Identificación de genes en enfermedades

PASOS PARA IDENTIFICAR EL GEN
REPONSABLE DE UNA ENFERMEDAD
HUMANA.
1. Mediante estudio de pedigree (estudio de familias numerosas con individuos
afectados, sanos, portadores, etc...) para determinar si:
a) La enfermedad es autosómica o X-linked.
b) La enfermedad es dominante o recesiva.
2. Una vez localizado el cromosoma sobre el que está mapado el gen, habrá que
localizar la región exacta del coromosoma para una posterior secuenciación.
a) Localizar un RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) que
segregue junto con el gen con una elevada frecuencia, para utilizarlo en un posterior
“clonaje posicional directo” como “primer” para la PCR.
Establecer si un gen y un RFLP segregan o no juntos, se hace mediante estudios de
distancia genética. Esto es, en el estudio de pedigree se establecen los recombianates
para dicho RFLP y el gen de interés y si la frecuencia de recombnación resulta muy
baja, es decir, el gen y el RFLP no distan lo suficiente como para dar lugar a muchas
recombinaciones entre ellos, consideraremos el RFLP adecuado. La distancia
genética, se calcula mediante estadística, nº de recom/nº total.
Puede que el RFLP segregue con el gen, pero aun así, diste muchísimo de éste
mismo. En este caso, el “clonaje posicional directo” no nos sirve, necesitamos otro
método; “el clonaje posicional a saltos”, el cual en este caso no nos interesa.
3. Clonaje posicional directo.
a) Crear un primer artificial homologo al RFLP que hemos localizado anteriormente,
y utilizarlo como iniciador par la PCR. Someter el DNA a una PCR con dicho primer
y clonar una secuencia lo suficientemente larga como para contener en un interior al
menos una secuencia única. Hibridar esta secuencia nueva con una librería genómica
(hoy en día esto está a la orden dado que el genoma humano ha sido secuenciado casi
por entero).
b) Describir la secuencia hibridada y localizar en su parte terminal una secuencia
única que pueda ser utilizada como primer en la siguiente PCR.
c) Repetir los pasos “a” y “b” hasta creer que hemos topado con una secuencia
codificante.
4. Cómo reconocer una secuencia codificante?
Aquí es donde entra en juego la biología molecular evolutiva. Es aquí donde los
biólogos evolutivos, deben comparar con otros organismos cercanos en la evolución
la existencia de secuencias homólogas. Las secuencias codificantes suelen tener un
alto grado de conservación.
5. Tipificar mutantes.
a) Una vez localizado el gen objetivo, hay que secuenciar tanto el gen sano, como los
diversos (si los hay) genes mutantes.
b) Comparar mediante lectura simple si hay algún tipo de variación entre ambas
secuencias (y hay más secuencias mutantes, caracterizarlas todas).
6. Estudio en organismos modelo.
Si es posible, el gen de interés puede ser inserido en un organismo modelo (D.
melanogaster o C. elegans) y estudiados sus efectos, su proteína, su mutantes y sus
síntomas, etc..