UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE LA COSTA CAMPUS PUERTO VALLARTA

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE LA COSTA
CAMPUS PUERTO VALLARTA
LIC. EN MÉDICO CIRUJANO Y PARTERO
BIOLOGÍA MOLECULAR
DR. JUAN FRANCISCO LLAMAS
PRESENTAN:

BARRIENTOS RUIZ FANNY

FLORES PELAYO SUSANA

MARTÍNEZ PADILLA JAVIER ALFONSO

TREVIÑO PÉREZ CARLA JANET
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SECUENCIACIÓN Y RATONES TRANSGÉNICOS
SECUENCIACIÓN
Método preciso para determinar el orden o secuencia en que se encuentran
dispuestos los nucleótidos en una cadena de DNA.
En 1977, F. Sanger y W. Gilbert publicaban de forma simultánea un método
eficaz de secuenciación conocido actualmente como método enzimático y
método químico respectivamente. Ambos métodos se basan en la obtención de
una colección de moléculas de DNA de distinto tamaño y con un extremo 3’
específico, se diferencian en la forma en que se obtienen estos extremos.
El principio fundamental del método consiste en la síntesis in vitro de una
cadena complementaria al DNA que se pretende secuenciar en unas
condiciones tales que se pueda detener el crecimiento de modo controlado en
posiciones específicas. Esto requiere la hibridación de un oligonucleótido
cebador a una cadena sencilla del DNA que se quiere secuenciar, DNA molde.
El iniciador se sintetiza de forma que presente una secuencia complementaria
a una región adyacente al extremo 3’ del DNA que queremos determinar,
normalmente cerca del sitio de clonaje del vector, por lo que es posible usar un
único iniciador para todos los fragmentos de DNA que se desee secuenciar.
El DNA de cadena sencilla puede obtenerse desnaturalizando con álcali el
plásmido que lleva clonado el DNA de interés o bien introduciendo este DNA en
un fago filamentoso como el bacteriófago M13, el cual produce partículas
víricas con DNA monocatenario.
El complejo formado por el iniciador y el molde sirve de sustrato para el
fragmento Klenow de la DNA polimerasa I.
En presencia de los cuatro desoxinucleótidos (dNTPs), la enzima inicia la
síntesis de una cadena complementaria al molde.
La segunda condición del método es poder controlar la posición en la que
finaliza dicha síntesis. Esto se consigue introduciendo una relación adecuada
de dideoxinucleótido en la reacción. Los dideoxinucleótidos (ddNTPs) son
componentes análogos a los dNTPs, pero que carecen del grupo hidroxilo en la
posición 3‘, el cual es imprescindible para la formación del enlace fosfodiéster
con otro nucleótido.
Para secuenciar un fragmento de DNA necesitamos realizar cuatro reacciones
independientes, cada una de las cuales tendrá una pequeña proporción de un
ddNTP específico. La incorporación de este análogo dará como resultado una
mezcla de fragmentos de DNA que tendrán un extremo 5’ común (el iniciador) y
un extremo 3’ diferente, que coincidirá con todas las posibles posiciones en las
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que se localiza ese nucleótido en la cadena de DNA. De esta forma, cada
reacción nos revela la posición ocupada a lo largo de la cadena de DNA por
cada uno de los cuatro nucleótidos.
Para visualizar el resultado de la reacción, el conjunto de fragmentos obtenidos
se separa en electroforesis de acrilamida en condiciones desnaturalizantes.
Esta técnica de alta resolución nos permite separar fragmentos de DNA de
cadena sencilla que se diferencian en un único nucleótido de longitud. Al
colocar en el gel las cuatro reacciones de forma adyacente se obtiene una
figura de bandas que, al seguirlas de forma escalonada, nos indica la
secuencia del fragmento de DNA que se está analizando.
Estrategias de secuenciación
Estrategia que nos permita determinar la secuencia completa a partir de varias
reacciones. La estrategia a seguir dependerá del tamaño del DNA que se
pretende secuenciar, así como del equipo especializado que se posea.
Secuenciación de fragmentos generados al azar
El fragmento de DNA a secuenciar es fraccionado al azar mediante sonicación
o digestión controlada con la endonucleasa DNAsa l. Los fragmentos obtenidos
son clonados y secuenciados al azar hasta que se completa la secuencia
entera que deseamos determinar.
Subclonaje mediante el uso de enzimas de restricción
Este método requiere un conocimiento previo del mapa de restricción del DNA
que se quiere secuenciar. La digestión del DNA con enzimas seleccionadas
nos genera fragmentos que pueden ser clonados y secuenciados. La secuencia
