BIORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE MICROORGANISMOS (YERSINIA ENTEROCOLITIS, ESCHERICHIA COLI) BIORREMEDIATION OF SOILS CONTAMINATED WITH HYDROCARBONS THROUGH THE USE OF MICROORGANISMS (YERSINIA ENTEROCOLITIS, ESCHERICHIA COLI) Chávez Q. Cristian J1, Chiclla D. Hirwin S.2, Huamani C. Rovista3, Huayca I. Roberth G.4, Sequeiros S. Marcia5, Sueldo H. Emerson W.6, Vílchez A. Jordán G7. Laboratorio Físico - Químico. Facultad de Ingenierías. Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental y Recursos Naturales. Universidad Tecnológica de los Andes. Contaminación y Recuperación de Aguas. Junio 2019 RESUMEN Hoy en día los microorganismos se utilizan como una alternativa de solución a la contaminación del suelo, consiste principalmente en el uso de los microorganismos (bacterias) para descomponer o degradar sustancias peligrosas convirtiéndolas en sustancias de caracteres menos tóxicos o inocuos para el ambiente. El trabajo de investigación tiene por objetivo utilizar microorganismos aislados, obtenidos de las muestras: heces de gallo, suelo estancado, carne. Identificando las especies de microorganismos con capacidad degradativa en hidrocarburos usados en el parque automotor (gasolina, petróleo y aceites lubricantes“ en nuestra ciudad de Abancay. El trabajo de investigación se realizó en el laboratorio de microbiología de la facultad de Ingeniería Ambiental de la Universidad Tecnológica de los Andes. Donde se aislaron tres grupos microbianos (yersinia enterocolitis y escherichia coli, proteus), con los que se realizó los ensayos biológicos mediante la prueba de sensibilidad para determinar los parámetros óptimos de crecimiento y capacidad degradativa de estos microorganismos en el laboratorio. En el ensayo de biodegradación del “aceite lubricante residual de automotriz”, de los tres grupos de microorganismo aislados presentando diferentes comportamientos de reacción como HALOS DE INHIBICIÓN con el contaminante. Palabras claves: biorremediación, bacterias, degradar, hidrocarburos, biodegradación. ABSTRACT The objective of this bioremediation work is based mainly on the use of microorganisms (bacteria) to decompose or degrade dangerous substances and convert them into substances of less toxic or environmentally friendly character. The objective of this research work is to use the microorganisms, the results of the samples: rooster feces, stagnant soil, meat. Identify the species of microorganisms with degradative capacity in "lubricating oil used in the vehicle fleet" in our city of Abancay. The research work was carried out in the microbiology laboratory of the Faculty of Environmental Engineering of the Technological University of the Andes. Where three microbial groups were isolated, with which the bioassays were made by the sensitivity test to determine the optimal growth parameters and the degradation capacity of these microorganisms in the laboratory. In the biodegradation test of the "automotive residual lubricating oil", of the three microorganism groups we present different reaction behaviors such as INHIBITION HALUES with the contaminant. Keywords: bioremediation, bacteria, degrade, hydrocarbons, biodegradation. 1. Introducción: Uno de los problemas ambientales más importantes en la actualidad es la contaminación de ecosistemas terrestres y acuáticos por derrames de petróleo y sus derivados. En el caso del suelo, las principales consecuencias ambientales que se presentan después de un evento de contaminación por hidrocarburos y sus derivados son; la reducción o inhibición del desarrollo de la cobertura vegetal del lugar del derrame, cambios en la dinámica poblacional de la fauna y la biota microbiana y contaminación por infiltración de cuerpos de agua subterráneos. Además del impacto ambiental negativo, los derrames de hidrocarburos generan impactos de tipo económico, social y de salud pública en las zonas aledañas al lugar afectado (Pardo y col., 2004). En los ecosistemas terrestres, el suelo representa el medio físico que sustenta la vida de diversas especies, tanto animales como vegetales. La materia orgánica e inorgánica del suelo da cabida a la coexistencia de una gran cantidad de microorganismos que se adaptan a sus características físicas y químicas aun cuando estas sean variables. Los microorganismos tienen una gran importancia ecológica en los sistemas terrestres, pues cumplen la función de descomponer sustancias orgánicas de desecho en sus componentes básicos, los cuales se metabolizan junto con los nutrientes obtenidos del suelo, para generar nueva biomasa y llevar a cabo sus funciones vitales (Pardo y col., 2004). Los hidrocarburos y sus derivados, como el aceite lubricante, está constituido por un conjunto de moléculas formados principalmente por carbono e hidrógeno con contenidos menores de otros elementos como azufre, oxígeno, nitrógeno o trazas de metales, dependiendo del lugar de origen. Los incidentes de contaminación pueden ser remediados mediante eventos naturales que ocurren en el medio