División Ciencias de la Vida Campus Irapuato-Salamanca XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010 Guanajuato, Gto. DETERMINACIÓN DE SULFONAMIDAS EN MÚSCULO DE BOVINOS SACRIFICADOS EN RASTROS TIPO INSPECCIÓN FEDERAL (TIF) EN NUEVO LEÓN, MÉXICO, POR MEDIO DE LA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC). Lazcano Villarreal J.L. a*, Wong González A. b*, Roig Sagués A. X. b, Pérez Fernández B. b, Moreno Degollado G. c, Cantú Martínez M. A. c , Zarate Ramos J.J. c , Avalos Ramírez R c , Aguirre Ramos Ac. , Dávalos Aranda G. c. a*, b*c Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UAN.L Ave Francisco Villa s/n Ex - Hacienda el Canadá C.P. 66050 General Escobedo N.L, México. b Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Universidad Autónoma de Barcelona, Bellaterra 8193 (Cerdanyola del valle) Campus de la UAB edificio B, Barcelona España. jlazcanovi@hotmail.com RESUMEN: Los residuos de Sulfonamidas en la carne de animales tratados representan un riesgo para la salud de los consumidores. El objetivo fue determinar la presencia de Sulfapiridina, Sulfatiazol, Sulfametazina y Sulfadimetoxina, en músculo de bovino por la técnica de HPLC. El análisis se realizó a partir de 28 muestras de músculo de bovinos de 28 lotes de 100 animales cada uno, sacrificados en dos rastros Tipo Inspección Federal, provenientes de 15 municipios del Estado de Nuevo León México; las Sulfonamidas después de la adición del estándar interno fueron extraídas con acetato de etilo, y separadas dentro de un buffer de glicina. Después de una limpieza con hexano, la fase acuosa fue extraída evaporada y recuperada, posteriormente se le adicionó fluorescamina. Las condiciones del equipo fueron: volumen de inyección 50µl, temperatura de la columna 30ºC, λ Excitación del detector 405 nm, λ Emisión del detector 495 nm, columna de cromatografía, Luna ODSLC-18. La fase móvil estuvo constituida en forma de gradiente por ácido acético 62%, 15%, 62% acetonitrilo 38%, 85%, 38% hasta los 17 min., a un flujo constante de 2 ml/min.El resultado obtenido fue que el 100% de las muestras analizadas resultaron negativas a los estándares de las cuatro Sulfonamidas por el método de HPLC. Las concentraciones detectadas variaron de 0.005-0.01ppm. 0.1ppm ABSTRACT: Sulfonamides residues in meat from treated animals have a health risk to consumers. The objective was to determine the presence of sulfapyridine, sulfathiazole, sulfamethazine and sulfadimethoxine in bovine muscle by HPLC. The analysis was performed by HPLC, from 28 samples of muscle from cattle of 28 batches of 100 animal each, two abattoirs Federal Inspection Type, from 15 municipalities in the State of Nuevo Leon, Mexico; the Sulfonamides after addition internal standard were extracted with ethyl acetate, and separated in a glycine buffer. After cleaning with hexane, the aqueous phase was extracted evaporated and recovered, then was added fluorescamina. The conditions of the equipment team were: injection volume 50µl, column temperature 30 º C, λ excitation detector 405 nm, λ emission detector 495 nm, column chromatography, Luna ODSLC-18. The mobile phase was set up as a gradient of acid Acetic 62%, CA33 1 División Ciencias de la Vida Campus Irapuato-Salamanca XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010 Guanajuato, Gto. 15%, 62% acetonitrile 38%, 85%, 38% to 17 min., a constant flow of 2 ml / min.The result was that 100% of the samples were negative to the standards of the four Sulfonamides by the HPLC method.The detected concentrations ranged from 0.005-0.01ppm. Official Mexican Standard establishes the Maximum Residue Limit (MRL) is 0.1ppm. Palabras clave: Detección, Sulfonamidas, HPLC. INTRODUCCIÓN Las Sulfonamidas se han usado en animales productores de alimentos, para promover su crecimiento y/o con fines terapéuticos y profilácticos (Bordier, et al., 2007). Tras la administración parenteral u oral de Sulfonamidas se producen residuos en carne, leche de mamíferos y en huevos de aves (Cancho Grande, et al., 2000; Repetto y Camean, 2005). Sin embargo se ha limitado su empleo debido a que los residuos de Sulfonamidas encontrados en algunos animales, son cancerígenos (Pérez, 