Grado en Química Departamento de Química Analítica Facultad de Ciencias Químicas Universidad Complutense de Madrid Memoria de Laboratorio Química Analítica II Nombre Alumno: Práctica 2: DETERMINACIÓN DE SELENIO POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON GENERACIÓN DE HIDRUROS (HG-AA) EN MUESTRAS BIOLÓGICAS. PARTICIPACIÓN EN UN EJERCICIO DE INTERCOMPARACIÓN Profesor: Fecha entrega: 05/11/19 Curso: 2019-2020 Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II Título de la práctica: DETERMINACIÓN DE SELENIO POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON GENERACIÓN DE HIDRUROS (HG-AA) EN MUESTRAS BIOLÓGICAS. PARTICIPACIÓN EN UN EJERCICIO DE INTERCOMPARACIÓN Alumno: Cristina Castañón de Pascual-Teresa Grupo Teoría/Prácticas: C1 Introducción y objetivos En esta practica se lleva a cabo la determinación de Se(IV) en una muestra de ostra por reducción del metal y posterior generación y volatilización de su hidruro volátil que sufrirá una atomización en el interior de la célula mediante sistema HG-AA y lectura de la absorbancia se llevará a cabo gracias a un espectrofotómetro. Tras la recogida de datos estos son tratados estadísticamente con el fin de determinar el contenido de selenio pero también de comparar diferentes técnicas analíticas. Parte experimental Se indicarán aquí sólo los aspectos específicos del desarrollo experimental utilizado (por ejemplo: cantidad de muestra o de patrones, diluciones utilizadas, etc.) Se miden en balanza gracias a unas capsulas de medida, tres muestras de ostra liofilizada de masa 100mg con precisión de 0.1mg que se introducen en un reactor de teflón. Muestra Masa de ostra liofilizada (g) T1 0.1042 T2 0.1018 T3 0.1024 Blanco 0 A esas cuatro muestras se les añaden 3mL de una mezcla de ácidos ya preparada de HNO3, H2SO4 y HCl (3:1:1). Se cierran herméticamente los reactores y se deja toda la noche en una estufa a 120ºC para realizar la digestión de la muestra y romper la matriz orgánica. Al día siguiente cuando los reactores bajan a temperatura ambiente se vierte el contenido en un vaso de precipitados de 100 mL y se añaden 4.5 mL de HCl (4M) y 1.5 mL de agua Milli Q1. Se calienta en placa hasta que hierva, más o menos 20 1 En esta practica se emplea únicamente agua Milli Q. 1 Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II minutos, se añaden 50 mL de agua y se deja enfriar. A continuación, se enrasa en un matraz de 100 mL. Se miden las absorbancias de las tres muestras y el blanco y se corrigen las absorbancias con la medida del blanco. Muestra media Amedia – Ablanco (Acorregida) Absorbancia (𝐴̅) 0 0.2995 0.2836 0.3015 Blanco T1 T2 T3 0.2995 0.2836 0.3015 Para preparar la disolución trabajo de Se (IV) se toma una disolución patrón de Se (IV) de concentración 100mg/L disuelto en agua y HNO3 0.5mol/L y se diluye con agua Milli Q hasta una disolución de Se (IV) de 1mg/L de volumen 100mL. 𝑉𝑖 𝑀𝑖 = 𝑉𝑓 𝑀𝑓 𝑉𝑖 = 𝑉𝑓 𝑀𝑓 𝑀𝑖 = 1 𝑚𝐿 (Ec1) Se toma 1 mL de disolución patrón y se diluye en 100mL de agua en matraz aforado. Para realizar el calibrado (con el blanco) se preparan 7 disoluciones de concentraciones de disolución trabajo diferentes en matraces aforados de 50 mL y con micropipeta, gracias a la ecuación 1: Concentración de disolución trabajo (µg/L) 0 10 25 50 100 150 200 𝑉𝑖 (mL) 𝑉𝑖 (µL) Absorbancia media 0 0.5 1.25 2.5 5 7.5 10 0 500 1250 2500 5000 7500 10000 0 0.007 0.0487 0.1235 0.225 0.3029 0.3635 A continuación trataremos los datos obtenidos. Los resultados finales se darán con una cifra significativa en el error. Calibrado externo y concentración de Se (IV) en µg/L en las tres muestras de