contaminado, por ejemplo; en los suelos se presentan procesos de atenuación natural que viene a ser la capacidad de los suelos para degradar cantidades de sustancias orgánicas; estos procesos están ligados a actividades metabólicas de microorganismos -proceso denominado biorremediación-, pero también se presentan procesos físicos y químicos tales como; lavado, volatilización, fotodescomposición, hidrólisis, entre otros(Pardo y col., 2004). Algunos accidentes que han supuesto un elevado impacto ambiental como el vertido de combustibles, la liberación de productos radiactivos o la rotura de la presa, han puesto de manifiesto la justificada preocupación y alarma que estos temas suscitan en el conjunto de la población y lo mucho que queda por hacer para prevenir y finalmente resolver adecuadamente ese tipo de situaciones. Al iniciar la investigación, observamos que el aceite lubricante es uno de los contaminantes importantes en los suelos de los talleres de reparación de motores y en suelos de los grifos y establecimientos que venden aceites lubricantes situados en nuestra localidad, especialmente en zonas de reparación de motores y de uso de maquinarias, debido a que el aceite lubricante está relacionado con la generación de energía y usado en todo tipo de motores, ocurren derrames accidentales y provocados, cuyos autores vienen a ser el personal que trabaja en los talleres, con el pretexto de impermeabilizar el suelo al interior de los talleres de reparación de motores, los establecimientos de venta y las zonas aledañas de este modo evitar la polvareda. Esta situación no constituye un problema ambiental focalizado, sino que el aceite lubricante puede infiltrarse y contaminar los cuerpos de agua subterráneos (Martín y col., 2004). En esta situación se hace indispensable la aplicación de tratamientos de biorremediación a bajo costo y que sean accesibles. La biorremediación es una herramienta efectiva para mejorar la degradación de contaminantes en suelos. El uso de microorganismos aislados de los suelos contaminados con aceite lubricante y magnificados en condiciones de laboratorio, pueden constituir una ayuda importante para acelerar el proceso de descomposición y degradación de los aceites lubricantes vertidos en suelos. 2. Parte experimental 2.1. Instrumentos y equipo Se utilizó placas Petri de vidrio tapa 100x15mm Anumbra y plástico, tubos de ensayo con tapones, probetas burckle, matraz Brand, balanza analítica balanza, analítica Poiner Modelo Kern ABJ-320, guantes de cuero, pinzas, cocina eléctrica, estufa Esterilizadora MEMMERT modelo UNB 200, mechero bunsen, incubadora, refrigeradora indurama, papel filtro, papel aluminio ultrafoil, papel filtro#40 whatman de absorción rápida, papel kraft, pabilo. 2.2. Reactivos y muestras Los medios utilizados fueron enriquecidos: Agar sangre y Agar endo; medios funcionales: TSI (triple sugar iron agar), simmons citrato agar y LIA (lysine iron agar); bacterias derivadas de las heces de ave, suelo estancado y 3. Resultados y Discusión: carne de res, también se tomó 2 muestras de hidrocarburos (gasolina y petróleo) y una muestra de aceite quemado. 2.3. Procedimiento Esterilización y desinfectados: todos los instrumentos a utilizar tienen que esta previamente desinfectados (lejía) y esterilizados (115°c para vidrios por 120 minutos y 85°c para el papel filtro por 45 minutos) para eliminar todo organismo que altere nuestro estudio trazado. Preparación de medios: para la preparación de medios de cultivos: Agar Sangre, Agar endo, Citrato, LIA, TSI. Una vez preparados y dosificado los medios en placas y tubos se forraron con papel kraft, se ataron con pabilo y se llevara al refrigerador por 24 horas. Siembra de muestras: Se tomó un inoculo de cada muestra (heces, suelo y carne) y se procedió a sembrar por estría en las placas de agar sangre y endo, posteriormente se llevó a la incubadora a 37° por 24 horas Reconocimiento de bacterias: las colonias existentes en las placas se reconocieron y posteriormente se eligió una colonia aislada, para la identificación de la bacteria, nos apoyamos de los medios diferenciales (estos deben estar inoculadas con las colonias aisladas), con una tabla se procedió a identificar los microorganismos (yersinia enterocolitis y escherichia coli, proteus) Método de sensibilidad: cada bacteria se esparció con un hisopo en toda la placa de agar, luego se tomó los discos hechos con papel filtro y se mezcló con las muestras de aceite quemado, gasolina y petróleo, para después ponerlas encima de las bacterias con el agar. Se llevó a incubar por 16 a 24 horas a una temperatura de 37°. TABLA 1. Resultado 1. Prueba de sensibilidad de las bacterias y los hidrocarburos a descomponer (petróleo, gasolina, aceite de motor) utilizando los siguientes parámetros descompone (+), no descompone (-). N.º Muestra Medio de cultivo Gasolina Petróleo aceite 01 Heces de gallo Agar sangre ± ± + 02 Carne Agar endo ± ± + 03 Agua estancado Agar sangre ± ± + TABLA 2. Resultado 2. Identificación de microorganismos obtenidos de muestras (heces de gallo, aguas estancadas, carne) mediante medios diferenciales. A: acido: cambia de color k: alcalino: no cambia de color N.