamente submetidos ao
TMO alogênico entre 1 e 12 anos antes, por diferentes doenças hematológicas. A maioria
recebeu irradiação corporal total, em diferentes doses, associada a diferentes esquemas de
quimioterapia. Os autores observaram nos doadores normais uma correlação inversa entre a
idade e o número de CFU-F. Estas se encontravam em um número significativamente menor
nos pacientes (p < 0,05) quando comparados aos doadores normais pareados, e, apesar de seus
níveis começarem a aumentar por volta do dia 100, tal redução persistiu por mais de 12 anos.
Concluíram que o estroma medular é grave e irreversivelmente lesado após o TMO alogênico
em adultos e que o microambiente estromal é incapaz de reparar os sítios de lesão, exceto em
crianças muito jovens.
Banfi et al. (2001) avaliaram o efeito sobre os osteoprogenitores da MO de altas doses
de quimioterapia utilizadas como condicionamento para o auto-TMO em pacientes portadores
Introdução
61
de linfoma não-Hodgkin (LNH) e carcinoma de mama. Os autores demonstraram que os dois
regimes utilizados levaram a uma redução em 50% no número de CFU-F, e em 10% e 20%
nas densidades dos ossos cortical e trabecular, respectivamente. Concluíram que a
quimioterapia mesmo sem radioterapia, leva a uma toxicidade dependente da dose nos
osteoprogenitores estromais e pode acarretar osteopenia por dano direto ao compartimento
osteoblástico.
Ben-Ishay e Barak (2001) avaliaram o efeito da citarabina em baixas (400 mg/kg) ou
altas doses (1750mg/kg) nas células estromais de camundongos, nos dias 1, 2 e 4 após a
quimioterapia e concluíram que as administrações de baixas ou altas doses de citarabina,
produzem alterações nas células estromais que consistiram em diminuição das CFU-F e
variação nos níveis secretados de IL-6.
Novitzky, Makgoka e Mohamed (2001) avaliaram a proliferação de progenitores
estromais de pacientes portadores de LMA ou LNH, no mínimo 6 meses após terem sido
submetidos ao TMO alogênico. Encontraram uma redução no número de CFU-F (p < 0,01),
além de uma menor área dos frascos de cultura coberta por células fibroblastóides (p =
0,000006) quando comparado com os controles normais.
Recentemente, Li et al., (2004) avaliaram, em um sistema de cultura in vitro, os efeitos
agudos e diretos de quimioterápicos, sobre as CTMs. Demonstraram que as CTMs são
relativamente resistentes aos agentes quimioterápicos comumente utilizados no TMO como o
bussulfan, a ciclofosfamida e o metotrexate, entretanto, são sensíveis, podendo ser
irreversivelmente lesadas, por um painel de agentes citotóxicos que incluem o paclitaxel, a
vincristina, o etoposide e a citarabina. Apesar disto, as CTMs mantiveram o potencial de
diferenciação em osteócitos e adipócitos in vitro.
Introdução
62
Estes estudos sugerem que o microambiente estromal é lesado pela quimioterapia em
altas doses e pela exposição à radiação. Contudo, pouco se conhece sobre a extensão desta
lesão e a habilidade de auto-renovação do estroma.
1.5.20 Tr ansplantabilidade das CTMs:
As CTMs podem ser transplantadas por duas vias: a) infusão ou implante local no órgão
lesado; b) infusão sistêmica. No primeiro caso, espera-se que as CTMs aumentem o reparo
local e no segundo, que migrem para os tecidos lesados e tenham papel ativo no reparo
tissular (MINGUELL; CONGET; ERICES, 2000).
A injeção local é bem tolerada e já foram obtidos bons resultados para o tratamento de
defeitos ósseos, cartilaginosos, isquemia vascular arterial, dentre outros. Contudo, necessitam
de confirmação em estudos duplo-cegos randomizados (BARRY; MURPHY, 2004;
KASSEM; KRISTIANSEN; ABDALLAH, 2004).
As CTMs infundidas por via endovenosa são capazes de migrar especificamente para o
sítio de lesão. Esta habilidade foi demonstrada em estudos com fraturas ósseas, enfarte do
miocárdio e isquemia cerebral (BARRY; MURPHY, 2004). Além disso, podem ser úteis para
os transplantes em que se espera um atraso na enxertia, como os autólogos para LMA ou em
pacientes extensivamente tratados, como nos portadores de linfomas e mielomas. Em teoria
também podem ser utilizadas para facilitar a expansão de CTHs autólogas ex vivo, prevenir ou
melhorar a DECH (doença do enxerto contra o hospedeiro) e em protocolos de engenharia
tissular, após ser combinada com a terapia gênica (BACIGALUPO, 2004; KASSEM;
KRISTIANSEN; ABDALLAH, 2004).
Todavia, sua capacidade migratória, parece diminuir com o seu cultivo ex vivo, o que
poderia influênciar negativamente no preparo destas células para o uso terapêutico (BARRY;
MURPHY, 2004).
Introdução
63
1.5.20.1 Repopulação do micr oambiente estr omal do r eceptor por células estr omais
do doador :
A maioria dos estudos reporta que, nos paciente submetidos ao TMO com CTHs
alogênicas, as CTMs continuam sendo as do receptor (revisado por BACIGALUPO 2004).
Koç et al. (1999) avaliaram 13 pacientes submetidos ao transplante de CTHs alogênicas
para tratamento de doenças metabólicas. Todos apresentavam quimerismo completo de CTHs
do doador, contudo, estudos de polimorfismos de DNA (do inglês, desoxiribonucleic acid) e
ou de determinação dos cromossomos relacionados ao sexo, não detectaram a presença de
CTMs em nenhum dos 9 pacientes avaliados. Em adição, as CTMs dos 13 pacientes
permaneciam com o defeito na enzima especifica ou na expressão da proteína após o
transplante. Estas observações sugerem que o transplante com CTHs da MO, não resulta em
quimerismo demonstrável das CTMs.
Bacigalupo (2004) revisou o tema e relatou a detecção 2% de osteoblastos do doador em
receptores de TMO para osteogenesis imperfecta (OI), sugerindo que as CTMs da MO são
capazes de migrar, enxertar, se diferenciar em células ósseas e produzir colágeno I, com
melhora parcial do fenótipo de OI. Contudo, também foi demonstrado que as células do
doador sobrevivem aos regimes de condicionamento utilizado para o transplante. Estudos em
animais, evidenciaram a presença de células derivadas das CTMs dos doadores em vários
órgãos como o osso, a cartilagem, o pulmão, o baço, o fígado, o rim, o trato gastrointestinal, o
timo e a pele, muitos meses após o transplante.
Possíveis explicações para a perda do microquimerismo estromal seriam a rejeição
mediada pelo sistema imunológico, a inabilidade de competir efetivamente com os
componentes estromais do hospedeiro e a baixa freqüência das CTMs nos aspirados de MO,
podendo inclusive estar presente em número insuficiente para enxertia (KOÇ et al., 1999;
DEVINE; HOFFMAN, 2000). Contudo, os dados citados nos dois parágrafos anteriores,
Introdução
64
sugerem que os osteoblastos podem ser transplantados com sucesso em certas condições e
doenças, como por exemplo, crianças com OI, cuja velocidade de duplicação das CTMs é
maior do que em pacientes com neoplasias hematológicas. Assim, quando em vantagem
competitiva, pode ser possível a detecção de osteoblastos derivados do doador, CTMs ou
ambos (BACIGALUPO, 2004).
1.5.21 Possíveis aplicações clínicas par a as CTMs:
Vários estudos com as CTMs, estão sendo realizados em modelos animais e em
humanos, visando o tratamento de doenças hematológicas, ortopédicas, cardíacas,
neurológicas, dentre outras (DEANS; MOSELEY, 2000; BIANCO et al., 2001; BARRY,
2003; FIBBE; NOORT, 2003; BACIGALUPO, 2004; BAKSH; SONG; TUAN, 2004;
BARRY; MURPHY, 2004; JAVAZON; BEGGS; FLAKE, 2004; LAZARUS et al., 2005; LE
BLANC; PITTENGER, 2005; LE BLANC; RINGDÉN, 2005). Alguns destes trabalhos
encontram-se citados abaixo.
1.5.21.1 Resultados pr é-clínicos:
Estudos em modelos animais sugerem que a co-infusão das CTMs com as CTHs
facilitam a enxertia das últimas. Esta enxertia não é linhagem específica e parece ser
independente da migração das CTMs para a medula, sugerindo que pode ser mediada por um
aumento nas citocinas como o SDF-1, GM-CSF, G-CSF, SCF e IL-6 envolvidas na migração,
proliferação e diferenciação das CTHs. Este efeito é mais pronunciado após o transplante
utilizando-se um número relativamente pequeno de células CD34+, indicando que nestes
casos, a co-infusão das CTMs pode acelerar a enxertia (revisado por BACIGALUPO, 2004).
Estudos pré-clínicos realizados em modelos animais de enfarte do miocárdio,
demonstram que após a infusão intracoronária ou intramiocárdica, as CTMs são capazes de
Introdução
65
enxertar e de se diferenciar na via cardiogênica, passando a expressar marcadores de
cardiomiócitos. Trabalhos com suínos sugerem que a diferenciação das CTMs em células
similares aos cardiomiócitos ocorre duas semanas após a infusão das primeiras e é
acompanhada de atenuação significante da disfunção cardíaca. A maioria dos autores
demonstrou que a infusão intramiocárdica é segura e possível de ser realizada, sem toxicidade
imunológica, arritmias, alterações das enzimas cardíacas, eletrocardiográficas, histológicas ou
outras identificáveis (MINGUELL; ERICES, 2006).
1.5.21.2 Resultados clínicos:
Lazarus et al. (1995) realizaram um estudo de fase I, envolvendo CTMs de MO de 23
pacientes portadores de neoplasias hematológicas em remissão completa sendo que, destes, 12
haviam sido previamente submetidos ao transplante com CTHs 4 a 52 meses antes do coleta
das CTMs. Infusões de até 50 x 106 foram bem toleradas, sem reações adversas. Contudo, não
houve alteração na celularidade da MO nem na quantificação das CFU-GM (do inglês, colony
forming unit-granulocyte-monocyte), das CFU-GEMM (do inglês, colony forming unitgranulocyte-eritrocyte-monocyte-macrophage), e das BFU-E (do inglês, burst forming uniterythroid), comparadas com o valor basal. Concluíram que as CTMs obtidas de pacientes com
câncer podem ser coletadas, expandidas in vitro e administradas de forma segura, sem
toxicidade.
Koç et al. (2000) realizaram um estudo de fase I-II envolvendo 28 mulheres portadoras
de câncer de mama, das quais foram coletados 20 a 25 mL de MO. As CTMs foram cultivadas
e expandidas in vitro por 20 a 50 dias e um total de 1,0 a 2,2 x106 CTMs/Kg foram coinfundidas com as CTHs após um regime de condicionamento com altas doses de
quimioterapia. As CTMs foram detectadas no sangue periférico destas pacientes por mais de 1
hora após a infusão. Não foram observadas toxicidades relacionadas à infusão e a
Introdução
66
reconstituição hematopoética foi mais rápida neste grupo quando comparado a uma coorte de
pacientes deste mesmo centro. Estes dados sugerem que a infusão de CTMs após
quimioterapia mieloablativa pode ter um impacto positivo na reconstituição da hematopoese.
Horwitz et al. (2002) trataram 6 crianças portadoras de OI, previamente submetidas ao
protocolo padrão de TMO alogênico para esta doença. Cada criança recebeu duas infusões de
CTMs dos mesmos doadores e geneticamente marcadas. Cinco dos seis pacientes,
apresentaram enxertia em mais de um sítio incluindo o osso, a pele e o estroma medular e
apresentaram uma aceleração na velocidade de crescimento durante os primeiros 6 meses
após a infusão. Não foi evidenciada nenhuma toxicidade clínica, exceto em um paciente que
apresentou eritema urticariforme logo após a segunda infusão.
Koç et al. (2002) avaliaram o efeito da infusão das CTMs no tratamento de 11 pacientes,
portadores de leucodistrofia metacromática e síndrome de Huler, previamente submetidos ao
TMO alogênico. Foram infundidas, sem toxicidade relacionada, 2-10 x106 CTMs/kg, isoladas
e expandidas de aspirados da MO dos doadores. O microquimerismo estromal foi avaliado 2,
30 a 60 dias e 6 a 24 meses após e, em sua maioria, as células estromais eram as originais do
hospedeiro. Contudo, em dois pacientes foram demonstrados por FISH (do inglês,
fluorescence in situ hybridization) 0,4 e 2% de CTMs do doador, 60 dias após o transplante.
Quatro dos 6 pacientes com leucodistrofia metacromática apresentaram melhora significativa
na velocidade da condução nervosa. A densidade óssea manteve-se inalterada ou melhorou
em todos os pacientes, entretanto, não houve melhora aparente no estado geral, físico ou
mental dos pacientes.
Lee et al. (2002) descreveram o caso de uma mulher de 20 anos, portadora de LMA, que
recebeu CTMs de MO e CTHs de sangue periférico HLA haplo-idênticas de seu pai. A
paciente apresentou rápida recuperação da hematopese, sem DECH aguda ou crônica.
Introdução
67
Fouillard et al. (2003) relataram o caso de uma outra mulher de 68 anos, portadora de
anemia aplástica grave, que recebeu as CTMs do seu filho, expandidas ex vivo. A presença de
CTMs do doador na MO do receptor foi detectada por PCR, contudo, o mesmo não foi
observado no aspirado de MO da paciente. Isto sugere enxertia, mas indica que as CTMs
podem se localizar no endósteo. Houve melhora parcial do estroma de sustentação da
hematopoese evidênciada pela redução da necrose do tecido adiposo medular e da diminuição
do edema e hemorragia intersticiais, entretanto, não houve recuperação do tecido
hematopoético.
Le Blanc et al. (2004) descreveram o caso de uma criança de 9 anos portadora de
leucemia linfóide aguda que foi transplantada com CTHs de uma doadora não-consangüínea
HLA-compatível. O paciente evoluiu com DECH aguda grave que acometia a pele, o intestino
e o fígado e que progrediu para grau IV, apesar do tratamento com ciclosporina, prednisolona,
metilprednisolona, PUVA (psoralenico ultravioleta-A), fotoaférese, infliximab, daclizumab,
micofenolato mofetil e metotrexate. Nesta ocasião, foram infundidas 2 x106 CTMs da MO da
mãe, expandidas ex vivo, sem efeitos colaterais relacionados. A criança evoluiu com melhora
progressiva da diarréia e da função hepática. A ciclosporina foi descontinuada para permitir
máximo efeito do enxerto contra a leucemia, contudo, houve uma recaída da DECH grave,
com diarréia e aumento das bilirrubinas, sendo novamente infundidas 1 x106 CTMs maternas
com aumento da consistência das fezes e da ingesta oral, o que permitiu alta hospitalar. A
criança ficou bem por mais de 1 ano após o transplante, com DECH hepático crônico e sem
sinais de recaída da doença. Foi relatado ainda que na experiência dos autores com mais de
1000 pacientes transplantados, apenas 24 evoluíram com DECH grau IV e que dentre eles,
este acima citado foi o único que sobreviveu. Todos os outros faleceram com uma mediana de
vida de 2 meses após o transplante.
Introdução
68
Lazarus et al. (2005) avaliaram a segurança e a exeqüibilidade do co-transplante de
CTMs expandidas ex vivo com CTHs do doadores HLA-compatíveis para o tratamento de
pacientes com neoplasias hematológicas. Para tal, realizaram um estudo multicêntrico no qual
56 pacientes e seus respectivos doadores foram envolvidos. As CTMs foram expandidas a
uma dose maior que 2,5 x106 células/kg do receptor em 51 (91%) dos 56 doadores. Dos 56
pacientes envolvidos, apenas 46 pacientes receberam a infusão das CTMs. As razões pelas
quais os outros foram excluídos foram a falha em expandir adequadamente as CTMs (n = 5)
ou inelegibilidade devido a progressão da doença, alterações laboratoriais ou recusa em
participar do estudo. As CTMs foram infundidas 4 horas antes das CTHs, sem efeitos
colaterais relacionados. A mediana de tempo necessário à recuperação dos neutrófilos e de
plaquetas foi de 14 e 20 dias, respectivamente. Foram observadas DECH aguda, graus II a IV
em 13 (28%) dos 46 pacientes e crônica em 22 (61%) dos 36 pacientes que sobreviveram por
no mínimo 90 dias, sendo extenso em 8 deles. Onze (24%) pacientes apresentaram recaída em
um tempo mediano de 213,5 dias (variação de 14 a 688 dias). A probabilidade de os pacientes
atingirem uma sobrevida livre de doença em 2 anos foi de 53%. O microquimerismo estromal
foi avaliado em 18 pacientes com uma mediana de tempo de 8 e 16 meses após o transplante.
Este microquimirismo foi evidenciado em 2 pacientes e nas duas ocasiões, sendo 2 e 14% na
primeira e 6 e 11% na segunda. Os autores concluíram que a co-infusão de CTMs e CTHs é
possível e parece ser segura, sem toxicidade imediata ou tardia relacionada à infusão das
CTMs, contudo, as doses adequadas, o seu real papel e efeito ainda devem ser avaliados.
1.5.21.3 Ter apia gênica:
As CTMs são facilmente transduzidas por uma variedade de vetores e podem ser
consideradas candidatas a veículos celulares para transferência gênica (JAVAZON; BEGGS;
FLAKE, 2004) e correção de erros inatos do metabolismo (BACIGALUPO, 2004) ou para
Introdução
69
favorecer a expressão de genes suicidas na terapia anticâncer (PEREBOEVA et al. 2003).
Podem ser transduzidas eficazmente promovendo uma expressão gênica estável e duradoura.
Em vários estudos em modelos animais, CTMs secretaram o fator IX da coagulação e
citocinas como a IL-3 e a IL-7, por longos períodos, mantendo o seu fenótipo estável, assim
como a sua capacidade de diferenciação multipotencial (BACIGALUPO, 2004; DI IANNI et
al., 2004).
Baseado na importância clínica das CTMs e da grande possibilidade de seu uso como
ferramenta na terapia celular para o tratamento das mais diversas doenças, este trabalho
estudou o efeito da quimioterapia em altas doses sobre as CTMs tanto do ponto de vista
quantitativo quanto qualitativo.
Introdução
70
2 Hipóteses:
• Existe dano qualitativo e quantitativo nas células-tronco mesenquimais isoladas de
pacientes previamente submetidos ao tratamento com altas doses de quimioterapia.
3 Objetivos:
3.1 Objetivo ger al:
Avaliar as células-tronco mesenquimais de pacientes submetidos a esquemas intensivos
de quimioterapia, comparando-as com as células de doadores normais.
3.2 Objetivos específicos:
• Isolar CTMs da medula óssea de pacientes previamente submetidos a altas doses de
quimioterapia.
• Avaliar a influência da idade, da doença de base e do tempo após a quimioterapia
sobre os resultados encontrados.
• Caracterizar as CTMs quanto à morfologia e ao imunofenótipo.
• Quantificar as unidades formadoras de colônias fibroblastóides.
• Avaliar o comportamento das CTMs durante o cultivo ex vivo.
• Avaliar a sua capacidade de diferenciação em adipócitos, condrócitos e osteócitos.
• Avaliar a sua capacidade de sustentação da hematopoese em cultura por curto e
longo período de tempo.
4 MATERI AL E MÉTODOS
Material e métodos
72
4.1 Seleção dos pacientes e dos controles:
4.1.1 Pacientes:
Participaram do estudo 12 pacientes acompanhados no ambulatório de transplante de
medula óssea autólogo do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
da Universidade de São Paulo (HC-FMRP-USP), selecionados a partir da avaliação prévia dos
prontuários médicos. Os critérios utilizados foram: a) doença de base (doença de Hodgkin
(DH) ou LNH); b) ausência de infiltração medular em qualquer fase da doença; c) utilização
do protocolo BEAM como condicionamento para o transplante; d) idade mínima de 18 anos e
máxima de 60 anos.
Foram colhidas amostras de pacientes portadores de linfoma de grandes células B
primário do mediastino (LGCBM), linfoma de grandes células B difuso (LGCBD), doença de
Hodgkin esclerose nodular (DHEN), doença de Hodgkin predomínio linfocitário (DHPL) e
doença de Hodgkin celularidade mista (DHCM).
Foram utilizados como primeira linha esquemas clássicos de quimioterapia para o
tratamento do LNH como o CHOP (MCKELVEY et al., 1976) e o CHOP-Bleo
(RODRIGUEZ et al., 1977), assim como o MOPP (COOPER et al., 1972), o C-MOPPABV
(STRAUS et al., 1983) e o ABVD (BONADONNA et al., 1975) para o tratamento da DH.
O DHAP (VELASQUEZ et al., 1988), o ESHAP (VELASQUEZ et al., 1994), e o
MINE (CABANILLAS, 1991) foram os esquemas de salvamento utilizados não só como
tratamento, mas também para mobilização das células progenitoras hematopoéticas para o
sangue periférico. Nos casos em que os pacientes encontravam-se em remissão e, portanto,
não tinham necessidade de receber outro ciclo de quimioterapia de salvamento, a
ciclofosfamida (Cy) na dose de 2.0 g/m2 associada ao fator de crescimento filgrastima
10µg/Kg/dia foi utilizada para mobilização das células progenitoras hematopoéticas para o
sangue periférico. Os protocolos quimioterápicos encontram-se descritos no Apêndice C
Material e métodos
73
(Tabela A1). Na Tabela 4, encontram-se sumarizadas algumas características dos pacientes
que participaram do estudo.
Tabela 4: Características dos pacientes estudados:
Idade Sexo
Doença
D+ TMO
QT pré TMO
Ciclos
Radioterapia
prévia
DP3
22
M
LGCBM
28
CHOP
DHAP
8
3
Mediastino
DP4
35
F
DHEN
662
ABVD
ESHAP
MINE
6
3
2
Cervical
DP5
29
F
LGCBM
1551
CHOP
Cy 2g/m2
8
1
Mediastino
DP6
34
F
DHEN
1836
ABVD
DHAP
MIFAP*
6
2
2
Cervical E
Mediastino
DP7
42
M
DHEN
104
ABVD
DHAP
8
3
Mediastino
DP8
32
M
DHPL
1620
MOPP
DHAP
Cy 2g/m2
8
2
1
Membro inferior
esquerdo
DP9
40
M
LGCBD
124
CHOP
DHAP
MINE
8
3
1
Abdominal e
pélvica
DP10
48
M
DHEN
1822
C-MOPPABV
DHAP
8
3
Cervical
DP11
49
F
LGCBD
1305
CHOP-BLEO
DHAP
8
3
Não
DP12
42
M
LGCBD
168
CHOP
DHAP
MINE
8
3
2
Não
DP13
28
M
LGCBM
159
CHOP
Cy 2g/m2
8
1
Mediastino
DP14
47
M
DHCM
770
ABVD
DHAP
6
3
Supraclavicular e
axilar
D+TMO = número de dias após o transplante de medula óssea; QT = quimioterapia; DP = doador paciente;
LGCBD = linfoma de grandes células B difuso; LGCBM = linfoma de grandes células B primário do
mediastino; DHCM = doença de Hodgkin celularidade mista; DHEN = doença de Hodgkin esclerose nodular;
DHPL = doença de Hodgkin predomineo linfocitário; * após o transplante, devido à recaída da doença, mas
antes da coleta das células para a pesquisa.
Material e métodos
74
O doador paciente (DP) 1 não preencheu os critérios estabelecidos. Suas células foram
utilizadas apenas durante a padronização de alguns experimentos e, portanto, os resultados
obtidos não foram incluídos neste trabalho. A amostra DP2 foi colhida de um paciente
portador de linfoma de células do manto mas foi excluída do estudo.
A paciente DP6 apresentou recaída da doença após o transplante autólogo. Foi tratada
com radioterapia e com um esquema de quimioterapia conhecido como MIFAP (HANEL et
al., 2001). No momento da coleta da amostra a paciente encontrava-se em remissão.
Todos os pacientes receberam como condicionamento para o transplante autólogo o
protocolo BEAM (GASPARD et al., 1988).
4.1.2 Controles:
Participaram como controles 6 doadores normais voluntários, com idade mínima de 18 e
máxima de 60 anos, recrutados dentre os doadores de medula óssea para transplante de
medula alogênico.
4.1.3 Aspectos éticos:
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HC-FMRP-USP e
encontra-se registrado sob o processo HCRP no 1783/2004.
Os doadores normais (DN) e os pacientes foram orientados verbal e por escrito sobre o
projeto de pesquisa, seus objetivos, riscos e justificativa, bem como os benefícios obtidos com
a conclusão do estudo. Assinaram e receberam uma cópia do termo de consentimento, foram
informados sobre os nomes dos responsáveis pela pesquisa (pesquisadora e orientador) e de
como contactá-los em caso de dúvidas. A privacidade dos envolvidos foi preservada em todas
as fases da pesquisa.
Material e métodos
75
4.2 Coleta e processamento das amostras de sangue periférico:
Sob condições adequadas de assepsia, por punção venosa, foram coletados 4 mL de
sangue periférico em tubos a vácuo com ácido etilenodiaminoteracético (EDTA) (BD
VacutainerTM K2 EDTA (7,2mg) Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). Este material foi
utilizado para realização de hemograma, pelo contador automatizado COULTER® AC T diff
™ Analyzer (Beckman Coulter™, Miami, Flórida, EUA).
4.3 Coleta das amostras de medula óssea:
Foram colhidos 4 a 5 mL de medula óssea dos pacientes por punção aspirativa da crista
ilíaca posterior ou anterior, com material estéril, após anti-sepsia com iodopovidona
degermante (Riodeine® Rioquímica, São José do Rio Preto, SP, Brasil) e anestesia local com
lidocaína a 2% sem vasoconstritor (Genérico Hipolabor, Sabará, MG, Brasil).
Foram realizados esfregaços sanguíneos com material obtido das primeiras gotas da
punção. Estes foram avaliados, por microscopia óptica, quanto à celularidade aparente, a
morfologia e a distribuição das células nas linhagens leuco e eritrocitárias, após coloração
com Leishman. O restante do material coletado foi acondicionado em um tubo com
anticoagulante EDTA (BD VacutainerTM K2 EDTA (7,2mg) Becton Dickinson, San Jose, CA)
e processado no laboratório de biologia celular.
As amostras dos controles foram colhidas no bloco cirúrgico durante o processo de
doação de medula.
Em geral, as amostras foram processadas em até 6 horas após terem sido coletadas.
Durante este intervalo, ficaram acondicionadas na geladeira entre 2 a 6ºC.
Os dados foram utilizados para comparações entre o grupo de doadores normais e o de
pacientes e a seguir entre os doadores normais e os subgrupos de pacientes classificados por
Material e métodos
76
idade (< 40 anos vs ≥ 40 anos), doença (LNH vs DH) e por tempo após o transplante (< 180 e
> 1280 dias).
4.4 Processamento das amostras de medula óssea:
4.4.1 Isolamento das células mononucleares:
A metodologia utilizada para isolamento das células mononucleares baseia-se na
separação por centrifugação em gradiente de Ficoll-Hypaque de densidade 1077 g/mL,
descrito originalmente por Boyum (1968), mas com algumas modificações, como descrito a
seguir.
Nesta técnica, após centrifugação em baixa velocidade, as hemácias e os granulócitos
atravessam a fase orgânica (Ficoll) e se sedimentam. As plaquetas e proteínas plasmáticas se
localizam na fase aquosa (fase superior) e as células mononucleares na interface entre as duas
soluções.
Após a identificação dos tubos cônicos de polipropileno de 50 mL, a amostra foi diluída
em solução salina tamponada (PBS, do inglês phosphate buffered saline) 1X até completar 30
mL. A seguir, foram lentamente acrescentados no fundo de cada tubo, 13 mL de Ficoll
(Ficoll-Paque Plus, Amersham-Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) sem
misturar as soluções. As amostras foram centrifugadas por 30 minutos a 900 x g à temperatura
ambiente de 22ºC, sem freio. O anel de células mononucleares presentes na interface das
soluções foi coletado com o auxílio de uma pipeta Pasteur e transferido para outro tubo. Foi
acrescentado PBS 1X até o volume final de 50 mL, centrifugado por 10 minutos a 328 x g,
sem freio a 22ºC, desprezado o sobrenadante, homogeneizado o botão celular, e acrescentado
PBS 1X até o volume final de 50 mL. Novamente centrifugado por 10 minutos a 328 x g a
22ºC sem uso de freio. Desprezado o sobrenadante, homogeneizado o botão celular contendo
as células mononucleares lavadas e acrescentado 1 a 10 mL de PBS 1X (conforme a
Material e métodos
77
concentração celular) e separado uma alíquota de 10 a 50 µL da suspensão celular para
contagem em câmara de Neubauer.
