CAPÍTULO 2. MARCADORES DE DETERMINACIÓN INDIRECTA - Antígenos eritrocitarios - Antígenos leucocitarios - Proteínas plasmáticas y enzimas eritrocitarios - Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Introducción Existen diferentes polimorfismos que resultan interesantes para estudiar el resultado de los procesos evolutivos en las poblaciones humanas. Veremos los más importantes, ordenados de acuerdo a un criterio histórico. Así, los primeros en ser analizados fueron los grupos sanguíneos, ya que fueron los primeros en ser descubiertos, a principios del siglo XX. Por el contrario, los polimorfismos que se analizan directamente sobre la molécula de ADN se han comenzado a estudiar más tardíamente, debido a las dificultades técnicas que entraña su análisis, cuestiones que no han sido solventadas hasta el último tercio del siglo XX. Se han dividido tradicionalmente los polimorfismos en dos grupos, uno que podemos denominar polimorfismos de determinación indirecta, que incluye aquellos caracteres detectables mediante el análisis de los productos derivados de los genes y otro denominado polimorfismos de ADN o de determinación directa, que incluye aquellos caracteres detectables mediante el análisis directo del material hereditario. Dentro de los polimorfismos de determinación indirecta se incluyen principalmente marcadores detectables en el tejido sanguíneo. La razón de que haya sido este tejido el seleccionado tradicionalmente para este tipo de análisis es obvia: es fácil de obtener, ya que mediante una simple punción la sangre fluye libremente y su obtención no es lesiva para el individuo. Por ello, se han podido analizar extensas muestras de muy diversas poblaciones una vez que se pusieron a punto las técnicas de análisis. Desde luego, aquellos polimorfismos que para su análisis necesitan de una biopsia de un determinado tejido, se han visto relegados a estudios minoritarios, ya que la disponibilidad de voluntarios para una prueba dolorosa siempre es menos entusiasta. Los diversos polimorfismos sanguíneos que se han analizado pueden clasificarse, de manera elemental, como sigue: Antígenos eritrocitarios Un antígeno es una sustancia que desencadena la formación de anticuerpos y eventualmente una respuesta inmunitaria. Es decir, es una molécula que es reconocida como extraña (y potencialmente peligrosa) por nuestro organismo. Los antígenos eritrocitarios son moléculas de glicoproteínas que determinan los grupos sanguíneos; se disponen superficialmente en la membrana de los glóbulos rojos. En general los genes responsables, es decir, aquellos genes que indirectamente se están analizando a través de estos caracteres, codifican para las enzimas glicosil-transferasas que añaden los monosacáridos terminales de las glicoproteínas. Se conocen unos treinta sistemas de antígenos eritrocitarios. Esquema de un antígeno eritrocitario, de los polisacáridos ABO y representación de varios antígenos (AB0, Rh, Kell, etc.) Antígenos eritrocitarios Test directo Eritrocitos Aglutinación Anticuerpos Test indirecto Eritrocitos Antiglobulina Anticuerpos Las técnicas utilizadas para su detección son, principalmente, la reacción directa de aglutinación (para AB0 y Rh D) y la aglutinación indirecta o test de Coombs (para el resto de grupos sanguíneos), dependiendo de la capacidad del anticuerpo para unirse a varios eritrocitos o a uno solo. Si bien en la actualidad están prácticamente abandonados estos métodos, la base de datos que se reunió en su día fue muy amplia y permitió analizar un gran número de poblaciones de todo el mundo. Antígenos eritrocitarios Mapas sintéticos que muestran las distribuciones de frecuencias de los alelos del grupo sanguíneo ABO. El alelo AB0*B es casi inexistente en América. Antígenos eritrocitarios Mapas sintéticos que muestran las distribuciones de frecuencias de los alelos FY*BA, FY*B y FY*BES del grupo sanguíneo Duffy. FY*BES es un alelo silente, que no codifica para ningún antígeno ¿Qué es un mapa sintético? Capítulo 5b Antígenos leucocitarios El Complejo Mayor de Histocompatibilidad Son moléculas glicoproteicas que se pueden encontrar en la membrana de los glóbulos blancos. Algunas de ellas también se encuentran en casi todas las células del organismo. Las más importantes son las codificadas por los genes HLA. Entre estos, los más interesantes por su variabilidad son los genes HLA clase I y clase II, responsables entre otros fenómenos, de la aceptación o rechazo de los tejidos u órganos injertados, de forma que el trasplante sólo es estable cuando existe identidad genética entre el individuo donante y el receptor. Antígenos leucocitarios Los genes HLA clase I codifican para la subunidad α del antígeno correspondiente, que se une con una molécula de β2-microglobulina. Los genes HLA clase II codifican para las dos subunidades (α y β) del antígeno. Presentan una gran variabilidad. Actualmente se conocen más de 17.000 alelos HLA. Antígenos leucocitarios HLA clase I La función varía entre los genes clase I y clase II. La función de las moléculas clase I es la de presentar fragmentos de proteínas detectadas en el interior de la célula (virus) a los linfocitos T citotóxicos. HLA clase II La función de las moléculas clase II es la de presentar fragmentos de proteínas extracelulares (bacterias) a los linfocitos T colaboradores y los linfocitos T citotóxicos Antígenos leucocitarios Entre las técnicas inmunológicas utilizadas tradicionalmente