2004; Yarén et al., 2007). En México desde 1984 se estableció un Programa Nacional de Control de Residuos Tóxicos, Biológicos y Contaminantes en tejidos animales para consumo humano, cuyo responsable es la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca, éste sólo ha tenido un avance importante en el análisis y control de estos residuos en carne. En México la normatividad sobre la presencia de residuos tóxicos en alimentos aún está incompleta, lo que impide garantizar plenamente la calidad sanitaria de los alimentos (Pérez, et al., 2004). En lo que respecta a México, se emitió la Norma Oficial Mexicana (NOM) NOM004-Z00-1994. Modificada en el 2001 de residuos tóxicos en la que se especifican límites máximos permisibles y procedimientos de muestreo de grasa, hígado, músculo y riñón en aves, bovino, caprino, cérvido, equino, ovino y porcino. Así también en la NOM-0011-ZOO-1994. Titulada determinación de Sulfonamidas en hígado y músculo de bovinos, ovinos, equinos, porcinos y aves por cromatografía capa fina densitometría para la determinación de Sulfadimetoxina (SDM), Sulfapiridina (SPY), Sulfametazina (SMZ) y Sulfatiazol (STZ). La técnica también es aplicable a las siguientes Sulfonamidas: Sulfadiazina, Sulfametoxipiridazina, Sulfamerazina, Sulfacloropiridazina, Sulfaquinoxaleína, Sulfafenazol, Sulfaetoxipiridazina, Sulfatroxazol, Sulfisoxazol y Sulfadoxina, con límites máximos de residuos de Sulfonamidas en hígado y músculo de 0.100 ppm (Anónimo, 1994). El Programa de Control de Residuos en Productos Pecuarios de Chile realizo en el 2004 un estudio sobre residuos de sustancias Grupo B Sulfonamidas (Sulfatiazol, Sulfadiazina, Sulfamerazina, Sulfametazina, Sulfadimetoxina, Sulfaquinoxalina) en bovinos en matriz de músculo donde se utilizo el método de cromatografía liquida de alta resolución Fluor (HPLC) (Anónimo, 2004). El objetivo del presente trabajo es determinar la presencia de Sulfapiridina, Sulfatiazol, Sulfametazina y Sulfadimetoxina, en músculo de bovino por le técnica de HPLC. CA33 2 División Ciencias de la Vida Campus Irapuato-Salamanca XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010 Guanajuato, Gto. METODOLOGÍA Toma de muestras El muestreo se realizó al azar, de acuerdo al sistema de número aleatorios indicado en el apéndice C de la NOM-004-1994, modificada en 25 de abril 2001. Se recolectaron 28 muestras de músculo de 28 lotes con un promedio de 100 bovinos cada uno, de 2 rastros TIF, procedentes de 15 municipios del Estado de Nuevo León, México. Para la preparación de los tejidos posteriormente se tomaron 200g de músculo, se molieron y homogenizaron individualmente. Los tejidos se identificaron y se almacenaron en recipientes adecuados y se refrigeraron a una temperatura de -10 ºC para su posterior análisis por HPLC. Descripción de los procedimientos analíticos De las muestras almacenadas se pesaron 2.5g +/- 0.05 de tejido. Por cada serie de muestras, se preparo un blanco de cristalería, un blanco de reactivos, un tejido blanco y las recuperaciones. Así mismo se utilizaron estándares de cuatro Sulfonamidas SPY, STZ, SMZ, SDM, de pureza certificada (U.S. Pharmacopea, Rockville, MD, EEUU) seguidamente se preparo la solución stock, se peso por separado en matraces volumétricos aproximadamente 100 ml de 0.1 mg de cada sulfonamida y se llevo a volumen con acetona, posteriormente se pipetearon 2 ml de la solución stock de STZ de 1000 µg/ml y 1 ml de solución stock de 1000 µg/ml de SMZ y SDZ en un matraz volumétrico de 100 ml y se llevo a volumen con la solución de buffer de fosfatos 0.2M. Para obtener una concentración de 20 µg/ml de STZ y 10 µg/ml de SMZ y SDZ (concentración 1), posteriormente se realizaron las diluciones correspondientes para obtener las siguientes concentraciones 10 µg/ml de STZ y 5.0 µg/ml de SMZ y SDZ (concentración 2), 5µg/ml de STZ y 2.5 µg/ml de SMZ y SDZ, (concentración 3), 2.5 µg/ml de STZ y 1.25 µg/ml de SMZ y SDZ (concentración 4). En el caso de SPY por ser el estándar interno (SI) se peso 1ml de la solución de SPY de la solución de 1000 µg/ml en un matraz volumétrico de 100 ml se llevo a volumen con la solución de buffer de fosfatos 0.2M para tener una concentración