TALLER DE GENÉTICA (Tecnología de ADN Recombinante y Enzimas de Restricción) INTEGRANTES: CARLOS JULIO RODRIGUEZ CARDONA RUTH TATIANA CHACON PRESENTADO A: Prof. ª: TEODORA CAVADIA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS ACUÍCOLAS PROGRAMA DE ACUICULTURA 2012 CUESTIONARIO 1. Enzimas de restricción o endonucleasas de restricción. Son enzimas que catalizan la ruptura de la doble cadena del ADN en secuencias de bases específicas. En la actualidad se diferencian tres tipos de sistemas de restricción y modificación, los tipos I, II y III. Cada sistema incluye dos actividades enzimáticas diferenciadas: una ADN metilasa y una endonucleasa que cataliza una ruptura de doble cadena del ADN. Las endonucleasas con especificidad de secuencia, que son las más utilizadas en biología molecular, son enzimas de tipo II. Tipo I: estas enzimas tienen ambas actividades metilasa y nucleasa en una molécula proteica, que contiene tres subunidades. Una subunidad contiene la nucleasa, otra la metilasa y otra un determinante de reconocimiento de secuencia. Para la ruptura, la enzima se mantiene unida al lugar de reconocimiento, y el ADN forma un bucle hacia fuera a su alrededor, junto con un superenrollamiento. Para que allá ruptura es necesario ATP (se hidrolizan unas 105 moléculas de ATP) y AdoMet (puede ser un activador alostérico). Tipo II: Estas cortan dentro de la secuencia de reconocimiento, con lo que hacen que la ruptura sea específica con respecto a la secuencia. Estas enzimas tiene una metilasa correspondiente, que se une a la misma secuencia de reconocimiento y metila un nucleótido de esa secuencia. Para que allá ruptura es necesario un catión divalente, aquí no se necesita ATP. No todas las nucleasas de tipo II tienen una especificidad de secuencia absoluta. Así, por ejemplo, la HindII reconoce cuatro secuencias de hexanucleótidos diferentes, y algunas enzimas (como la HgaI) rompen en un lugar fuera de la secuencia de reconocimiento. Tipo III: contienen ambas actividades nucleasa y metilasa en una enzima de dos subunidades. Difieres de las de tipo I en que no requieren ATP, modifican tan sólo una cadena del ADN y su lugar de ruptura está muy próximo al lugar de reconocimiento. La capacidad de romper las moléculas de ADN en secuencias cortas conocidas con exactitud abrió el camino a un gran número de técnicas de investigación muy potentes. 2. Tecnología de ADN recombinante. Se entiende por recombinación como el proceso que comparte la formación de un nuevo ADN a partir de moléculas de ADN distintas, de manera que la información genética procedente de cada molécula de ADN original está presente en las nuevas moléculas. PCR ( Reacción en cadena de la polimerasa): Es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Esta técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas. RFLP (polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción): se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción, que varían entre individuos. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción. La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relación genética entre individuos. MICROSATÉLITES: Son secuencias de ADN en las que un fragmento (cuyo tamaño va desde uno hasta seis nucleótidos) se repite de manera consecutiva. La variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos. Generalmente se encuentran en zonas no codificantes del ADN. Son neutros, co-dominantes y poseen una alta tasa de mutación, lo que los hace muy polimórficos. A pesar de esto, la variabilidad que presentan útil para su uso como marcadores moleculares, es respecto al número de repeticiones, no de la secuencia repetida. Un microsatélite esta típicamente conformado por un motivo repetitivo, en el cual se encuentra contenido la secuencia repetida, y dos regiones flanqueantes, las cuales se encuentran a ambos lados del motivo repetitivo. Sin embargo en algunos casos, puede haber dos motivos repetitivos o más dentro de un microsatélite. Los microsatélite se clasifica de acuerdo al número de nucleótidos que posea el motivo de repetición como: mono, di, tri, tetra, penta o hexanucleótidos. La clasificación también incluye el patrón de orden de los motivos: Puro o perfecto: Un solo motivo repetido n veces en serie. ej: (AC)9. Puro interrumpido: Un solo motivo repetido n veces, donde se intercalan nucleótidos entre las distintas repeticiones. ej: (CA)2AA(CA)12. Compuestos: Dos o más motivos repetidos en serie. ej: (GT)2(TG)10 Compuestos interrumpidos: Al menos uno de sus motivos presenta nucleótidos intercalados. ej: (CT)4(GT)2CTAT(GT)15. Complejos: Combinaciones entre cualquiera de las clases anteriores, sin ningún patrón de orden definido. ej: (ACC)8+TG+(GA)12+(TTA)5+GC+(TTA)4. Son utilizados como marcadores moleculares en una gran variedad de aplicaciones en el campo de la genética como parentescos y construcción de mapas de ligamiento más completos y detallados; así como la identificación de genes de interés (QTL´s). TRANSGÉNESIS: Se conoce como el proceso de transferir genes en un genoma diferente. La transgénesis se usa actualmente para hacer plantas y animales transgénicos. Este tipo de tecnología permite modelar enfermedades humanas en otras especies donde se puede estudiar la biología y posibles terapias para la enfermedad. 