para su detección, la más habitual era la denominada técnica de citotoxicidad mediada por anticuerpos y complemento. Se basa, como en las reacciones de aglutinación, en la unión específica del antígeno con su correspondiente anticuerpo. Sin embargo, la unión del anticuerpo a los antígenos leucocitarios determina la lisis celular, es decir, la rotura de las membranas de los glóbulos blancos. Por ello, se reconoce una reacción positiva cuando mediante la observación al microscopio aparecen un gran número de células lisadas en las que ha penetrado un colorante. Antígenos leucocitarios Allsopp et al. (1992). American Journal of Human Genetics, 50(2), 411. En un análisis de frecuencias de los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C en poblaciones de Gambia, se obtuvo este dendrograma. Extrañamente, los San a parecen más alejados de las otras poblaciones africanas que los europeos. ¿Quiénes son los San? Capítulo 11a Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Esquema básico de un sistema de electroforesis Cátodo - Anodo + En el plasma sanguíneo y en los eritrocitos se encuentran disueltas una gran cantidad de proteínas con diferentes funciones, no siempre bien identificadas. Algunas proteínas presentan actividad enzimática (catalizando reacciones bioquímicas en el organismo). Se conocen más de veinte enzimas con carácter polimórfico en los eritrocitos. Casi todas las proteínas son identificables mediante electroforesis. Puede describirse la electroforesis como la migración de moléculas a través de un soporte o medio relativamente inerte bajo la influencia de un campo eléctrico y se basa en la propiedad que tienen las proteínas de adquirir carga eléctrica a determinados valores de pH. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Electroforesis horizontal Mediante la variante más sencilla de electroforesis, las moléculas son sometidas a una diferencia de potencial eléctrico. Para ello se dispone de una fuente de alimentación, con la que se generan las condiciones más adecuadas de voltaje, amperaje y tiempo de exposición. Mediante dos electrodos se transmite la diferencia de potencial entre ambos extremos de una cubeta de electroforesis, en cuyo interior se encuentra un gel por el que se desplazarán las muestras y una solución tamponada que transmite en alguna medida la electricidad. Las moléculas se desplazarán en función de su carga eléctrica y de su peso molecular. Las diferentes variantes de una molécula se reconocen por su diferente recorrido a lo largo del gel. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Electroforesis vertical Cubeta de electroforesis de campo pulsante Existen diferentes variantes de electroforesis, basadas en el peso molecular de las moléculas o en su punto isoeléctrico. Puede ser horizontal, submarina si el gel se encuentra sumergido en el tampón, vertical si las moléculas se desplazan desde arriba hacia abajo, de campo pulsante (en la que se altera en pasos sucesivos la orientación del campo eléctrico), etc. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Nei and Roychoudhury 1993 Mol Biol Evol 10:927-943 Dendrograma NJ obtenido con 26 poblaciones analizadas para 28 marcadores: ABO, DI, FY, JK, K, MNS, P, RH, SE, ACPl, ADA, AKl, ESD, GLOl, G6PD, GPT, PGD, PGM 1, PGM2, GC, HP, PI, TF, HBB, GM, KM, HLA-A, HLA-B y PTC. Aparecen claramente separadas las poblaciones africanas del resto. ¿Qué es un dendrograma NJ? Capítulo 5a Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Hay un tipo de polimorfismo proteico que no es analizable mediante electroforesis y que dada su importancia para el estudio de la heterogeneidad de las poblaciones humanas, merece una consideración especial. Son los alotipos de las inmunoglobulinas, entre los que destacan los grupos GM. Se trata de unos polimorfismos que se detectan en las moléculas de las inmunoglobulinas (es decir, en los anticuerpos). La molécula de inmunoglobulina consta de una zona variable y una zona constante. La zona variable es la que se adapta a todo tipo de moléculas reconocidas como extrañas por el organismo (los antígenos) y toma por tanto una enorme variedad de configuraciones. En un mismo organismo habrá un gran número de moléculas de inmunoglobulinas diferenciables por su zona variable. La zona constante es igual en todas las inmunoglobulinas de un individuo y presenta unas pocas variantes entre individuos. Los grupos GM representan una pequeña parte de la zona constante de las cadenas pesadas y son codificados por 3 genes situados en el cromosoma 14 (14q 32.3). Esquema de una molécula de anticuerpo Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Dugoujon et al., 2004 American Journal of Physical Anthropology 125:175–192 Para su análisis se utilizaban, entre otras, técnicas de inhibición de la aglutinación. En esencia, si se encontraba presente el antígeno analizado, se unía a un anticuerpo específico, que quedaba capturado. Al añadir después unos eritrocitos también específicos, puesto que no quedaban anticuerpos, no se daba aglutinación. Si el suero del individuo no portaba el antígeno buscado, se daba aglutinación. Africa N. Africa Europa C. Asia America Los haplotipos GM han resultado ser marcadores muy útiles, pues permiten diferenciar muy claramente las poblaciones humanas. En la figura se muestran las frecuencias haplotípicas en diferentes poblaciones de todo el mundo. ¿Qué es un haplotipo? Capítulo 1 E. Asia Oceanía