de 10µg/ml. Posteriormente se preparo la dilución correspondiente para obtener una concentración de 5.0 µg/ml. Se fortificaron las muestras con 100 µl de estándar interno SPY para tener una concentración en matriz de 0.020 ppm. Se preparo una curva de estándares fortificando las muestras de tejido blanco con 100 µl de cada una para tener una concentración en matiz de: Concentración 1, 0 .08, ppm de STZ - 0.04 ppm de SMZ, SDM Concentración 2, 0.04 ppm de STZ - 0.02 ppm de SMZ, SDM. Concentración 3, 0.02 ppm de STZ - 0.01 ppm de SMZ, SDM Concentración 4, 0.01 ppm de STZ - 0.005 ppm de SMZ, SDM Esto calculado en base a 2.5 g de tejido. Las recuperaciones se fortificaron de acuerdo a los diferentes niveles cada estándar excepto sulfapiridina. CA33 3 División Ciencias de la Vida Campus Irapuato-Salamanca XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010 Guanajuato, Gto. El análisis de residuos de Sulfonamidas se realizo por HPLC, a partir de músculo; las Sulfonamidas después de la adición del estándar interno fueron extraídas con acetato de etilo, y fueron separadas dentro de un buffer de glicina. Después de un ajuste de pH y una limpieza con hexano, la fase acuosa fue extraída con diclorometano, evaporada y recuperada con un buffer de acido acético. Posteriormente se le adicionó fluorescamina para ser cuantificada por el detector de fluorescencia. En el presente estudio se utilizó un cromatógrafo de líquidos de alta resolución modelo 9012 marca Varian™, a una temperatura de 30 ºC, con una columna econosférica de octadecilsiliano (ODSL C18) de 5 µm de tamaño de partícula, con una longitud de 25 cm y 4.6 mm de diámetro interno (Cía Phenomenex, Torrance, CA, EEUU), así como un detector de fluorescencia marca Pro Star a una λ Excitación del detector 405nm y una λ Emisión del detector de 495 a un volumen de inyección de 50 µl/min. Este sistema se conectó a una computadora equipada con un Software Star Cromatography y Worksation System Control Versión 552. Calibración del sistema Para la calibración del sistema se utilizaron diferentes condiciones cromatográficas en cuanto a variaciones en el flujo que fluctuaron 0.2 a 2 ml/min., volumen de inyección de 20 a 50 µl, y las proporciones de la fase móvil (Acido acético 15 a 77%, Acetonitrilo 23 a 85 %, temperatura de 22 a 55º C y el tiempo de corrida de 20 a 60 minutos. Curvas de calibración del sistema (sin matriz) Para la curva de calibración del sistema se inyectaron 50 µl de la soluciones de las estándares de las Sulfonamidas reconstituidos a las concentraciones de: 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0624 ppm para SMZ y SDM, y para el caso de STZ las concentraciones fueron al doble y de 1 ppm para SPY por ser el estándar interno. La fase móvil estuvo constituida por Acido Acético (AC) al 2%, Acetonitrilo (AN) en forma de gradiente iniciando con un 62% AC y un 38% AN, manteniéndose hasta los 10 minutos, seguidamente a los 11 minutos se cambió a 15% de AC y un 85% de AN, manteniéndose hasta los 16 minutos. Finalmente a los 17 minutos se cambió a 62% AC y un 38% de AN hasta los 20 minutos, a un flujo constante de 2.0 ml/minutos. Curva de calibración con matriz Se corrieron las curvas de calibración con matriz fortificando las muestras de tejido blanco con las concentraciones de: 0.04, 0.02, 0.01, 0.005 ppm para SMZ y SDM y al doble de concentración para STZ. Como también SPY a una concentración de 0.020 ppm por se el estándar interno. Estas concentraciones se calcularon en matriz tomando en cuenta 2.5 g de músculo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Como resumen del proceso de optimización del método propuesto en la Tabla 1 se muestran los valores y parámetros óptimos del método Condiciones del Equipo Velocidad de flujo 2.00 ml/min. CA33 4 División Ciencias de la Vida Campus Irapuato-Salamanca XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010 Guanajuato, Gto. Volumen de inyección Temperatura de la columna λ Excitación del detector λ Emisión del detector Columna de cromatografía Fase Móvil 50µl. 30ºC 405 nm 495 nm Phenomenex Luna ODSLC18 (25cm, 4.6mm, 5µm) Acido acético al 2%, Acetronilo (15: 85) Programa de Gradiente de la fase móvil Tiempo (min.) Acido Acetonitrilo acético (%) % Flujo Constante Inicio 62 38 2 ml/min. 10 62 38 11 15 85 16 15 85 17 62 38 Tabla 1.