4.4.2 Contagem celular em câmara de Neubauer:
A câmara de Neubauer (hemacitômetro) é um tipo especial de lâmina de microscópio
que é dividida em quadrantes de área definida, sobre o qual um determinado volume da
suspensão celular é distribuído. Por meio da contagem de células neste volume e aplicando
um cálculo apropriado pode ser aferido o número de células por mL da amostra.
Uma amostra da suspensão celular foi diluída em um tudo cônico, tipo eppendorf, de 1,5
mL contendo um volume pré-determinado de solução de Turk’s. A seguira amostra foi
homogeneizada e foram colocados 10 µL na câmara de Neubauer. As células coradas,
presentes nos quatro quadrantes laterais da câmara, foram contadas com o auxílio de um
microscópio óptico (Olympus CBA, Tóquio, Japão). O número de células nucleadas por mL
foi determinado pela divisão do número total de células contadas por 4, multiplicado por
10.000 (fator de correção) e pelo fator de diluição na solução de Turk’s.
4.4.3 Isolamento e cultivo das CTMs:
As CTMs foram isoladas das outras CMN da medula óssea pela sua capacidade de
aderência ao plástico e de expansão, sem perda da sua capacidade multipotencial, em meio de
cultivo pobre em glicose, com altas concentrações de aminoácidos e proteínas (soro bovino
fetal), sem a necessidade de citocinas.
As condições de cultivo utilizadas foram: a) meio de cultivo: α-MEM (Gibco-BRL,
Gaithersburg, MD, EUA) acrescido de 2mM/L de L-glutamina (L-Glutamine, Gibco-BRL,
Gaithersburg, MD, EUA), 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina (Penicillin
– Sterptomycin, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EUA), 2,4 g/L de Hepes (Gibco-BRL,
Material e métodos
78
Gaithersburg, MD, EUA) e 2g/L de bicarbonato de sódio (Merck, São Paulo, SP, Brasil)
conforme orientação do fabricante e enriquecido com 15% de soro bovino fetal (Fetal Bovine
Serum Standard - HyClone™, Logan, UT, EUA) previamente inativado a 56 ºC por 45
minutos; b) cultivo em estufa úmida a 37 ºC com 5% de CO2.
Após a separação e a contagem das CMN totais da medula óssea, alíquotas de 1 a 4 x107
CMN foram diluídas em um tubo cônico de polipropileno de 50 mL contendo 15 mL de αMEM 15% SBF. A seguir, a suspensão celular foi colocada em cultivo em garrafas de 75 cm2
(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha), visualizada com o auxílio de um microscópio
de contraste de fase (Olympus IX50, Tóquio, Japão) e incubada em estufa úmida a 37 ºC com
5% de CO2.
Após 3 a 7 dias, dependendo do número de células aderidas à garrafa, foi adicionado
novo meio de cultivo, após a remoção do antigo e das células não-aderentes. Este meio foi
trocado uma a duas vezes a cada 10 dias e a cultura celular mantida até confluência celular de
50 a 100% quando as células foram colhidas por tripsinização.
4.4.4 Quantificação das CFU-F:
As CMN separadas pela técnica de Ficoll foram cultivadas em 4 placas quadriculadas de
35 mm2, com as concentrações de 1 e 5 x105 cada (DN) e em 8 placas quadriculadas, na
concentração de 5 x105 (DP), em câmara úmida a 37 oC com 5% de CO2, totalizando 8 placas
por amostra. Após sete dias, foi adicionado novo meio após a remoção do antigo e das células
não-aderentes. A seguir, foram contadas as colônias com mais de 50 células fibroblastóides,
com o auxílio de um microscópio de contraste de fase. As placas com as células foram
reincubadas e as colônias novamente contadas entre o 12º e o 14º dia de cultivo. O valor
considerado para o cálculo da quantificação das CFU-F foi o número total de colônias com
mais de 50 células no “14º dia” de cultivo, dividido pelo número total de CMN plaqueadas.
Material e métodos
79
Nos casos em que as colônias encontravam-se confluentes no “dia 14”, o que impossibilitava
a contagem exata destas, foram utilizados os valores obtidos no dia 7.
4.4.5 Tripsinização:
As CTMs, como todas as células que crescem em monocamadas, secretam uma matriz
extracelular e proteínas de ligação que permitem adesão das mesmas à superfície de
crescimento. Para que sejam coletadas é necessário um tratamento prévio com uma enzima
proteolítica, como por exemplo a tripsina, que desfaz as ligações entre as células, as destas
com a matriz extracelular e com as proteínas de ligação. Antes, é importante que o SBF, o
cálcio e o magnésio do meio sejam removidos, de forma a afrouxar a ligação célula – célula e
permitir o acesso da enzima proteolítica às superfícies basal e lateral das células em
monocamada. Atenção especial deve ser dada ao tempo e à concentração da tripsina, que não
devem ser excedidos, pois resultariam em lise ou perda da viabilidade celular. No caso das
CTMs senescentes, é necessária uma tripsinização mais intensiva, já que estas aderem mais
intensamente à superfície de crescimento.
Neste trabalho foi utilizada solução de tripsina-EDTA 1x (0,05% Tripsin 0,53 mM
EDTA, Gibco™ Carlsbad, CA, EUA) por 2 a 4 minutos a 37 ºC e a técnica utilizada encontrase descrita abaixo.
O frasco de cultivo foi lavado com 10 mL de PBS 1X por três vezes, após a remoção de
todo o meio. A seguir, a tripsina foi acrescentada, no volume de 3 mL para as garrafas de 75
cm2 (T75) ou 1 mL para as de 25 cm2 (T25), com o objetivo de recobrir toda a monocamada
de células. Em seguida, a amostra foi incubada a 37ºC por 2 a 3 minutos e após, as células
foram visualizadas ao microscópio de contraste de fase. Nos casos em que as células ainda
estavam aderidas, os frascos foram reincubadas por mais 1 a 2 minutos. Quando as células
estavam soltas, a tripsina era inativada com 5 (T25) ou 10 mL (T75) de RPMI (meio Roswell
Material e métodos
80
Park Memorial Institute) 5% SBF e as células coletadas. Estas células foram transferidas para
um tubo de polipropileno previamente identificado, centrifugadas por 10 minutos a 500 x g,
sem freio, a 22ºC. O sobrenadante foi desprezado, o botão celular homogeneizado e
acrescentado 1 a 3 mL de meio de cultivo ou PBS 1X, dependendo do tamanho deste e do
experimento desejado. Uma amostra destas células foi separada para contagem em câmara de
Neubauer. Após a determinação do número de células coletadas, alíquotas foram separadas e
destinadas para uso no experimento previsto.
4.4.6 Cultivo e expansão das CTMs:
Após a tripsinização, alíquotas de 2 x105 (T75) ou 5 x104 (T25) CTMs foram diluídas
em um tubo de polipropileno contendo 15 (T75) ou 5 mL (T25) de α-MEM 15% SBF. A
seguir, a solução de células foi colocada em garrafas de cultivo, visualizada com o auxílio de
um microscópio de contraste de fase e incubadas em estufa úmida a 37ºC com 5% de CO2.
Até a 3ª ou 4ª passagem foram utilizadas garrafas de 75 cm2 e a partir de então, de 25 cm2.
O cultivo celular foi monitorado sob microscopia óptica e o meio trocado 1 a 2 vezes a
cada 10 dias, de acordo com a necessidade da cultura. As células foram cultivadas por tantas
passagens quanto possíveis e descartadas quando perdiam a capacidade de expansão e
apresentavam características morfológicas sugestivas de células senescentes.
A capacidade de expansão em cultura foi calculada, em cada repique ou passagem,
como descrito por Stenderup et al. (2003), ou seja, extraindo-se o logarítmo de N em base 2,
onde N é o número de células contadas por ocasião da confluência do frasco de cultivo
dividido pelo número inicial de células plaqueadas. Este procedimento foi repetido até que as
células atingissem a expectativa máxima de vida evidenciada pela falha de crescimento
adequado e a soma destes, resultou na expansão final de cada amostra.
Material e métodos
81
O tempo de duplicação celular foi calculado dividindo-se o número de dias (horas) entre
a 1ª e a 2ª passagens, pela expansão das células no referido período.
Foi considerado como o número final de dias de cultivo, o correspondente ao dia da
realização da última tripsinização.
4.4.7 Congelamento e descongelamento:
Alíquotas de 105 a 107 CTMs foram congeladas por segurança e realização de
experimentos futuros. Para tal, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 328 x g sem
freio, a 4ºC. O sobrenadante foi desprezado e o botão celular ressuspenso em meio de
congelamento (dimetilsulfóxido (DMSO) e 10% de SBF inativado). A suspensão celular foi
distribuída em tubos próprios para congelamento de 1,5 mL, congelada a -80ºC por no
mínimo 24 horas e em seguida, transferida para o nitrogênio liquido.
No dia do experimento previsto, as células foram descongeladas em banho Maria a
37ºC, ressuspensas em RPMI com 5% de SBF e centrifugadas por 10 minutos a 328 x g. A
seguir foram lavadas em PBS 1X, ressuspensas em αMEM 15% SBF e destinadas ao
experimento previsto após terem sido contadas em câmera de Neubauer.
Todo o processo de congelamento e descongelamento foi realizado em banho de gelo e
com soluções e centrifuga à temperatura entre 6 e 12ºC.
4.4.8 Imunofenotipagem das CTMs:
Na técnica de citometria de fluxo, a suspensão celular passa por um sistema de canais
que gera um fluxo laminar de células. Estas interrompem feixes luminosos a laser que
incidem diretamente sobre as células frente a frente ou a 90º gerando informações que são
captadas pelo software. O raio de luz sofre desvios de acordo com as características físicas
das células gerando uma dispersão luminosa que, no primeiro caso, parâmetro FSC (do inglês,
Material e métodos
82
forward scatter), informa sobre o tamanho celular, e no segundo, parâmetro SSC (do inglês,
side scatter) sobre a granularidade ou complexidade interna da célula. Assim, permite a
análise quantitativa e qualitativa de vários parâmetros celulares.
Para correta identificação dos antígenos, os anticorpos monoclonais são conjugados com
três diferentes fluorocrômos: ficoeritrina (PE, do inglês phycoeritrin), isotiocianato de
fluoresceína (FITC, do inglês fluorescein isothiocyanate), PerCP (do inglês peridinin
chlorophyll). Estes podem ser empregados isoladamente ou em combinações de dois ou três
anticorpos conjugados. Controles positivos e negativos devem ser incluídos para a adequada
calibração do aparelho, análise dos resultados e definição da positividade da amostra.
O primeiro passo consiste na marcação das células pela técnica direta, na qual são
utilizados anticorpos monoclonais previamente conjugados com o fluorocrômo ou pela
técnica indireta, onde é necessária uma segunda incubação com um anticorpo previamente
marcado com fluorocrômo anti-imunoglobulina de camundongo. Como todas as reações de
reconhecimento antígeno-anticorpo, o sucesso da reação dependente da interação específica
do domínio Fab (do inglês, fragment, antigen binding) do anticorpo com o antígeno o qual
determina a sua especificidade. Para tanto, no caso da marcação celular, torna-se necessário o
bloqueio dos receptores Fc (do inglês, fragment, crystalizable) presentes na superfície de
diversos tipos de células, os quais podem ser responsáveis por inúmeras ligações
inespecíficas. Os reagentes bloqueadores são bastante diversificados como por exemplo, soro
AB inativado, soro da mesma espécie utilizada para gerar o anticorpo secundário, ou ainda,
anticorpo anti-FcR II e III.
Uma vez que a suspensão celular tenha sido marcada pela técnica direta ou indireta,
procede-se à aquisição das intensidades de fluorescências no citômetro. As células que
expressam o antígeno em questão estarão marcadas com o anticorpo conjugado ao
fluorocrômo. Estes são excitados pela incidência do feixe de laser e emitem ondas luminosas
Material e métodos
83
de diferentes comprimentos. Estas ondas luminosas são detectadas por detectores
fotomultiplicadores após terem sido filtradas por um sistema óptico. A seguir, os dados
captados são analisados com o auxílio de um software, de acordo com os parâmetros FSC,
SSC e fluorescência e podem ser representados em gráficos de pontos (dot plots), histogramas
(fluorescência e número de fluorocrômos empregados), ou de um contorno (counter plots).
Sempre que necessário, uma janela de análise pode ser criada com o objetivo de estudar em
separado uma subpopulação celular.
A imunofenotipagem de células mesenquimais foi realizada com a utilização de
anticorpos monoclonais que reconhecem antígenos de superfície da membrana da célula. Para
a identificação dessas células foi montado um painel contendo os seguintes marcadores
CD105 PE (Serothec, Oxford, Inglaterra), CD73 PE, CD51/61 FITC, HLA-ABC PE (BD
PharMingen, San Jose, CA, EUA), CD45 FITC, CD14 PE, CD34 PE, CD54 PE, CD44 FITC,
CD49e PE, CD29 PE, HLA-Dr FITC, CD90 PE e CD13 PE (Becton Dickinson, San Jose,
CA, EUA), KDR FITC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), Stro-1 (marcação indireta com
sobrenadante de cultura de células estromais, IgM, gentilmente doado pela pesquisadora
Bervely Torok-Storb do Fred Hutchinson Câncer Research Center – Seattle, WA, EUA),
além do controle negativo IgG FITC e IgG2a PE (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). A
distribuição e as funções destes antígenos encontram-se descritos no Apêndice D (Tabela
A2).
No decorrer do trabalho, foram percebidas três populações distintas de células, divididas
conforme os parâmetros tamanho e complexidade interna. Com o objetivo de avaliarmos
possíveis diferenças quanto à expressão antigênica nestes 3 grupos celulares, estas células
foram separadas em janelas ou regiões seguindo os parâmetros FSC e SSC, descritos a seguir
e comparadas entre si e em relação à população total (PT): a) região 1 (R1) - população
pequena (PP): FSC e SSC de 0 a 250; b) região 2 (R2) - população média (PM): FSC de 250 a
Material e métodos
84
650 e SSC de 250 a 800; c) região 3 (R3) - população grande (PG): FSC de 400 a 1024 e SSC
de 800 a 1024.
As técnicas de marcação com anticorpo fluorescente utilizadas neste trabalho, para
análise por citometria, encontram-se descritas abaixo:
4.4.8.1 Marcação direta:
Alíquotas de 100 µL, de suspensão celular diluídas em PBS 1X contendo 105 células,
foram colocadas em tubos de poliestireno 12 x 75 (Falcon, EUA) previamente identificados
com os diferentes marcadores. Logo após, foram adicionados 5 µL dos anticorpos
monoclonais marcados com fluorocrômos e as amostras foram incubadas no escuro, à
temperatura ambiente, por 20 minutos. A seguir, após terem sido acrescentados 2 mL de PBS
1X em cada tubo, as amostras foram centrifugadas à 300 x g por 3 minutos. Os sobrenadantes
foram desprezados, novamente adicionado 2 mL de PBS 1X em cada tubo e a centrifugação
repetida. Cada botão celular foi ressuspenso em 200 µL de PBS 1X.
4.4.8.2 Marcação indireta:
Neste caso, o anticorpo primário não é marcado com fluorocrômo sendo necessária uma
marcação secundária com um anticorpo fluorescente.
Foi realizada como na marcação direta até a primeira centrifugação, quando, a seguir
foram adicionados em cada amostra, 5 µL de anticorpos monoclonais IgG de cabra anticamundongo marcado com FITC e então, a amostra foi incubada no escuro por 10 minutos, à
temperatura ambiente. Cada suspensão celular foi lavada duas vezes com 2 mL de PBS 1X,
centrifugada à 300 x g por 3 minutos e seus respectivos botões celulares foram ressuspensos
em 200 µL de PBS 1X.
Material e métodos
85
As células foram adquiridas e a intensidade de fluorescência foi captada por citometria
de fluxo pelo aparelho FACSort™ (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). Os dados foram
analisados com o software CELLQuest™ (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA).
4.4.9 Viabilidade celular:
A viabilidade celular também foi avaliada por citometria de fluxo. Para tal, os ácidos
nucléicos das células, que estavam com a membrana citoplasmática lesada, foram marcados
pelo corante iodeto de propídeo (PI, do inglês propidium iodide) (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, EUA). Assim, estas células passaram a emitir fluorescência própria que é captada pelo 3º
canal do citômetro, o que possibilita a avaliação da viabilidade celular. Esta pode ser aferida
em todo o poll de células ou em uma subpopulação previamente marcada com um
fluorocrômo (ex: CD34+).
Na técnica utilizada, uma alíquota de 100 µL contendo 105 células foi colocada em um
tubo de poliestireno 12 x 75 (Falcon, EUA) previamente identificado. Foram adicionados 400
µL de PBS 1X e 50 µL do corante e em seguida, a amostra foi incubada por 10 minutos no
escuro e à temperatura ambiente.
Nos casos em que o objetivo foi avaliar a viabilidade de uma subpopulação celular, o
primeiro passo foi a marcação direta ou indireta das células, como descrita na técnica de
citometria de fluxo, porém, após a segunda centrifugação, o botão celular foi ressuspenso em
400 µL de PBS 1X e a seguir , foi adicionado o PI conforme descrito acima.
As células foram adquiridas e a intensidade da fluorescência foi captada por citometria
de fluxo pelo aparelho FACSort™ (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). Os dados foram
analisados com o software CELLQuest™ (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA).
Material e métodos
86
4.4.10 Avaliação do ciclo celular:
Para avaliar se havia ou não diferença entre as diversas fases do ciclo celular das CTMs
de doadores normais e de pacientes pós-quimioterapia, foi utilizado o CycleTEST™ PLUS
DNA Reagent Kit (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, EUA), cujo
princípio consiste na coloração dos ácidos nucléicos pelo iodeto de propídeo, após a
eliminação do citoesqueleto e das proteínas nucleares da célula por digestão enzimática
(tripsina) e da digestão do RNA (do inglês, ribonucleic acid) celular seguido da estabilização
da cromatina nuclear com a enzima espermina. O PI, dependendo da fase do ciclo celular,
emite diferentes intensidades de fluorescência que, por sua vez, são captadas pelos detectores
fotomultiplicadores do citômetro de fluxo.
Para tal, as CTMs foram colhidas por tripsinização, em 4ª ou 5ª passagem e com
confluência entre 50 e 80%. O protocolo foi seguido de acordo com as instruções do
fabricante e encontra-se descrito abaixo:
A uma alíquota 100 µL contendo 105 CTMs, foram acrescentados 250 µL da solução A,
em um tubo de poliestireno 12 x 75 (Falcon, EUA) previamente identificado. A amostra foi
incubada por 10 minutos no escuro e a seguir, foram acrescentados 200 µL da solução B. A
amostra foi reincubada e finalmente, acrescentados 200 µL da solução C.
As células foram captadas pelo citômetro FACSort™ (Becton Dickinson, Franklin
Lakes, NJ, EUA), adquiridas com o software CELLQuest™ (Becton Dickinson, Franklin
Lakes, NJ, EUA) e analisadas pelo software (Modfit™ Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ,
EUA). A porcentagem das células nas diferentes fases do ciclo celular foi quantificada e os
dados foram expressos em gráficos de histogramas.
Material e métodos
87
4.4.11 Diferenciação das CTMs em adipócitos, osteócitos e condrócitos:
As CTMs foram induzidas à diferenciação em adipócitos, osteócitos e condrócitos após
terem sido coletadas por tripsinização.
4.4.11.1 Adipócitos e osteócitos:
Alíquotas de 1 mL contendo 40.000 células/mL (diferenciação em adipócitos e
osteócitos) e 5.000 células/mL (controle) foram cultivadas em placas de 24 poços com
lamínulas para a realização de estudos morfológicos ou em placas de 35 mm2 para análise da
expressão gênica por técnicas moleculares. A diferenciação foi iniciada no mínimo 24 horas
após o início do cultivo, quando à aderência e confluência estavam em torno de 50%. Nesta
ocasião, todo o meio de cultura foi removido e, a seguir, foi adicionado 1 mL de meio de
indução (adipócitos ou osteócitos) ou somente o meio α-MEM 7,5% SFB como controle. As
placas foram reincubadas em estufa úmida a 37ºC com 5% de CO2 e metade do meio foi
trocado 2 vezes por semana. O meio utilizado para troca continha o dobro da concentração
dos agentes indutores. As amostras foram cultivadas em estufa úmida a 37ºC com 5% de CO2
até a diferenciação celular e monitorizadas sob microscopia invertida.
O meio utilizado para a indução da diferenciação em adipócitos foi o α-MEM 15% SBF,
suplementado com 10 µM de dexametasona (Decadron injetável, Prodome, Campinas, SP,
Brasil), 10 µg/mL de insulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 100 mM de
indometacina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e para os osteócitos o α-MEM 7,5% SBF
suplementado com 0,10 µM de dexametasona (Decadron injetável, Prodome, Campinas, SP,
Brasil), 100 µM de ácido ascórbico e 10 mM de β glicerolfosfato (Reagem, Rio de Janeiro,
RJ, Brasil).
Material e métodos
88
4.4.11.2 Condrócitos:
Para a diferenciação em condrócitos, uma suspensão celular contendo 106 CTMs
indiferenciadas, foi ressuspensa em meio indutor, em um tubo cônico de polipropileno de 15 mL e
então centrifugada a 146 x g por 5 minutos. O botão celular foi cultivado no próprio tubo, em
estufa úmida, a 37ºC com 5% de CO2 e o meio de cultivo foi trocado 2 vezes por semana. Após
14 dias, a amostra foi lavada com PBS 1X e fixada em formol tamponado a 10% por 2 horas. A
seguir, a amostra foi diafanizada em banhos sucessivos de álcool a 50, 70, 90%, seguidos de três
banhos a 100% com duração de 10 minutos cada. Na seqüência, recebeu dois banhos de xilol a
100%, com duração de 5 e 10 minutos, respectivamente, e então, foi colocada em banho com
paraplast liquido a 60ºC, em estufa seca, por 30 minutos e incluída em paraplast.
Foram realizados cortes de 4 a 5 µm e colocados sobre lâminas previamente silanizadas.
Estas secaram por 12 horas e então, foram colocadas em estufas secas a 60ºC por mais 12
horas, com o objetivo de escorrer o paraplast e fixar o corte.
O meio utilizado para a indução da diferenciação em condrócitos foi o DMEM (Gibco™
Carlsbad, CA, EUA), sem SBF suplementado com 10 ng/mL de TGF β3 (PeproTech, Rocky
Hill, NJ, EUA), 100 µM de piruvato de Na (Gibco™ Carlsbad, CA, EUA), 0,1 µM de
dexametasona (Decadron injetável, Prodome, Campinas, SP, Brasil), 50 µM de ácido
ascórbico, 0,5X insulina-transferrina – selenium A (ITS - Gibco™ Carlsbad, CA, EUA) e
0,2% albumina humana (Aventis Behring, Melbourne, Austrália).
4.4.12 Avaliação da morfológica das células:
As CTMs foram continuamente avaliadas, por microscopia em contraste de fase, durante
todo o cultivo. Também foram tiradas fotos, nas diferentes fases, com o objetivo de
documentar os experimentos e a evolução natural das células.
Material e métodos
89
Além da microscopia em contraste de fase, foram utilizadas colorações histoquímicas e
imunohistoquimicas para avaliação morfológica das células, tanto indiferenciadas, quanto
diferenciadas. Esta avaliação foi realizada sob microscopia de luz, utilizando o miscroscópio
Axioskop 2 plus (Carl Zeis, Alemanha). As imagens foram capturadas com a câmera digital
Axiocam (Carl Zeis, Alemanha) e analisadas como auxílio do software AxioVision (Carl
Zeis, Alemanha).
As células mesenquimais indiferenciadas foram plaqueadas em lamínulas e após 5 a 7
dias de cultivo foram coradas com a coloração de Leishman ou HE (hematoxilina e eosina),
diafinizadas e montadas em permout SP 15 (Fisher, Hampton, NH, Inglaterra).
As células diferenciadas em adipócitos e os seus controles foram fixados em
paraformaldeído (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, EUA) a 4%, por 15 minutos, à
temperatura ambiente, e após, lavados em água destilada e incubados em álcool 70% por 2 a 3
minutos. A seguir, foram coradas com a solução de sudan II-escarlate por 2 a 5 minutos,
lavadas em álcool 70% em água corrente e contra-coradas com hematoxilina de Harris por 2
minutos. O material foi montado em glicerina.
As células diferenciadas em osteócitos e os seus controles foram fixados em
paraformaldeído a 4% por 15 minutos à temperatura ambiente, e após, lavados em água
destilada e coradas com solução de nitrato de prata a 5%, no escuro por 30 minutos. Em
seguida, foram lavadas em água destilada, expostas a lâmpada de 100W por 60 minutos
(coloração Von Kossa) e então, lavadas rapidamente com tiossulfato de sódio a 5%, contracoradas com hematoxilina de Harris, submetidas ao processo de diafinização e a seguir,
montadas em permout SP 15.
No dia da reação, as amostras diferenciadas em condrócitos foram desparafinizadas em
banhos de xilol e série decrescente de álcoois. A seguir, foram lavadas em água corrente e
após em água destilada. Na seqüência, foram coradas com HE, Safranina O (Saf O) e
Material e métodos
90
tricômico de Massom (TM) e realizada imuno-histoquimica com colágeno II (anticorpo
policlonal de coelho, Novocastra™, Benton Lane, Newcastle, Inglaterra).
4.4.13 Análise da expressão gênica para avaliação da diferenciação celular:
A análise da expressão gênica foi realizada com o objetivo de avaliar a cinética de
expressão dos genes envolvidos na diferenciação em adipócitos e osteócitos. Foram utilizadas
células cultivadas em placas de 35 mm2, como anteriormente descrito.
Foi utilizada a reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT-PCR). Para
tanto, o RNA total foi extraído pelo método do TrizolTM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a
partir das CTMs indiferenciadas (dia zero) e das culturas de diferenciação em adipócitos e
osteócitos nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42. Após remoção do meio de cultivo, foram
adicionados às placas de 35mm2 750 µL de TrizolTM. A mistura foi homogeneizada e coletada
com o auxílio de uma pipeta e a seguir congelada a - 80ºC até o momento do uso.
Após descongelamento em gelo, foram adicionados às amostras, 200 µL de
clorofórmio puro e 100 µg glicogênio, e a seguir, foi feita agitação vigorosa por 15 segundos
em vórtex. Na seqüência, esta mistura foi incubada à temperatura ambiente por 5 minutos e
centrifugada por 11.538 x g por 15 minutos a 4°C. Após a centrifugação, a fase aquosa da
mistura foi transferida para um novo tubo.
Em uma etapa posterior, foi realizada a precipitação do RNA, usando para cada tubo
500 µL de álcool isopropílico gelado. As amostras foram incubadas a -20°C por 16 horas e,
após esse período, centrifugadas por 9.615 x g por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi
desprezado e acrescentado ao pellet, 1 mL de etanol a 75%. As amostras foram
homogeneizadas e centrifugadas por 10.000 x g por 15 minutos a 4°C.
A síntese do cDNA (do inglês, complementary desoxiribonucleic acid) foi realizada por
Material e métodos
91
meio do kit de transcrição reversa SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A partir de
2,0 µg de RNA total, foram adicionados 10 mM de desoxirribonucleotídeo trifosfato (dNTP) mix,
0,5 µg/µL de Oligo (dT)12-18 e água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC), em uma quantidade
suficiente para completar um volume final de 10 µL. Esta mistura foi incubada à temperaturas de
65°C por 5 minutos e 4°C por um minuto. Transcorrido este tempo, foi adicionado ao tubo de
reação um segundo mix contendo: 10x RT buffer, 25 mM de cloreto de Magnésio (MgCl2), 0,1 M
de ditiotreitol (DTT) e Rnase OUT Recombinant Rnase Inhibitor. Após homogeneização, a
amostra foi incubada a 42°C por dois minutos, na seqüência foi adicionado 1 µL (50 unidades) da
enzima SuperScriptTM III RT, novamente incubada a 42°C por 50 minutos e em seguida a 70°C
por 15 minutos. O armazenamento foi realizado a 4°C.
Para a análise da expressão dos genes envolvidos na diferenciação em adipócitos e
osteócitos foram selecionados genes específicos envolvidos neste processo: PPARγ e
osteopontina, respectivamente. Como controle endógeno foi utilizado o gene da β-actina. As
seqüências dos primers utilizados encontram-se na Tabela 5.
