Guía 22 ESTUDIOS GENÉTICOS EN LA DISFUNCIÓN REPRODUCTIVA. DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTATORIO. CONSEJO PRECONCEPCIONAL. Autores: Llácer J, Bernabéu A, Bernabéu R. Centro: Instituto Bernabéu. Alicante. INTRODUCCIÓN Los factores genéticos constituyen una de las causas más habituales de fallo reproductivo. En los últimos años, avances tecnológicos en Biología Molecular y Genética han hecho factible acceder a niveles de conocimiento, respecto a la carga cromosómica, impensables hasta hace poco, acompañado de un descenso importante en los costes, haciéndolos mucho más accesibles para las parejas. Esto ha posibilitado que las parejas con problemas genéticos, no solo puedan conocer su pronóstico sino también evitar o disminuir el riesgo de tener niños afectos con enfermedades severas. Al mismo tiempo, dichas técnicas de diagnóstico genético preimplantacional pueden mejorar la efectividad de los tratamientos de fertilización in vitro. Por todo lo anterior, un adecuado consejo genético resulta fundamental para el manejo individualizado de cada caso y la toma de decisiones por parte de la pareja y el equipo que la trata. ESTUDIOS GENÉTICOS EN LA DISFUNCIÓN REPRODUCTIVA Estudios genéticos en el varón con disfunción reproductiva (Tabla I) Tabla I. Indicaciones de los test genéticos en el varón con disfunción reproductiva. Cariotipo Azoospermia no obstructiva Indicado Oligozoospermia severa Indicado Oligozoospermia leve Controvertido Esterilidad de origen desconocido Controvertido Aborto de repetición Indicado Microdelecciones del cromosoma Y Azoospermia no obstructiva Oligozoospermia severa Oligozoospermia leve Indicado Indicado No indicado Mutaciones del Gen de la Fibrosis Quistica Agenesia bilateral de deferentes Agenesia de deferentes con malformación renal asociada Agenesia unilateral de deferentes Obstrucción bilateral de epididimos Azoospermia no obstructiva Indicado No indicado Aborto de repetición Fallo de implantación en FIV Factor masculino severo Controvertido Controvertido Controvertido FISH en espermatozoides Indicado Indicado Controvertido 1. Cariotipo. La prevalencia de alteraciones cromosómicas es mayor en varones infértiles. La probabilidad de encontrar una alteración en el cariotipo es inversamente proporcional al recuento de espermatozoides pudiendo observarse en el 10-15% de los varones con azoospermia, 5% en los individuos con oligozoospermia severa (< 5 millones por ml) y <1% en varones con recuentos normales. El síndrome de Klinefelter es sin duda la alteración cromosómica más frecuentemente encontrada, constituyendo el 69% de las alteraciones citogenéticas en varones infértiles. Su diagnóstico precoz es fundamental para preservar espermatozoides que en ocasiones se llegan a formar durante la adolescencia. Las alteraciones estructurales, translocaciones recíprocas o rebertsonianas, constituyen el 24% de las alteraciones cromosómicas encontradas en varones con azoospermia u oligozoospermia severa. Teniendo en cuenta la probabilidad de encontrar alteraciones cromosómicas significativas, se recomienda la realización de un cariotipo a los varones con azoospermia no obstructiva y oligozoospermia severa (<5 mill/ml). Aunque en general los estudios realizados no han apreciado un incremento de las alteraciones cromosómicas, tanto numéricas como estructurales, en varones infértiles con recuento de espermatozoides normales o con oligozoospermia leve, otros trabajos si han apreciado un incremento en la incidencia, por lo que su realización podría estar indicada sobretodo en parejas con esterilidad de origen desconocido. En aproximadamente un 5% de las parejas con abortos de repetición, uno de los progenitores es portador de una alteración cromosómica balanceada, siendo las más frecuentes las translocaciones tanto recíprocas como robertsonianas. La realización de un cariotipo está indicada en los varones de las parejas con abortos de repetición. Se recomienda la realización de un cariotipo a los varones con azoospermia no obstructiva, oligozoospermia severa (<5 mill/ml), a los varones de las parejas con abortos de repetición y podría estar indicado en parejas con esterilidad de origen desconocido. 