3. Que es la electroforesis La electroforesis es una técnica de separación de una mezcla de moléculas orgánicas. Los fragmentos de DNA pueden ser separados por medio de esta técnica. El DNA se “siembra” en un extremo de una cuba que contiene una matriz porosa en forma de gel. Al aplicar una corriente eléctrica a través de esa matriz, las moléculas de DNA, que están cargadas negativamente, se desplazan hacia el polo positivo. La velocidad con la que los fragmentos de DNA se mueven en el gel por acción del campo eléctrico es inversamente proporcional a su tamaño. Los fragmentos luego pueden ser purificados y usados para su estudio y/ o manipulación. La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN recombinan-te ya que nos permite saber la carga que poseen los polipeptidos, y separar los diferentes polipeptidos resultantes de las variaciones del experimento del adn recombinante. La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. 4. Compare y contraste las características de los plasmidos, el bacteriófago y los cosmidos como vectores. Cuáles son las ventajas del plasmido Ti como vector para introducir genes en las células de las plantas. Las moléculas de ADN plasmídico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los plásmidos no tienen proteínas asociadas. El gen a ser replicado se inserta en copias de un plásmido el cual contiene genes que hacen células resistentes a un antibiótico en particular. En el paso siguiente el plásmido es insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transformación. Luego, la bacteria es expuesta a un antibiótico particular. Solo la bacteria que toma copias del plásmido sobrevive al antibiótico debido a que el plásmido lo hace resistente. En particular, los genes protectores son expresados (usados para hacer proteína) y la proteína expresada evita la acción del antibiótico. De esta forma, los antibióticos actúan como un filtro que seleccionan únicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas en largas cantidades, cosechadas y el plásmido de interés puede ser aislado El bacteriófago: Los fagos cumplen un papel de gran importancia en la biología molecular al ser utilizados como vectores de clonación para insertar ADN dentro de las bacterias y obtener como resultado bibliotecas genómicas. Hay una biblioteca de búsqueda de fagos específicos y sus usos terapéuticos en el Instituto Tbilisi, en la República de Georgia. La terapia fágica ha sido utilizada desde la década de 1940 en la ex Unión Soviética como una alternativa a los antibióticos para tratar infecciones bacterianas, ya que eliminar bacterias es lo que los fagos hacen mejor. El desarrollo de cepas bacterianas resistentes a múltiples drogas ha conducido a investigadores en medicina a reconsiderar a los fagos como una alternativa al uso de antibióticos. Los cosmidos como vectores: Realmente un cósmido consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago, el fago λ. Un cósmido contiene: Del plásmido, el ori C y un gen de resistencia a un antibiótico, esto depende del tipo de plásmido del cual derive y, por tanto puede contener más segmentos como por ejemplo el gen LacZ, que permite la selección blanco/azul de las colonias u orígenes de replicación para fagos como el M13, que permiten la obtención de ssDNA usado para aplicaciones como la secuenciación del inserto. Del fago λ, los extremos COS, extremos complementarios del genoma del fago y que se emplean para la recircularización del mismo. Estos vectores facilitan el trabajo porque permiten el empaquetamiento in vitro de las secuencias entre dos extremos COS y usar los fagos empaquetados para transfectar cepas de E. coli, consiguiendo un plásmido en la bacteria, ya que el cósmido se recirculariza al entrar gracias a los extremos COS. La capacidad de Agrobacterium para transferir genes a las plantas se ha explotado en ingeniería genética para la creación de plantas trangénicas. Pueden utilizarse plásmidos Ti modificados El plásmido se desarma eliminando los genes que inducen el tumor. Las únicas partes esenciales del ADN-T son dos pequeñas repeticiones (25 pares de bases) en los extremos, por lo menos una de las cuales es necesaria para la transformación de la planta. Marc Van Montagu y Jozef Schell en la universidad de Gante (Bélgica) descubrieron el