Tabela 5: Primers utilizados para a análise da expressão dos genes PPARγ e da
osteopontina.
Primer
PPAR89
PPAR429
OST66
OST388
β-actina forward
Seqüência 5’-3’
GTTATGGGTGAAACTCTGGGAG
GGAGATGCAGGCTCCACTTTG
CCATGAGAATTGCAGTGATTTGC
GTCGTTCGAGTCAATGGAGTCC
GCCCTGAGGCACTCTTCCA
β-actina reverse
CCAGGGCAGTGATCTCCTTCT
Tamanho (pb)
340
387
195
* PPAR = do inglês, peroxisome proliferator activated receptor γ2; Ost = osteopontina
As condições de amplificações foram de 28 ciclos a 94ºC por 40 segundos; 55 a 60ºC
por 50 segundos, 72ºC por 1 minuto, 2 minutos, seguidos de 72ºC por 10 minutos e
Material e métodos
92
refrigeração. O produto de PCR foi visualizado em gel de agarose a 1% contendo brometo de
etídeo (0,1µg/mL) por meio de luz ultravioleta.
4.4.14 Sustentação da hematopoese:
No final da década de 70, foi descrito (DEXTER; ALLEN; LAJTHA, 1977) um sistema
de cultura líquida que permitia a proliferação das CTHs, de precursores granulocíticos e a
manutenção da granulopoese em cultura por várias semanas. Em 1994, este mesmo grupo,
publicou um artigo, no qual descreveram uma técnica de diluição limitante, que permite a
análise e a quantificação de células iniciadoras de cultura por longo tempo, o que possibilita
estimar a atividade de CTHs em amostras clínicas (PETTENGELL et al., 1994). Desde então,
vários autores vêm utilizando modificações desta técnica, não só, para um melhor
entendimento da sobre as CTHs, mas também, para demonstrar a capacidade das CTMs em
sustentar a hematopoese (ZHANG et al., 2004).
Para avaliação da capacidade das células mesenquimais em sustentar a hematopoese,
foram utilizados os ensaios de co-cultivo destas com CTHs por curto (STC-IC, do inglês,
short-term culture-initiating cell) e longo (LTC-IC, do inglês, long-term culture-initiating
cell) período de tempo, baseados nos estudos anteriormente descritos, nos quais as células
foram cultivadas por 7 e 28 dias, respectivamente.
Estes ensaios foram divididos em 3 etapas: a) isolamento e congelamento das células
CD34+ de sangue de cordão umbilical e placentário; b) co-cultivo das CTMs e CTHs; c)
ensaio clonogênico.
4.4.14.1 Isolamento de células CD34+ de SCUP:
Para o isolamento por seleção positiva das células CD34+ foi utilizado o kit de marcação
imunomagnética, CD34+ Progenitor Cell Isolation Kit (MACS, Bergisch Gladbach,
Material e métodos
93
Alemanha), no qual as células que expressam o antígeno CD34 são imunomarcadas com
anticorpos monoclonais conjugados a microesferas paramagnéticas, ficam presas ao passarem
pelo campo magnético no interior da coluna LS (LS Separation Columns – MACS, Bergisch
Gladbach, Alemanha) e são recuperadas quando a coluna é retirada deste campo. As
marcações com os anticorpos monoclonais e os tempos de incubação foram realizadas
segundo protocolo descrito abaixo.
4.4.14.1.1. Marcação das células:
Após a separação das CMN do SCUP por gradiente de Ficoll e contagem em câmara de
Neubauer, a suspensão celular foi centrifugada a 500 x g por 10 minutos a 22ºC e o botão
celular foi ressuspenso em 300 µL de solução tampão de coluna (PBS 1X, EDTA 2mM e
Albumina 0,5%), 100 µL do reagente A1 (bloqueador do receptor de Fc) e 100 µL do
reagente A2 (anticorpo anti-CD34), para cada 1 x108 CMN. A suspensão celular foi
homogeneizada, incubada por 15 minutos em geladeira, lavada com 40 mL de solução tampão
e a seguir, novamente homogeneizada e centrifugada a 500 x g por 10 minutos. O
sobrenadante foi removido e o botão celular ressuspenso em 400 µL de solução tampão. A
seguir, a suspensão celular foi incubada por 15 minutos em geladeira (6 a 12ºC) após a adição
de 100 µL do reagente B (microesferas paramagnéticas conjugadas a anti-imunoglobulina
αCD34). As células foram então lavadas com 40 mL de solução tampão, homogeneizadas,
centrifugadas a 500 x g por 10 minutos, o sobrenadante foi removido e o botão celular
ressuspenso em 20 mL de solução tampão.
4.4.14.1.2.Separação pela coluna imunomagnética:
A suspensão celular foi submetida ao campo magnético no interior da coluna LS e em
Material e métodos
94
processo, a coluna foi removida do campo magnético e foram acrescentados 5 mL de solução
tampão para a eluição das células marcadas. As células eluídas foram coletadas num tubo
cônico de poliestireno 15 mL. O procedimento de eluição foi repetido 2x. A seguir, as células
eluídas da 1ª coluna foram novamente submetidas ao campo magnético no interior de uma
segunda coluna, para aumentar a pureza da amostra. A suspensão celular foi centrifugada a
500 x g por 10 minutos, o botão celular foi ressuspenso em 2 mL de solução tampão e as
células foram contadas em câmara de Neubauer. Uma alíquota contendo 105 células foi
separada para determinação da pureza e viabilidade por citometria de fluxo. O restante da
amostra foi centrifugado a 500 x g por 10 minutos, ressuspenso em solução de congelamento
e congelado à -80ºC por no mínimo 24h quando foi transferido para o nitrogênio liquido.
4.4.14.2 Co-cultivo das CTMs e CTHs:
Para avaliar a capacidade das CTMs de diferentes doadores e pacientes em sustentar a
hematopoese, foi realizado um experimento no qual as CTHs de SCUP foram cultivadas em
meios enriquecidos ou não com citocinas, na presença das CTMs como feeder layer.
O meio de cultivo utilizado foi o α-MEM 15% de SBF enriquecido ou não com o
seguinte coquetel de citocinas: a) 100 ng/mL de SCF (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA); b)
20 ng/mL de IL-3 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA); c) 20 ng/mL de IL-6 (PeproTech,
Rocky Hill, NJ, EUA); d) 50 ng/mL de Flt-3 lig (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA). O meio
de troca foi preparado com o dobro da concentração final desejada de citocinas, com o
objetivo de repô-las uma vez por semana.
Para tanto, 6 alíquotas contendo 40.000 células mesenquimais foram cultivadas por 24 a
96 horas, em placas de 24 poços até atingiram confluência em torno de 90%. A seguir, foram
irradiadas com 16 Gy (fonte de cobalto 60 com irradiação gama) e reincubadas em incubadora
úmida a 37ºC com 5% de CO2 após a troca de metade do meio.
Material e métodos
95
Para cada paciente ou doador, alíquotas contendo 4 x103 CTHs viáveis foram cultivadas
em poços com meio enriquecido com citocinas e CTMs, ou apenas na presença de um destes.
Como controle do experimento, as CTHs foram cultivadas sem as CTMs, na presença e na
ausência de citocinas. Em um outro poço as CTMs foram cultivadas sem as CTHs.
Nos dias 7 (STC-IC) e 28 (LTC-IC) de co-cultivo, as células aderentes e as nãoaderentes foram coletadas e colocadas em um tubo de polipropileno de 15 mL. A seguir,
foram centrifugadas por 10 minutos a 500 x g em 900 µL de α-MEM 15% SBF e aquelas com
tamanho compatível com as células CD34+ foram contadas. A concentração final das células
foi ajustada para que não mais de 100 µL fossem adicionados a cada 3 mL de metilcelulose. A
viabilidade celular foi determinadas por imunofenotipagem.
4.4.14.3 Ensaio clonogênico:
O ensaio clonogênico foi realizado com o objetivo de quantificar as BFU-E e CFU-GM
que se encontravam viáveis ao término do co-cultivo.
No dia zero de co-cultivo, 500 a 1.000 células CD34+, foram cultivadas em meio semisólido (Methocult™ without cytokines – Stem Cell Technologies inc. Vacouver, Canada)
previamente enriquecido com 50 ng/mL de SCF (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA), 10
ng/mL de IL-3, (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA), 10 ng/mL de GM-CSF (PeproTech,
Rocky Hill, NJ, EUA), 10 ng/mL de G-CSF (Leucin® Dong-A Pharmaceutical, Taegue,
Coréia) e 4 U/mL de EPO (do inglês, erythropoietin – Eprex ® VETTER Pharma Fertigung
Ravensburg, Alemanha).
Após homogeneização cuidadosa em vórtex, o meio com a suspensão celular foi
incubado por 1 a 2 minutos à temperatura ambiente e a seguir, 1 mL do produto foi
distribuído em uma placa quadriculada de 35 mm2. Todo experimento foi realizado em
Material e métodos
96
duplicata. Após 14 dias de cultivo em incubadora extra-úmida a 37ºC com 5% de CO2, as
colônias foram contadas com o auxílio de um microscópio de contraste de fase.
Nos dias 7 e 28 de co-cultivo, as células foram colhidas e alíquotas de 103 células com
morfologia sugestiva de células CD34+ foram cultivadas como no dia zero.
Para o cálculo da expansão das células CD34+ co-cultivadas com as CTMs, a média das
colônias obtidas foi multiplicada por um fator para correção da diluição aplicada e do número
de células plaqueadas. Para o cálculo da expansão das unidades formadoras de colônias, o
resultado acima foi dividido pelo número de colônias obtidas no ensaio realizado com as
CTHs antes da expansão (dia zero de cultivo).
4.5 Análise estatística:
A análise estatística foi realizada com o auxílio do software GraphPad InStat versão 3.0
para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www.graphpad.com. Os
gráficos foram criados com o auxílio do software GraphPad Prism versão 3.0 para Windows,
GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www.graphpad.com.
Os dados foram comparados e analisados com o auxilio da estatística descritiva e de
testes não-paramétricos escolhidos devido ao pequeno número de amostras avaliadas. Os
valores correspondentes aos percentis 25 (P25) e 75 (P75) dos doadores normais, por
convenção, foram utilizados como referência para comparações com os pacientes.
O teste de Mann-Whitney foi utilizado para a comparação das amostras independentes.
O de Kruskal-Wallis e o de Friedman para comparações envolvendo mais de duas amostras
independentes e correlacionadas, respectivamente. Na presença de diferença estatisticamente
significante entre os grupos, o pós-teste de comparações múltiplas de Dunn foi aplicado para
identificar os subgrupos com real diferença estatística. Foram consideradas como
estatisticamente significantes as comparações cujo p valor foi menor que 0,05, i.e., p < 0,05.
5 RESULTADOS
Resultados
98
5.1 Características dos pacientes estudados:
Os resultados obtidos estão baseados em um estudo envolvendo 18 doadores de medula
óssea, dos quais 6 constituem o grupo de doadores normais e 12 o grupo de pacientes. Estes
últimos foram classificados em subgrupos segundo a idade (anos), a doença de base (LNH e
DH) e o tempo (dias) após o transplante. Os dados foram utilizados para comparações entre o
grupo de doadores normais e de pacientes e a seguir entre os doadores normais e os subgrupos
acima descritos.
Dos 12 pacientes avaliados, 4 são do sexo feminino e 8 do masculino. Seis são
portadores de doença de Hodgkin e 6 de linfoma não-Hodgkin. A mediana (amplitude) do
tempo (em dias) no qual a amostra de MO foi coletada dos pacientes totais, dos subgrupos
com < 180 e com > 1280 dias após o transplante foram, respectivamente, 716 (28 a 1836),
124 (28 a 168), 1620 (1305 a 1836). Os principais esquemas de quimioterapia utilizados como
primeira linha para tratamento dos portadores de DH e LNH foram o ABVD e o CHOP,
respectivamente. O DHAP, seguido pelo MINE foram os esquemas de resgate mais usados
em ambos os casos. Dez dos 12 pacientes receberam radioterapia no sítio da doença, em
algum momento do tratamento, sendo que 5 pacientes foram irradiados no mediastino e
apenas um na região pélvica.
Quanto à idade (anos) a mediana (amplitude) dos doadores normais, pacientes totais, <
40 anos e ≥ 40 anos foram, respectivamente, 31,5 (23 a 42), 37,5 (22 a 49), 30,5 (22 a 35),
44,5 (40 a 49). O teste de Mann-Whitney foi aplicado com o objetivo de avaliar a igualdade
de comportamento da idade do grupo de pacientes com o de doadores normais e proporcionou
p = 0,1740. Para comparar o comportamento dos subgrupos separados por idade com o grupo
de doadores normais, foi aplicado o teste de Kruskal-Wallis que evidenciou a existência de
diferença estatisticamente significante (p = 0,0059). A seguir, o teste de comparações
múltiplas de Dunn detectou diferença comportamental entre o subgrupo ≥ 40 anos e os
Resultados
99
doadores normais (p < 0,05) e entre os primeiros e os < 40 anos (p < 0,05). Por outro lado,
não houve diferença estatisticamente significante entre a idade dos DN e a dos < 40 anos (p >
0,05). A Tabela 4 (material e métodos) sumariza as características do pacientes estudados e a
Figura 4 representa a distribuição das idades (anos) dos doadores normais, dos pacientes e
seus subgrupos.
50
Idade (anos)
45
40
35
P75
30
P25
25
20
DN
DP
<40a
>40a
DH
LNH
<180d >1280d
Figura 4: Distribuição das idades (anos) dos doadores normais, pacientes e seus
subgrupos. ____ mediana; DN = doador normal; DP = doador paciente; DH = doença de
Hodgkin; LNH = linfoma não-Hodgkin.
5.2 Características das amostras de sangue periférico e medula óssea:
A crista ilíaca posterior (CIP) foi o local escolhido para a punção da MO, contudo, na
paciente 5, devido a dificuldades técnicas, a punção foi realizada na crista ilíaca anterior
(CIA). A mediana (amplitude) do volume coletado (mL) e a do número total de CMN (x107)
Resultados
100
obtidas foi de 4,5 (4,0 a 5,0) e 4,43 (2,05 a 17,5) respectivamente. A Tabela 6 representa
algumas das características das amostras de medula óssea coletadas dos pacientes.
Tabela 6: Características das amostras de medula óssea dos pacientes avaliados:
Amostra
Doença
DP-3
DP-4
DP-5
DP-6
DP-7
DP-8
DP-9
DP-10
DP-11
DP-12
DP-13
DP-14
LGCBM
DHEN
LGCBM
DHEN
DHEN
DHPL
LGCBD
DHEN
LGCBD
LGCBD
LGCBM
DHCM
D+
TMO
28
662
1551
1836
104
1620
124
1822
1305
168
159
770
Volume
aspirado
4,50
4,50
4,00
4,50
4,50
4,50
4,50
4,50
5,00
4,50
4,50
4,50
Local
CMN
CIP
CIP
CIA
CIP
CIP
CIP
CIP
CIP
CIP
CIP
CIP
CIP
5,00 x 107
8,75 x 107
3,25 x 107
7,19 x 107
3,56 x 107
7,56 x 107
3,85 x 107
17,50 x 107
2,06 x 107
10,90 x 107
2,45 x 107
2,05 x 107
Celularidade
aparente
normocelular
normocelular
normocelular
normocelular
normocelular
normocelular
sem fragmento
normocelular
normocelular
normocelular
normocelular
normocelular
Relação
L:E
1,5:1
2,7:1
2,8:1
3,0:1
2,3:1
2,3:1
4,8:1
2,0:1
3,4:1
2,2:1
2,4:1
2,9:1
* D+TMO = número de dias após o transplante de medula óssea; CMN = células mononucleares; relação L:E =
relação leucócitos:eritrócitos; DP = doador paciente; DHCM = doença de Hodgkin celularidade mista; DHEN =
doença de Hodgkin esclerose nodular; DHPL = doença de Hodgkin predomíneo linfocitário; LGCBD = linfoma
de grandes células B difuso; LGCBM = linfoma de grandes células B primário do mediastino; CIP = crista
ilíaca posterior; CIA = crista ilíaca anterior.
A análise dos mielogramas evidenciou medula óssea normocelular com relação
leucoeritrocitária (relação L:E) dentro dos limites da normalidade em todas as amostras
exceto na do paciente 9, cuja avaliação foi prejudicada pela ausência do fragmento ósseo. Não
foram encontradas alterações displásicas significativas exceto por diseritopoese leve,
evidenciada principalmente pela presença de pontes e prolongamentos citoplasmáticos, falhas
de hemoglobinização e assincronia de maturação núcleo-citoplasmática, presentes em 10 das
12 amostras estudadas.
Os hemogramas dos pacientes e doadores normais encontram-se representados no
Apêndice E (Tabela A3).
Resultados
101
5.3 Isolamento e cultivo das células-tronco mesenquimais:
5.3.1 Caracterização morfológica:
As células-tronco mesenquimais foram isoladas de todas as amostras e então cultivadas
até a perda de sua capacidade de expansão. A Figura 5 representa as CTMs em duas fases do
cultivo.
630x
A B
630x
40x
C
D
40x
Figura 5: Caracterização morfológica das CTMs. A e B: CTMs de um doador paciente em 3ª
passagem - coloração Leishman (630X); C: CTMs fibroblastóides, de um doador normal
em 1ª passagem (40X); D: CTMs senescentes de um doador paciente em 2ª passagem
(40X).
As células jovens (A, B e C) apresentam-se morfologicamente como células afiladas,
fibroblastóides, com núcleo bem delimitado, dois a três nucléolos bem evidentes e citoplasma
amplo, com limites imprecisos e borda irregular. As mais velhas (D) apresentam-se com
Resultados
102
significativo do tamanho do citoplasma. As células jovens foram, aparentemente, mais
freqüentes nas primeiras passagens e nas amostras cultivadas dos doadores normais, quando
comparadas às dos pacientes.
5.3.2 Quantificação das unidades formadoras de colônias fibroblastóides:
As unidades formadoras de colônias fibroblastóides foram quantificadas entre o 12º e o
14º dia de cultivo e encontram-se representadas na Figura 6 e na Tabela A4 (Apêndice F).
CFU-F (x10 -5 CMN)
10
9
4
3
2
P75
P25
1
0
DN
DP
<40a
>40a
DH
LNH
<180d >1280d
Figura 6: Quantificação das unidades formadoras de colônias fibroblastóides (x10-5
CMN plaqueadas) dos doadores normais, pacientes e seus subgrupos. ____
mediana; _____ percentil; P75 = percentil 75 dos DN; P25 = percentil 25 dos DN; DN =
doador normal; DP = doador paciente; DH = doença de Hodgkin; LNH = linfoma nãoHodgkin.
A mediana (amplitude) das CFU-F (x10-5 CMN plaqueadas) dos doadores normais e dos
pacientes totais foram, respectivamente, 1,25 (0,13 a 9,25) e 0,94 (0,00 a 3,75), sendo que,
Resultados
103
dos 12 pacientes, 7(58%) apresentaram contagem de CFU-F inferior ao valor correspondente
ao P25 dos doadores normais (1,16 x10-5 CMN plaqueadas).
As medianas (amplitude) das CFU-F (x10-5 CMN plaqueadas) observadas para os
valores organizados e avaliados de acordo com a subclassificação dos pacientes foram: a) por
idade: 0,80 (0,00 a 3,75) para < 40 anos e 0,96 (0,00 a 3,45) para ≥ 40 anos; b) por doença:
2,78 (0,28 a 3,75) para a DH e 0,23 (0,00 a 1,18) para o LNH; c) tempo após o transplante:
0,73 (0,00 a 1,18) para < 180 dias e 2,52 (0,00 a 3,45) para > 1280 dias. Sendo que, 4/6
(66,6%) pacientes com idade < 40 anos e 3/6 (50%) com idade ≥ 40 anos apresentaram
contagem de CFU-F inferior ao valor correspondente ao percentil 25 dos DN. Tal resultado
também foi encontrado em 5/6 (83,3%) dos portadores de LNH e em apenas 2/6 (33,3%) dos
portadores de DH, assim como em 4/5 (80%) dos que realizaram o transplante há < 180 dias e
2/5 (40%) dos que o fizeram há > 1280 dias.
Contudo, o teste de Mann-Whitney não evidenciou diferença estatisticamente
significante entre os grupos de doadores normais e pacientes (p = 0,4421), bem como o de
Kruskal-Wallis não rejeitou a equivalência de comportamentos entre os doadores normais e os
subgrupos classificados por idade (p = 0,6996), por tempo após o transplante (p = 0,2252) ou
por doença (p = 0,0506).
5.3.3 Quantificação do tempo de duplicação das CTMs:
O tempo (horas) necessário para a duplicação celular das CTMs foi calculado entre a 1ª
e a 2ª passagens e encontra-se representado na Figura 7 e na Tabela A.5 (Apêndice G).
A mediana (amplitude) dos valores encontrados para os doadores normais e os pacientes
foram, respectivamente, 46,30 (36,36 a 270,59) e 80,66 (34,08 a 195,35) horas, sendo que,
apenas 2 (16,6%) dos 12 pacientes, apresentaram um valor de tempo (horas) necessário à
duplicação celular inferior àquele correspondente ao P75 dos doadores normais (54,22 horas).
Resultados
104
280
270
190
Horas
170
150
130
110
90
70
50
P75
P25
30
DN
DP
<40a
>40a
DH
LNH
<180d >1280d
Figura 7: Tempo (horas) necessário à duplicação das CTMs entre a 1ª e a 2ª passagem
dos doadores normais, pacientes e seus subgrupos. ____ mediana; _____ percentil;
P75 = percentil 75 dos DN; P25 = percentil 25 dos DN; DN = doador normal; DP =
doador paciente; DH = doença de Hodgkin; LNH = linfoma não-Hodgkin.
As medianas (amplitude) do tempo (horas) necessário à duplicação celular entre a 1ª e a
2ª passagens observadas para os valores organizados e avaliados de acordo com a
subclassificação dos pacientes foram, respectivamente: a) por idade: 83,15 (34,08 a 185,64)
para os < 40 anos e 80,66 (58,90 a 195,35) para os ≥ 40 anos; b) por doença: 64,05 (49,48 a
185,64) para a DH e 99,77 (34,08 a 195,35) para o LNH; c) tempo após o transplante: 68,33
(34,08 a 107,22) para < 180 dias e 69,01 (49,48 a195,35) para > 1280 dias. Sendo que, 2/6
(33,3%) pacientes com idade < 40 anos e 0/6 (0%) com idade ≥ 40 anos apresentaram valores
correspondentes ao tempo (horas) necessário à duplicação celular entre a 1ª e a 2ª passagens,
superiores ao percentil 75 dos DN. Tal resultado também foi encontrado em 1/6 (16,6%) dos
Resultados
105
portadores de DH e LNH e em 1/5 (20%) dos que realizaram o transplante há < 180 dias ou
dos que o fizeram há > 1280 dias.
Entretanto, o teste de Mann-Whitney não evidenciou diferença estatisticamente
significante entre os grupos de doadores normais e pacientes (p = 0,1025) e os
comportamentos dos subgrupos classificados por idade (p = 0,1956), por doença (p= 0,2359)
ou por tempo após o transplante (p = 0,2507) foram detectados equivalentes pelo
procedimento do teste de Kruskal-Wallis.
5.3.4 Quantificação dos dias que as CTMs permaneceram em cultivo:
O dia da última passagem foi considerado como o último dia em que as CTMs
permaneceram em cultivo. Os valores correspondentes a este dado encontram-se representado
na Figura 8 e na Tabela A.6 (Apêndice H).
A mediana (amplitude) dos dias que as CTMs dos doadores normais e dos pacientes
permaneceram em cultivo foram, respectivamente, 81 (57 a 103) e 71,50 (46 a 88), sendo que,
dos 12 pacientes, 7 (58,3%) apresentaram valores inferiores àquele correspondente ao P25 dos
doadores normais (73,25 dias).
As medianas (amplitude) dos dias que as CTMs permaneceram em cultivo, observadas
para os valores organizados e avaliados de acordo com a subclassificação dos pacientes,
foram, respectivamente: a) por idade: 71,50 (46 a 88) para os < 40 anos e 69 (53 a 88) dias
para os ≥ 40 anos; b) por doença: 63 (46 a 84) para a DH e 79 (58 a 88) dias para o LNH; c)
tempo após o transplante: 85 (58 a 88) para < 180 dias e 70 (56 a 74) dias para > 1280 dias.
Sendo que, as CTMs isoladas de 4/6 (66,6%) pacientes com idade < 40 anos e 3/6 (50%) com
idade ≥ 40 anos permaneceram em cultivo por um número de dias inferior ao percentil 25 dos
DN. Tal resultado também foi encontrado em 4/6 (66,6%) dos portadores de DH e em 3/6
Resultados
106
(50%) dos portadores de LNH, assim como em apenas 1/5 (20%) dos que realizaram o
transplante há < 180 dias e 4/5 (80%) dos que o fizeram há > 1280 dias.
110
Dias de cultivo
100
90
P75
80
P25
70
60
50
40
DN
DP
<40a
>40a
DH
LNH
<180d >1280d
Figura 8: Duração (dias) do cultivo das CTMs dos doadores normais, pacientes e seus
subgrupos. O dia da última tripsinização foi considerado como o último dia de cultivo
das CTMs. ____ mediana; _____ percentil; P75 = percentil 75 dos DN; P25 = percentil 25 dos
DN; DN = doador normal; DP = doador paciente; DH = doença de Hodgkin; LNH =
linfoma não-Hodgkin.
Todavia, o procedimento correspondente ao teste de Mann-Whitney não evidenciou
diferença estatisticamente significante entre os doadores normais e os pacientes (p = 0,1505).
Da mesma forma, o teste de Kruskal-Wallis utilizado na comparação de comportamentos
entre o grupo de doadores normais e os subgrupos de pacientes classificados por idade (p =
0,3188), por doença (p= 0,1106) e por tempo após o transplante (p = 0,1375), não rejeitou a
equivalência de comportamentos relativos à quantificação média/mediana dos dias em que as
CTMs permaneceram em cultivo.
Resultados
107
5.3.5 Expansão celular em cultura:
A capacidade de expansão em cultura das CTMs foi registrada quantitativamente em
cada passagem e a soma destes valores foi convencionado como a expansão final. Estes dados
encontram-se representados na Figura 9 e na Tabela A.7 (Apêndice I).
Expansão celular
30
25
P75
20
15
P25
10
5
0
DN
DP
<40a
>40a
DH
LNH
<180d >1280d
Figura 9: Expansão final das CTMs dos doadores normais, pacientes e seus subgrupos.
A capacidade de expansão em cultura foi quantificada em cada passagem e a somas destes
valores foi convencionado como a expansão final. ____ mediana; _____ percentil; P75 =
percentil 75 dos DN; P25 = percentil 25 dos DN; DN = doador normal; DP = doador
paciente; DH = doença de Hodgkin; LNH = linfoma não-Hodgkin.
A mediana (amplitude) da expansão das CTMs dos doadores normais e dos pacientes
foram, respectivamente, 18,11 (11,85 a 27,48) e 8,17 (1,81 a 28,27) vezes, sendo que, 8/12
pacientes (66,6%) apresentaram valores inferiores àquele correspondente ao P25 dos doadores
normais (14,21 vezes).
As medianas (amplitude) da expansão das CTMs observadas para os valores
organizados e avaliados de acordo com a subclassificação dos pacientes foram,
Resultados
108
respectivamente: a) por idade: 14,75 (1,81 a 28,27) vezes para < 40 anos e 7,31 (3,32 a 19,61)
vezes para ≥ 40 anos; b) por doença: 9,63 (1,81 a 20,48) vezes para DH e 7,77 (3,32 a 28,27)
vezes para o LNH; c) tempo após o transplante: 17,95 (6,91 a 28,27) vezes para < 180 dias e
7,71 (3,32 a 20,48) vezes, para os > 1280 dias. Sendo que, 3/6 (50%) pacientes com idade <
40 anos e 5/6 (83,3%) com idade ≥ 40 anos apresentaram um valor de expansão inferior ao
correspondente ao percentil 25 dos DN. Tal resultado também foi encontrado em 4/6 (66,6%)
dos portadores de DH ou LNH, assim como em 2/5 (40%) dos que realizaram o transplante há
< 180 dias e 4/5 (80%) dos que o fizeram há > 1280 dias.
Entretanto, o teste de Mann-Whitney, ao comparar a capacidade de expansão das CTMs
dos doadores normais e pacientes, não encontrou diferença estatisticamente significante entre
os grupos (p = 0,0668). De maneira similar, o teste de Kruskal-Wallis não rejeitou a
equivalência de comportamentos entre os doadores normais e os subgrupos classificados por
doença (p= 0,1720), tempo após o transplante (p = 0,1424) ou idade (p = 0,0853).