ostra diluidas en 100mL de agua. Se representan los resultados de esta tabla en una grafica realizando una regresión lineal. En donde: 𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎 𝐴𝑏𝑠 = 𝑏[𝑆𝑒] + 𝑎 2 Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II Con el fin de calcular los siguientes parámetros se emplean las formulas siguientes (aquí y en el resto de la práctica cuando se necesiten): a 0,0075416 b 0,0019024 S2a 0,00014639 S2b 1,3532.10-8 sa 0,012099 sb 0,00011633 R2 0,97913 R 0,98951 Recta del calibrado con t(0,05; 5; 2 colas) = 2,571 Con 𝑎 ± t(0,05; 5; 2 colas) ∙ 𝑠𝑎 = (1 ± 3) ∙ 10−2 Y 𝑏 ± t(0,05; 5; 2 colas) ∙ 𝑠𝑏 = (1,9 ± 0,3) ∙ 10−3 Finalmente la recta de regresión es : 𝐴 = (1,9 ± 0,3 ). 10−3 [𝑆𝑒] + ( 1 ± 3 ). 10−2 Para calcular la concentración de las muestras se realiza una interpolación con la siguiente ecuación, restándole la absorbancia del blanco de digestión ( este valor es cero por lo que no se modifica el valor de la absorbancia de las tres muestras). 𝐴𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 − 𝑎 𝑏 [𝑆𝑒] = Muestra T1 T2 T3 Media [Se] en 𝜇𝑔/𝐿 en el matraz de 100mL 153,68 145,32 154,74 151,25 3 Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II Contenido de selenio (IV) en la muestra en mg/kg determinado por calibrado externo con su intervalo de confianza. Muestra Absorbancia Acorregida T1 T2 T3 0.2995 0.2836 0.3015 [Se] en 𝝁𝒈/𝑳 en el matraz de 100mL 153,68 145,32 154,74 𝒎𝒈 de Selenio en 100 mL de disolución 0,015368 0,014532 0,015474 Masa de ostra en la muestra (g) 0,1042 0,1018 0,1024 [Se] en 𝒎𝒈/𝒌𝒈 147,485 142,750 151,113 Para calcular las columnas se emplean las siguientes formulas: 𝜇𝑔 Columna 4: [Se]en 𝐿 en el matraz de 100mL × 10−4 𝑚𝑔 de Selenio en 100 mL de disolución Columna 6 : Masa de ostra en la muestra (g) × 10−3 Para calcular el intervalo de confianza para tres muestras independientes por el método del calibrado externo se debe calcular la varianza combinada de la varianza del calibrado y la del proceso analítico como se muestra a continuación: 2 2 2 𝑢𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎 = 𝑢𝑝𝑟𝑜𝑐𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑜 + 𝑢𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜 2 𝑢𝑝𝑟𝑜𝑐𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑜 2 𝑢𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜 = 2 𝑠𝑝𝑟𝑜𝑐𝑒𝑠𝑜 = 𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠 ∑𝑛1 𝑠𝑥2̂𝑝,𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑛 2 𝑠𝑥̂𝑝 𝑠𝑦⁄𝑥 (𝑦𝑝 − 𝑦̅) 1 √1 + + = 2 𝑏 𝑁 𝑏 2 ∑𝑁 1 (𝑥𝑖 − 𝑥̅ ) 𝒔𝒚⁄𝒙 𝒃 N 11,4126 7 ̅ 𝒚 𝑵 ̅) 𝟐 ∑(𝒙𝒊 − 𝒙 𝟏 0,153 34835,7143 A 𝑠𝑥̂𝑝 se le aplican las operaciones de conversión de unidades y proporcionalidad con la muestra que se ha realizado en el apartado anterior para llevarlo a mg/kg de selenio en ostra. Muestra Yp (Acorregida) T1 T2 T3 0.2995 0.2836 0.3015 ̅)2 (ys-𝒚 0,02148 0,01707 0,02207 Media 4 𝒔𝒙̂𝒑 (𝝁𝒈/𝑳) 𝒔𝒙̂𝒑 (𝒎𝒈/𝒌𝒈) 13,0783 12,9031 13,1016 12,5512 12,6749 12,7946 𝒔𝟐𝒙̂𝒑 (𝒎𝒈 /𝒌𝒈)𝟐 157,5325 160,6542 163,7010 160,6292 Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II [Se] en 𝒎𝒈/𝒌𝒈 147,4856 142,7505 151,1133 𝒔𝟐𝒑𝒓𝒐𝒄𝒆𝒔𝒐 Media [Se] en mg/kg 160,6542 2 𝑢𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜 2 𝑢𝑝𝑟𝑜𝑐𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑜 𝒖𝟐𝒄𝒐𝒎𝒃𝒊𝒏𝒂𝒅𝒂 53,5431 5,8621 59,4031 17,5863 2 𝑢𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎 en (mg/kg)2 59,4031 Grados de libertad t(0,05; 17; 2 colas) 𝜈 = (𝑛 − 1) + 𝑛(𝑁 − 2) 17 2,110 2 𝑡. √𝑢𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎 16,26 Patrón externo: [𝐒𝐞] 𝐞𝐧 𝐦𝐠/𝐤𝐠 = 𝟏𝟔𝟎 ± 𝟐𝟎 Precisión del método: Desviación estándar 𝒔 = √ ∑(𝑥𝑖 −𝑥̅ )2 𝑛−1 19,0261 = √ 2 = 3,08 𝑠 Desviación estándar relativa RSD = 𝑥̅̅ = 𝟎, 𝟎𝟏𝟗 Coeficiente de variación CV(%) = RSD x 100 = 1,9% Varianza s2 = 9,5 Calibrado de adiciones estándar y determinación por este método del contenido de Se en mg/kg de la muestra de ostra Se preparan 7 disoluciones con las mismas concentraciones de disolución trabajo para las 3 muestras con ostra liofilizada a las que se les añaden 5 mL de disolución de la muestra con ostra previamente preparada como indica el guión (digestión con ácidos y calor y posterior dilución en agua, matraz de 100mL). Se toman 10 datos para cada disolución con el fin de hacer un promedio y que el dato esté más cerca del real. Para las tres muestras, la absorbancia media corregida con la absorbancia del blanco de digestión (1ue en nuestro caso es 0,0000) se recoge en la siguiente tabla: Concentración de disolución Trabajo en (µg/L) 0 10 25 50 100 150 200 Absorbancia de T1 Absorbancia de T2 Absorbancia de T3 0,0372 0,0566 0,0944 0,1569 0,2588 0,3397 0,4075 0,0136 0,0405 0,078 0,1404 0,2419 0,3272 0,3982 0,0043 0,0365 0,0786 0,1436 0,2487 0,3329 0,4025 5 Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II Los gráficos con las rectas de regresión se adjuntan a continuación : a 0,04856 b 0,001890 S2a 8,156. 10-5 S2b 7,540.10-9 sa 0,009031 sb 8,683.10-5 R2 0,99998 R 0,99999 Finalmente la recta de calibrado, con la misma t(0,05; 5; 2 colas) = 2,571 es: 𝐴 = ( 19 ± 2 ). 10−4 [𝑆𝑒]𝐿/𝜇𝑔 + ( 5 ± 2 ). 10−2 6 Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II S2a 7,884. 10-5 S2b 7,288.10-9 a 0,02896 b 0,001938 sa 0,008879 sb 8,537.10-5 R2 0,9519 R 0,9757 Finalmente la recta de calibrado, con la misma t(0,05; 5; 2 colas) = 2,571 es: 𝐴 = ( 19 ± 2 ). 10−4 [𝑆𝑒]𝐿/𝜇𝑔 + ( 3 ± 2 ). 10−2 S2a 1,235. 10-4 S2b 1,142.10-8 a 0,02567 b 0,001995 sa 0,01111 sb 1,068.10-4 R2 0,9907 R 0,9953 Finalmente la recta de calibrado, con la misma t(0,05; 5; 2 colas) = 2,571 es: 𝐴 = ( 2 ± 3 ). 10−2 + ( 20 ± 3 ). 10−4 [𝑆𝑒] L/μg Determinación de si existe efecto matriz gracias a la comparación de las pendientes con la t de Student y la de las varianzas con la F de Snedecor. En primer lugar se debe evaluar si las varianzas difieren estadísticamente mediante el ensayo de hipótesis basado en la F de Snedecor. Tomando como Ho : bAE = bPE 2 𝑠(𝑦 ⁄𝑥)𝑃𝐸 𝐹𝑒𝑥𝑝 = 𝑠2 ; tomando como numerador la varianza más grande (𝑦⁄𝑥)𝐴𝐸 7 Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II Muestra 1 2 3 S2(y/x) PE AE 0,0004714 0,0002627 0,0002539 0,0003974 Fexp F(0,05;5;5) 1,7944 1,8566 1,1853 7,146 Se observa que en los dos casos Fexp< Ftab por lo que no se observan diferencias significativas al 95% entre las dos varianzas de los dos métodos. Lo mas probable es que no haya efecto matriz. Por lo tanto las pendientes se comparan con la varianza ponderada y la t de Student : Los datos se recogen en la siguiente tabla: 𝑵 Muestra ̅) 𝟐 ∑(𝒙𝒊 − 𝒙 S2b en L/μg N V = N1+N2 4 S2ponderada 𝟏 PE 1 2 3 34835,7 -8 1,3532.10 AE 7,540.10-9 7,288.10-9 1,142.10-8 PE AE PE 7 AE 1,054.10-8 10 1,041.10-8 1,248.10-8 Para calcular la texp y compararla con ttab se calcula de la forma, pero antes podemos observar en la siguiente tabla que las pendientes de los dos métodos son muy similares por lo que no habrá efecto matriz. Con bPE = 0,0019024 Muestra bAE S2bPE + S2bAE texp 1 0,001890 6,051.10-13 15,9 2 0,001938 5,976.10-13 42,6 3 0,001995 7,165.10-13 109,4 8 ttab Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II Por otra parte la volatilización del hidruro de selenio en la maquina de medida por el reactor y la célula de atomización tiene la ventaja de reducir las