- Valores y parámetros óptimos del método Los valores y parámetros obtenidos en la optimización del método de este estudio son similares a los utilizados por (Posyniak et al., 2002) en el análisis de residuos de Sulfonamidas por HPLC en miel. Además se determinaron los tiempos de retención para las cuatro Sulfonamidas estudiadas los cuales se pueden observar en la Tabla 2 Sulfonamida Sigla Tiempo de retención (Minutos) Sulfapiridina SPY 7.418 Sulfatiazol STZ 7.876 Sulfametazina SMZ 8.656 Sulfadimetoxina SDZ 13.330 Tabla 2.-Tiempo de retención para cada Sulfonamida en la columna HPLC En el perfil cromatográfico (Figura 2) se puede observar la separación de las cuatro Sulfonamidas analizadas con una buena resolución, bajo las condiciones experimentales descritas anteriormente. Figura 2.- Perfil cromatográfico de los estándares de las cuatro Sulfonamidas Curvas de calibración con matriz CA33 5 XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS División Ciencias de la Vida Campus Irapuato-Salamanca Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010 Guanajuato, Gto. La linealidad de la respuesta se comprobó a partir de cuatro concentraciones fortificadas y la curva de calibrado se estableció considerando la altura de los picos. (Relación de la altura del pico del analito entre la altura del pico del SI. En función a la concentración del analito). Se calcularon los coeficientes de y = 8.9268x determinación de (R2 ) y la ecuación de las curva obteniéndose valores 0.9903,1.0, R² = 0.9903 0.9978 (Figura 3) los resultados anteriores indican que la curva tiene un Sulfametazina y = 1.464x 0.0456 comportamiento lineal y directamente proporcional, con una baja dispersión de 10 5 R2 = 1 valores. Estos parámetros son satisfactorios ya que debe ser mayor o igual que 0.995 aunque pueden encontrarse entre 0.980 y 0.990 según el analito (FAO Sulfadimetoxina 5 2005). y = 1.1737x + 0.1609 a)50 Sulfametazina Sulfatiazol b) 0 0 2 R² = 0.9978 Lineal… Sulfadimet… 4 0 c) 0 2 4 Figura 3.- Curva de calibración de: a) Sulfatiazol, b) Sulfametazina, c) Sulfadimetoxina. Reproducibilidad del método La reproducibilidad por este método fue aceptable ya que el coeficiente de variación fue inferior al 20 % y los porcentajes de recuperación en los tejidos analizados en las diferentes concentraciones se presentaron dentro de los rangos de recuperación aceptables, entre el 70 y 120 %. Así mismo los resultados obtenidos en las recuperación se encuentran entre del 67 al 114 %, en el caso de Sulfatiazol 67.80 %, la homogeneidad es menor por factores no determinados. Los resultados obtenidos en las recuperaciones en este estudio son mayores a los reportados por (Pérez, 1999). Quien reporto un 71% para Sulfatiazol y 74.2% para Sulfadimetoxina aunque posiblemente esto es debido a que estos autores utilizaron un método diferente de HPLC con arreglo de diodos. Exactitud Los porcentajes de desviación estándar y los porcentajes de recuperación, observados en este método fueron aceptables. Esto es interesante ya que cualquier concentración detectada y/o cuantificada por este método advierte la presencia de residuos de sulfonamidas en músculo de bovino. Para demostrar la aplicabilidad del método desarrollado en muestras reales se preparo una curva con cuatro concentraciones para realizar el análisis de 28 muestras de músculo de bovinos de 28 lotes de 100 animales en promedio cada uno, sacrificados en 2 rastros TIF. Las muestras provenían de 15 municipios del Estado de Nuevo León, México. Los resultados fueron negativos para la detección de residuos de Sulfapiridina, Sulfatiazol, Sulfametazina, Sulfadimetoxina en las 28 muestras analizadas. Los resultados obtenidos en este estudio son similares a los reportados por Pérez, 1999, en el cual analizo 48 muestras con resultados negativos por el método HPLC arreglo de diodos CONCLUSIONES CA33 6 División Ciencias de la Vida Campus Irapuato-Salamanca XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010 Guanajuato, Gto. De acuerdo a la metodología seguida y las condiciones de trabajo para la