5.4 Avaliação do tamanho e complexidade interna das CTMs:
As CTMs foram subdivididas em janelas seguindo os parâmetros FSC e SSC,
previamente descritos. A Figura 10 representa as subpopulações celulares.
Os valores porcentuais medianos (amplitude) observados, no grupo de doadores normais
e de pacientes foram, respectivamente, para as células pequenas 17,90 (5,92 a 23,00) e 26,15
(6,74 a 62,00), para as médias 71,95 (59,13 a 89,32) e 65,44 (25,62 a 89,49) e grandes 6,99
(3,23 a 16,59) e 6,09 (1,76 a 10,45). A distribuição dos valores encontrados para os pacientes
foi mais heterogênea que no grupo de doadores normais. O valor correspondente ao P25 dos
doadores normais, foi ultrapassado por 9/12 (75%) dos pacientes no caso das células pequenas
(P25 - 11,57%) e não foi alcançado em 7/12 (58,3%) para as células médias (P25 - 67,06%).
Resultados
109
O teste de Mann-Whitney foi aplicado para comparação entre a porcentagem
média/mediana de células em cada subpopulação dos pacientes e doadores normais e não
encontrou diferença entre a porcentagem de células pequenas (p = 0,1505), médias (p =
0,2496) e grandes (p = 0,8916). A Figura 11 e a Tabela A.8 (Apêndice J) representam a
porcentagem de células encontradas em cada uma das subpopulações de CTMs de pacientes e
doadores normais.
Figura 10: Subpopulações de CTMs. As CTMs foram avaliadas por citometria de fluxo e
subdivididas em grupos celulares de acordo com os parâmetros tamanho e
complexidade interna. A região R1 engloba a subpopulação de células pequenas (PP), a
R2 a de células médias (PM) e a R3 a de células grandes (PG).
Células (%)
100
75
50
25
0
DN-PP DP-PP DN-PM DP-PM DN-PG DP-PG
Figura 11: Porcentagem de CTMs dos doadores normais e dos pacientes em cada uma
das subpopulações celulares. As CTMs foram separadas em grupos baseados nos
parâmetros tamanho e complexidade interna. DP = doador paciente, DN = doador
normal; PP = população pequena, PM = população média e PG = população grande.
____
Resultados
110
5.5 Imunofenotipagem das CTMs:
A expressão antigênica das proteínas de superfície das CTMs foi avaliada por citometria
de fluxo pela técnica de imunofenotipagem. Os resultados encontrados demonstram que as
células isoladas possuem características imunofenotípicas compatíveis com as das CTMs,
tanto para os doadores normais quanto para os pacientes, isto é, expressão baixa ou ausente
dos marcadores de células hematopoéticas (CD34, CD14, CD45), endoteliais (CD51/61,
KDR) e HLA-DR, expressão baixa a moderada do Stro-1 e significativa, mas em diferentes
níveis de intensidade, dos antígenos CD73, CD105, CD90, CD13, CD29, CD49e, CD54,
CD44 e HLA-ABC.
A Figura 12 representa esquematicamente o resultado da imunofenotipagem das CTMs
de pacientes e doadores normais e mostra, na forma de histograma, a porcentagem de células,
dentre as totais, que expressam cada um dos antígenos avaliados.
As porcentagens médias/medianas (amplitude) de células dos doadores normais e dos
pacientes que expressam os antígenos a seguir foram, respectivamente: a) CD45: 0,06 (0,00 a
0,34) e 0,10 (0,00 a 1,29); b) CD14: 0,02 (0,00 a 0,25) e 0,21 (0,00 a 4,08); c) CD34: 0,76
(0,00 a 1,49) e 0,40 (0,04 a 3,48); d) KDR: 1,31 (0,48 a 7,10) e 0,59 (0,00 a 3,32); e)
CD51/61: 1,46 (1,01 a 3,84) e 1,58 (0,10 a 9,61); f) HLA-DR: 0,79 (0,28 a 2,07) e 0,80 (0,00
a 3,86); g) HLA-ABC: 70,41 (7,74 a 89,77) e 73,61: (0,35 a 94,62); h) CD105: 80,61 (56,79
a 82,96) e 51,57 (18,24 a 75,23); i) CD73: 88,30 (46,35 a 95,29) e 82,21 (2,19 a 97,56); j)
Stro-1: 13,29 (1,95 a 36,04) e 14,98 (0,76 a 27,46); l) CD90: 98,65 (97,21 a 99,01) e 98,24
(73,13 a 99,53); m) CD29: 87,94 (79,03 a 96,61) e 87,06 (15,47 a 97,12); n) CD13: 97,46
(92,93 a 98,68) e 95,20 (36,82 a 98,74); o) CD49e: 85,56 (57,36 a 95,19) e 83,55 (3,89 a
96,23); p) CD54: 31,36 (8,00 a 50,73) e 35,75 (1,57 a 64,42); q) CD44: 41,31 (2,41 a 93,57)
e 63,37 (0,39 a 92,66). Alguns destes valores encontram representados na Figura 13.
Resultados
111
Figura 12: Imunofenotipagem das CTMs do paciente 12 em 3ª passagem. A expressão
antigênica das glicoproteínas de superfície das CTMs foi avaliada por citometria de
fluxo pela técnica de imunofenotipagem e encontra-se expressa na forma de
histogramas.
Os dados foram analisados e a porcentagem média/mediana de células que expressam os
antígenos de superfície da população total e de cada uma de suas subpopulações (células
pequenas (PP), médias (PM) e grandes (PG)) foi comparada entre os grupos de pacientes e
doadores normais com o teste de Mann-Whitney. Não houve diferença estatisticamente
significante em nenhuma das comparações indicando assim comportamentos equivalentes
entre os grupos comparados dois a dois. A intensidade de fluorescência dos antígenos
analisados para a população total de células e suas subpopulações encontra-se nas Tabelas
A.9, A.10, A.11, A.12 (Apêndice L) para os pacientes e nas Tabelas A.13, A.14, A.15, A.16
(Apêndice M) para os doadores normais.
Resultados
112
7.5
% Expressão antigênica
% Expressão antigênica
5
4
3
2
1
0
CD45 DN
A
CD45 DP
CD14 DN
CD14 DP
0.0
% Expresão antigênica
% Expressão antigênica
CD34 DN
CD34 DP
KDR DN
KDR DP
Stro-1 DN
Stro-1 DP
CD44 DN
CD44 DP
CD90 DN
CD90 DP
CD13 DN
CD13 DP
100
85
75
65
55
45
35
8
6
4
75
50
25
2
0
0
HLA-I DN
C
HLA-I DP
HLA-DR DN HLA-DR DP
D
100
100
85
% Expressão antigênica
% Expressão antigênica
2.5
B
95
70
55
40
20
10
0
E
5.0
CD73 DN
CD73 DP
CD105 DN
CD105 DP
F
90
80
70
60
40
35
30
Figura 13: Expressão antigênica (porcentagem) das proteínas de superfície das CTMs
dos doadores normais e dos pacientes. A expressão antigênica das proteínas de
superfície das CTMs foi avaliada por citometria de fluxo pela técnica de
imunofenotipagem. Expressão dos antígenos: A: CD45 e CD14; B: CD34 e KDR; C:
HLA-ABC e HLA-DR; D: Stro-1 e CD44; E: CD73 e CD105; F: CD90 e CD13. DP =
doador paciente, DN = doador normal; CD = do inglês, cluster of differentiation, HLA=
do inglês, human leucocyte antigen ____ mediana.
5.6 Avaliação da viabilidade celular:
A viabilidade celular foi avaliada por citometria de fluxo. A técnica utilizada foi a da
Resultados
113
A mediana (amplitude) da viabilidade celular das CTMs dos doadores normais totais e
dos pacientes foram 88,66 (86,95 a 94,40) e 86,33 (73,82 a 93,73), respectivamente. Os dados
foram analisados pelo teste de Mann-Whitney que não evidenciou diferença estatisticamente
significante entre os porcentuais médios/medianos da viabilidade celular dos grupos (p =
0,1877). Estes dados encontram-se representados graficamente na Figura 14.
p = 0,1877
% viabilidade
100
90
80
70
Doadores normais
Pacientes
Figura 14: Viabilidade das CTMs dos doadores normais e dos pacientes. A viabilidade
celular foi avaliada por citometria de fluxo após marcação com iodeto de propídeo.
mediana. Teste Mann-Whitney (p = 0,1877).
____
A viabilidade celular nas subpopulações de células pequenas, médias e grandes também
foi avaliada. A Figura 15 mostra de forma representativa os resultados obtidos tanto para os
pacientes quanto para os doadores ilustrando a viabilidade da população total de células e suas
subpopulações. A área vermelha representa as células pequenas, a verde as células médias e a
rosa as células grandes.
Resultados
114
Figura 15: Viabilidade das subpopulações de células pequenas, médias e grandes das
CTMs do paciente 10 em 3ª passagem. A viabilidade celular foi avaliada por
citometria de fluxo após marcação com iodeto de propídeo. As CTMs foram subdivididas
em grupos celulares de acordo com os parâmetros tamanho e complexidade interna. A
região em vermelho engloba a população de células pequenas (PP), a verde a de células
médias (PM) e a rosa a de células grandes (PG).
A porcentagem mediana (amplitude) de células viáveis das subpopulações dos grupos de
doadores normais e de pacientes foi, respectivamente: a) células pequenas 89,13 (58,41 a
91,92) e 85,00 (57,00 a 93,38); b) células médias 91,89 (87,31 a 95,56) e 86,72 (65,58 a
96,62); c) células grandes 72,88 (55,65 a 91,03) e 79,33 (44,86 a 90,05). A Figura 16
representa graficamente os valores observados para as populações de células totais e suas
subpopulações, tanto para os doadores normais quanto para os pacientes. Estes dados se
encontram organizados na Tabela A.17 (Apêndice N).
O teste de Mann-Whitney, utilizado para comparar a porcentagem média/mediana da
viabilidade celular populacional do grupo de pacientes com o de doadores normais, não
evidenciou diferença estatisticamente significante entre as subpopulações de células pequenas
(p = 0,9593), médias (p = 0,3827) e grandes (p = 0,7990). O mesmo, também não foi
evidenciado pelo teste de Freidman, utilizado para comparar as subpopulações dentro de um
mesmo grupo, com p = 0,1738 para o de pacientes e p = 0,0934 para o de doadores normais.
Resultados
115
% Viabilidade
100
90
80
70
60
50
DN-PP
DP-PP
DN-PM
DP-PM
DN-PG
DP-PG
Figura 16: Viabilidade celular das diferentes subpopulações de acordo com os
parâmetros tamanho e complexidade interna. A viabilidade celular foi avaliada
por citometria de fluxo após marcação dos ácidos nucléicos das células com iodeto de
propídeo. ____ mediana. DP = doador paciente, DN = doador normal; PP = população
pequena, PM = população média e PG = população grande.
5.7 Avaliação do ciclo celular:
Para avaliar o comportamento das CTMs do grupo de doadores normais e do de
pacientes nas diversas fases do ciclo celular foi utilizado o CycleTEST™ PLUS DNA Reagent
Kit, cujo princípio baseia-se na emissão pelo iodeto de propídeo de diferentes intensidades de
fluorescência nas diversas fases do ciclo celular. Estas são captadas por um citômetro de
fluxo, analisadas e expressas em porcentagem de células em cada fase do ciclo celular por
meio de gráficos de histogramas como representado na Figura 17.
A porcentagem mediana (amplitude) do número de CTMs dos doadores normais e dos
pacientes totais presentes em cada fase do ciclo celular foram: a) GO-G1 82,41 (82,19 a 87,02)
e 85,63 (63,19 a 92,17); b) G2-M 6,59 (5,75 a 7,08) e 1,37 (0,00 a 4,62); c) Fase S 10,67 (6,59
a 12,05) e 12,17 (3,33 a 36,81), respectivamente.
Resultados
116
Figura 17: Análise do ciclo celular das CTMs do paciente 8 em 4ª passagem. O pico maior,
em vermelho, representa a fase G0-G1 (82,1%), o menor, a G2-M (4,42%) e a área entre os
canais 50 e 100, tracejada em azul, a fase S (13,48%).
Os dados foram avaliados com o auxílio do teste de Mann-Whitney que evidenciou
diferença estatisticamente significante, entre as porcentagens médias/medianas de células, dos
grupos de pacientes e doadores normais, na fase G2-M (p = 0,004) do ciclo celular, contudo, o
mesmo não foi demonstrado para as fases GO-G1 (p = 1,000) e S (p = 0,6828). Os resultados
observados encontram-se na Tabela A.18 (Apêndice O) e representados na Figura 18.
100
90
Células (%)
80
70
60
40
30
20
10
0
DN G0G1 DP G0G1 DN G2M DP G2M
DN S
DP S
Figura 18: Porcentagem de células dos doadores normais e dos pacientes nas fases G0G1, G2-M e S do ciclo celular. O teste de Mann-Whitney evidenciou comportamentos
equivalentes da porcentagem média/mediana de células dos grupos de pacientes e
doadores normais, nas fases G0-G1 (p = 1,000) e S (p = 0,6828) do ciclo celular. Tal
equivalência de comportamento, não foi observada na fase G2-M (p = 0,004). ____
Resultados
117
5.8 Diferenciação das CTMs em adipócitos, osteócitos e condrócitos:
As CTMs indiferenciadas dos doadores normais e dos pacientes foram induzidas à
diferenciação em adipócitos e osteócitos pelo cultivo em meio específico. Esta diferenciação
foi nitidamente evidenciada no caso dos adipócitos e osteócitos, a partir do 15º e 30º dia de
cultivo, respectivamente, em todas as amostras para as quais o experimento foi concluído.
Entretanto, as amostras DP04, DP09, DP11 e DP14 evoluíram para senescência precoce não
sendo possível realizar este ensaio já que não havia número suficiente de células. As Figuras
19 e 20 ilustram a diferenciação em adipócitos e osteócitos.
A
B
C
D
Figura 19: Exemplos de CTMs diferenciadas ex vivo em adipócitos. As CTMs foram
cultivadas em α-MEM 15% SBF, suplementado com dexametasona, insulina e
indometacina. Coloração sudan II – escarlate e hematoxilina de Harris. A: DP 07 corado
no dia 28 de cultivo (100x). B, C e D: DP 13 corado no dia 18 de cultivo, B (630x), C
(1000x) e D controle negativo da diferenciação, cultivado em α-MEM 7,5 % SBF sem
suplementos (630x).
Resultados
118
A B
C D
Figura 20: Exemplos de CTMs diferenciadas ex vivo em osteócitos. As CTMs foram
cultivadas em α-MEM 7,5% SBF, suplementado com dexametasona, ácido ascórbico e
β-glicerolfosfato. Coloração Von Kossa e hematoxilina de Harris. A, B e D: DP 05
corado no dia 39 de cultivo; A (100x), B (630x) e D controle negativo da diferenciação,
cultivado em α-MEM 7,5% SBF sem suplementos (630x). C: DP 03 corado após 65
dias de cultivo (630x).
As CTMs foram cultivadas em α-MEM enriquecido com 7,5% SFB, sem a presença de
agentes indutores à diferenciação, com o objetivo de servir como controle da reação. Estas
células permaneceram indiferenciadas durante o tempo necessário para a diferenciação em
adipócitos (Figura 19D). Contudo, quando mantidas em cultivo por mais tempo como no
caso da diferenciação osteogênica dos pacientes, as CTMs se diferenciaram espontaneamente
em osteócitos (Figura 20D), porém, em menor intensidade do que as cultivadas em meio
indutor específico (Figura 20B). A diferenciação espontânea em osteócitos dos doadores
Resultados
119
Três amostras de doadores normais e cinco de pacientes foram induzidas à diferenciação
ex vivo em adipócitos e osteócitos e avaliadas quanto à expressão dos genes PPARγ e OST,
respectivamente, por RT-PCR. O gene da osteopontina já se encontrava expresso, em
diferentes intensidades, nas CTMs indiferenciadas tanto dos pacientes quanto dos doadores
normais. O gene PPARγ iniciou uma fraca expressão no 7º dia, sendo que esta expressão foi
claramente percebida no 14º dia de cultivo em meio indutor. Ambos os genes continuaram
sendo expressos até o dia 42 de cultivo, quando o ensaio foi encerrado. A Figura 21 ilustra a
expressão destes genes nas amostras do DP 13 e DN13.
Figura 21: Avaliação da expressão dos genes PPARγ e osteopontina por RT-PCR
durante a diferenciação ex vivo das CTMs em adipócitos e osteócitos. * indica
a amplificação do gene do controle endógeno β-actina
Amostras com CTMs indiferenciadas de pacientes e doadores normais foram cultivadas
em tubos cônicos de polipropileno com meio indutor específico sem SBF e suplementado com
TGFβ3. As células foram incluídas em paraplast entre os dias 13 e 15 de cultivo. A
diferenciação foi evidenciada pela perda da morfologia de células fibroblastóides, passando-se
a apresentar como células arredondadas e posteriormente pelo aparecimento de regiões muito
semelhantes às lacunas condrocitárias e, pela produção de matriz extracelular rica em
colágeno comprovada pela coloração tricômico de Masson e pela imuno-histoquimica com
anticorpo específico anti-colágeno II. Não foi obtido número suficiente de células para este
ensaio das amostras DP04, DP05, DP11 e DP14. A Figura 22 ilustra esta diferenciação.
Resultados
120
A B
C D
Figura 22: Exemplos de CTMs diferenciadas ex vivo em condrócitos. As células foram
cultivadas em um tubo cônico de polipropileno, em DMEM sem SBF, suplementado
com TGFβ3 piruvato de Na+, ácido ascórbico, albumina humana, dexametasona e
insulina-transferrina-selenium. A, C e D: amostra do DP 13, incluída em paraplast no
14º dia de cultivo. A: imunohistoquímica para colágeno II (400x), note células
fortemente coradas em marrom (setas azuis) pelo anticorpo específico e a presença de
lacunas condrocitárias (setas alaranjadas); C: hematoxilina e eosina (1000x), note a
presença de células com característica morfológica sugestiva de condrócito (seta verde);
D: tricômico de Masson (1000x) note a matriz de colágeno em torno das células corada
em azul (seta vermelha). B: DN12, amostra incluída em paraplast no 14º dia de cultivo,
controle negativo da imuno-histoquímica (1000x), note a ausência de células coradas
pelo anticorpo.
5.9 Sustentação da Hematopoese:
Quatro amostras de CTMs de doadores normais e seis de pacientes foram escolhidas
para o ensaio de sustentação da hematopoese. As células foram irradiadas e após, cocultivadas com CTHs por 7 (ensaio de STC-IC) e 28 dias (ensaio de LTC-IC). A seguir, as
células foram coletadas, aquelas com morfologia de CTHs foram contadas, plaqueadas em
Resultados
121
metilcelulose para realização de ensaio clonogênico e as restantes, foram enviadas para
análise de viabilidade celular pela técnica de incorporação do iodeto de propídeo.
A Figura 23 ilustra o co-cultivo das CTMs e CTHs na ausência (A) e na presença (B)
de citocinas, além de exemplos de BFU-E (C) e CFU-GM (D).
100x
100x
A B
100x
C
D
100x
Figura 23: Fotos ilustrativas do co-cultivo das CTMs com as CTHs e do ensaio
clonogênico. As CTMs foram co-cultivadas com as CTHs por 7 e 28 dias. A: Cocultivo das CTMs e CTHs na ausência de citocinas (100x). B: Co-cultivo das CTMs e
das CTHs na presença de citocinas (100x). C: Ensaio clonogênico, exemplo de duas
BFU-E (100x). D: Ensaio clonogênico, exemplo de uma CFU-GM (100x). CTMs =
células-tronco mesenquimais; CTHs = células-tronco hematopoéticas; CFU-GM = do
inglês, colony forming unit-granulocyte-monocyte; BFU-E = do inglês, burst forming
unit- erythroid;
A expansão das células CD34+ dos pacientes e doadores normais na ausência e na
presença de citocinas, após 7 e 28 dias de co-cultivo com as CTMs, foi calculada após a
quantificação das células CD34+ viáveis.
Resultados
122
A mediana (amplitude) dos valores encontrados na expansão de células CD34+ após cocultivo com as CTMs de doadores normais e de pacientes por 7 dias foram 3,24 (2,15 a 4,91)
e 3,13 (2,42 a 4,29) na ausência e 5,22 (4,81 a 7,26) e 6,33 (5,72 a 7,36) na presença de
citocinas, respectivamente. Estes dados encontram-se representados na Figura 24 e
sumarizados na Tabela A.19 (Apêndice P).
p = 0,9143
4
3
2
1
0
A
CTM DN
CTM DP
Sem CTM
p = 0,1714
9
Expansão das Células CD34+
Expansão das Células CD34+
5
8
7
6
5
4
B
CTM/CIT DN CTM/CIT DP
CIT
Figura 24: Expansão das CTHs (CD34+) na ausência (A) e presença de citocinas (B) após
co-cultivo com as CTMs por 7 dias. As CTHs foram co-cultivadas com as CTMs por
7 dias quando as células CD34+ viáveis foram quantificadas e a sua expansão calculada.
CTM = células-tronco mesenquimais; DP = doador paciente; DN = doador normal; Sem
CTM = controle experimento, as células CD34+ forma cultivadas na ausência das CTM;
CIT = citocinas, controle do experimento, células cultivadas apenas com citocinas, na
ausência das CTM. ____ mediana.
A mediana (amplitude) dos valores encontrados na expansão de células CD34+ após o
co-cultivo com as CTMs de doadores normais e de pacientes por 28 dias foram 4,12 (3,84 a
4,68) e 4,46 (3,42 a 5,09) na ausência e 7,49 (6,51 a 8,38) e 7,21 (6,83 a 7,80) na presença de
citocinas, respectivamente. Estes dados encontram-se representados na Figura 25 e
sumarizados na Tabela A.20 (Apêndice P).
O teste de Mann-Whitney não evidenciou diferença de comportamento quanto à
expansão de células CD34+ co-cultivadas com as CTMs do grupo de doadores normais e as do
grupo de pacientes, na presença (p = 0,1714 e p = 0,1667) ou na ausência (p = 0,9143 e p =
0,4762) de citocinas por 7 e 28 dias, respectivamente.
Resultados
123
p = 0,4762
4.5
3.5
2.5
1.5
0.5
A
CTM DN
CTM DP
Sem CTM
p = 0,1667
9
Expansão das Células CD34+
Expansão das Células CD34+
5.5
8
7
6
B
CTM/CIT DN CTM/CIT DP
CIT
Figura 25: Expansão das CTHs (CD34+) na ausência (A) e presença de citocinas (B) após
co-cultivo com as CTMs por 28 dias. As CTHs foram co-cultivadas com as CTMs
por 28 dias quando as células CD34+ viáveis foram quantificadas e a sua expansão
calculada. CTM = células-tronco mesenquimais; DP = doador paciente; DN = doador
normal; Sem CTM = controle experimento, as células CD34+ forma cultivadas na
ausência das CTM; CIT = citocinas, controle do experimento, células cultivadas apenas
com citocinas, na ausência das CTM. ____ mediana.
O ensaio clonogênico foi realizado com o objetivo de quantificar as BFU-E e CFU-GM
que se encontravam viáveis ao término do co-cultivo com as CTMs de pacientes e doadores
normais na presença e na ausência de citocinas. Para tal, células CD34+ foram plaqueadas em
meio semi-sólido nos dias zero, 7 e 28 deste ensaio. As colônias CFU-GM e BFU-E foram
contadas após o cultivo por 14 dias e a expansão destas foi calculada como previamente
descrito.
A mediana (amplitude) dos valores encontrados na expansão das células iniciadoras de
colônias após co-cultivo das células CD34+ com as CTMs de doadores normais e de pacientes
por 7 dias foram, respectivamente: a) CFU-GM: 7,25 (3,52 a 10,75) e 6,40 (4,74 a 10,40) na
ausência e 56,36 (41,21 a 271,48) e 258,31 (195,88 a 347,27) na presença de citocinas; b)
BFU-E: 1,19 (0,50 a 3,29) e 1,43 (0,38 a 2,80) na ausência e 31,41 (27,27 a 34,27) e 24,58
(6,81 a 38,64) na presença de citocinas.
O teste de Mann-Whitney não evidenciou diferença de comportamento quanto à
expansão de CFU-GM e das BFU-E após o co-cultivo das células CD34+ com as CTMs, do
Resultados
124
na presença (p = 0,0667 e p = 0,4762) de citocinas, respectivamente. Os valores observados
encontram-se representados na Figura 26 e nas Tabelas A.21 e A.22 (Apêndice Q).
p = 1,000
9
6
3
CTM DN
CTM DP
4
Sem CTM
300
200
100
CTM/CIT DN
B
p = 0,9143
CTM/CIT DP
3
2
1
CIT
p = 0,4762
140
Expansão BFU-E
Expansão BFU-E
400
0
0
A
p = 0,0667
500
Expansão CFU-GM
Expansão CFU-GM
12
120
100
80
60
40
20
0
C
0
CTM DN
CTM DP
Sem CTM
D
CTM/CIT DN
CTM/CIT DP
CIT
Figura 26: Expansão das CFU-GM e BFU-E após 7 dias de co-cultivo. As células CD34+
foram co-cultivadas com CTMs de pacientes (DP) e doadores normais (DN) por 7 dias
na presença e ausência de citocinas. A e B: expansão das CFU-GM na ausência (A) e na
presença (B) de citocinas. C e D: expansão das BFU-E na ausência (C) e na presença
(D) de citocinas. CFU-GM = do inglês, colony forming unit-granulocyte-monocyte;
BFU-E = do inglês, burst forming unit- erythroid; DP = doador paciente; DN = doador
normal; Sem CTM = controle experimento, as células CD34+ forma cultivadas na
ausência das CTM; CIT = citocinas, controle do experimento, células cultivadas apenas
com citocinas, na ausência das CTM. ____ mediana.
A mediana (amplitude) dos valores encontrados na expansão das células iniciadoras de
colônias após co-cultivo das células CD34+ com as CTMs dos doadores normais e dos
pacientes por 28 dias foram, respectivamente: a) CFU-GM 3,91 (0,45 a 8,10) e 0,56 (0,00 a
11,40) na ausência e 799,32 (23,79 a 1039,0) e 49,21 (0,00 a 293,04) na presença de citocinas;
b) BFU-E 0,21 (0,00 a 10,82) e 0,00 (0,00 a 0,00) na ausência e 97,43 (6,29 a 134,45) e 10,38
(0,00 a 40,02) na presença de citocinas.
Resultados
125
Não foi detectada diferença de comportamento, pelo teste de Mann-Whitney, quanto à
expansão das CFU-GM (p = 0,4762) após o co-cultivo sem citocinas, nem para as CFU-GM
(p = 0,1714) e BFU-E (p = 0,1143) após o co-cultivo na presença de citocinas. Os valores
observados encontram-se representados na Figura 27 e nas Tabelas A.23 e A.24 (Apêndice
R).
p = 0,4762
9
6
3
950
700
300
200
100
0
0
CTM DN
A
CTM DP
Sem CTM
CTM/CIT DN
B
11
CTM/CIT DP
10
0.5
0.4
0.3
0.2
CIT
p = 0,1143
150
Expansão BFU-E
Expansão BFU-E
p = 0,1714
1200
Expansão CFU-GM
Expansão CFU - GM
12
100
50
0.1
0.0
C
CTM DN
CTM DP
Sem CTM
0
D
CTM/CIT DN
CTM/CIT DP
CIT
Figura 27: Expansão das CFU GM e BFU-E após 28 dias de co-cultivo. As células CD34+
foram co-cultivadas com CTMs de pacientes (DP) e doadores normais (DN) por 28 dias
na presença e ausência de citocinas. A e B: expansão das CFU-GM na ausência (A) e na
presença (B) de citocinas. C e D: expansão das BFU-E na ausência (C) e na presença
(D) de citocinas. CFU-GM = do inglês, colony forming unit-granulocyte-monocyte;
BFU-E = do inglês, burst forming unit- erythroid; DP = doador paciente; DN = doador
normal; Sem CTM = controle experimento, as células CD34+ forma cultivadas na
ausência das CTM; CIT = citocinas, controle do experimento, células cultivadas apenas
com citocinas, na ausência das CTM. ____ mediana.