2. Estudio de Microdelecciones del cromosoma Y Se ha observado un incremento en la incidencia de microdelecciones del cromosoma Y (delecciones demasiado pequeñas para ser detectadas con el cariotipado convencional) en varones infértiles con azoospermia u oligozoospermia severa. Aunque su incidencia varía ampliamente de unos estudios a otros (1-16%) su determinación resulta de gran importancia tanto para un adecuado consejo genético como para un factor pronóstico en la obtención de espermatozoides en caso de azoospermia. La mayoría de microdelecciones clínicamente relevantes se encuentran en el brazo largo del cromosoma Y concretamente en la región Yq11 conocida como AZF. En dicha región se encuentran tres zonas AZFa (proximal), AZFb (central) y AZFc (distal) que contienen genes necesarios para la espermatogénesis como por ejemplo el gen DAZ en la región AZFc. Dependiendo de la zona afectada puede haber un significado clínico distinto. Microdelecciones en AZFc suelen cursar con oligozoospermia severas o en otros casos azoospermia aunque con posibilidades de tener áreas de espermatogénesis conservada en el testículo y por tanto permitir la obtención de espermatozoides aptos para ICSI tras extracción mediante biopsia o punción testicular. Las microdelecciones que afectan a amplias zonas de las regiones AZFa y AZFb cursan con azoospermia con muy escasas posibilidades de encontrar zonas de espermatogénesis conservada en los testículos. Por otra parte es necesario realizar un adecuado consejo genético a los pacientes afectos de microdelecciones del cromosoma Y, ya que tras la realización de ICSI, el 100% de los hijos varones nacidos estarán afectos de dichas alteraciones genéticas siendo potencialmente infértiles. Se recomienda la realización de test para la detección de microdelecciones del cromosoma Y en varones afectos de azoospermia no obstructiva u oligozoospermia severa. Las microdelecciones en AZFc suelen tener áreas de espermatogénesis conservada en el testículo testículo y por tanto permitir la obtención de espermatozoides aptos para ICSI tras extracción mediante biopsia o punción testicular. 3. Estudio de las mutaciones del gen de la Fibrosis quística. Existe una estrecha relación entre la azoospermia obstructiva causada por la agenesia bilateral de deferentes y la presencia de mutaciones del gen de la fibrosis quística (FQ). Casi todos los varones afectos de FQ tienen agenesia de deferentes y los afectos de agenesia de deferentes son portadores de alguna mutación de la FQ en el 80% de los casos. Por tanto el estudio de mutaciones del gen de la FQ debe realizarse a todos los varones afectos de agenesia de deferentes. Dado que son más de mil las mutaciones que afectan a este gen tan largo, y los test diagnósticos no evalúan más que las 50 más frecuentes, la pareja debe ser estudiada y en caso de ser positivo para alguna mutación realizar un estudio completo del gen en el varón y posteriormente un adecuado consejo genético. Si la agenesia de deferentes forma parte de un cuadro malformativo de la vía renal, estos varones tendrán un riesgo similar a la población general de presentar mutaciones en el gen de la FQ y por tanto no estaría indicado el estudio. Las mutaciones del gen de la FQ están también aumentadas con respecto a la población general en varones con azoospermia con agenesia unilateral de deferentes u obstrucción bilateral de epidídimos por lo que el screening de mutaciones estaría indicado en estos pacientes. El estudio de mutaciones del gen de la FQ debe realizarse a todos los varones con azoospermia obstructiva causada por la agenesia bilateral de deferentes, agenesia unilateral de deferentes u obstrucción bilateral de epidídimos. 4. Estudio de aneuploidías en espermatozoides (FISH en espermatozoides) Mediante técnicas de hibridación in situ fluorescente podemos detectar aneuploidías de un número limitado de cromosomas, habitualmente hasta 7 en el espermatozoide. Se ha descrito mayores porcentajes de aneuploidías en espermatozoides de varones infértiles con cariotipos normales. También un incremento de embriones aneuploides en los casos de varones con aumento de aneuploidías en los estudios de FISH en espermatozoides. Nuestro grupo reportó que la incidencia de aneuploidías en blastocisto de 5 días en ovodonación, era el doble cuando el FISH del varón estaba alterado. Los casos con mayor riesgo de presentar un elevado porcentaje de espermatozoides con aneuploidías en el estudio FISH son los afectos de alteraciones morfológicas seminales, fallo repetido de implantación y aborto de repetición. Su uso es controvertido por las dificultades para establecer unos valores de corte estandarizado así como la evaluación adecuada del riesgo para estas parejas y por tanto su influencia en la toma de decisiones. Podría estar recomendado realizar un FISH en espermatozoides a los varones afectos de