interacciones entre el anualito y la matriz. Concentración de selenio en mg/kg en la muestra por el método de adiciones estándar a un nivel de confianza del 95% asumiendo que las tres técnicas tienen efecto matriz. Así la concentración de Selenio (IV) por adiciones estándar en la muestra a un nivel de confianza del 95% se calcula gracias a las rectas de calibrado con la expresión usada anteriormente: 𝐴𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 − 𝑎 [𝑆𝑒] = 𝑏 A la desviación estándar se le aplican las mismas operaciones. Muestra Absorbancia media corregida (𝐴̅) [Se] en µg/L en la alícuota de 5 mL [Se] en S[Se] µg/L en la disolución de 100 mL T1 0.2995 131,32 131,32 T2 0.2836 133,47 133,47 T3 0.3015 140,75 140,75 mg de Se en 1 Kg de muestra 86,41 µg de Se Masa de la en 100mL muestra en de kg disolución trabajo 13,132 0.1042.10-3 88,17 13,347 0.1018.10-3 131,1100 14,075 -3 92,59 0.1024.10 126,0268 137,4511 Para calcular los mg/kg de selenio en la muestra se opera de la siguiente manera: 𝑚𝑔 𝑆𝑒 𝜇𝑔 (𝑒𝑛 𝑙𝑜𝑠 100𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑡𝑟𝑎𝑏𝑎𝑗𝑜). 10−3 𝑆𝑒 𝑒𝑛 = 𝑘𝑔 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑒𝑛 𝑔). 10−3 [Se] media (mg/kg) 131,52935 Desviación estándar (mg/kg) 5,72368 t(0,05; 2; 2 colas) 4,303 𝑡 × 𝑠 √𝑛 13,2196 Adiciones estándar : [𝑺𝒆] 𝒎𝒈/𝒌𝒈 = 𝟏𝟑𝟏 ± 𝟏𝟑 Patrón externo: [𝐒𝐞] 𝐞𝐧 𝐦𝐠/𝐤𝐠 = 𝟏𝟔𝟎 ± 𝟐𝟎 A la vista de los resultados el método más preciso es el de adiciones estándar pues su error es menor que el de patrón externo. No obstante si comparamos con el valor tabulado o analizado por algún laboratorio tendríamos un dato bibliográfico para valorar la calidad y exactitud de nuestro método de trabajo y también entre los dos métodos. Por lo tanto a la vista de nuestros conocimientos daría por valida y más precisa la concentración del método de adiciones estándar: 𝒎𝒈 Adiciones estándar : [𝑺𝒆] 𝒌𝒈 = 𝟏𝟑𝟏 ± 𝟏𝟑 9 Departamento de Química Analítica Laboratorio: Química Analítica II Limite de detección y de cuantificación de la técnica instrumental y del método. En este caso tomamos únicamente el ejemplo de la muestra 1 y usamos la ecuación: Además puesto que nuestro blanco no tiene desviación estándar los resultados son iguales y se representan en la siguiente tabla. S2b S2a S2Blanco a/b K CLOD en µg/L 7,54E-09 8,16E-05 0,000 25,693 3 K 14,766 10 49,220 CLOQ en µg/L Muestra acuosa: En el caso en el que la muestra fuese acuosa podríamos usar una técnica de detección atómica o simplemente la misma que en esta practica. Además se podría medir con un espectrofotómetro pues el se absorbe a 196,06nm. En un primer lugar se determinaría la cantidad de Se(IV) y a continuación se trataría la muestra para reducir el Se(VI) presente en ella y se volvería a medir la cantidad de Se(IV) en la muestra. Finalmente por simple substracción se sacaría la cantidad de Se(IV) y Se(VI) de la muestra. Conclusiones En esta práctica y su correspondiente análisis de datos posterior se constata como se puede tratar estadísticamente los datos recogidos en el laboratorio. La comparación entre los dos métodos de análisis el de adiciones estándar y el de patrón externo nos permite apreciar que ventajas o desventajas poseen para la determinación de Se(IV) en una muestra de ostra mediante un sistema de HG-AA, que consiste en la atomización de un hidruro volátil y posterior lectura de la absorbancia de este compuesto por espectrofotometría. Tras el análisis de datos concluimos que en este caso y para el selenio el método de adiciones estándar es más preciso, aunque no conociendo el valor real tabulado no se puede determinar que método es más exacto. 10