ÁCIDOS NUCLEICOS INTRODUCCIÓN Los ácidos nucleicos son POLÍMEROS lineales de una unidad respectiva llamada nucleótido, el cual está constituido por: a) Una pentosa ribosa o desoxirribosa b) Una base nitrogenada púrica o pirimídica c) Acido fosfórico La unión de las bases nitrogenadas con la pentosa constituye un nucleósido. Finalmente la unión Ester de un nucleósido con ácido fosfórico se conoce como nucleótido. El DNA es el responsable de la transmisión de los caracteres hereditarios. El DNA está formado por dos cadenas polinucleotícas, enrolladas en espiral a lo largo de un eje común. Las dos cadenas de la doble hélice corren en direcciones opuestas. El esqueleto azúcar fosfato de cada una de las cadenas se encuentran hacia el exterior de la doble hélice y las bases nitrogenadas están en el interior. Las dos cadenas están unidas por Puentes de Hidrógeno establecidos entre las bases. La adenina siempre se unirá con la timina y la guanina siempre se unirá con la citosina. Los puentes de hidrógeno pueden romperse por el calor y por agentes químicos, obteniéndose un DNA desnaturalizado ANALOGÍA 1. AISLAMIENTO DEL ADN 1.1. Homogenizar 2 g de timo de ternera en una licuadora en 25 mililitros de una solución salina 0.15 M más EDTA 01 M pH 8. 1.2. Transferir el homogenizado anterior en una probeta de 100 mililitros y añadir 2 mililitros de detergente aniónico (Laurel Sulfato a (25 %) Mezclar. 1.3. Colocar en baño maría a 60oC durante 10 minutos. 1.4. Añadir 0.3 mililitros de NACI 5 M. Mezclar. 1.5. Añadir solución de cloroformo- alcohol isoamílico (24; 1 v/v) en un volumen igual al obtenido en la etapa anterior; aproximadamente 30 mililitros. Agitar vigorosamente. 1.6. Centrifugar a 10,000 RPM. 1.7. Separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar que el DNA se desnaturalice y colocarlo en una probeta de 100 mililitros. Agregar dos volúmenes de alcohol etílico al 95 %. El alcohol debe añadirse lentamente, mientras que con una varilla de vidrio se trata de enrollar el DNA. 1.8. Colocar la varilla de vidrio en el DNA enrollando en un tubo de prueba y disolverlo en 20 mililitros de solución salina citrato (0.0150.0015M). Dejar en reposo 30 minutos. 1.9. Añadir 2 mililitros de solución acetato de sodio 3 M a pH 7 la cual contiene 0.001 M de EDTA. 1.10. Mezclar con varilla de vidrio, añadiendo simultáneamente gota a gota 0,5 volúmenes de isopropanol para precipitar selectivamente al DNA. Seguir mezclando con la varilla de vidrio tratando de enrollar el DNA. 1.11. Disolver el DNA obteniendo en 20 mililitros de solución salinacitrato. 2. IDENTIFICACIÓN DE DESOXIRRIBOSA: REACCIÓN DE DISCHE. 2.1. Tomar dos tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera: X (Solución de DNA obtenida en la práctica) y C (CONTROL). 2.2. En cada tubo medir lo siguiente: Control Muestra Solución de DNA obtenida en la practica 2.0 ml H2O destilada 1.0 ml Reactivo difenilamina en solución ácida 2.0 ml 2.0 ml 2.3. 2.4. Mezclar el contenido de cada tubo; colocarlos en baño hirviente durante 10 minutos. Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. L a presencia de desoxirribosa se revela por la aparición de un color azul. 3. IDENTIFICACIÓN DE FOSFATO 3.1. 3.2. 3.3. Primero se procederá a hidrolizar el DNA con el objeto de liberar el fosfato, luego se identificará el fosfato mediante una reacción de coloración. Tomar dos tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera: X (Solución de DNA obtenida en la práctica) y C (control) Luego medir lo siguiente: Control Solución de DNA obtenida en la practica H2O destilada Acido perclórico 7.5 M 3.4. 0.5 ml 0.5 ml Muestra 0.5 ml 0.5 ml Colocar en cada tubo un embudo pequeño con una perla de vidrio. Luego colocarlo en baño hirviente durante 30 minutos. Enfriar y proceder a identificar el fosfato inorgánico de la siguiente manera: Contenido del tubo C después de la hidrólisis ácida Contenido del tubo X despues de la hidrólisis ácida H2O destilada Molibdato de amonio al 25% Reactivo reductor (ácido amino naftol sulfurico) Control 0.5 ml 3.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Muestra 0.5 ml 3.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 3.5. Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposo durante 5 minutos. Observar. La presencia de fosfato inorgánico se revela por la aparición de un color azul. 4. DESNATURALIZACIÓN DEL DNA 4.1. Medir en un tubo 5 mililitros de la solución de DNA obtenida en la práctica. Colocar el tubo en baño hirviente durante 15. Enfriar. Medir la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 260 nm. 4.2. Si la solución de DNA desnaturalizada es muy concentrada, diluirla con solución salina. Citrato y determinar nuevamente la absorbancia. 4.3. Comparar la absorbancia obtenida, con la absorbancia de la solución de DNA (nativo) obtenida en la practica. 4.4. Realizando los mismos pasos señalados anteriormente, en una práctica similar a la presente, se obtuvieron los siguientes resultados. 4.5. Longitud de onda en nm. Longitud de onda en nm 320 310 300 290 280 270 260 250 240 230 4.6. Absorbancia del DNA nativo 0.005 0.019 0.025 0.062 0.135 0.205 0.283 0.235 0.175 0.140 Absorbancia del DNA desanturalizado 0.020 0.026 0.038 0.125 0.335 0.520 0.650 0.600 0.420 0.350 En el siguiente espacio coloque el gráfico obtenido con los resultados anteriores, usar papel milimetrado colocando en el eje de las ordenadas las absorbancia y en el de absisas las longitudes de onda tanto para el DAN nativo como para el desnaturalizado en el mismo gráfico. CUESTIONARIO 1) ¿Qué otros tejidos podrían ser utilizados en la presente práctica? ¿Es posible utilizar hematíes humanos? 2) ¿Por qué razón se usan 6,3 mililitros de NACI 5 M en una de las etapas de extracción del DNA? 3) Si luego de la extracción del DNA realizado en la práctica ala leer la absorbancia a 260 nm se obtiene una lectura de l.25 D.O. y al calentarla durante un tiempo considerable, en baño hirviente la lectura es de 1.26 D.O ¿Qué explicación daría Ud? 4) ¿Cuál es el fundamente de la determinación de fósforo usando en la presente práctica? 5) Indique qué otras formas para identificar el DNA aparte de la reacción de Dische conoce Ud. 6) ¿Qué bases se encuentran comúnmente formando la molécula del DNA Y RNA? 7) ¿Qué bases n o comunes se encuentran también en las moléculas de los ácidos nucleicos y particularmente en cuál? 8) ¿Qué importancia cree Ud. Que tiene el hecho de que en el DNA las bases queden en el interior de la doble hélice? 9) ¿Qué tipos de RNA conoce Ud. Dónde se encuentran localizados en la célula? 10) ¿Cuáles son las funciones de los diferentes tipos de RNA? 11) ¿Cuál es el fundamento de la reacción de Dische? 12) Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de la DNA asa II.