alteraciones morfológicas seminales, fallo repetido de implantación y aborto de repetición. Pero su uso es aún controvertido por las dificultades para establecer unos valores de corte estandarizado así como la evaluación adecuada del riesgo para estas parejas y por tanto su influencia en la toma de decisiones. Estudios genéticos en la mujer con disfunción reproductiva (Tabla II) Tabla II. Indicaciones de los test genéticos en la mujer con disfunción reproductiva. Cariotipo Fallo ovárico precoz Indicado Esterilidad de origen desconocido Controvertido Aborto de repetición Indicado Estudio de premutación del Fallo ovárico precoz gen FMR1 Indicado 1. Cariotipo. Existe una relación clara entre las alteraciones cromosómicas y la esterilidad femenina por fallo ovárico. Entre el 10 y el 15% de las mujeres con fallo ovárico precoz tienen alteraciones numéricas o estructurales en el cariotipo y algunas en mosaico. En más del 90% de los casos, dichas alteraciones afectan al cromosoma X siendo con mucho la más frecuente el síndrome de Turner seguido por alteraciones estructurales del cromosoma X y translocaciones entre un cromosoma X y un autosoma. Por tanto la realización de un cariotipo en mujeres con fallo ovárico precoz, aporta una información útil para el manejo clínico de las pacientes y la realización de un consejo genético adecuado. En algunos trabajos publicados, se ha constatado un aumento de las alteraciones cromosómicas en mujeres con problemas de esterilidad por lo que se ha propugnado la realización de un cariotipo a todas las mujeres que consultan por este problema siendo esta indicación controvertida. Aproximadamente en un 5% de las parejas con abortos de repetición, uno de los progenitores es portador de una alteración cromosómica balanceada, siendo las más frecuentes las translocaciones tanto recíprocas como robertsonianas. .Por ello, el cariotipo está indicado en mujeres con abortos de repetición. Se debe realizar un cariotipo a las mujeres con fallo ovárico precoz y con abortos de repetición. Algunos trabajos publicados propugnan la realización de un cariotipo a todas las mujeres que consultan por problemas de esterilidad, siendo esta indicación controvertida. 2. Estudio de Premutación del Síndrome X-Frágil. El síndrome X-Frágil es causa frecuente de retraso mental y su causa genética es una mutación conocida como expansión de repeticiones de trinucleótidos. En este caso se trata de la expansión del triplete CGG en la región 5’ del gen FMR1 localizado en el brazo largo del cromosoma X concretamente en la región Xq27.3. Habitualmente el número de repeticiones es variable entre 5 y 50. Si este número de repeticiones es superior a 200 se produce una disfunción del gen que condiciona las características fenotípicas del síndrome. Cuando el número de repeticiones se sitúa entre 50 y 200, aunque los individuos no muestran las características del síndrome, hablamos de premutación ya que esta situación puede condicionar descendencia con un número de repeticiones mayor de 200 y por lo tanto individuos afectos. Además de las consecuencias que puede acarrear para la descendencia, la presencia de la mutación produce dos alteraciones distintas del síndrome de XFrágil. El primero es un síndrome neurológico de aparición tardía caracterizado por temblor y ataxia conocido como síndrome FXTAS. La segunda alteración es el fallo ovárico precoz. Las mujeres portadoras de la premutación son diagnosticadas de fallo ovárico precoz en 13-26% de los casos. Cuando la mujer es diagnosticada de fallo ovárico, encontramos la mutación entre el 1-7% de los casos, siendo más alta la incidencia (13%) en mujeres con historia familiar de fallo ovárico precoz. El estudio de la premutación del Síndrome de X-Frágil está indicado en mujeres con fallo ovárico precoz dado que su diagnóstico implica no sólo el consejo genético a la afecta sino también para sus familiares. DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL (DGP) El término Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP), hace referencia a la extracción y posterior análisis genético de núcleos procedentes del ovocito (corpúsculos polares) o del embrión (blastómeras o células del trofoectodermo) con el objetivo de seleccionar los embriones que posteriormente serán transferidos al útero. Esta técnica se lleva realizando con éxito desde 1990, cuando uno o ambos miembros de la pareja son portadores de una mutación genética o una alteración cromosómica balanceada, con el objetivo de investigar si la mutación o una dotación