º MUESTRA TSI LIA CITRATO Genero 01 Heces de gallo K/A K/A -/+ PROTEUS/ECHERICHA COLI 02 Carne A/A K/K - ECHERICHA COLI 03 Agua estancada A/A K/A - YERSINIA ENTEROCOLITIS(se descartó) BACTERIAS: ORDEN FAMILIA CLASE GENERO Enterobacteriales Enterobacteriaceae Gammaproteobacteria Yersinia Todas las Yersinia poseen lipopolisacáridos (bacterias Gram negativas) con actividad endotoxica (componente esencial de las gran negativa) y antígenos de envoltura celular bacteriana llamada fracción I, una proteína que se produce a 37ºC, tiene propiedades antifagocitaria y activa el complemento. El antígeno V-W es producido por las cepas virulentas de Y. pestis y codificado por genes plasmídicos. Y. pestis también produce catalasa a baja temperaturas (28ºC y no 35ºC), endotoxinas bloqueadores beta adrenérgicos y cadriotóxicos en animales, y bacteriocina, una pesticina que lisa bacterias de otras especies. ORDEN FAMILIA CLASE GENERO Enterobacteriales Enterobacteriaceae Gammaproteobacteria Escherichia coli Escherichia coli pertenece a las entero bacterias, las colibacterias son bacilos rectos generalmente flagelados periticos y, por tanto, móviles. Pueden multiplicarse tanto en condiciones aerobias como anaerobias y son fácilmente cultivables en medios nutritivos sencillos. Son Bacilo Gram negativo, No forma esporas, llega a medir 0.5 µ de ancho por 3 µ de largo, reducen nitratos a nitritos y producen vitamina B y K. ORDEN FAMILIA CLASE GENERO Enterobacteriales Enterobacteriaceae Gammaproteobacteria Proteus La estructura antigénica está compuesta por antígeno somático O, flagelar H y superficial K. El antígeno flagelar H contribuye a la capacidad invasora de las vías urinarias. La variante X del antígeno somático O está presente en algunas cepas de P. mirabilis. Otros grupos antigénicos definidos son el OX2, OX19 y OXK. El grupo OX19 (y a veces el grupo OX2). 4.Conclusiones: 1. Los tres grupos de microorganismos obtenidos, se aislaron a partir de muestras (eses de gallo, suelos estancados y carne), realizando ensayos de biodegradación en el laboratorio de microbiología utilizando un método denominado “prueba de sensibilidad” durante un periodo de 3 días de incubación en los hidrocarburos(aceite quemado, gasolina y petróleo) evidenciando diferentes reacciones de comportamiento significativo, se eligió este grupo microbiano (yersinia enterocolitis y escherichia coli, proteus) y continuar con la investigación por la mayor tendencia degradativa del contamínate de los hidrocarburos. 2. Los resultados de las condiciones operativas de cultivo más propicias fueron soluciones enriquecidas (AGAR SANGRE, AGAR ENDO) y medios funcionales (TSI, CITRATO Y LIA), temperatura y PH, para lo cual se busca mecanismos, técnicas y condiciones adecuadas para el cultivo en los suelos contaminados para la degradación de estos contaminantes, las capacidades de degradación de estos microorganismos (yesenina, escheruicha coli, proteus) son lentas, pero eficientes de acuerdo a las condiciones operativas que se emplea. 3. El uso de microorganismos (yersenina, eschericha coli, proteus) en la biorremediación de suelos representa una alternativa de solución para reducir la contaminación generada por residuos peligrosos y recuperación de zonas impactadas producidos por el uso de hidrocarburos y derivados en el parque automotor, teniendo una mala disposición final y manejo inadecuado de estos residuos en los talleres mecánicos de la av. Panamericana de nuestra ciudad de Abancay, con este trabajo de investigación se trata de buscar una solución frente a este problema a de contaminación de suelos empleando in situ para demostrar la capacidad degradativa de este grupos de microorganismos. 5. Agradecimiento: Agradecer a nuestros padres por todo su apoyo incondicional que nos brindan para salir adelante también agradecer a la Mag. Anjhela Rosa Callo Mamani por sus enseñanzas, sabiduría y por todo el esfuerzo que hace para que nosotros podamos aprender más sobre el curso de recuperación y tratamiento de suelos. Agradecer de manera especial y sincera a la profesora Elena Gonzales por asesorarnos para realizar este trabajo de investigación bajo su dirección. Su apoyo y confianza en nuestro trabajo y su capacidad para guiar nuestras ideas ha sido un aporte invaluable. Agradecer también por avernos facilitado siempre los medios suficientes para llevar a cabo todas las actividades propuestas durante el desarrollo de este trabajo de investigación Muchas gracias. 6. Referencias: Suess, M. J. 1976. La carga ambiental y el ciclo de los hidrocarburos aromáticos policíclicos. Sci. Total. Environ.6: 239-250. Abalos, A., A. Pinazo, R. Infante, M. Casals, F. Garcia y M. A. Manresa. 2001 Propiedades físico-químicas y antimicrobianas de los nuevos ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa AT10 a partir de desechos de la refinería de aceite de soja. Langmuir 17: 1367-1371.