técnica de HPLC que se empleo en el presente trabajo es posible la detección de Sulfonamidas con límites de detección de 0.01ppm en el caso de Sulfatiazol y de 0.005ppm para Sulfametazina , Sulfadimetoxina y Sulfapiridina. En el estudio realizado no se encontraron residuos inferiores ni superiores del LMR de las cuatro Sulfonamidas en las muestras analizadas de músculo de bovino en el Estado de Nuevo León, México Por otra parte, en un estudio anterior de control de residuos tóxicos y contaminantes en alimentos de origen animal por el método HPLC realizado en México, se encontraron 2 muestras positivas en 262 muestras de músculo de bovino y 4 muestras positivas en 300 muestras de músculo de porcino por encima del límite de tolerancia de 0.100 mg/Kg a Sulfametazina (Anónimo, 2007a). En forma similar, en Chile, de 112 muestras analizadas, 111 resultaron negativas y solo una positiva con un limite de detección de 0.05 ppm (Anónimo, 2004). De acuerdo a los resultados obtenidos, se sugiere ampliar el número de muestras, así como el cambiar el tipo de rastros para la obtención de las muestras, ya que en los rastros TIF se llevan a cabo un estricto control sanitario. REFERENCIAS Anónimo. 1994. 02 de febrero de 1995. Norma Oficial Mexicana NOM-011-ZOO1994. Determinación de sulfonamidas en hígado y músculo de bovinos, ovinos, equinos, porcinos y aves por cromatografía capa fina-densitometría.3-8 Disponible en: http://www.cmp.org/NORMAS/NOM-011-ZOO-1994. Anónimo. 2001. 25 abril 2001. Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM004-ZOO-1994, Grasa, hígado, músculo y riñón en aves, bovino, caprino, cérvido, equino, ovino y porcino. Residuos tóxicos. 3-6. Disponible en: http://www.sagarpa.gob.mx/ganaderia/NOM/m004zoo.pdf Anónimo. 2004. Resultados del programa de Control de residuos en Productos Pecuarios. 6-7. Disponible en: http://www2.sag.gob.cl/Pecuaria/bvo/marzo_mayo_2005/articulos/resultados_2004 _programa_control_residuos.pdf Anónimo, 2007a. Programa mexicano de monitoreo y control de residuos tóxicos y contaminantes en alimentos de origen animal 2007 y resultados del 2006. 6-23 Disponible en: http://senasicaw.senasica.sagarpa.gob.mx/portal/html/inocuidad_agroalimen taria/inocuidad_acuicola/inocuidad_acuicola.html Bordier, MC., DE Morán, JA., Navarro AE., Gómez, MI. 2007. Preparation and Physicochemical Properties of Iron (III) Salt of the N1-Acetyl Sulfanilamide. 18, 2. 77-82. Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S071807642007000200012&lng=en&nrm=iso CA33 7 División Ciencias de la Vida Campus Irapuato-Salamanca XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010 Guanajuato, Gto. Cancho Grande, B.,MS., García Falcón J., Simal Gandara. 2000. El uso de antibióticos en la alimentación animal: perspectiva actual. Cienc. Tecnol. Aliment, 3:39-47. Pérez JA. de Ciriza, A. Huarte, I. Saiz, MT. Ozcáriz, MT. Purroy. 1999. Residuos de sustancias inhibidoras en carnes. Disponible en: http://www.cfnavarra.es/salud/anales/textos/vol22/suple3/pdf/26resi.pdf Pérez, B. 20 de julio 2004. La detección de residuos farmacológicos en los alimentos. Disponible en: http://www.consumaseguridad.com/ciencia-y-tecnologia/2004/07/20/13468.php Pérez, Flores NA., Vega, LS., Gutiérrez., TR., Días, GG., Monroy, HC., Coronado, HM. 2004. Residuos de medicamentos veterinarios plaguicidas y órgano fosforados en leche y derivados. Disponible en: http://www.alfa-editores.com/carnilac/Dic%2004%20%20Enero%2005/Residuos%20de%20medicamentos.pdf?phpMyAdmin=aIj69 rg0MYWn18mTYfYRyPHZ2T4 Repetto, CM., Camean, A. 2005. Toxicología avanzada Edición, 1a. editorial Publicación, Madrid: Díaz de Santos, 250 -252 Posynlak, A., Śniegocki,T., Żmudzki, J. 2002. Solid Phase extraction and Liquid chromatography analysis of sulfonamide residues. Bull.Vet- Inst. Polawy 46, 11117. Disponible en: http://www.piwet.pulawy.pl/doc/biuletyn_461/posyniak_297.pdf Yarén Escobedo L., Espinosa PA., Robles B MR., Bermúdez, AMC. 2007. Transformación y acumulación de sulfametazina en porcinos alimentados con una dieta medicada, revista mexicana de la ciencias farmacéuticas. 1: 5-13 Disponible en: http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/579/57938102. pdf. CA33 8