cromosómica no balanceada ha sido transmitida a los ovocitos o embriones. El DGP también se ha utilizado para intentar mejorar los resultados de la FIV cuando los progenitores son cromosómicamente normales. Durante años se ha indicado en pacientes de edad avanzada, factor masculino severo, fallo implantatorio y abortos de repetición. Los ovocitos o embriones son analizados con el fin de detectar aneuploidías y por tanto transferir al útero embriones con dotación cromósomica euploide. A esta técnica se le ha denominado Diagnostico Genetico Preimplantacional con Screening de Aneuploidias (DGP-SA). EL DGP está principalmente indicado cuando uno o ambos miembros de la pareja son portadores de una mutación genética o una alteración cromosómica balanceada. Otras indicaciones son: pacientes de edad avanzada, factor masculino severo, fallo implantatorio y abortos de repetición para intentar mejorar los resultados de la FIV (DGP-SA). Realización de la biopsia embrionaria. Los trabajos publicados en los últimos años han constatado beneficios en la realización de la biopsia en células del trofoectodermo del blastocisto sobre la biopsia del corpúsculo polar o la de una blastómera en estadio de células en el tercer día de cultivo embrionario. El beneficio fundamental es la viabilidad posterior del embrión. En un trabajo con diseño adecuado, se demostró una disminución significativa de la probabilidad de implantación del 39% en los embriones biopsiados en D3 mientras la tasa de implantación de los embriones biopsiados en D5 no se vio afectada. Aparte de este beneficio fundamental, la biopsia de trofoectodermo permite una mayor precisión diagnóstica al disponer de un número mayor de células aumentando considerablemente los embriones con diagnóstico y disminuyendo el impacto en el resultado provocado por los mosaicismos. El inconveniente fundamental es la reducción del tiempo de diagnóstico para la transferencia en fresco y por tanto la obligación en muchos casos de la congelación embrionaria y la segmentación del ciclo. Esto constituye un problema menor teniendo en cuenta las altas tasas de supervivencia e implantación obtenidas con la vitrificación de embriones en estadio de blastocisto y la posible mejoría en las condiciones endometriales en las transferencias fuera de la estimulación ovárica. En cualquier caso, la aplicación de nuevas técnicas de estudio cromosómico embrionario permiten tener el resultado en menos de 24 horas y por tanto la realización de la transferencia embrionaria en el día 6º de cultivo sin necesidad de congelación. La realización de la biopsia del primer corpúsculo polar tiene limitaciones añadidas dado su bajo poder predictivo, la alta tasa de resultados no informativos y la exclusión del genoma paterno en la contribución de aneuploidías. Su uso estaría limitado a la obtención de informatividad en embriones procedentes de progenitores con mutaciones “de novo”. Teniendo en cuenta la influencia de múltiples factores, cada laboratorio debería diseñar su propio protocolo en función de los resultados en el programa de cultivo hasta blastocisto y de supervivencia e implantación tras vitrificación de embriones. El beneficio fundamental de la biopsia en células del trofoectodermo del blastocisto es la viabilidad posterior del embrión y que, además, permite una mayor precisión diagnóstica al disponer de un número mayor de células, aumentando considerablemente los embriones con diagnóstico y disminuyendo el impacto en el resultado provocado por los mosaicismos. DGP en portadores de enfermedades monogénicas El diagnóstico preimplantacional constituye una alternativa en las parejas portadoras de enfermedades monogénicas para evitar el nacimiento de un niño afecto o la interrupción de un embarazo cuando el diagnóstico se establece de forma prenatal. La dificultad del procedimiento reside fundamentalmente en lo limitado del material disponible para su realización, bien un solo núcleo en el caso de biopsia de corpúsculo polar o blastómera o varias células en el caso de biopsia de trofoectodermo. Otra dificultad de la técnica es la limitación en el tiempo para establecer un diagnóstico antes de la transferencia embrionaria aunque en la actualidad los resultados en la criopreservación de embriones pueden permitir la realización de la biopsia en estadio de blastocisto y la emisión de un diagnostico tras varios días o incluso semanas sin merma en las posibilidades de éxito. Resulta fundamental la realización de un estudio previo a la pareja e incluso a otros miembros