6 DI SCUSSÃO
Discussão
127
Neste estudo foram avaliadas amostras de CTMs de MO de 6 doadores normais e 12
pacientes, portadores de linfoma de Hodgkin ou não-Hodgkin, submetidos ao transplante
autólogo de CTHs no HC-FMRP-USP. Os critérios de inclusão foram: a) ausência, em
qualquer momento, de infiltração da MO pela doença; b) idade entre 18 e 65 anos; c)
protocolo BEAM como regime de condicionamento para o auto-TMO. Os resultados
obtidos foram utilizados para comparações entre os grupos de doadores normais e
pacientes e a seguir, entre os doadores normais e os subgrupos classificados de acordo
com a idade (anos), a doença de base (LNH e DH) e o tempo (dias), após o transplante.
O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa do HC-FMRP-USP e a
privacidade dos envolvidos foi preservada em todas as fases da pesquisa.
6.1 São as mesenquimais células-tronco?
Apesar do crescente interesse clínico e experimental, ainda muito pouco se sabe
sobre a biologia destas células. As características das CTMs diferem entre os laboratórios
e ainda não há um marcador específico ou uma combinação destes que identifiquem esta
célula in vivo ou ex vivo. Assim, as CTM atualmente são definidas por uma combinação
de critérios físicos, morfológicos, fenotípicos e propriedades funcionais (JAVAZON;
BEGGS; FLAKE, 2004).
Embora esta terminologia seja freqüentemente utilizada, a legitimidade de se considerar
as células mesenquimais como “tronco” não está provada. Isto ocorre porque até o momento,
não foi rigorosamente demonstrado in vivo, ao nível de uma única célula, que a CTM é capaz
de regenerar ou manter um compartimento celular, já que ainda não foram transplantadas,
isoladas e novamente implantadas em gerações consecutivas de receptores (JAVAZON;
BEGGS; FLAKE, 2004; FEHRER; LEPPERDINGER, 2005). Estes experimentos são difíceis
Discussão
128
de ser realizados devido à sua vasta distribuição no organismo e à ausência de marcadores
específicos para esta célula (FEHRER; LEPPERDINGER, 2005).
Se este “atributo” for avaliado no contexto de uma definição menos restrita, como a
capacidade de auto-renovação e a habilidade de originar um ou mais tipos de progenitores,
com base em experimentos ex vivo, a célula mesenquimal pode ser qualificada como uma
célula-tronco. Contudo, esta designação é baseada apenas em estudos in vitro, posto que,
até o presente momento, as CTMs de um determinado tecido, ainda não foram isoladas,
caracterizadas e as suas propriedades biológicas avaliadas sem manipulação prévia. Sendo
assim, mais dados in vivo, demonstrando seu potencial terapêutico e suas características
biológicas, são necessários antes destas serem aclamadas como células-tronco verdadeiras
(JAVAZON; BEGGS; FLAKE, 2004; LE BLANC; RINGDÉN 2005).
Como ainda não existem dados convincentes para sustentar a idéia de que, esta
população heterogênea de células, apesar da sua multipotencialidade e da sua capacidade de
regenerar tecidos ex vivo, seja de células-tronco legítimas, ISCT propôs que a nomenclatura
células mesenquimais estromais multipotentes seja utilizada (HORWITZ et al., 2005).
Mais recentemente, com o objetivo de uniformizar a caracterização e facilitar o entendimento
entre os diversos pesquisadores, esta mesma sociedade definiu os critérios mínimos para uma
célula ser considerada mesenquimal estromal multipotente. São eles: a) capacidade de
aderência ao plástico nas condições usuais de cultivo; b) expressão antigênica, aferida por
citometria de fluxo, ≥ 95% para os antígenos CD105, CD73 e CD90 e ≤ 2% (ausência de
expressão) para os antígenos CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-Dr; c)
diferenciação in vitro em osteoblastos, adipócitos e condrócitos, demonstrado por colorações
específicas (DOMINICI et al., 2006).
No presente trabalho, o termo células-tronco mesenquimais ou CTMs, por convenção, e,
por ser o termo empregado nos diversos trabalhos aqui citados, foi utilizado para denominar
Discussão
129
as células mesenquimais estromais multipotentes, isoladas da medula óssea dos pacientes e
doadores normais.
6.2 Por que estudar as células-tronco somáticas?
Classicamente,
as
células-tronco
somáticas
são
consideradas
como
células
indiferenciadas, presentes em vários, se não em todos os tecidos, mas com capacidade de
auto-renovação e de diferenciação limitada aos tipos celulares da organização tecidual da qual
se originam. São reservatórios de células reparativas, prontas para serem mobilizadas e se
diferenciar em resposta a vários estímulos ou doenças. Estas células são raras e não se
replicam indefinidamente em cultura, mas, in vivo, permanecem por toda a vida (BARRY;
MURPHY, 2004).
Atualmente
já
foram
descritas
células-tronco
somáticas
com
características
pluripotenciais, possíveis de serem isoladas e expandidas ex vivo. São elas a MPC (REYES et
al., 2001), a MAPC (JIANG et al., 2002), a MIAMI (D’IPPOLITO et al., 2004), a USSC
(KOGLER et al., 2004), dentre outras. Isto demonstra que, mesmo no indivíduo adulto, apesar
de raras, existem células com ampla capacidade de auto-renovação e expansão, sem perda da
sua capacidade de diferenciação pluripotencial.
As células embrionárias, apesar de poderem originar todos os órgãos e tecidos e de se
propagarem indefinidamente, também originaram espontaneamente, em muitos experimentos,
teratomas e teratocarcinomas. Além disso, as CEs sempre serão alogênicas e por isso, os
riscos residuais de transmissão de doenças infecciosas, genéticas, metabólicas e de reações
imunológicas como a DECH devem ser considerados (DALEY; GOODELL; SNYDER,
2003; ZIPORI, 2004). Sendo assim, tanto pelos aspectos práticos envolvidos, como também
por razões ético-religiosas, muitos pesquisadores preferem estudar as CT somáticas às
embrionárias (LE BLANC; PITTENGER, 2005).
Discussão
130
As CTMs não são tão poderosas ou diversas quanto as CEs podem um dia se tornar.
Contudo, são mais freqüentes e de mais fácil isolamento e cultivo ex vivo do que das célulastronco somáticas pluripotentes e, oferecem muitas vantagens na atualidade para o
desenvolvimento da terapia celular, como a multipotencialidade, o amplo potencial de
expansão, o fenótipo estável por várias passagens, a habilidade de migrar para o sítio de
injúria, a possibilidade de infusão local ou sistêmica, do uso autólogo ou alogênico, sem
muitas restrições relacionadas às interações com o sistema imunológico, podendo ter,
inclusive, um papel imunomodulador. Representam assim, uma alternativa à terapia celular,
sendo ainda, considerada por alguns, como as maiores candidatas para curar lesões nos mais
diversos tecidos (LE BLANC; PITTENGER, 2005).
6.3 Características dos pacientes e das amostras estudadas:
Apesar de serem portadores de doenças com evoluções e tratamento distintos, os
pacientes avaliados compõem um grupo relativamente homogêneo, visto que, em nenhum
momento da doença apresentaram infiltração medular, apenas um foi irradiado na região
pélvica e todos receberam o protocolo BEAM como regime de condicionamento para o autoTMO. Além disso, o esquema DHAP foi empregado como terapia de salvamento em 9 dos 12
pacientes estudados.
Ao serem avaliados quanto à idade, foi detectada diferença de comportamento
apenas entre os subgrupos separados por idade e os doadores normais (p = 0,0059).
Contudo, apesar de estatisticamente os subgrupos classificados pela idade serem passíveis
de comparação, os pacientes estudados são relativamente jovens (idade mínima de 22 e
máxima de 49 anos) o que pode justificar a ausência de diferença entre estes subgrupos,
nos vários testes realizados. Estes dados vão de acordo com o descrito por DiGirolamo et
al. (1999) que, ao estudarem CTMs isoladas de indivíduos normais com idade entre 19 e
Discussão
131
49 anos, encontraram diferenças relacionadas à amostra e não à idade. Já Stenderup et al.
(2003) encontraram diferença de comportamento (p < 0,05) quanto à capacidade de
duplicação celular entre as CTMs isoladas de indivíduos com idade inferior a 30 anos com
as CTMs de indivíduos com idade superior a 65 anos, ou seja, indivíduos com idade bem
superior à dos aqui estudados.
A provável influência da doença de base sobre as CTMs foi avaliada por comparações
dos subgrupos classificados pela doença em questão com o grupo de doadores normais.
Foram selecionados pacientes portadores de linfoma, sem infiltração medular prévia, como
forma de excluir um possível efeito da doença de base sobre as CTMs, o que não seria
possível nos pacientes portadores de outras doenças hematológicas, como o mieloma múltiplo
e as leucemias.
E, finalmente, para avaliar a possibilidade de lesão provocada pela quimioterapia, aguda
ou crônica, os pacientes foram classificados em subgrupos com até 180 dias (6 meses) ou
mais que 1280 dias (3,5 anos) após o transplante, respectivamente. Para esta avaliação, foram
excluídos os dados obtidos de dois pacientes, submetidos ao transplante 662 e 770 dias antes
da coleta da amostra de MO.
Para minimizar a variabilidade secundária à coleta da amostra como, por exemplo, a
diluição, o volume médio/mediano aspirado foi de 4,5 mL e o local escolhido para a punção
foi a CIP. Contudo, o número de CMN obtidos variou em 10x entre a amostra com menor e a
com maior número de células isoladas.
A relação leucoeritrocitária foi normal para a idade em todas as amostras, exceto em
uma única amostra, que não apresentou fragmento ósseo adequado, o que prejudica a
avaliação da celularidade. Não foram observadas alterações displásicas significativas. Apenas
3 pacientes, pertencentes ao subgrupo que havia recebido a quimioterapia a menos de 180
dias, apresentaram níveis de hemoglobina menores que os normais para o sexo e idade, apesar
Discussão
132
da diseritopoese leve estar presente em 10 das 12 amostras avaliadas. Estes dados em
conjunto, sugerem uma recuperação parcial, contudo significativa, da hematopoese nos
pacientes estudados.
6.4 Isolamento, cultivo e expansão das CTMs:
6.4.1 Isolamento e cultivo:
As CTMs foram isoladas por uma metodologia similar à originalmente descrita por
Friedenstein et al. (1976) e popularizada por Caplan (1991), a qual utiliza a propriedade física
de aderência ao plástico.
Para diminuir a contaminação das preparações precoces de CTMs de MO por
macrófagos, células endoteliais, linfócitos e células de músculo liso, que também podem
aderir ao plástico, as CTMs foram expandidas e cultivadas em meio destituído de nutrientes e
fatores de crescimento, exceto pelo SBF (JAVAZON; BEGGS; FLAKE, 2004) e utilizadas
nos experimentos previstos, em geral, após a 3ª passagem, como sugerido por Colter et al.
(2000).
As CTMs foram isoladas com sucesso, em todas as amostras de MO, tanto dos
pacientes, quanto dos doadores normais. As culturas resultantes se apresentaram em grupos
morfologicamente heterogêneos, contendo células que variaram desde células fibroblastóides
afiladas e pontiagudas, a células largas e poligonais como descrito por Javazon, Beggs e Flake
(2004). Em algumas culturas, já confluentes, também foram observadas células firmemente
compactadas, levemente cuboidais.
É interessante ressaltar que, nas culturas cujo número de células fibroblastóides e
pontiagudas predominou sobre o de largas e poligonais e assim permaneceu por várias
passagens, a capacidade de expansão e a velocidade de proliferação foram maiores do que nas
culturas em que células senescentes predominaram. Os tipos celulares acima citados, assim
Discussão
133
como as suas formas intermediárias, foram encontrados nas amostras isoladas dos dois
grupos, contudo, subjetivamente, as células jovens foram mais freqüentes nos grupos de
doadores normais.
6.4.2 Cinética da expansão celular:
As três fases da cinética de expansão celular foram claramente percebidas durante o
cultivo. Durante a fase inicial, que ocorre logo após o plaqueamento das CMN, o
crescimento celular foi muito lento e, à microscopia de luz, foram visualizadas poucas
células aderidas. Por este motivo, as células não-aderentes foram removidas após 3 a 7
dias de cultivo e não em 24 a 72 horas como descrito na literatura (DIGIROLAMO et al.,
1999; PITTENGER et al., 1999; DEANS; MOSELEY, 2000; TONDREAU et al., 2004).
Não
houve
contaminação
das
culturas
por
CTHs,
como
demonstrado
pela
imunofenotipagem.
A fase seguinte, de crescimento logarítmico, esteve presente tanto nos grupos quanto
nos subgrupos avaliados, contudo com algumas diferenças quanto à velocidade de
crescimento e a capacidade de expansão em cultura que, devido à sua grande importância,
serão descritas em itens específicos.
A terceira fase, de senescência ou plateau, durante a qual a célula perde a capacidade de
expansão celular, iniciou em um paciente na segunda passagem, em três, na terceira, em
outros três na quarta, ou seja, iniciou em 58,34% dos pacientes até a quarta passagem,
enquanto que nos doadores normais, começou após a sexta passagem em todos os casos
(dados não mostrados).
Discussão
134
6.4.3 Tempo necessário à duplicação celular:
As medianas de tempo, em horas necessárias à duplicação celular entre a 1ª e a 2ª
passagem foram de 46,30 horas para os doadores normais e de 80,66 horas para os pacientes.
Estes valores sugerem uma possível diferença entre os grupos, principalmente quando são
considerados os descritos na literatura de 24 e 33 horas (STUTE et al.; 2004; CONGET;
MINGUELL, 1999).
Os resultados encontrados para o grupo de doadores normais foram bem
homogêneos, exceto por uma amostra, a do DN12 cujo tempo de duplicação celular foi de
270,59 horas. Este dado deve ser avaliado com ressalvas, pois acreditamos que este tempo
tão longo foi secundário a dois vieses, sendo um relacionado com a amostra e outro com o
cultivo.
Em primeiro lugar, este doador é portador de HbAS e foi incluído no estudo devido
ao pequeno número de amostras de doadores normais disponíveis, considerando que esta
alteração é uma mutação específica da Hb. Além disso, acreditamos que este tempo tão
longo para duplicação celular foi secundário ao outro viés, mais significativo do que esta
mutação pontual. Em geral, a 2ª passagem foi realizada por volta do 7º dia de cultivo após
a 1º passagem, mas nesta amostra foi realizada apenas no 23º dia. Isto ocorreu porque
durante este período, estas células cresceram preferencialmente em algumas regiões do
frasco de cultivo, a invés de crescerem de maneira uniforme em todo o frasco. Sendo
assim, no momento da tripsinização, havia algumas regiões com células muito
confluentes, que se soltaram em grumos e outras regiões mais vazias. É também
importante considerar que a velocidade de crescimento diminui com o aumento da
confluência (STUTE et al., 2004), portanto, as células que estavam nestas regiões mais
confluentes, provavelmente estavam se duplicando em uma velocidade menor. Deste
modo, e considerando que as CTMs isoladas deste doador se comportaram de maneira
Discussão
135
similar às CTMs dos outros DN nos outros experimentos, a confluência e a presença de
grumos à tripsinização provavelmente contribuíram de forma mais significativa para este
tempo de duplicação tão longo do que o fato do doador ser portador do traço falciforme.
Já o comportamento das CTMs isoladas dos pacientes foi muito heterogêneo, sendo
que, apenas 2 (16,6%) dos 12 pacientes (DP3 – 22anos, masculino, LGCBM, 28 dias após
o TMO e o DP6 – 34 anos, feminino, DHEN, 1836 dias após o TMO) apresentaram um
valor de tempo (horas) necessário à duplicação celular inferior àquele correspondente ao
P75 dos doadores normais, de 54,22 horas. Este dado indica uma diferença de
comportamento entre os grupos, assim como a idade parece ter influência sobre o
comportamento das amostras, já que os dois pacientes cujas células se duplicaram de
maneira similar às dos doadores normais tinham idade < 40 anos. Contudo, estas
diferenças não foram identificadas pelos testes estatísticos utilizados, o que pode ser
explicado pelo pequeno número de amostras estudadas.
6.4.4 Duração do cultivo e capacidade de expansão ex vivo das CTMs:
A mediana dos dias em que as CTMs dos doadores normais permaneceram em cultivo
foi 10 dias maior do que a dos pacientes. De fato, 7/12 (58,3%) pacientes apresentaram
valores inferiores àquele correspondente ao P25 dos doadores normais de 73,25 dias.
O comportamento dos grupos classificados por idade foi similar, sendo que, 3/6
(50%) das CTMs isoladas dos pacientes com idade ≥ 40 anos e 4/6 (66,6%) dos com idade
< 40 anos permaneceram em cultivo por um número de dias inferior ao P25 dos DN,
contudo, uma das amostras, a de um paciente com < 40 anos, foi cultivada por 73 dias,
valor muito próximo ao valor considerado como referência. Quanto à doença de base, o
comportamento das células do subgrupo de portadores de LNH foi mais parecido com o
das células dos doadores normais do que as isoladas dos portadores de DH. Este dado fica
Discussão
136
mais evidente ao compararmos números absolutos, pois assim, o valor de referência (P25
dos DN) passa a ser de 73 dias e nesta situação, apenas 2/6 (33,3%) das amostras do
subgrupo LNH permaneceram em cultivo por um período inferior aos 73 dias,
contrastando com 4/6 (66,6%) dos portadores de DH. Este dado poderia indicar uma
melhor evolução das células isoladas dos portadores de LNH, todavia, este achado não foi
confirmado nos outros experimentos. O comportamento das amostras dos pacientes que
realizaram o transplante há < 180 dias foi melhor (4/5 ou 80%) e mais similar ao das
amostras dos doadores normais do que as amostras dos pacientes submetidos ao
transplante há > 1280 dias (2/5 ou 40%) seguindo o valor de referência de 73 dias.
As medianas de expansão final das CTMs foram de 18,11 e 8,17 para os grupos de
doadores normais e de pacientes, respectivamente. O comportamento das amostras isoladas
dos doadores normais foi similar e superior a 10 vezes em todas as amostras avaliadas,
enquanto que o comportamento das amostras dos pacientes foi muito heterogêneo. Destes
últimos, 8/12 (66,6%) apresentaram valores inferiores àquele correspondente ao P25 dos
doadores normais de 14,21 vezes. Sendo que, 5/6 (83,3%) tinham idade superior a 40 anos,
enquanto que, apenas 3/6 (50%) tinham menos de 40 anos, reforçando a provável influência
da idade sobre as CTMs, não percebida no ensaio que avaliou a sobrevida das células em
cultivo. O comportamento das amostras classificadas pela doença de base foi parecido.
Quanto ao tempo após o transplante, das 4 amostras que se comportaram de maneira similar
aos doadores normais, 3 (75%) eram de pacientes submetidos ao transplante a menos de 180
dias.
Estes achados vão de acordo com os nossos dados referentes aos dias de sobrevida em
cultura e, em conjunto, indicam que há uma lesão qualitativa nas CTMs provocada pela
quimioterapia, demonstrada pela diminuição da capacidade de proliferação e estão de acordo
com o que foi previamente descrito, só que em relação aos progenitores estromais da MO, por
Discussão
137
Carlo-Stella et al. (1997). Indicam também que, uma vez que a célula é lesada pela
quimioterapia, este dano pode ser irreversível, isto é, não recuperável com o tempo, o que
corrobora com o sugerido por Galotto et al. (1999).
Apesar destas diferenças, os testes estatísticos utilizados não rejeitaram a
equivalência de comportamentos entre os doadores normais, pacientes e os seus
subgrupos. Isto reforça a importância de se considerar o tamanho da amostra durante a
análise das informações fornecidas por estes testes, assim como a distribuição das
amostras, já que dados muito heterogêneos em amostras muito pequenas podem induzir os
testes a erros.
Vale a pena relembrar que os dados da literatura, para a capacidade de expansão em
cultura das CTMs isoladas de doadores normais, são extremamente variáveis (4 a 56
vezes). Esta variabilidade pode em parte ser explicada pelas diferentes condições de
cultivo (lote e concentração do SBF, meio de cultivo, dentre outros) dos diversos
laboratórios e o momento da tripsinização, que, como já mencionado, está diretamente
relacionado ao cálculo da capacidade de expansão já que a velocidade de crescimento
celular é inibida pelo contato célula-célula. Seguindo estes valores como referência,
apenas 2/12 (16,6%) amostras apresentaram expansão inferior a 4 vezes e portanto, os
valores encontrados para os pacientes poderiam ser considerados normais se comparados
com a literatura. Todavia, acreditamos que o estudo comparativo com as amostras dos
doadores normais, realizadas sob as mesmas condições de cultivo, e que indica uma lesão
qualitativa, é mais fidedigna com a realidade.
Discussão
138
6.5 Quantificação das CFU-F:
No presente estudo, as colônias de células fibroblastóides com mais de 50 células,
quantificadas entre o 12º e o 14º dia de cultivo das CMN, foram denominadas CFU-F
(TONDREAU et al., 2004).
Javazon, Beggs e Flake (2004), descreveram que as colônias derivadas de ensaios de
CFU-F são muito heterogêneas na aparência e na capacidade de diferenciação, que existem
poucas CTMs com capacidade de diferenciação tripotencial, sendo a maioria bi- ou
unipotente, assim como existem poucos clones com grande capacidade de expansão. De fato,
foram observadas colônias de células fibroblastóides, pontiagudas e com rápido crescimento;
outras, de células achatadas, largas, poligonais de crescimento lento, além daquelas com
características intermediárias. Além disso, algumas colônias derivadas de CFU-F das
amostras envolvidas neste trabalho foram isoladas, expandidas e induzidas à diferenciação
(dados não mostrados) e, como anteriormente citado, se diferenciaram preferencialmente em
alguma via, como por exemplo, a adipogênica ou a osteogênica. Estes achados sugerem que
as CFU-F, são clones celulares derivados de uma única célula e que muitas vezes, já se
encontram comprometidos com determinada via de diferenciação celular.
Neste trabalho, a mediana (amplitude) das CFU-F isoladas das amostras dos doadores
normais e dos pacientes foram, respectivamente, 1,25 (0,13-9,25) e 0,94 (0,00-3,75) x10-5
CMN plaqueadas. Os valores obtidos para os doadores normais se encontram de acordo com
os descritos na literatura (3,4 x10-3 a 10-6 CMN da MO plaqueadas). Neste grupo, das 5
amostras avaliadas, 4 (80%) apresentaram valores de CFU-F maiores que 10-5, sendo que o
valor correspondente ao P25 foi 1,16 x10-5 CMN plaqueadas. Quanto aos pacientes, apenas
6/12 (50%) apresentaram valores de CFU-F similares a estes, incluindo nesta análise, o DP3
que apresentou contagem de CFU-F de 1,14 x10-5 CMN plaqueadas, por se tratar de um valor
muito próximo ao valor de referência. Estes dados indicam assim, uma lesão quantitativa nas
Discussão
139
CTMs pela quimioterapia em altas doses, não identificada estatisticamente (p = 0,4421),
provavelmente devido a heterogeneidade e ao pequeno número de amostras estudadas, como
anteriormente comentado.
Seguindo este mesmo raciocínio, não houve diferença de comportamento quanto à
freqüência das CFU-F entre os DN e os subgrupos classificados por idade. Entretanto, dos 6
pacientes que apresentaram contagens similares às dos DN, 4 (66,6%) são portadores de DH,
enquanto que, não foram visualizadas CFU-F em 3/6 (50%) das amostras dos portadores de
LNH. Tal contagem pode ser secundária à ausência de aderência das CFU-F às placas
quadriculadas ou à existência células em uma freqüência inferior às 40 x105 CMN plaqueadas
para estes pacientes. Em conjunto, estes dados sugerem uma possível correlação entre a
doença de base, os esquemas de quimioterapia utilizados e a recuperação quantitativa das
células mesenquimais, após o tratamento quimioterápico, não identificada pelo teste
estatístico utilizado (p = 0,0506). Todavia, neste mesmo subgrupo de portadores de DH, dos 6
pacientes avaliados, apenas um foi submetido ao TMO a menos de 180 dias, dois há 662 e
770 dias e os outros três, há mais de 1280 dias. Portanto, a possibilidade de uma lesão
quantitativa aguda, com recuperação mesmo que parcial ao longo do tempo, apesar de não ter
sido estatisticamente evidenciada (p = 0,2252), não deve ser descartada.
A ausência de correlação entre a lesão qualitativa e a quantitativa, aqui encontrada nos
pacientes portadores de DH e LNH, foi relatada por Carlo-Stella et al. (1997) em amostras de
pacientes com LMA.
A lesão quantitativa secundária à quimioterapia encontrada neste trabalho e demonstrada
pela redução na freqüência da CFU-F em 50% dos pacientes, vai de acordo com o descrito por
Galotto et al. (1999), Banfi et al. (2001), Ben-Ishay e Barak (2001) e Novitzky, Makgoka e
Mohamed (2001). Contudo, a influência de outros fatores como as variações relacionadas às
amostras (DIGIROLAMO et al., 1999), a idade dos doadores avaliados (FEHRER;
Discussão
140
LEPPERDINGER, 2005) e o lote de soro bovino fetal utilizado (STUTE et al., 2004) também
devem ser considerados.
6.6 Características das CTMs avaliadas por citometria de fluxo:
As CTMs foram subclassificadas em pequenas, médias e grandes, conforme
previamente descrito, após avaliação do tamanho e complexidade interna por citometria de
fluxo. A porcentagem média/mediana das células, em cada uma destas subpopulações, foi
comparada duas a duas e não foi detectada diferença estatisticamente significante, o que
sugere igualdade de comportamento entre os grupos. Entretanto, a distribuição dos valores
encontrados para os pacientes foi mais heterogênea que no grupo de doadores normais, sendo
que o valor correspondente ao P25 dos doadores normais foi ultrapassado, no caso das células
pequenas, por 9/12 (75%) dos pacientes (P25 - 11,57%), indicando a existência de uma maior
quantidade de restos celulares no grupo de pacientes, fato este reforçado pela menor
viabilidade geral, em relação ao P25 dos doadores normais de 86,95%, em 6 (66,6%) destas 9
amostras.
Entretanto, este subgrupo, além dos fragmentos e restos celulares, também contém
CTMs verdadeiras, fato evidenciado pela viabilidade celular acima de 50% em todas as
amostras testadas.
Atualmente, muito pouco se sabe sobre as características imunofenotípicas precisas
das CTMs primárias da MO, in vivo, já que é conhecido apenas o perfil de expressão das
proteínas de superfície das CTMs expandidas em cultura. A baixa freqüência destas
células e a ausência de marcadores específicos são as maiores barreiras para este estudo.
Assim, a diversidade na intensidade de expressão dos marcadores, referida por alguns
autores, pode ser explicada pelas diferenças nas condições de isolamento e cultivo
utilizadas.
Discussão
141
Caracteristicamente, as CTMs possuem expressão baixa ou ausente dos marcadores de
células hematopoéticas (CD34, CD14, CD45), endoteliais (CD51/61, KDR) e do HLA-Dr.
Expressam em altos níveis o HLA-ABC, CD90, CD166, CD105, CD73, e CD29 e em
proporções variáveis o Stro-1 e diversas moléculas de adesão como o CD44 e o CD49e
(JAVAZON; BEGGS; FLAKE, 2004; LE BLANC; RINGDÉN, 2005). Estes antígenos,
conforme demonstrado no Apêndice C, também são expressos em outros tipos celulares
do organismo, o que dificulta a identificação precisa das CTMs in vivo.
Como demonstrado nas Figuras 12 e 13 dos resultados e nos Apêndices L e M, tanto as
CTMs isoladas dos pacientes quanto as células dos doadores normais exibem as
características imunofenotípicas esperadas, apesar de não apresentarem expressão antigênica
superior a 95% para os antígenos CD105, CD73 e CD90 em todas as amostras avaliadas,
conforme proposto pela ISCT (DOMINICI et al., 2006). Os dados foram avaliados e não
houve diferença estatisticamente significante entre os grupos de pacientes e doadores normais,
nem dos subgrupos, classificados com base no tamanho e complexidade interna das células,
quando comparados dois a dois.
Contudo, é interessante ressaltar que as células com FSC e SSC entre 0 e 250, aqui
denominadas de células pequenas, apresentaram os menores valores quanto à expressão dos
antígenos CD90, CD13, CD29, CD49e, CD44 e CD54 (p < 0,05). Tal diferença também foi
evidenciada para os marcadores CD73 e HLA-ABC, mas apenas no grupo de pacientes. As
prováveis explicações para este fato são: a) menor superfície celular, conseqüentemente, um
menor número de antígenos estarão expressos na superfície celular; b) presença de restos
celulares.