mecanismo de transferencia de genes entre Agrobacterium y las plantas, que permiten el uso de esta bacteria en ingeniería genética. Un equipo de investigadores dirigido por Maria-Dell Chilton demostró que podían eliminarse los genes de virulencia sin afectar a la capacidad de la bacteria para insertar su propio ADN en el genoma de la planta (1983). Los genes que se desea introducir en la planta son clonados en la región ADN-T del plásmido desarmado, junto con un marcador seleccionable (tal como la resistencia antibiótica) que será usado para seleccionar a las plantas que han sido modificadas con éxito. Después de la modificación, se hace crecer a las plantas en un medio que contiene el antibiótico, de forma que las que no tienen el ADN-T integrado en su genoma morirán. Un método alternativo es la agroinfiltración. La modificación genética mediante Agrobacterium se puede realizar de dos formas. Una consiste en la incubación de protoplastos u otros tejidos de la planta con la bacteria y la posterior regeneración de las plantas completas. Otra forma (común para modificación de Arabidopsis se denomina "floral dipping": las flores se sumergen en un cultivo de Agrobacterium, y la bacteria transforma las células de la línea germinal que producen los gametos femeninos. Agrobacterium no infecta a todas las especies de plantas, pero se han desarrollado otras técnicas eficaces para la modificación genética de la plantas tales como la biobalística. 5. Suponga que desea localizar en el cromosoma el gen que codifica una péquela molécula de proteinina y tiene la capacidad técnica para sintetizar una molécula de ARNm mensajero artificial con cualquier secuencia de nucleótidos que usted elija, ¿cómo haría para localizar el gen? Suponga que desea separar el gen del resto del cromosoma. ¿Cómo procedería? Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen en un genoma era como encontrar una aguja en un pajar. Si tuviéramos que realizar dicha tarea, probablemente usaríamos un imán para atraer la aguja (siempre y cuando esta sea de metal y posea propiedades magnéticas). De manera análoga, hoy día podemos encontrar genes o proteínas usando, respectivamente, sondas y anticuerpos, que actúan como imanes moleculares. Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la región de ADN o ARN que queremos encontrar. Contienen alguna “marca” que permite revelar su unión (hibridación) a la secuencia elegida y de esa manera revela presencia de la región buscada. Las sondas pueden ser “coloreadas” durante su síntesis utilizando nucleótidos marcados con isótopos radiactivos. Otra manera de marcarlas es mediante la unión con una molécula que pueda ser detectada posteriormente como fluorescente, un marcador químico que puede ser detectado por un anticuerpo, o una enzima cuya actividad produce el cambio de color de su sustrato. Una de las técnicas más empleadas para localizar fragmentos determinados del genoma (o la expresión de algún gen en particular por medio de la detección de la presencia de su correspondiente ARNm) es la hibridación in situ. Durante este proceso se incuba el ADN con una sonda (de ADN o ARN) complementaria a la secuencia buscada, y marcada radiactiva o químicamente. La sonda “navega” por el interior de la célula hasta encontrar una secuencia complementaria a ella. Una vez que esto ocurra se formará una doble cadena que permitirá no sólo detectar la presencia de esta secuencia, sino indicar el lugar específico que ocupa dentro de la célula. Si se tratara de un fragmento de un cromosoma, nos permitiría saber su localización exacta o locus. Para revelar la presencia de hibridación de la sonda, la muestra debe exponerse a una placa radiográfica; en el caso de las sondas marcadas químicamente se procede a su revelado mediante el uso de moléculas fluorescentes o que puedan ser detectadas por colorimetría (utilizando una enzima que provoque el cambio de color de un sustrato). Se puede también utilizar colonias de bacterias con ADN recombinante con una técnica similar, pero que usa anticuerpos en vez de sondas. Se comienza por una colonia de bacterias que contengan y expresen el gen de ADNc. Luego se trata las bacterias con un anticuerpo marcado, que se unirá a la colonia que sintetice la proteína deseada. De esta manera se puede localizar el gen en cuestión y clonarlo para obtener múltiples copias. 6. Porque el ADN polimerasa utilizada en la PCR debe ser termoestable El PCR (reacción de cadena polimerasa) Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. BIBLIOGRAFIA Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K. y Watson J. Biología Molecular de la Célula, Tercera Edición, Omega, 1996. Curtis H. y Barnes N. S. Biología, Quinta Edición, Editorial Médica Panamericana,1993. Van Holde M. Bioquimica, 3a ed, omega, 1996.