de la familia para determinar la técnica de forma personalizada. Es lo que se denomina “estudio de informatividad” y debe realizarse siempre antes del inicio de la estimulación ovárica. La técnica para la amplificación del ADN debe determinarse previamente, así como los controles adecuados para detectar el fallo de amplificación en uno de los alelos (ADO), lo cual llevaría a la emisión de falsos negativos. Cuando la mutación a estudiar se encuentra localizada en el cromosoma X, es posible determinar el sexo en el embrión para evitar el nacimiento de varones afectos. Esta práctica debe limitarse a los casos en los que no es posible la detección específica de la mutación para evitar desechar embriones varones sanos y la transferencia de embriones femeninos portadores. DGP en portadores de translocaciones. Las parejas en las que uno de sus miembros está afecto de una translocación balanceada recíproca o robertsoniana, tienen un alto riesgo de producir embriones no balanceados (con exceso o defecto de material genético) condicionados a no implantar, producir un aborto o en el peor de los casos al nacimiento de un niño con graves anomalías si son alteraciones no letales. La realización de un DGP en este tipo de pacientes se ha realizado de forma clásica con la utilización de técnicas de hibridación in situ (FISH) con sondas específicamente diseñadas para cada una de las translocaciones. En la actualidad las técnicas de screening cromosómico completo (CGH) detectan pérdidas y ganancias con una sensibilidad y especificidad mucho mayor que el FISH por lo que su uso se ha generalizado. DGP-SA. Screening de aneuploidías. El DGP-AS fue postulado por primera vez por Munne en 1993 y desde entonces su uso se ha extendido como técnica para mejorar los resultados en la FIV en pacientes con alto riesgo de generar embriones aneuploides. Actualmente según el órgano de seguimiento creado por la ESHRE ”PGD consortium” los casos realizados con DGP-SA constituyen más del 60% de los tratamientos con DGP. Desde su introducción ha sido utilizado y recomendado para las siguientes indicaciones: 1. 2. 3. 4. Edad materna avanzada Fallo repetido de FIV. Fracaso de Implantación. Aborto de repetición Factor masculino severo. Sin embargo su introducción en la práctica clínica y posterior generalización de su uso no fue precedida de estudios prospectivos y aleatorizados. En los trabajos bien diseñados publicados con posterioridad y su metaanálisis posterior, evidenciaron tasas de recién nacido significativamente peores en las pacientes a sometidas a DGP-SA. Las razones esgrimidas para explicar tan desalentadores resultados fueron: 1. Afectación de la viabilidad embrionaria tras la biopsia 2. Mosaicismos. El diagnóstico de una sola célula no siempre era representativo del resto del embrión. 3. Estudio limitado a un número reducido de cromosomas 4. Dificultades de la técnica utilizada (FISH) con alto % de embriones sin diagnóstico. Desde hace unos años se han introducido cambios significativos en la técnica que reducen los problemas que justificarían los malos resultados del DGP-SA. La realización de la biopsia embrionaria en trofoectodermo como se ha mencionado anteriormente parece menos lesiva para el embrión, aumenta considerablemente el material para el diagnóstico y disminuye la presencia de mosaicismos con una alta correlación de los resultados con respecto a los obtenidos en el análisis de la masa celular interna. El desarrollo de técnicas que permiten el estudio de todos los cromosomas (screening cromosómico completo) mediante la amplificación del DNA y posterior análisis automatizado, aumentan la seguridad diagnóstica disminuyendo considerablemente el número de embriones sin diagnóstico. Estudios randomizados y controlados han demostrado que el DGP-SA es capaz de seleccionar embriones con alta capacidad implantatoria evitando transferencias de embriones destinados a no implantar o a producir abortos. Atendiendo a estas circunstancias, la tendencia actual es a generalizar su aplicación como método de selección embrionaria. En la actualidad, su uso, tanto en pacientes con indicaciones clásicas como en parejas no seleccionadas, es controvertido. La realización de la biopsia embrionaria en trofoectodermo parece menos lesiva para el embrión, aumenta considerablemente el material para el diagnóstico y disminuye la presencia de mosaicismos. El desarrollo de técnicas que permiten el estudio de todos los cromosomas, aumenta la seguridad diagnóstica, disminuyendo considerablemente el número de