Um outro grupo de células também apresentou menor expressão dos antígenos acima
citados, o das células com características morfológicas de células senescentes por ocasião
da tripsinização e análise por imunofenotipagem. Este fato foi mais significante nas
Discussão
142
células do DP11 e DP14. Entretanto, as células dos DP4 e DP5 foram propositalmente
analisadas na 2ª e não na 3ª passagem, pois subjetivamente, apresentavam menor potencial
de expansão, fato posteriormente demonstrado pela análise da expansão final destas
células.
As diferentes fases do ciclo celular foram avaliadas, por citometria de fluxo, durante a
fase de crescimento logarítmico das células, na 4ª ou 5ª passagem. Este estudo foi limitado a 8
pacientes, devido a dificuldades na expansão e conseqüente obtenção de número adequado de
células. No caso dos doadores normais, os resultados obtidos foram uniformes e por isso, este
ensaio foi realizado em 4 das 6 amostras.
Os valores encontrados demonstraram que as células estão, em sua maioria, nas fases
G0-G1 do ciclo celular, entretanto, com números inferiores aos 90% sugeridos pela literatura
(CONGET; MINGUELL, 1999). De fato, no grupo de doadores normais, foram encontrados
valores acima de 80% em todas as amostras, enquanto que estes, o foram em apenas 62,5%
dos pacientes. Todavia, esta diferença não foi considerada estatisticamente significante pelo
teste de Manny-Whitney, ao comparar a porcentagem de células dos grupos, nas fases G0-G1 e
fase S, do ciclo celular.
6.7 Potencial de diferenciação:
As CTMs já foram induzidas à diferenciação ex vivo, em adipócitos, osteócitos,
condrócitos e miócitos, dentre outros. Esta diferenciação decorre do cultivo das CTMs
indiferenciadas em meio de cultura específico, enriquecido com agentes indutores por um
determinado período de tempo, em geral, por volta de 7 a 21 dias (PITTENGER et al., 1999).
Vários estudos têm comprovado que esta diferenciação também pode ocorrer in vivo, como,
por exemplo, o que demonstrou que a CTM, quando transplantada intra-útero, pode contribuir
para formação do tecido cartilaginoso, ósseo e muscular (MACKENZIE; FLAKE, 2001) e um
Discussão
143
outro, que evidenciou a participação na reconstituição de fraturas e defeitos articulares na vida
pós-natal (LAKSHMIPATHY; VERFAILLIE, 2005).
A heterogeneidade das CTMs, demonstrada por estudos in e ex vivo, relacionada à
sua capacidade de auto-renovacão e potencial de diferenciação, pode ser explicada pela
noção de que na MO, o conjunto de células mesenquimais engloba não só as célulastronco, mas também as suas subpopulações comprometidas com as diferentes fases da
diferenciação celular. Neste modelo, as CTMs da MO constituem uma população de CT
primitivas (multipotentes) e de progenitores capazes de auto-renovação extensiva, mas
que vão perdendo a capacidade multipotencial durante o cultivo, durante o qual se
comprometem com uma linhagem específica (BAKSH; SONG; TUAN, 2004; JAVAZON;
BEGGS; FLAKE, 2004).
No presente estudo, a habilidade das CTMs em diferenciar-se em adipócitos e
osteócitos foi avaliada em amostras de 8 dos 12 pacientes (4 evoluíram para senescência
precoce e portanto não foram avaliadas), e nos 6 doadores normais. Todas foram avaliadas
morfologicamente e além disso, 5 do primeiro e 4 do último grupo, também foram
analisadas quanto à expressão dos genes PPARγ e osteopontina, pela reação de RT-PCR.
Em todas as amostras avaliadas, houve mudança gradativa e constante, na morfologia das
células.
Nas amostras induzidas à diferenciação em adipócitos, os vacúolos lipídicos começaram
a aparecer por volta do 10º dia de cultivo em meio indutor, inicialmente em pequeno número,
que foi progressivamente maior até ocupar totalmente o citoplasma, chegando, em alguns
casos a sobrepor o núcleo (Figura 19 C). Gotículas de gordura se soltaram em permaneceram
sobre as outras células indiferenciadas (Figuras 19 B e C) em muitas amostras. Em todas,
após o 15º dia de cultivo, foram observadas células morfologicamente diferenciadas em
adipócitos intercaladas por células indiferenciadas. A intensidade da diferenciação, assim
Discussão
144
como o dia escolhido para a coloração, variou nas diferentes amostras. Subjetivamente, o
número de células diferenciadas foi menor e o tempo necessário à diferenciação maior, no
grupo de pacientes comparados com o grupo de doadores normais. Tanto as células induzidas
à diferenciação quanto as utilizadas como controle, cultivadas apenas em α-MEM com SBF a
7,5%, foram coradas com sudan II – escarlate, que cora as gotículas de gordura em alaranjado
escuro, e contra-coradas com hematoxilina de Harris, que colore o núcleo de roxo. Mesmo nas
amostras que permaneceram por quase 30 dias em cultivo, não houve diferenciação
espontânea em adipócitos.
A diferenciação em osteócitos foi inicialmente percebida na periferia das lamínulas, por
volta de 21 dias de cultivo. Foi notado em diversas amostras, que as células vão mudando
gradativamente a morfologia de fibroblastóide para arredondada e, a seguir, para uma célula
com limites irregulares e prolongamentos finos, sempre formando camadas. Com a
estimulação repetida e cultivo por um maior período de tempo, o número de células que vão
se comprometendo com a diferenciação vai progressivamente aumentando, mas sempre da
periferia (células mais diferenciadas) para o centro (células mais jovens ou ainda
indiferenciadas), sendo quase impossível delimitar uma célula isolada nas bordas, pois estas
células se encontram recobertas por uma matriz extracelular, que se cora fortemente pelo
nitrato de prata (coloração Von Kossa), indicando que o cálcio é um de seus principais
constituintes.
Estas etapas foram nitidamente percebidas nas células cultivadas por longo período. Por
este motivo, o tempo médio aproximado de cultivo, em meio indutor de osteócitos, foi de 40
dias, mas chegou a ser tão longo quanto 69 dias. Não houve diferença na intensidade de
diferenciação das amostras de pacientes e doadores normais, sendo que em geral, as que
permaneceram em cultivo por mais tempo, também foram as que mais se diferenciaram, e que
se apresentaram morfologicamente mais características.
Discussão
145
Contudo, ao serem coradas após tanto tempo em cultivo, as amostras controles dos
pacientes, também evidenciaram células com características morfológicas de osteócitos e
matriz extracelular rica em cálcio (Figura 20 D). É interessante ressaltar que, apesar de terem
sido cultivadas em lamínulas distribuídas em poços de uma mesma placa de 24 poços, foi
tomado um grande cuidado na distribuição destas, de forma que não houve contaminação das
amostras controle pelo meio indutor.
Alguns autores relatam que a via padrão de diferenciação das CTMs isoladas da MO é a
osteogênica, sendo mais fácil as CTMs expandidas produzirem nódulos ósseos ricos em
proteoglicanos do que os vacúolos lipídicos da via adipogênica ou os glicosaminoglicanos da
condrogênica (BANFI et al., 2000, JAVAZON; BEGGS; FLAKE, 2004; DAZZI et al. 2006).
Outros autores, também relataram dados interessantes como: a) baixa expressão de
osteopontina e osteocalcina, mesmo em CTMs indiferenciadas (PITTENGER et al., 1999;
BANFI et al., 2000), com aumento espontâneo e progressivo, em relação ao basal, nas
culturas por longo tempo, mesmo sem estímulo específico (BANFI et al., 2000); b)
manutenção da capacidade de diferenciação em osteócitos, mesmo após extensiva
proliferação em cultura (BRUDER; JAISWAL; HAYNESWORTH, 1997; CONGET;
MINGUELL, 1999); c) potencial de diferenciação espontânea das CTMs em osteócitos
(DIGIROLAMO et al., 1999), enquanto que o potencial de diferenciação em adipócitos vai
diminuindo durante o cultivo celular, podendo estar ausente nas células senescentes (BANFI
et al., 2000; PARK et al., 2005).
Portanto, a diferenciação espontânea em osteócitos nas amostras cultivadas por
longo tempo encontra-se de acordo com o descrito na literatura e reforça a hipótese de que
esta é a via preferencial das CTMs da MO. Isso provavelmente decorre de um
comprometimento intrínseco, evidenciado pela presença de osteocalcina e ostepontina,
ainda que em baixos níveis, mesmo nas células indiferenciadas ou de forma secundária às
Discussão
146
condições de cultivo que representariam um microambiente favorecedor da osteogênese
(BANFI et al., 2000).
Os resultados encontrados nos ensaios com RT-PCR deste trabalho estão de acordo com
esta teoria, já que baixos níveis de osteopontina foram encontrados nas amostras
indiferenciadas, antes mesmo de qualquer estímulo à diferenciação, enquanto que o PPARγ,
iniciou a sua expressão no 7º dia, claramente percebida apenas no 14º dia de cultivo, como
exemplificado na Figura 21.
As amostras induzidas à diferenciação em condrócitos foram incluídas em paraplast
entre os dias 13 e 15 de cultivo em meio indutor, suplementado com TGF-β3. Esta
citocina foi escolhida, por ser mais eficiente na promoção da condrogênese que o TGF-β1
(BARRY; MURPHY, 2004). Em todos os casos, a morfologia das células mudou de
fibroblastóide para arredondada (Figura 22 C e D), assim como foram observadas regiões
semelhantes às lacunas condrocitárias (Figura 22 A). Além disso, a coloração Tricômico
de Masson evidenciou a presença de matriz rica em colágeno, como demonstrado na
Figura 22 D. A confirmação de que as CTMs diferenciaram-se em condrócitos foi
realizada pela imuno-histoquímica, com anticorpo especifico anti-colágeno II. Tal reação
foi positiva em todas as amostras testadas, e encontra-se exemplificada na Figura 22 A.
6.8 Sustentação da hematopoese:
O transplante com células-tronco hematopoéticas é uma modalidade terapêutica que
vem sendo cada vez mais utilizado para o tratamento de diversas doenças, sejam elas
neoplásicas ou não. Porém, o pequeno número de CTHs coletadas do SCUP e dos
pacientes “maus mobilizadores”, tem gerado uma limitação no tratamento de alguns
pacientes.
Discussão
147
Neste sentido, a expansão ex vivo das CTHs surge como uma boa opção. Entretanto,
quando realizada pelo cultivo em meio enriquecido com citocinas, apesar do aumento
substancial na dose de CD34+, não há diminuição significativa no tempo necessário à enxertia
(KADEREIT et al., 2002). Este fato está de acordo com os avanços recentes nos mecanismos
celulares e moleculares responsáveis pela diferenciação das CTHs, indicando que o
microambiente medular é crucial para a manutenção da capacidade de auto-renovação das
CTHs (CARLO-STELLA et al., 1997; CONGET; MINGUELL, 1999; KADEREIT et al.,
2002).
As CTMs humanas além de promoverem um microambiente rico em citocinas, proteínas
da matriz extracelular e moléculas de adesão, produzem e expressam receptores para vários
fatores de crescimento, citocinas e interleucinas o que contribui para a formação e o
funcionamento do microambiente estromal, o qual produz sinais indutores e regulatórios não
só para as CTMs, mas também para o desenvolvimento dos progenitores hematopoéticos e
outras células estromais (DEVINE; HOFFMAN, 2000; MINGUELL; ERICES; CONGET,
2001; DAZZI et al., 2006).
Com o objetivo de mimetizar o microambiente medular necessário ao desenvolvimento
das CTHs, e assim, sustentar a função celular durante a expansão mediada por citocinas in
vitro, as CTMs têm sido utilizadas como feeder layer por diversos grupos (KADEREIT et al.,
2002; BACIGALUPO, 2004; ZHANG et al., 2004; JANG et al., 2006). Em todos os ensaios,
as CTMs são capazes de manter viáveis as células CD34+ e de expandi-las mesmo na ausência
de citocinas. Em dois destes, as proporções de progenitores CD34+ CD38- foi
significantemente maior após a expansão na presença das CTMs e citocinas, quando
comparadas às cultivadas apenas na presença destas últimas, sugerindo um retardo, por ação
das CTMs, na diferenciação das células CD34+ CD38- (KADEREIT et al., 2002;
BACIGALUPO, 2004).
Discussão
148
Para avaliação da capacidade das CTMs dos pacientes e doadores normais em sustentar
a hematopoese, foram realizados, em três ocasiões, ensaios de co-cultivo destas células com
células CD34+ isoladas por seleção positiva de duas amostras de SCUP e criopreservadas até
o momento do uso. Para comparação e cálculo da expansão das células iniciadoras de
colônias, alíquotas das amostras originais de SCUP foram cultivas em meio semi-sólido, sem
co-cultivo prévio com as CTMs.
Em placas de 24 poços foram cultivadas 4 x104 CTMs dos pacientes e doadores
normais, por 24 a 96 horas, quando foram irradiadas (14 Gy,
60Co)
para prevenir o super-
crescimento das CTMs. A seguir, foram adicionadas aos poços destas placas: a) células
CD34+ previamente isoladas e então cultivadas em α-MEM 15% SBF enriquecido com
citocinas (SCF, IL-3, IL-6, Flt-3 lig); b) células CD34+ isoladas e cultivadas nestas mesmas
condições, contudo sobre uma monocamada de CTMs; c) CD34+ cultivadas apenas sobre a
monocamada de CTMs, sem a adição de qualquer citocina. Ao final de 7 e 28 dias, as CTMs e
as células CD34+ foram colhidas por tripsinização para incluir as células iniciadoras de
colônias aderidas às primeiras. Nesta ocasião, as células com características morfológicas de
CD34+ foram contadas, separadas em alíquotas de até 100 µL, e a seguir, cultivadas em
duplicata, em meio semi-sólido previamente enriquecido SCF, IL-3, GM-CSF, G-CSF, e
EPO.
As
células
restantes
foram
analisadas
quanto
à viabilidade celular
por
imunofenotipagem.
Após 7 dias de co-cultivo com CTMs de 6 pacientes e 4 doadores normais, as
medianas de expansão das células CD34+ foram, respectivamente, 3,13 e 3,24 vezes (p =
0,9143) na ausência e 6,33 e 5,22 vezes (p = 0,1714) na presença de citocinas. Padrões de
expansão similar, contudo, mais intensa, foram encontrados após 28 dias de co-cultivo das
células CD34+ com CTMs dos mesmos pacientes e doadores normais, com medianas de
expansão de 4,46 e 4,12 vezes (p = 0,4762) na ausência e 7,21 e 7,49 vezes (p = 0,1667)
Discussão
149
na presença de citocinas. Como controle dos experimentos acima, as células CD34+ foram
cultivadas na ausência e na presença de citocinas, com expansão mediana respectiva de
1,32 e 6,60 vezes, nas duas amostras cultivadas por 7 dias e de 1,95 e 7,93 vezes nas 3
cultivadas por 28 dias. Como demonstrado não houve diferença estatisticamente
significante na expansão das células CD34+ co-cultivadas com CTMs de pacientes e
doadores normais, na ausência ou presença de citocinas, por 7 e 28 dias, indicando
igualdade de comportamento entre os grupos.
A expansão das CTMs cultivadas apenas em α-MEM enriquecido com 15% SBF deve
ser cuidadosamente analisada, já que poucos experimentos foram realizados. Possíveis
explicações para esta expansão seriam a presença de fatores de crescimento intrínsecos nos
meios utilizados no processo de isolamento, congelamento e cultivo ou, no DMSO utilizado
para a criopreservação. Já a possível maior expansão das células CD34+ na presença apenas
das citocinas pode ser explicada pelo efeito inibitório exercido pelas CTMs quando utilizadas
como feeder layer no crescimento das células CD34+ (KADEREIT et al., 2002).
Alíquotas de células CD34+ foram plaqueadas e cultivadas por 14 dias, em meio semisólido, nos dias zero, 7 e 28 do co-cultivo com as CTMs de pacientes e doadores normais, na
presença e na ausência de citocinas, com o objetivo de quantificar as unidades iniciadoras de
colônias eritróides e das unidades iniciadoras de colônias de granulócitos-monócitos que se
encontravam viáveis ao término deste. As colônias CFU-GM e BFU-E foram contadas, e a
expansão destas foi calculada como previamente descrito.
As CTMs dos pacientes, aparentemente, propiciaram uma maior expansão, das CFUGM que as dos DN, durante o cultivo por 7 dias (Figura 26 B) e que o contrário foi
observado após o cultivo por 28 dias (Figura 27 B), ocasião em que também foi observado
uma melhor sustentação e expansão das BFU-E por parte das CTMs dos DN (Figura 27
D). Uma possível explicação seria uma maior reatividade das CTMs dos pacientes,
Discussão
150
previamente expostas à quimioterapia, o que poderia favorecer a expansão de progenitores
hematopoéticos comprometidos com as linhagens celulares e responsáveis pela enxertia
precoce. Neste mesmo raciocínio, as CTMs dos pacientes secretariam mais citocinas nos
primeiros dias do co-cultivo ex vivo, mas também entrariam em exaustão mais precoce,
dificultando a sustentação da hematopoese no co-cultivo por longo período de tempo.
As diferenças encontradas entre os grupos de pacientes e doadores normais após o
co-cultivo por 7 e 28 dias, devem ser cuidadosamente avaliadas, já que foram utilizadas
células CD34+ obtidas de 2 amostras de SCUP, isoladas e criopreservadas em diferentes
ocasiões. Isto ocorreu devido a contaminação por fungos das amostras de CTMs de 2 dos
3 doadores normais que estavam sendo avaliadas em paralelo com as dos pacientes.
Conseqüentemente, foi necessária a realização de um outro ensaio, realizado com CTMs
de 3 doadores normais, em condições de cultivo similares, mas não iguais às dos
pacientes. Assim, em um total de 4 experimentos com doadores normais, apenas um, foi
realizado em paralelo e com células CD34+ do mesmo SCUP utilizado na avaliação dos
pacientes: o doador normal que apresentou os menores valores na expansão das CFU-GM
e BFU-E.
É também importante ressaltar que o número de células CD34+ plaqueadas na
metilcelulose após o co-cultivo por 28 dias variou nos três experimentos, sendo no primeiro
2.000 células/mL, no segundo 4.000 e 8.000 células/mL, para as cultivadas na presença ou
ausência de citocinas, respectivamente e, no terceiro 8.000 células/mL. Isto ocorreu devido à
ausência de BFU-E em 5/5 amostras avaliadas no primeiro e em 3/4 avaliadas no segundo
experimento. Tal atitude foi tomada com base na hipótese de que o baixo número de colônias
obtidas poderia ser secundário à diluição da amostra, e, portanto, que os resultados obtidos
não correspondiam à realidade e com o aumento progressivo do número de células plaqueadas
este viés seria corrigido.
Discussão
151
Os testes estatísticos não encontraram diferença significante de comportamento, quanto
à expansão das CFU-GM e BFU-E, após co-cultivo de células CD34+, por 7 e 28 dias, com
CTMs de doadores normais e de pacientes na ausência e na presença de citocinas. Não foram
realizados testes com o objetivo de comparar a expansão das células CD34+ ou das CFU-GM
e das BFU-E após co-cultivo com as CTMs do mesmo doador, na presença e na ausência de
citocinas, pois as células cultivadas na presença de citocinas expandiram-se indubitavelmente
mais que as cultivadas na ausência destas. Além das diferenças quantitativas,
morfologicamente, as colônias originadas das células CD34+ expandidas na presença de
citocinas eram maiores e mais robustas do que as originadas das células CD34+ expandidas
apenas na presença de CTMs.
Em conjunto, estes dados demonstram que, assim como as CTMs dos doadores normais,
as CTMs dos pacientes também são capazes de promover a expansão das células CD 34+.
Além disso, aparentemente são mais reativas, promovendo uma maior expansão das CFU-GM
no co-cultivo por curto período de tempo, contudo, entram logo em exaustão e, portanto, são
menos eficientes na sustentação hematopoese após o co-cultivo por 28 dias.
6.9 Lesão estromal pós-quimioterapia:
Sabe-se que o microambiente estromal é lesado pela quimioterapia em altas doses e pela
exposição à radiação, contudo, pouco é conhecido sobre a extensão desta e a habilidade de
auto-renovação do estroma, que, por sua vez, se lesado, pode afetar a enxertia e sobrevivência
a longo tempo da CTH além da manutenção da hematopoese.
Vários autores demonstraram que o estroma de sustentação da hematopoese é
qualitativa e/ou quantitativamente lesado pelo tratamento citotóxico por si (CARLOSTELLA et al., 1997; DOMENECH et al., 1998; SCHWARTZ et al., 1998; GALOTTO et
al., 1999; BANFI et al., 2001; NOVITZKY; MAKGOKA; MOHAMED, 2001), já que tal
Discussão
152
dano, não foi relacionado com a DECH ou com a terapia imunossupressora após o
transplante (DOMENECH et al., 1998; GALOTTO et al., 1999). Entretanto, estes
trabalhos acima citados referem-se às células estromais como um todo, e não
especificamente as CTMs.
Assim, no atual trabalho, pela primeira vez, as CTMs de pacientes previamente
submetidos à altas doses de quimioterapia, foram isoladas, caracterizadas sobre os pontos
de vista morfológico, imunofenotípico e funcional, e avaliadas quanto à influência da
idade, da doença de base e dos efeitos da quimioterapia a curto e a longo prazo, sobre as
mesmas.
O estudo comparativo entre as amostras de CTMs isoladas da MO de pacientes
previamente expostos a altas doses de quimioterapia e as amostras isoladas da MO de
doadores normais, quando avaliado com o auxilio da estatística descritiva, sugere
fortemente que as CTMs qualitativa e quantitativamente lesadas pela quimioterapia. A
primeira lesão foi evidenciada pela menor expansão em cultura, duração do cultivo,
velocidade de duplicação celular entre a 1ª e a 2ª passagem e capacidade de sustentação da
hematopoese após co-cultivo por longo período de tempo. A lesão quantitativa foi
evidenciada pela redução na freqüência das CFU-F nas amostras nos pacientes.
Entretanto, quando avaliados com o auxilio dos testes não-paramétricos, os resultados
encontrados não apresentaram poder estatístico para demonstrar diferença entre o grupo
de doadores normais, pacientes e seus subgrupos. Isto pode ser explicado pela grande
heterogeneidade de comportamento das amostras dos pacientes nos diversos experimentos
associado ao pequeno número de pacientes, sendo portanto, necessário a realização de
novos estudos para comprovar a existência desta lesão.
Além disso, o quanto na gradualidade deste processo, esta lesão limitaria a expansão
e, conseqüentemente, o sucesso do uso destas células na terapia, também necessita ser
Discussão
153
melhor definido, já que, em algumas amostras de pacientes, independentemente do tempo
após o transplante, idade e doença de base, as CTMs se comportaram nos mais diversos
ensaios, igualmente ou melhor do que as dos doadores normais, enquanto que outras não o
fizeram.
6.10 Uso terapêutico das CTMs:
A medicina regenerativa desponta como uma ferramenta terapêutica promissora no
tratamento de uma grande variedade de doenças degenerativas e de desordens relacionadas à
idade, para as quais ainda não há, disponível na atualidade, tratamento específico ou efetivo
(KASSEM; KRISTIANSEN; ABDALLAH, 2004).
As CTMs representam um grupo de células muito atrativo para a terapia celular, pois
podem se diferenciar em múltiplas linhagens celulares, são de fácil isolamento, expansão,
manipulação e podem ser autólogas (BANFI et al., 2000). O efeito terapêutico promissor
das CTMs recai em sua capacidade de enxertar e sobreviver em tecidos-alvo distintos por
um longo período (MINGUELL; ERICES, 2006), onde podem proliferar rapidamente e
originar células-filhas capazes de substituir as células doentes (BANFI et al., 2000). Seu
uso clínico potencial relaciona-se com a facilitação da enxertia das CTHs, com a
imunomodulação e com a correção de desordens das CTMs (BACIGALUPO, 2004).
Entretanto, alguns problemas biotecnológicos, relacionados às características
biológicas destas células, necessitam ser solucionados antes de as CTMs estarem prontas
para o uso terapêutico (KASSEM; KRISTIANSEN; ABDALLAH, 2004). Por exemplo,
como obter um número terapêutico destas células? É possível cultivá-las em meio sem
SBF? É possível direcionar o potencial de diferenciação destas células para uma
determinada linhagem necessária ao tratamento de uma doença específica? Até que ponto
Discussão
154
as células cultivadas in vitro estão correlacionadas com a população de células
mesenquimais in vivo?
Risco potencial de transmissão de partículas infecciosas como vírus, bactérias e príons
dos animais para os homens, além de reações imunológicas e inflamatórias locais secundárias
a contaminação com proteínas bovinas, que nem sempre são excluídas, mesmo após a
lavagem exaustiva, podem levar a formação de anticorpos, à falha de enxertia ou à rejeição
das células transplantadas, especialmente se as CTMs forem administradas repetidas vezes
(STUTE et al., 2004).
Já foi relatado que o cultivo das CTMs em meio contendo soro autólogo é possível,
sendo que as CTMs podem ser igualmente bem cultivadas em soro humano, sem diferenças
significativas na capacidade de proliferação ou no potencial de diferenciação ex vivo ou in
vivo, quando comparadas às células cultivadas em soro de cavalo, mesmo sem a adição de
fatores de crescimento (KASSEM; KRISTIANSEN; ABDALLAH, 2004; STUTE et al.,
2004).
Apesar de todas estas dúvidas, as CTMs já foram utilizadas terapeuticamente, e com
sucesso, em modelos animais e humanos, em várias ocasiões. Podem facilitar a enxertia das
CTHs (DEVINE; HOFFMAN, 2000; KOÇ et al., 2000; FIBBE; NOORT, 2003; LAZARUS
et al., 2005; LE BLANC; RINGDEN, 2005), reconstituir o estroma medular (FOUILLARD
ET AL., 2003), serem utilizadas no tratamento (LE BLANC et al., 2004) ou na prevenção da
DECH (LEE et al., 2002), assim como no tratamento da Osteogenesis Imperfecta (HORWITZ
et al., 2002) e de desordens metabólicas como a Leucodistrofia Metacromática e a Síndrome
de Huler (KOÇ et al., 2002).
Neste estudo descrevemos o isolamento, a expansão e a caracterização morfológica,
imunofenotípica e funcional das CTMs da MO de pacientes previamente submetidos a altas
doses de quimioterapia e concluímos que estas células provavelmente são qualitativa e
Discussão
155
quantitativamente lesadas pela quimioterapia, mas que, em muitos casos, podem ser isoladas e
expandidas em níveis suficientes para o uso terapêutico.
7 CONCLUSÕES
Conclusões
157
• É possível isolar e cultivar células com características morfológicas e
imunofenotípicas de CTMs de pacientes submetidos a altas doses de quimioterapia.
• Os dados encontrados indicam uma diminuição da freqüência das CFU-F em 6/12
(50%) amostras dos pacientes, mais significativa nos portadores de LNH (4/6 ou
66,6%), o que sugere uma lesão quantitativa das CTMs previamente expostas à
quimioterapia.
• Os dados referentes à duração do cultivo e a capacidade de expansão ex vivo das
CTMs foram heterogêneos, sendo que, quando comparadas às dos doadores normais,
das 12 amostras de pacientes, 7 (58,3%) permaneceram em cultivo por menos tempo e
de 8 (66,6%) expandiram-se menos indicando uma lesão qualitativa nas CTMs
provocada pela quimioterapia, que não se recupera com o tempo, já que dos 4 resultados
considerados como normais quanto à expansão ex vivo, 3 (75%) eram de pacientes
submetidos ao transplante há < 180 dias.
• Em relação às CTMs dos doadores normais, as CTMs de pacientes comportam-se de
maneira similar quanto à capacidade de diferenciação multipotencial e de promover a
expansão das células CD 34+. Além disso, aparentemente são mais reativas promovendo
uma maior expansão das CFU-GM no co-cultivo por curto período de tempo, contudo,
entram em exaustão mais precoce e, portanto, são menos eficientes na sustentação da
hematopoese após o co-cultivo por 28 dias.
• Os resultados encontrados são heterogêneos e sugerem que as CTMs são qualitativa
e quantitativamente lesadas após altas doses de quimioterapia. Entretanto, o quanto esta
lesão limitaria a expansão e, conseqüentemente, o sucesso do uso destas células na
terapia, ainda necessita ser melhor definido.