embriones sin diagnóstico. Su uso, tanto en pacientes con indicaciones clásicas como en parejas no seleccionadas, es controvertido. CONSEJO GENÉTICO El consejo preconcepcional genético consiste en el asesoramiento sobre el riesgo de una determinada entidad patogénica a la descendencia, teniendo en cuenta la causa y la herencia, así como los test existentes, pronóstico, manejo médico y las opciones terapéuticas y/o preventivas de las que se disponen en la actualidad. En muchas ocasiones, supondrá también el estudio de otros miembros de la familia, en especial a aquellos que se encuentren en fase reproductiva. El objetivo final del asesoramiento es permitir la toma de decisión del paciente con respecto al riesgo de una determinada enfermedad a su descendencia, con una información clara y teniendo en cuenta sus valores y creencias personales. En cualquier caso, es fundamental el asesoramiento correcto pre y post-test de las pruebas a realizar, así como el seguimiento psicológico de estas parejas. Idealmente, un abordaje individualizado permitirá una mejor decisión autónoma del paciente. Las causas tributarias a un asesoramiento genético reproductivo se consideran, en general, las siguientes: - Edad materna mayor o igual a 35 años. - Parejas con problemas reproductivos y fallos repetidos en tratamientos de reproducción asistida. - Factor masculino severo. - Progenitor portador de alguna condición genética determinada, como hemofilia, fibrosis quística, translocación cromosómica equilibrada, etc. - Antecedente de un hijo previo o historia familiar de retraso mental, defecto de tubo neural, cardiopatía, alteración cromosómica, alteraciones genéticas puntuales como atrofia medular espinal,…y otros defectos que puedan tener una implicación genética. - Antecedente de múltiples pérdidas gestacionales: abortos de repetición, óbito fetal y/o muerte neonatal. - Parejas con alto riesgo de alteraciones genéticas basada en su historia familiar y/o médica personal. - Personas pertenecientes a determinados grupos étnicos o geográficos que presenten una predisposición superior a ciertas enfermedades como TaySachs, talasemia,… - Factores maternos tales como esquizofrenia, alcoholismo, depresión, diabetes,… en donde existe alteraciones fetales asociadas a la enfermedad materna en sí o a la toma de fármacos prescritos para el tratamiento de tales enfermedades. - Exposición fetal o de alguno de los progenitores a agentes potencialmente teratógenos como drogas, químicos, radiación o infecciones. - Consanguineidad. - Screening en el primer trimestre de alto riesgo para defectos de tubo neural y aneuploidía fetal. La asociación entre genética e infertilidad es cada vez más nítida. El conocimiento de las causas genéticas de las parejas con problemas reproductivos nos aportará un mayor conocimiento de las pruebas genéticas a realizar, del diagnóstico de la infertilidad, y por tanto, un mayor éxito en los tratamientos de reproducción asistida y en el objetivo de un hijo sano en casa. A medida que progresemos en el conocimiento entre ambas disciplinas, resultará imprescindible una mayor discusión en relación a qué procesos resultarán clínica y éticamente aceptables, así como su regulación. Las Guías de Práctica Clínica de la SEF y de la SEGO pretenden contribuir al buen quehacer profesional de todos los ginecólogos, especialmente de los más alejados de los grandes hospitales y clínicas universitarias. Presentan métodos y técnicas de atención clínica aceptadas, contrastadas y utilizadas por especialistas en cada tema. Estas guías no deben interpretarse de forma rígida ni excluyente, sino que deben servir para la atención individualizada a las pacientes. No agotan todas las posibilidades, ni pretenden sustituir a los protocolos ya existentes en los Departamentos y Servicios Hospitalarios. Bibliografía: Allingham-Hawkins, D. J. et al. Fragile X premutation is a significant risk factor for premature ovarian failure: the International Collaborative POF in Fragile X study-preliminary data. Am. J. Med. Genet. 83, 322–325 (1999). Stegen, Ç., Van Rumste, M. M. E., Mol, B. W. J. & Koks, C. a M. The value of chromosomal analysis in oligozoospermic men. Fertil. Steril. 98, 1438–1442 (2012). Foresta, C., Garolla, A., Bartoloni, L., Bettella, A. & Ferlin, A. Genetic abnormalities among severely oligospermic men who are candidates for intracytoplasmic sperm injection. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 152–156 (2005). Scott, R. T. et al. 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