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followed by co-infusion of T cell-depleted haematopoietic stem cells and culture-expanded
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APÊNDI CES
Apêndice A
174
APÊNDICE A - Termo de consentimento livre e esclarecido dos
pacientes
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Nome da pesquisa: “Análise das características biológicas das células progenitoras
mesenquimais de pacientes submetidos a radio e/ou quimioterapia intensiva”
Pesquisadores responsáveis: Karen de Lima Prata e Prof Dr Dimas Tadeu Covas
Gostaríamos de convidá-lo a participar deste projeto de pesquisa. Este projeto faz parte
de uma linha de pesquisa que vem sendo desenvolvida pelo corpo clínico do Hospital das
Clínicas da FMRP-USP-RP, em conjunto com os pesquisadores do Centro de Terapia Celular
- Centro Regional de Hemoterapia do HC-FMRP-USP, com o objetivo de conhecer melhor as
células tronco ou progenitoras, que são as células mãe, isto é, as células que darão origem a
outras células do nosso corpo.
A sua participação é voluntária. Para participar, é necessário ler atentamente este
documento e ouvir nossas explicações em caso de dúvidas. Se estiver interessado em
participar, solicitaremos que assine este documento.
Porque esta pesquisa esta sendo feita?
Atualmente, muitas doenças estão sendo tratadas com quimioterapia. Sabemos do efeito
desta medicação no sangue, nos cabelos, na vontade de comer, mas muito pouco se sabe sobre
o efeito destas medicações em um tipo de células tronco, as mesenquimais. Estas células
moram na medula óssea (tutano do osso) e são muito importantes no processo de produção do
sangue.
Esta pesquisa tem como objetivo conhecer melhor sobre o efeito da quimioterapia sobre
esta célula. Para isto, precisamos estudar as células de pacientes que já receberam altas doses
destes medicamentos, ou seja, que já foram submetidos ao transplante de medula e comparálas com as células de pessoas que nunca receberam quimioterapia.
Como será feita esta pesquisa?
Após ter concordado em participar do estudo e ter assinado este termo de
consentimento, será coletado uma amostra de 4mL de sangue de sua veia e outra de sua
medula óssea, em um dia em que você precisar vir ao Hospital por qualquer motivo.
A coleta de sangue periférico será feita por punção de veia, semelhante à coleta de
sangue para realização de exame de sangue. A coleta de sangue da medula óssea será feita por
punção aspirativa do osso da bacia, após técnicas de assepsia e anestesia local.
Quanto tempo durará a pesquisa?
A pesquisa será concluída em 2 anos, mas será coletado amostra de sangue periférico e
de medula óssea apenas uma vez de cada paciente ou doador.
Apêndice A
175
Quais são os riscos que podem ocorrer?
Os riscos que podem ocorrer são os mesmos que você já conhece e que estão previstos
na coleta de medula óssea e de sangue para exames de rotina: formação de hematomas no
local das punções, sensação dolorosa ao se puncionar o osso da bacia, apesar da anestesia
local; reação alérgica à anestesia local, infecção no local da punção.
O que acontece se eu não aceitar em participar?
Caso não queira participar, o seu seguimento em nosso ambulatório continuará o
mesmo, sem prejuízo nenhum para o seu tratamento.
Haverá alguma despesa ou benefício com este estudo?
Não haverá nenhuma despesa e nenhum ganho em dinheiro. O único benefício será o de
auxiliar-nos a entender melhor sobre o efeito da quimioterapia nesta célula e no futuro tentar
melhorar o tratamento de pessoas com doença igual a sua.
Afirmamos que os dados obtidos serão guardados de maneira sigilosa e que os nomes
dos participantes não serão divulgados em nenhum momento.
Qualquer dúvida sobre esta pesquisa, entrar em contato com a Dra Karen de Lima Prata
pelo telefone 21019300 ramais 9515 ou 9605.
Eu, _____________________________________, autorizo a retirada de 4ml do meu
sangue através de punção venosa e 4ml de medula óssea, através de punção aspirativa, para a
realização de pesquisa sobre os efeitos da quimioterapia nas células tronco mesenquimais. Fui
informado (a) sobre o procedimento e que o volume retirado não causará dano a minha saúde.
Fui informado (a) também que a finalidade dessa pesquisa é de no futuro melhorar o
tratamento dos pacientes que são submetidos a transplante de medula óssea.
Ribeirão Preto , _____ de _________________ de 200__
_______________________________________________
Assinatura do paciente – Registro
_______________________________________________
Karen de Lima Prata CRM –SP 110065
Pesquisadora responsável
Apêndice B
176
APÊNDICE B - Termo de consentimento livre e esclarecido dos
doadores normais
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Nome da pesquisa: “Análise das características biológicas das células progenitoras
mesenquimais de pacientes submetidos a radio e/ou quimioterapia intensiva”
Pesquisadores responsáveis: Karen de Lima Prata e Prof Dr Dimas Tadeu Covas
Gostaríamos de convidá-lo a participar deste projeto de pesquisa. Este projeto faz parte
de uma linha de pesquisa que vem sendo desenvolvida pelo corpo clínico do Hospital das
Clínicas da FMRP-USP-RP, em conjunto com os pesquisadores do Centro de Terapia Celular
- Centro Regional de Hemoterapia do HC-FMRP-USP, com o objetivo de conhecer melhor as
células tronco ou progenitoras, que são as células mãe, isto é, as células que darão origem a
outras células do nosso corpo.
A sua participação é voluntária. Para participar, é necessário ler atentamente este
documento e ouvir nossas explicações em caso de dúvidas. Se estiver interessado em
participar, solicitaremos que assine este documento.
Porque esta pesquisa esta sendo feita?
Atualmente, muitas doenças estão sendo tratadas com quimioterapia. Sabemos do efeito
desta medicação no sangue, nos cabelos, na vontade de comer, mas muito pouco se sabe sobre
o efeito destas medicações em um tipo de células tronco, as mesenquimais. Estas células
moram na medula óssea (tutano do osso) e são muito importantes no processo de produção do
sangue.
Esta pesquisa tem como objetivo conhecer melhor sobre o efeito da quimioterapia sobre
esta célula. Para isto, precisamos estudar as células de pacientes que já receberam altas doses
destes medicamentos, ou seja, que já foram submetidos ao transplante de medula e comparálas com as células de pessoas que nunca receberam quimioterapia.
Como será feita esta pesquisa?
Após ter concordado em participar do estudo e ter assinado este termo de
consentimento, será colhido uma amostra de 4mL de sangue de sua veia e outra de sua medula
óssea, pela equipe do transplante, no momento em que você for doar a sua medula óssea para
a sua irmã (o), no bloco cirúrgico sob anestesia e condições de assepsia adequadas.
Quanto tempo durará a pesquisa?
A pesquisa será concluída em 2 anos, mas será coletada amostra de seu sangue
periférico e de sua medula óssea apenas uma vez.
Apêndice B
177
Quais são os riscos que podem ocorrer?
Não haverá acréscimo de risco em relação à doação de medula óssea para a sua irmã
(o). Os riscos que podem ocorrer são os mesmos já previstos na doação, isto é: formação de
hematomas no local das punções, sensação dolorosa após o término da anestesia; reação
alérgica à anestesia, infecção no local da punção.
O que acontece se eu não aceitar em participar?
Caso não queira participar, não haverá nenhum prejuízo no tratamento de sua irmã (o)
em nosso hospital.
Haverá alguma despesa ou benefício com este estudo?
Não haverá nenhuma despesa e nenhum ganho em dinheiro. O único benefício será o de
auxiliar-nos a entender melhor sobre o efeito da quimioterapia nesta célula e no futuro tentar
melhorar o tratamento de pessoas com doença semelhantes à da sua irmã (o).
Afirmamos que os dados obtidos serão guardados de maneira sigilosa e que os nomes
dos participantes não serão divulgados em nenhum momento.
Qualquer dúvida sobre esta pesquisa, entrar em contato com a Dra Karen de Lima Prata
pelo telefone 21019300 ramais 9515 ou 9605.
Eu, _____________________________________, autorizo a retirada de 4ml do meu
sangue através de punção venosa e 4ml de medula óssea por técnica aspirativa, para a
realização de pesquisa sobre os efeitos da quimioterapia nas células tronco mesenquimais. Fui
informado (a) sobre o procedimento e que o volume retirado não causará dano a minha saúde
nem prejuízo ao tratamento de minha irmã (o). Fui informado (a) também que a finalidade
dessa pesquisa é de no futuro melhorar o tratamento dos pacientes que são submetidos a
transplante de medula óssea.
Ribeirão Preto , _____ de _________________ de 200__
_______________________________________________
Assinatura do doador – Registro
_______________________________________________
Karen de Lima Prata CRM –SP 110065
Pesquisadora responsável
Apêndice C
178
APÊNDICE C - Esquemas de quimioterapia utilizados
Tabela A.1: Esquemas de quimioterapia utilizados durante o tratamento dos pacientes
Esquemas de
Quimioterápicos
Quimioterapia
ABVD
(BONADONNA
et al., 1975)
BEAM
(GASPARD et al.,
1988)
CHOP
(MCKELVEY et
al., 1976)
Adriamicina
Dose
Via de
Dias de
administração administração
25mg/m2
EV
1 e 15
2
Bleomicina
10mg/m
EV
1 e 15
Vimblastina
6mg/m2
EV
1 e 15
Dacarbazina
375mg/m2
EV
1 e 15
300mg/m
2
EV
D-6
100mg/m
2
EV (12/12h)
D-5 a D-2
Citarabina (Aracytin)
100mg/m
2
EV (12/12h)
D-5 a D-2
Melfalan
140mg/m2
VO
D-1
Ciclofosfamida
750mg/m2
EV
1
EV
1
BCNU
Etoposide
2
Adriamicina
(Hidroxydaunomycin)
Vincristina (Oncovin)
50mg/m
1,4mg/m2*1 EV
1
100mg
VO
1a5
CHOP-Bleo
Prednisona
Esquema CHOP
(RODRIGUEZ et
al., 1977),
Bleomicina
5mg/m2
C-MOPPABV
(STRAUS et al.,
1983)
Ciclofosfamida
Vincristina (Oncovin)
Procarbazina
EV
1
2
EV
1
2*1
EV
1
2
650mg/m
1,4mg/m
VO
1a7
Prednisona
2
40mg/m
VO
1 a 14
Adriamicina
35mg/m2
EV
8
Bleomicina
10mg/m2
EV
8
EV
8
EV
1
Vimblastina
100mg/m
2
6mg/m
2
Cy
Ciclofosfamida
2000mg/m
DHAP
Dexametasona
Citarabina (High-dose
Aracytin)
40mg
VO ou EV
2
2000mg/m EV (12/12h)
1a4
2
Cisplatina (Platinum)
100mg/m2
1
(VELASQUEZ et
al., 1988)
EV (24h)
continua
Apêndice C
179
continuação
Esquema de
Quimioterápicos
Quimioterapia
Dose
Via de
Dias de
administração administração
ESHAP
Etoposide
40mg/m2
EV
1a4
(VELASQUEZ et
al., 1994)
Metilprednisona
(Solu-medrol)
Citarabina (High-dose
Aracytin)
500mg/m2
EV
1a4
2000mg/m2 EV (12/12h)
5
Cisplatina (Platinum)
25mg/m2
EV (24h)
1a4
Mitoxantrone
4mg/m2
MIFAP
(HANEL et al.,
2001)
Fludarabina
Citarabina (Aracytin)
Cisplatina (Platinum)
MINE
intensificado
(CABANILLAS,
1991)
MOPP
(COOPER et al.,
1972)
EV
2a5
2
EV
1a4
2
EV
1a4
EV
1a4
15mg/m
50mg/m
2
25mg/m
2
Mesna
1700mg/m
EV
1a3
Ifosfamida
1700mg/m2 EV
1a3
Mitoxantrone
(Novantrone)
Etoposide
10mg/m2
EV
1
175mg/m2
EV
1a3
Mecloretamina
6mg/m2
Vincristina (Oncovin)
Procarbazina
Prednisona
EV
1e8
2*1
EV
1e8
2
VO
1 a 28
VO
1 a 14
1,4mg/m
100mg/m
2
40mg/m
conclusão
*EV = endovenoso; VO = via oral
*1
Máximo de 2mg;
Apêndice D
180
APÊNDICE D – Sinonímia, distr ibuição e fisiologia dos antígenos de super fície avaliados
Tabela A.2: Sinonímia, distr ibuição e fisiologia dos antígenos avaliados na imunofenotipagem por citometr ia de fluxo das CTMs.
Antígeno:
Sinonímia:
Distr ibuição:
Fisiologia:
CD 13
My7, Aminopeptidase N.
Células mielóides, endoteliais, do
estroma de suporte da
hematopoese, cerebrais;
fibroblastos, monócitos,
osteoclastos e outras.
Metaloprotease que se liga ao zinco catalisando a remoção do NH2 terminal
de aminoácidos dos peptídeos e reduzindo assim a concentração local de
peptídeos hormonais. Regula a morfogênese endotelial e a motilidade
celular, ambos críticos na angiogênese e na progressão tumoral. Alta
expressão de CD13 permite uma maior sobrevivência da célula pelo
bloqueio da apoptose, provavelmente como resultante da inativação da IL-8
(KIPPS, 2001; PARASKEVAS, 2004).
CD 14
Receptor de lipopolissacáride,
(LPS-R).
Monócitos, macrófagos, células
dendríticas e fracamente nos
granulócitos.
Receptor de lipopolissacáride (LPS) que pode transduzir sinais, levando a
queima oxidativa e/ou síntese de TNFα. Tem papel importante na ativação
induzida pelo LPS, na resposta inflamatória e na imunidade inata (KIPPS,
2001).
CD 29
Cadeia β1 integrina, cadeia- β
VLA, GPIIa plaquetária.
Plaquetas, todos os leucócitos e
maioria das outras células. Altos
níveis nas células T de memória.
Liga-se a cadeias α para formar receptores envolvidos na adesão célulacélula e célula-matriz. Levam à reorganização do citoesqueleto e à expressão
de genes que resultam na migração celular, proliferação, diferenciação e
sobrevida. Papel importante no desenvolvimento da cartilagem, assim como
na organização da matriz de colágeno (KIPPS, 2001; PARASKEVAS,
2004).
CD 34
My10, Spg90.
1 a 4% das células da medula
óssea, incluindo a CTH e
endotelial.
Pode ter um papel na transdução de sinais ou interações leucócito-endotélio
através da habilidade de interagir com o CD62L, CD62P e o CD62E
(moléculas de adesão). O papel na hematopoese ainda é desconhecido, mas
possivelmente, media a retenção da CTH na medula óssea, através da sua
ligação com o estroma (KIPPS, 2001).
CD 44
Glicoproteína fagocítica 1,
antígeno de Hermes, receptor
matriz extra-celular tipo III.
Maioria dos tipos celulares, exceto
plaquetas, células testiculares,
hepatócitos, epitélio tubular renal,
cardiomiócitos.
Receptor para o hialuronato, que facilita a ligação do linfócito ao endotélio
das vênulas. Variantes do CD44 têm se ligado ao sulfato de condroítina e
são capazes de se ligar a fibronectina, laminina e ao colágeno. É também um
receptor para citocinas quimiotáxicas para a osteopontina (KIPPS, 2001).
continua
Apêndice D
181
continuação
Antígeno:
Sinonímia:
Distr ibuição:
Fisiologia:
CD 45
T200, B220, antígeno comum
leucocitário.
Todas as células hematopoéticas,
exceto eritrócitos.
É uma tirosina fosfatase que modula a transdução de sinais pelos receptores
dos antígenos de superfície. Tem papel fundamental na ativação linfocitária.
Regula positivamente a sinalização TCR e negativamente a PTK nos sítios
de adesão pelas integrinas. Suprime as cinases JAK e regula negativamente a
produção de citocinas. As diferentes isoformas regulam diferentemente a
produção de IL-2. Deficiência de CD45 resultante da mutação do gene do
CD45 resulta no fenótipo SCID (KIPPS, 2001; PARASKEVAS, 2004).
CD 49e
VLA-5 sub unidade α,
subunidade α5 da integrina,
subunidade Ic do GPIc-IIa.
Timócitos, células T, monócitos,
plaquetas, células B progenitoras
ou ativadas.
Liga-se ao CD29 para formar o receptor para a fibronectina e invasina, via
de ligação ao sítio (Arginina-Glicina-Aspargina). Após a ligação, ativa a
bomba Na+/H+ e pode agir como molécula acessória na ativação da célula T
(KIPPS, 2001; PARASKEVAS, 2004).
CD 51
αv: subunidade α do receptor da
vitronectina, subunidade αv da
integrina.
Células endoteliais, monócitos,
macrófagos, plaquetas, leucócitos
ativados, células NK e neutrófilos,
alem de células do músculo liso e
osteoclastos.
Associa-se ao CD61(β3) para formar o receptor para a vitronectina, que se
liga também ao fator de Von Wilebrand, trombospontina, osteopontina,
laminina, fibrinogênio, colágeno dentre outros. Estes receptores facilitam a
agregação plaquetária e/ou adesão das células endoteliais e podem ter um
papel na migração do monócito através do subentotélio. Tem papel na
angiogênese e a sua inibição induz a apoptose das células angiogênicas. O
CD51 também pode se associar com a integrina β5 para formar um receptor
alternativo da vitronectina (KIPPS, 2001; PARASKEVAS, 2004).
CD 54
Molécula intracelular de adesão1 (ICAM-1).
Vasta distribuição entre as células
hematopoéticas e não
hematopoéticas, sendo moderada
nos monócitos, CTH linfócitos B e
T. Expresso nas células endoteliais
e epiteliais, sendo altamente
expresso quando as primeiras
encontram-se ativadas.
Funciona como ligante para o CD11a/CD18, CD11b/CD18 e CD11c/CD18.
O CD54 também é receptor para o fibrinogênio, rinovirus, pode ligar-se ao
CD43 e às hemácias infectadas pelo Plasmodium falciparum. É membro de
um grupo de moléculas que orquestra a migração trans-endotelial dos
leucócitos. Tem papel como molécula de adesão durante a indução, tão bem
quanto na função efetora da resposta imunológica como a citotoxidade
mediada pela célula T (KIPPS, 2001; PARASKEVAS, 2004).
continua
Apêndice D
182
continuação
Antígeno:
Sinonímia:
Distr ibuição:
Fisiologia:
CD 61
GPIIIa, subunidade β3 integrina,
receptor da cadeia β da
vitronectina.
Plaquetas, megacariócitos,
monócitos, macrófagos, células
endoteliais.
Associa-se ao CD41 para formar o GPIIb-IIIa, heterodímero que facilita a
agregação plaquetária, ou ao CD51 formando o receptor para o fibrinogênio,
vitronectina, vWF, entre outros, tendo assim papel importante na hemostasia
(KIPPS, 2001; PARASKEVAS, 2004).
CD 73
5’NT, L-VAP-2
Células mesenquimais, endoteliais,
epiteliais, neurais e dendríticas;
alguns linfócitos B e T.
Hidrolisa o nucleosídeo 5’monofosfato (AMP); via de salvamento da purina
podendo prover o total de purinas requeridas pelos linfócitos; molécula coestimulatória dos linfócitos T naive; intermedia a adesão dos linfócitos B às
células dendríticas e dos linfócitos B e T às células endoteliais; atua na
diminuição da permeabilidade vascular no processo inflamatório, assim
como a manutenção da integridade vascular durante a migração celular; atua
também, no aumento dos neuro-transmissores nas sinapses colinérgicas, na
diferenciação das células neuronais ex vivo e provavelmente durante o
desenvolvimento neuronal; é responsável pela produção da maioria da
adenina na hipóxia e na doença isquêmica do coração (KIPPS, 2001;
PARASKEVAS, 2004).
CD 90
Thy-1, theta.
Pró-timócitos, cérebro e outros
tecidos não linfóides.
Podem contribuir para a formação dos neurônios de memória e com a
regulação do crescimento das CTHs (KIPPS, 2001).
CD 105
Endoglina, receptor para o TGFB I e III.
Células estromais, endoteliais,
monócitos, macrófagos, próeritroblastos, precursores da
linhagem B, células dendríticas.
Glicoproteína dimérica presente no endotélio vascular e no estroma da MO.
É componente do sistema de sinalização TGF-β, agindo como receptor tipo
III. Tem alta afinidade de ligação para o TGF-β I e III mas não se liga ao TGFβ II. Media interações entre as CTHs e CTMs. Forma um complexo com os
receptores I e II. Está envolvido no processo de formação vascular e na
regulação da diferenciação condrogênica. (BARRY, 1999; KIPPS, 2001).
continua
Apêndice D
183
continuação
Antígeno:
Sinonímia:
Distr ibuição:
Fisiologia:
HLA
Antígenos leucocitários
humanos (human leucocyte
antigens)
As proteínas expressas pelos genes
HLA encontram-se
contitutivamente distribuídas:
Os genes do complexo HLA são caracterizados por alta variabilidade
genética. Codificam um elevado número de proteínas que diferem entre si e
atuam como potentes antígenos no organismo. São consideradas como o
principal fator genético na rejeição ou pega dos tecidos enxertados e por isto,
pertencem ao complexo principal de histocompatibilidade. São responsáveis
pela apresentação de antígenos, tumorais ou procedentes de agentes
infecciosos, ao receptor dos linfócitos T, permitindo assim, o sistema imune
diferenciar o próprio do que não é próprio, ou seja, distinguir células
normais de células neoplásicas ou infectadas. Estes genes estão agrupados e
são divididos em três classes, de acordo com as características funcionais.
Classe I: na membrana
citoplasmática de praticamente
todas as células nucleadas e nas
plaquetas.
Classe II: nas células
apresentadoras de antígenos como
os linfócitos B, macrófagos, células
dendríticas, células de Langerhans
e nas células do epitélio tímico.
Na região de classe I estão localizados os genes HLA A, B e C, entre outros.
Codificam proteínas HLA que, se ligam a peptídeos resultantes da
fragmentação de proteínas endógenas, localizadas no citosol. A seguir, o
complexo HLA/peptídeo é transportado para a superfície celular onde será
exposto às células T CD8+, o que desencadeia uma série de interações
envolvendo moléculas CD8 e demais moléculas de adesão, culminando com
a diferenciação e ativação das células T citotóxicas, responsáveis pela
detecção e eliminação de células infectadas por vírus e ou outros organismos
de parasitismo intracelular.
A região HLA-D abrange três sub-regiões, DR, DQ e DP, que contêm genes
HLA classe II e vários outros genes envolvidos na resposta imune. As
proteínas HLA de classe II apresentam peptídeos derivados de proteínas
extracelulares, capturados por endocitose, para o receptor dos linfócitos T
auxiliares CD4+. Quando o complexo HLA/peptídeo for imunogênico, uma
serie de interações que envolvem, alem do receptor do linfócito T, as
moléculas CD4 e outras moléculas de adesão, serão promovidas, acarretando
a ativação das células T auxiliares. Estas, uma vez ativadas, promovem a
diferenciação e ativação dos linfócitos B e T citotóxicos e efetores.
A região de classe III contêm genes envolvidos na resposta imune inata e
nos processos inflamatórios.
Texto adaptado de Pereira e Pasquini (2001).
continua
Apêndice D
184
continuação
Antígeno:
KDR
Str o-1
Sinonímia:
Distr ibuição:
Fisiologia:
Flk- 1, VEGFR2 (receptor tipo
II do gene da tirosina Kinase).
Células endoteliais, células tronco
hematopoéticas, HUVECs (do
inglês, human umbilical vein
endothelial cells).
A família de receptores para os fatores de crescimento do endotélio vascular
(VEGFs) contem três membros, os quais regulam a formação dos vasos
sangüíneos e linfáticos (Shibuya, 2002). O KDR (do inglês, kinase insert
domain containing receptor), é um destes e funciona como chave regulatória
da angiogenese (Boyer, 2002). É o principal receptor responsável pela
atividade da atividade do VEGF, no desenvolvimento vascular fisiológico e
patológico (Shinkaruk et al., 2003), media a expressão dos Ets-1, MMP-1,
and Flt-1 e também estimula a síntese de DNA e a migração das HUVECs
(Sato et al., 2000). É também, um marcador funcional positivo, definidor das
CTHs distinguindo-as de seus progenitores (Ziegler et al., 1999)
Células estromais da MO,
precursores eritróides.
Anticorpo denominado STRO-1 devido a sua reatividade com os elementos
estromais da MO in e ex vivo. Não reage com as CFU-GM, CFU-GEMM ou
BFU-E, mas reage com 10% das CMN da MO, sendo mais de 95% destas,
progenitores eritróides. Estes dados sugerem que as CFU-F são STRO1+/glicoforina A-. (SIMMONS; TOROK-STORB, 1991)
conclusão
* IL = interleucina; LPS = lipopolissacáride; TNFα = do inglês, tumor necrosis factor-alpha; VLA = do inglês, very late activation antigen; GP = glicoproteína; CTH =
célula-tronco hematopoética; CD = do inglês, cluster of differentiation; TCR = do inglês, T cell receptor, PTK = do inglês, protein tyrosine kinase; J AK = do inglês,
Janus kinase; SCID = do inglês, severe combined immunodeficiency; ICAM = do inglês, intercellular adhesion molecule; vWF = do inglês, von Willebrand factor;
5’NT= ecto -5’- nucleotidase; L-VAP-2 = do inglês, lymphocyte-vascular adhesion protein 2; AMP = do inglês, adenosine monophosphate; TGF-β = do inglês,
transforming growth factor – β; MO = medula óssea; CTMs = células-tronco mesenquimais; HLA = do inglês, human leucocyte antigen; KDR = do inglês, kinase insert
domain containing receptor; VEGFR = do inglês, vascular endothelial growth factor receptor; HUVEC = do inglês, human umbilical vein endothelial cells; MMP = do
inglês, matrix metalloproteinase; Str o-1 = anti – IgM, sobrenadante de cultura de células estromais; CFU-GM = do inglês, colony forming unit-granulocyte-monocyte;
CFU-GEMM = do inglês, colony forming unit-granulocyte-eritrocyte-monocyte-macrophag; BFU-E = do inglês, burst forming unit- erythroid; CMN = células
mononucleares.
Apêndice E
185
APÊNDICE E - Resultados dos Hemogramas
Tabela A.3: Hemogramas dos pacientes e doadores normais:
DP3
DP4
DP5
DP6
DP7
DP8
DP9
DP10
DP11
DP12
DP13
DP14
DN8
DN9
DN12
DN13
DN14
GB/
(mm3)
3100
11900
7600
6200
5500
6900
6400
7100
5900
6000
4000
6800
10700
7100
6900
8300
8000
Li/
(mm3)
800
6600
1900
1300
2200
1600
2600
3000
2600
1200
1500
1800
1500
1200
1600
2600
1700
Mo/
(mm3)
500
1400
500
200
600
300
500
500
200
500
500
500
500
700
300
700
Gr/
(mm3)
1800
3900
5200
4700
2600
5000
3400
3600
3100
4300
2000
4500
5300
4400
5300
5400
GV/
(mm3)
3,08
4,38
4,23
3,99
3,33
5,36
5,01
4,44
4,26
3,69
4,36
4,52
5.45
5.09
5.56
4.11
5.78
Hb/
(g/dL)
10,1
13,4
12,8
12,9
11,1
17,3
12,8
15,4
14,0
11,5
14,2
14,2
16.2
12.4
15.0
12.7
15.5
Ht (%)
30,3
39,5
40,1
39,3
32,6
50,6
39,7
45,8
42,2
34,6
41,3
39,7
49.7
40.2
46
38.2
50.4
VCM
(fl)
98,3
90,2
94,7
98,3
97,9
94,4
79,2
103,2
99,1
93,8
94,7
87,7
79.0
82.8
92.9
87.2
HCM
(pg)
32,7
30,5
30,2
32,3
33,4
32,3
25,6
34,7
32,9
31,1
32,5
31,4
24.4
26.9
30.9
26.8
CHCM(%)
RDW
33,3
33,8
31,9
32,9
34,1
34,2
32,3
33,7
33,2
33,1
34,3
35,8
30.9
32.5
33.3
30.7
18,6
13,8
14,2
14,2
12,6
14,8
18,7
14,8
15,3
15,3
14,9
13,1
12.7
12.4
14.9
12.9
Plaq
(mm3)
201000
247000
284000
177000
311000
180000
180000
216000
253000
56000
146000
159000
149000
298000
208000
199000
245000
* GB = glóbulos brancos; Li = linfócitos; Mo = monócitos; Gr = granulócitos; GV = glóbulos vermelhos; Hb = hemoglobina; Ht = hematócrito; VCM =
volume corpuscular médio; HCM = hemoglobina corpuscular média; CHCM = concentração da hemoglobina corpuscular média; RDW = do inglês, red
cell distribution width; Plaq = plaquetas.
Apêndice F
186
APÊNDICE F - Quantificação das CFU-F
Tabela A.4: Quantificação das unidades formadoras de colônias fibroblastóides. As CFU-F foram
contadas no 14º dia de cultivo e encontram-se classificadas em subgrupos por idade
(anos), doença (DH e LNH) e tempo (dias) após o transplante.
DN
DP
1.25
1.36
1.16
0.13
9.25
1.14
0.28
0.45
2.52
0.73
3.75
1.18
3.45
0.00
0.00
0.00
3.03
< 40
anos
1.14
0.28
0.45
2.52
3.75
0.00
≥ 40
anos
0.73
1.18
3.45
0.00
0.00
3.03
DH
LNH
0.28
2.52
0.73
3.75
3.45
3.03
1.14
0.45
1.18
0.00
0.00
0.00
< 180
dias
1.14
0.73
1.18
0.00
0.00
> 1280
dias
0.00
0.45
3.75
3.45
2.52
* DN = doador normal; DP = doador paciente ; DH = doença de Hodgkin; LNH = linfoma não Hodgkin
Apêndice G
187
APÊNDICE G - Tempo necessário à duplicação celular
Tabela A.5: Quantificação do tempo necessário (horas) à duplicação das CTMs entre a 1ª e a 2ª
passagem. O tempo (horas) necessário à duplicação celular das CTMS foi calculado
entre a 1ª e a 2ª passagem e encontra-se classificado em subgrupos por idade (anos),
doença (DH e LNH) e tempo (dias) após o transplante.
DN
DP
44.86
36.36
37.80
47.73
270.59
56.38
34.08
185.64
167.44
49.48
58.90
59.08
92.31
69.01
195.35
68.33
107.22
126.69
< 40
anos
34.08
185.64
167.44
49.48
59.08
107.22
≥ 40
anos
58.90
92.31
69.01
195.35
68.33
126.69
DH
LNH
185.64
49.48
58.90
59.08
69.01
126.69
34.08
167.44
92.31
195.35
68.33
107.22
< 180
dias
34.08
58.90
92.31
107.22
68.33
> 1280
dias
195.35
167.44
59.08
69.01
49.48
* DN = doador normal; DP = doador paciente ; DH = doença de Hodgkin; LNH = linfoma não Hodgkin
Apêndice H
188
APÊNDICE H - Dias de cultivo das CTMs
Tabela A.6: Quantificação dos dias em que as CTMs permaneceram em cultivo. O dia da última
tripsinização foi considerado como o último dia de cultivo das CTMs e encontra-se
classificado em subgrupos por idade (anos), doença (DH e LNH) e tempo (dias) após o
transplante.
DN
DP
73
57
92
103
88
74
85
46
73
70
84
56
58
74
64
88
88
53
< 40
anos
85
46
73
70
56
88
≥ 40
anos
84
58
74
64
88
53
DH
LNH
46
70
84
56
74
53
85
73
58
64
88
88
< 180
dias
85
84
58
88
88
> 1280
dias
64
73
56
74
70
* DN = doador normal; DP = doador paciente ; DH = doença de Hodgkin; LNH = linfoma não Hodgkin
Apêndice I
189
APÊNDICE I - Expansão celular final das CTMs
Tabela A.7: Quantificação da expansão celular final em cultura das CTMs. A capacidade de
expansão em cultura foi quantificada em cada passagem e a somas destes valores,
convencionado como a expansão final. Os valores observados encontram-se
classificados em subgrupos por idade (anos), doença (DH e LNH) e tempo (dias) após o
transplante.
DN
DP
16.59
19.63
21.95
27.48
11.85
13.42
28.27
1.81
5.53
20.48
19.61
11.55
6.91
7.71
3.32
8.62
17.95
4.87
< 40
anos
28.27
1.81
5.53
20.48
11.55
17.95
≥ 40
anos
19.61
6.91
7.71
3.32
8.62
4.87
DH
LNH
1.81
20.48
19.61
11.55
7.71
4.87
28.27
5.53
6.91
3.32
8.62
17.95
< 180
dias
28.27
19.61
6.91
17.95
8.62
> 1280
dias
3.32
5.53
11.55
7.71
20.48
* DN = doador normal; DP = doador paciente ; DH = doença de Hodgkin; LNH = linfoma não Hodgkin
Apêndice J
190
APÊNDICE J - Análise do tamanho e complexidade interna das
células
Tabela A.8: Porcentagem de células em cada uma das subpopulações celulares. As CTMs foram
avaliadas por citometria de fluxo e subdivididas em grupos celulares de acordo com os
parâmetros tamanho e complexidade interna em subpopulações de células pequenas,
médias e grandes.
Doadores Pacientes
Doadores Normais
Pequenas
Médias
Grandes
Pequenas
Médias
Grandes
6,74
39,06
50,04
9,60
20,27
7,97
42,93
24,33
62,00
17,40
27,97
49,76
89,49
52,96
46,56
85,00
64,27
83,61
44,91
66,60
25,62
75,13
67,43
38,49
2,76
5,60
1,76
3,92
9,69
6,45
9,97
9,07
10,45
5,73
2,48
9,33
18,78
5,92
17,01
23,00
22,57
15,63
76,36
89,32
66,91
59,13
67,53
78,38
3,23
4,92
9,30
16,59
8,64
5,34
Apêndice L
191
APÊNDICE L – Caracterização imunofenotípica das CTMs dos pacientes
Tabela A.9: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de células totais dos pacientes
Células
Totais
a
DP 3 3 P
DP 4 2aP
DP 5 2aP
DP 6 3aP
DP 7 3aP
DP 8 3aP
DP 9 3aP
a
DP 10 3 P
DP 11 3aP
DP 12 3aP
DP 13 3aP
DP 14 3aP
CD45
CD14
CD34
KDR
HLAII
CD51/61
STRO
CD73
0,01
1,24
0,05
0,17
1,29
0,39
0,00
0,00
0,00
0,76
0,03
0,15
0,00
1,24
0,10
3,10
4,08
0,27
0,00
0,03
0,14
1,45
0,12
0,41
0,15
3,48
0,19
0,40
1,07
0,40
0,08
0,04
0,09
0,76
0,44
0,84
0,63
3,32
3,06
0,94
1,69
0,54
0,06
0,24
0,10
0,00
0,32
0,81
0,16
1,99
0,76
3,86
0,87
0,57
0,00
1,39
0,10
1,89
0,56
0,84
1,52
6,44
0,44
9,61
3,62
1,64
1,62
0,37
0,10
2,68
1,54
1,20
19,69
8,36
27,46
17,46
22,38
0,76
16,52
13,43
3,18
17,25
12,45
11,02
97,56
45,77
82,76
94,61
91,79
95,27
81,65
79,73
2,19
88,05
80,78
11,37
CD105
49,25
51,57
52,79
75,23
18,24
CD90
CD13
CD29
CD49e
HLAI
CD44
CD54
99,47
90,98
98,89
97,95
99,51
99,53
98,39
98,09
73,13
98,08
98,39
85,35
98,65
86,51
93,08
97,71
97,43
98,74
95,02
95,37
36,82
94,85
95,66
63,15
97,12
76,73
76,25
89,73
96,34
95,60
88,41
85,70
15,47
91,56
83,77
41,50
96,23
71,26
83,22
83,54
94,79
95,78
79,00
84,08
3,89
83,56
89,50
16,42
94,62
73,90
36,30
88,82
85,62
78,45
54,88
73,32
0,35
78,67
40,98
3,02
92,66
43,65
57,51
86,86
90,15
47,91
71,05
83,10
0,39
69,23
34,14
4,62
26,22
27,51
26,24
57,37
38,88
55,69
64,42
56,55
1,57
32,62
44,90
3,49
* DP = doador paciente; CD = do inglês, cluster of differentiation; KDR = do inglês, kinase insert domain containing receptor; HLA = do inglês, human leucocyte antigen
Apêndice L
192
Tabela A.10: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de células pequenas dos pacientes
Células
Pequenas
DP 3 3aP
a
DP 4 2 P
DP 5 2aP
DP 6 3aP
a
DP 7 3 P
DP 8 3aP
DP 9 3aP
DP 10 3aP
DP 11 3aP
DP 12 3aP
a
DP 13 3 P
a
DP 14 3 P
CD45
CD14
CD34
KDR
HLAII
CD51/61
STRO
CD73
0,00
0,00
0,02
0,07
0,00
0,00
0,00
0,04
0,00
0,07
0,04
0,00
0,00
0,08
0,08
11,27
0,40
0,00
0,00
0,08
0,00
0,07
0,03
0,00
0,00
0,11
0,21
0,22
0,04
0,16
0,15
0,08
0,03
0,17
0,00
0,15
4,39
1,66
2,69
5,93
1,63
0,00
0,00
0,32
0,03
0,12
0,13
0,00
0,00
0,00
0,00
9,21
0,03
0,33
0,00
0,00
0,03
0,00
0,04
0,02
3,29
0,11
0,24
1,50
0,04
0,18
0,10
0,08
0,03
0,20
0,07
0,06
54,83
5,45
32,92
48,35
28,67
0,11
11,91
14,40
2,42
25,89
22,28
10,93
74,30
2,17
75,50
83,16
54,24
33,38
42,01
16,20
0,15
18,62
31,78
1,03
CD105
3,43
0,51
1,13
1,90
0,41
CD90
CD13
CD29
CD49e
HLAI
CD44
CD54
92,57
73,56
98,63
95,06
97,35
97,55
96,60
95,64
74,73
93,92
94,89
83,90
86,09
45,32
89,51
92,62
90,24
80,51
84,75
75,15
22,93
64,59
77,22
45,69
72,68
24,20
68,56
84,86
79,24
30,76
58,85
32,75
1,94
33,13
35,54
6,76
60,78
8,10
75,72
67,17
68,33
28,35
31,92
29,69
0,39
12,75
50,56
1,79
52,17
5,59
14,11
66,50
20,13
5,96
4,65
6,32
0,00
4,22
3,81
0,19
44,06
1,55
33,74
61,45
44,59
1,17
13,00
10,51
0,00
6,31
0,76
0,11
6,49
1,13
11,40
50,17
7,45
4,75
21,27
4,43
0,07
1,07
6,82
0,12
Tabela A.11: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de células médias dos pacientes
Células
Médias
a
DP 3 3 P
DP 4 2aP
DP 5 2aP
DP 6 3aP
DP 7 3aP
DP 8 3aP
DP 9 3aP
DP 10 3aP
DP 11 3aP
a
DP 12 3 P
DP 13 3aP
DP 14 3aP
CD45
CD14
CD34
KDR
HLAII
CD51/61
STRO
CD73
0,00
0,56
0,12
0,30
0,31
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,01
0,00
0,00
0,84
0,06
1,89
3,48
0,00
0,00
0,16
0,00
0,00
0,04
0,00
1,85
1,09
0,26
0,47
0,55
0,03
0,00
0,06
0,00
0,00
0,16
0,61
1,02
2,81
12,20
0,92
0,77
0,05
0,15
0,17
0,12
0,00
0,07
0,00
0,00
0,74
2,61
5,35
0,53
0,07
0,00
1,90
0,00
1,43
0,35
0,07
5,92
2,05
1,61
49,79
2,44
0,08
0,42
0,05
0,00
0,08
0,86
0,23
64,56
5,17
44,68
21,16
15,22
0,40
14,89
8,74
4,21
15,41
7,08
13,63
99,68
61,76
98,77
99,08
99,18
99,13
97,09
96,37
3,16
97,40
93,94
15,78
CD105
66,86
57,78
57,63
82,68
25,27
CD90
CD13
CD29
CD49e
HLAI
CD44
CD54
100,00
98,16
99,73
99,54
99,86
99,89
99,56
99,58
93,95
99,44
99,48
97,44
99,64
97,94
99,29
99,58
99,77
99,77
99,05
99,77
69,98
99,08
99,24
92,36
100,00
96,08
98,09
93,85
99,78
99,55
99,05
99,55
21,30
98,94
95,66
65,38
100,00
92,04
98,84
93,17
99,70
99,71
97,27
99,57
3,43
93,88
97,72
24,43
94,42
92,37
74,88
97,17
96,87
82,35
81,89
94,84
0,04
89,93
48,19
2,21
96,11
62,35
93,38
97,53
97,53
45,67
89,36
97,29
0,00
84,17
40,33
3,69
44,85
36,04
51,80
70,27
42,79
54,49
85,78
70,28
0,36
31,62
53,02
1,66
Apêndice L
193
Tabela A.12: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de células grandes dos pacientes
Células
Grandes
a
DP 3 3 P
a
DP 4 2 P
a
DP 5 2 P
DP 6 3aP
DP 7 3aP
DP 8 3aP
DP 9 3aP
DP 10 3aP
a
DP 11 3 P
DP 12 3aP
DP 13 3aP
a
DP 14 3 P
CD45
CD14
CD34
KDR
HLAII
CD51/61
STRO
CD73
0,06
0,12
0,91
1,61
0,25
0,37
0,00
0,00
0,16
0,33
0,00
0,00
0,02
0,69
0,91
3,83
0,14
0,37
0,00
0,00
0,00
0,33
0,00
0,15
0,06
4,47
0,00
0,92
0,02
0,41
0,22
0,00
0,00
0,24
0,04
0,42
0,69
0,07
14,94
0,15
0,61
0,39
0,08
0,00
0,00
0,00
0,19
0,13
0,11
2,18
5,71
4,09
0,07
0,11
0,00
0,28
0,00
0,36
0,00
0,00
6,32
3,83
2,48
26,74
0,00
0,23
0,07
0,05
0,08
1,89
0,00
0,00
25,91
6,00
46,51
52,57
6,92
0,99
3,15
2,59
0,08
6,93
2,09
1,92
99,79
45,62
100,00
99,00
96,39
95,57
96,21
81,70
0,00
97,67
64,99
3,23
CD105
54,46
13,25
41,74
71,14
2,63
CD90
CD13
CD29
CD49e
HLAI
CD44
CD54
99,94
98,13
100,00
98,45
99,80
100,00
100,00
99,31
97,81
99,80
99,00
98,02
99,69
96,37
99,32
98,70
99,80
99,62
99,77
99,51
66,17
99,33
98,24
90,03
99,70
96,41
100,00
92,40
99,80
99,65
99,62
99,49
15,94
99,48
86,52
52,04
99,56
80,83
99,27
96,86
99,70
99,52
98,68
98,26
2,62
94,35
87,01
5,31
96,18
80,25
71,32
96,34
77,34
31,79
55,04
43,63
0,01
82,18
17,15
0,57
97,71
53,60
86,88
98,07
84,21
31,01
63,01
88,91
0,00
86,01
4,58
0,56
35,37
32,59
65,31
76,17
29,44
54,58
82,27
73,92
0,65
35,69
42,47
1,43
* DP = doador paciente; CD = do inglês, cluster of differentiation; KDR = do inglês, kinase insert domain containing receptor; HLA = do inglês, human leucocyte antigen
Apêndice M
194
APÊNDICE M – Caracterização imunofenotípica das CTMs dos doadores normais
Tabela A.13: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de células totais dos doadores normais
Células
Totais
DN 05 4aP
DN 08 3aP
DN 09 3aP
DN 12 3aP
DN 13 3aP
a
DN 14 2 P
CD45
CD14
CD34
KDR
HLAII
CD51/61
STRO
0,34
0,00
0,00
0,06
0,07
0,06
0,25
0,00
0,00
0,04
0,14
0,00
0,76
0,43
0,00
0,75
1,49
0,81
7,10
1,80
2,01
0,48
0,69
0,81
2,07
0,28
0,78
0,77
0,95
0,79
3,84
1,17
1,01
1,18
1,74
1,88
23,60
14,59
36,04
1,95
9,41
11,98
CD73
95,29
93,39
46,35
88,30
86,11
CD105
80,61
56,79
82,96
CD90
CD13
CD29
CD49e
HLAI
CD44
CD54
98,99
99,01
98,51
97,21
98,43
98,78
97,52
98,68
97,39
92,93
98,03
95,80
79,03
96,61
95,66
81,05
91,02
84,86
69,58
95,19
94,84
57,36
87,38
83,53
82,69
68,97
89,77
7,74
71,85
50,02
54,53
76,31
93,57
2,41
28,08
12,17
32,91
29,80
17,88
8,00
50,73
38,20
* DN = doador normal; CD = do inglês, cluster of differentiation; KDR = do inglês, kinase insert domain containing receptor; HLA = do inglês, human leucocyte antigen
Tabela A.14: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de células pequenas dos doadores normais
Células
Pequenas
DN 05 4aP
DN 08 3aP
a
DN 09 3 P
DN 12 3aP
DN 13 3aP
DN 14 2aP
CD45
CD14
CD34
KDR
HLAII
CD51/61
STRO
CD73
CD105
0,06
0,00
0,06
0,00
0,00
0,00
0,00
0,51
0,00
0,06
0,00
0,00
0,18
1,47
0,00
0,47
0,14
0,07
12,12
4,68
2,59
0,00
0,12
0,34
0,57
0,99
0,49
0,12
0,00
0,06
0,80
0,00
0,19
0,30
0,00
0,25
34,71
46,62
40,84
3,66
15,08
12,54
88,07
64,55
10,53
29,91
10,69
61,19
0,50
4,17
CD90
CD13
CD29
CD49e
HLAI
CD44
CD54
95,91
99,15
96,48
88,41
93,61
94,06
88,09
96,38
86,38
70,24
89,05
55,63
34,45
92,40
71,89
12,22
35,01
14,06
27,74
82,61
70,71
2,79
23,68
10,47
17,74
21,32
33,03
1,58
6,93
0,16
35,41
55,47
47,45
0,21
0,06
0,00
10,19
11,78
7,63
0,24
0,83
1,24
* DP = doador paciente; CD = do inglês, cluster of differentiation; KDR = do inglês, kinase insert domain containing receptor; HLA = do inglês, human leucocyte antigen
Apêndice M
195
Tabela A.15: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de células médias dos doadores normais
Células
Médias
DN 05 4aP
DN 08 3aP
DN 09 3aP
DN 12 3aP
a
DN 13 3 P
DN 14 2aP
CD45
CD14
CD34
KDR
HLAII
CD51/61
STRO
CD73
CD105
0,05
0,00
0,00
0,08
0,03
0,19
0,08
0,03
0,00
0,00
0,03
0,00
0,19
0,67
0,00
0,35
0,29
0,06
3,88
2,31
0,36
0,51
0,07
0,63
0,70
0,20
0,06
1,28
0,21
0,56
2,02
1,42
0,02
1,32
0,16
0,65
18,15
20,01
11,65
2,83
3,92
7,98
98,90
97,98
77,06
98,53
95,98
92,85
66,91
97,01
CD90
CD13
CD29
CD49e
HLAI
CD44
CD54
99,95
99,71
99,50
99,69
99,79
99,35
99,83
99,68
99,47
99,60
99,90
99,27
88,34
99,59
99,08
98,08
99,64
96,44
76,93
99,38
99,28
86,55
98,73
93,03
95,89
88,34
96,20
22,66
86,59
62,84
58,21
89,07
96,36
9,45
30,45
11,68
36,03
40,60
12,78
18,48
56,21
43,10
* DP = doador paciente; CD = do inglês, cluster of differentiation; KDR = do inglês, kinase insert domain containing receptor; HLA = do inglês, human leucocyte antigen
Tabela A.16: Expressão dos antígenos de superfície, por imunofenotipagem, da população de células grandes dos doadores normais
Células
Grandes
a
DN 05 4 P
DN 08 3aP
DN 09 3aP
a
DN 12 3 P
DN 13 3aP
DN 14 2aP
CD45
CD14
CD34
KDR
HLAII
CD51/61
STRO
1,13
1,11
0,00
0,05
0,90
0,00
1,13
3,50
0,15
0,20
0,37
0,01
1,72
4,77
0,67
0,52
1,17
3,09
14,91
6,81
1,66
0,20
0,38
0,48
3,85
2,53
1,38
0,70
0,17
0,00
7,44
2,72
0,26
1,37
0,49
0,15
30,48
51,05
37,20
1,01
3,96
5,88
CD73
98,23
98,65
30,19
88,28
74,35
CD105
87,51
28,90
84,74
CD90
CD13
CD29
CD49e
HLAI
CD44
CD54
100,00
99,20
99,25
99,68
99,59
99,82
100,00
99,32
99,25
99,10
99,92
99,19
91,94
99,15
98,94
94,38
98,65
95,74
75,98
98,54
99,25
54,72
95,25
83,64
88,98
71,37
97,58
3,13
38,08
19,19
62,50
85,40
98,77
0,82
8,36
0,34
50,88
62,53
38,16
5,89
48,58
55,68
* DP = doador paciente; CD = do inglês, cluster of differentiation; KDR = do inglês, kinase insert domain containing receptor; HLA = do inglês, human leucocyte antigen
Apêndice N
196
APÊNDICE N - Viabilidade celular
Tabela A.17: Porcentagem de células viáveis encontrados para a população total e subgrupos
classificados pelos parâmetros tamanho e complexidade interna. A viabilidade
celular foi avaliada por citometria de fluxo, após marcação dos ácidos nucléicos das
células com iodeto de propídeo.
Doadores Pacientes
Doadores Normais
PT
PP
PM
PG
PT
PP
PM
PG
93,73
73,82
84,40
83,89
87,07
90,56
86,48
92,79
86,17
91,94
81,10
80,87
67,02
88,54
85,64
57,00
75,92
83,62
92,75
91,29
93,38
84,36
75,05
90,74
96,62
65,58
83,37
88,55
92,07
93,44
80,76
94,25
76,25
93,85
84,88
69,71
85,96
73,82
66,36
89,38
89,95
72,73
86,30
84,83
44,86
90,05
69,36
67,72
94,40
87,21
88,66
86,95
90,28
79,36
58,41
91,92
90,60
89,13
95,56
92,34
90,42
87,31
91,89
69,14
91,03
72,88
55,65
74,95
* PT = população total, PP = população pequena, PM = população média e PG = população grande.
Apêndice O
197
APÊNDICE O - Análise do ciclo celular
Tabela A.18: Porcentagem de CTMs, dos pacientes e doadores normais, na diferentes
fases do ciclo celular.
GO-G1
71,79
75,36
89,15
91,56
82,10
63,19
92,17
89,61
Pacientes
G2-M
FaseS
2,73
25,48
0,00
24,64
0,00
10,85
0,00
8,44
4,42
13,48
0,00
36,81
4,50
3,33
4,62
5,77
Doadores Normais
GO-G1
G2-M
Fase S
82,49
7,08
10,43
82,19
5,75
12,05
87,02
6,40
6,59
82,32
6,77
10,91
Apêndice P
198
APÊNDICE P - Expansão das células tronco hematopoéticas
Tabela A.19: Expansão das CTHs após 7 dias de co-cultivo com as CTMs. CTHs de cordão umbilical foram co-cultivadas com as CTMs de doadores
normais e pacientes por 7 dias, na presença ou ausência de citocinas. A seguir, foram enviadas para avaliação da viabilidade celular por
citometria de fluxo. Como controle do experimento, duas amostras foram cultivadas, nas mesmas condições, exceto pela ausência das CTMs
como feeder.
Sem CTM
STC-IC
+
CD34
+
CD34 + Cit
Pacientes
Doadores normais
Teste MannWhitney
s/CTM
s/CTM
DP3
DP6
DP7
DP8
DP10
DP13
DN9
DN11
DN13
DN14
p valor
0,97
1,67
2,42
2,46
3,09
3,16
3,22
4,29
2,83
4,91
2,15
3,64
0,9143
8,47
4,73
7,21
7,36
6,54
6,00
5,72
6,12
7,26
5,32
5,12
4,81
0,1714
* CTM = célula-tronco mesenquimal; STC-IC = do inglês, short-term culture-initiating cell; DP = doador paciente; DN = doadores normais
Tabela A.20: Expansão das CTHs após 28 dias de co-cultivo com as CTMs. CTHs de cordão umbilical foram co-cultivadas com as CTMs de doadores
normais e pacientes por 28 dias, na presença ou ausência de citocinas. A seguir, foram enviadas para avaliação da viabilidade celular por
citometria de fluxo. Como controle do experimento, três amostras foram cultivadas, nas mesmas condições, exceto pela ausência das CTMs
como feeder.
Sem CTM
LTC-IC
+
CD34
+
CD34 + Cit
Pacientes
Doadores normais
Teste MannWhitney
s/CTM
s/CTM
s/CTM
DP3
DP6
DP7
DP8
DP10
DP13
DN9
DN11
DN13
DN14
p valor
1,95
2,00
1,05
5,07
4,40
5,09
3,42
4,51
3,97
3,88
4,68
3,84
4,35
0,4762
7,93
7,35
8,24
7,21
7,42
7,03
7,21
7,80
6,83
6,51
7,74
8,38
7,24
0,1667
* CTM = célula-tronco mesenquimal; LTC-IC = do inglês, long-term culture-initiating cell; DP = doador paciente; DN = doadores normais
Apêndice Q
199
APÊNDICE Q - Expansão das GM-CSF e BFU-E no ensaio de STC-IC
Tabela A.21: Expansão das CFU-GM e BFU-E, após o co-cultivo por 7 dias com CTMs de pacientes e doadores normais, na ausência de citocinas.
Sem CTM
Pacientes
Teste de MannWhitney
Doadores normais
CD34+
s/CTM
s/CTM
DP3
DP6
DP7
DP8
DP10
DP13
DN9
DN11
DN13
DN14
Exp CFU-GM
1,31
2,23
5,77
4,74
5,31
9,67
7,03
10,40
8,90
10,75
3,52
5,60
p = 1,000
Exp BFU-E
0,18
0,32
2,80
1,77
1,34
0,50
1,51
0,38
0,95
3,29
1,43
0,50
p = 0,9143
* CTM = célula-tronco mesenquimal; DP = doador paciente; DN = doadores normais; CFU-GM = do inglês, colony forming unit-granulocyte-monocyte; BFU-E = do inglês,
burst forming unit- erythroid
Tabela A.22: Expansão das CFU-GM e BFU-E, após o co-cultivo por 7 dias com CTMs de pacientes e doadores normais, na presença de citocinas.
Sem CTM
Pacientes
Doadores normais
Teste de MannWhitney
CD34+ + citoc
s/CTM
s/CTM
DP3
DP6
DP7
DP8
DP10
DP13
DN9
DN11
DN13
DN14
Exp CFU-GM
480,32
142,86
293,06
195,88
204,12
291,06
225,56
347,27
271,48
69,51
43,21
41,21
p = 0,0667
Exp BFU-E
135,59
4,20
36,34
38,64
25,91
6,81
15,16
23,25
27,27
33,41
34,27
29,41
p = 0,4762
* CTM = célula-tronco mesenquimal; DP = doador paciente; DN = doadores normais; CFU-GM = do inglês, colony forming unit-granulocyte-monocyte; BFU-E = do inglês,
burst forming unit- erythroid
Apêndice R
200
APÊNDICE R - Expansão das GM-CSF e BFU-E no ensaio de LTC-IC
Tabela A.23: Expansão das CFU-GM e BFU-E, após o co-cultivo por 28 dias com CTMs de pacientes e doadores normais, na ausência de citocinas.
Sem CTM
Pacientes
Doadores normais
Teste MannWhitney
CD34+
s/CTM
s/CTM
s/CTM
DP3
DP6
DP7
DP8
DP10
DP13
DN9
DN11
DN13
DN14
Exp CFU-GM
0.26
0.55
0.00
0.55
0.00
0.57
11.40
0.00
2.87
0.45
6.71
8.10
1.10
p = 0,4762
Exp BFU-E
0.00
0.11
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
10.82
0.00
0.42
NR
* CTM = célula-tronco mesenquimal; DP = doador paciente; DN = doadores normais; CFU-GM = do inglês, colony forming unit-granulocyte-monocyte; BFU-E = do inglês,
burst forming unit- erythroid
Tabela A.24: Expansão CFU-GM e BFU-E, após o co-cultivo por 28 dias com CTMs de pacientes e doadores normais, na presença de citocinas.
Sem CTM
Pacientes
Doadores normais
Teste MannWhitney
CD34+ + citoc
s/CTM
s/CTM
s/CTM
DP3
DP6
DP7
DP8
DP10
DP13
DN9
DN11
DN13
DN14
Exp CFU-GM
36.82
102.09
1114.07
32.56
44.82
0.00
53.60
293.04
131.87
23.79
873.63
1038.96
725.00
p = 0,1714
Exp BFU-E
14.61
74.82
55.68
12.56
31.62
0.00
8.20
40.02
0.00
6.29
88.24
134.45
106.62
p = 0,1143
* CTM = célula-tronco mesenquimal; DP = doador paciente; DN = doadores normais; CFU-GM = do inglês, colony forming unit-granulocyte-monocyte; BFU-E = do inglês,
burst forming unit- erythroid