que se va obteniendo nos proporciona más información acerca de otros
posibles sitios de restricción que se desconocían, los cuales pueden ser
utilizados para la obtención de nuevos subfragmentos.
Deleción secuencial del fragmento de DNA
Esta estrategia se basa en la obtención de delecíones secuenciales a partir de
un extremo del fragmento que queremos secuenciar. Generalmente estas
deleciones son generadas enzimáticamente mediante la recogida de muestras
a diferentes tiempos de la digestión. Los parámetros de la digestión deben
ajustarse con objeto de obtener fragmentos delecionados que se diferencien en
aproximadamente 250 nucleótidos. Los productos de la reacción son clonados
con el extremo delecionado cerca del sitio de hibridación del iniciador universal;
por lo que puede obtener la secuencia entera usando un único.
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Secuenciación mediante síntesis de varios iniciadores
Si el DNA que queremos secuenciar puede ser clonado entero en el vector, la
secuencia entera del mismo puede ser determinada mediante el uso de varios
iniciadores específicos para ese DNA. La primera secuencia obtenida con el
iniciador universal es usada para diseñar un oligonucleótido cerca del límite de
la secuencia que hemos obtenido y que no posea homología con el vector.
Este nuevo iniciador nos permitirá conocer unos 250-300 nucleótidos más, con
lo que podremos diseñar un nuevo oligonucleótido. Este ciclo de secuenciación
y diseño de un nuevo iniciador puede repetirse hasta la determinación de la
secuencia completa.
Este es el método más eficiente, ya que la información redundante que se
obtiene es mínima.
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RATONES TRANSGÉNICOS
Organismos transgénicos
 Organismos vivos (plantas, animales o bacterias) manipulados
genéticamente mediante la inserción de un gen que habitualmente no
formaba parte de su repertorio genético.
 El a ser introducido consiste de una región promotora y una región
codificante para la proteína de interés.
Métodos de transformación genética en animales
Transformación genética mediante el uso de vectores retrovirales.
Esta se lleva cabo reemplazando genes que no son esenciales para el
organismo transgénico por genes que se quieren que se desarrollen para que
lleven a cabo una acción determinada. Este método tiene un punto débil puesto
la secuencia de genes codificada y transferida al organismo no será heredada
a la descendencia.
Transformación genética mediada por semen
Este se lleva a cabo por medio de la inseminación artificial utilizando semen
previamente estudiado. Este método es muy cuestionado debido a que su
efectividad es muy pobre.
Clonación
Este tema ya se vio con el equipo anterior.
Usos de la tecnología de transferencia nuclear y recombinación homologa
en producción animal.
Clonación de animales elite
Se usa para crear animales que fueran de primera calidad en las labores para
las que se les tiene asignados.
Conservación genética
Se puede usar para evitar la extinción de una especie determinada o inclusive
para mejorar a dicha especie y hacerla más resistente a determinadas
situaciones o eventos.
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Eliminación de genes (gene knock out)
Aquí se da la combinación de diversos genes en células somáticas previo a la
transferencia. Se podría usar en un futuro para realizar trasplantes de animales
a humanos sin ningún problema.
¿Cómo se hace un ratón transgénico?
Puede ser de dos maneras:
1. Inyectando el DNA en huevos fertilizados
Obtener los huevos fertilizados
Son obtenidos a través de las hembras, que fueron inyectadas con hormonas
de estrógeno y posteriormente apareadas. Los huevos fertilizados se remueven
del oviducto por medio de lavados de solución salina.
Microinyectados
pronúcleo masculino
dentro
del
Unos cuantos cientos de copias del
DNA que lleva el transgen, son
microinyectados en un volumen de 2-5
picolitros,
dentro
del
pronúcleo
masculino, a través de una pipeta de
vidrio ultrafina.
Implante de los embriones
10-20 huevos microinyectados son implantados
dentro del oviducto de una madre adoptiva. Las
crías de éstos huevos microinyectados nacen 1921 días después, completando el ciclo normal de
gestación de un ratón. Aproximadamente entre el
10-40% de las crías tendrán el transgen
integrado en su genoma.
Identificación de los animales transgénicos
Son identificados por el análisis de DNA a partir de un fragmento de la cola del
ratón.
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Generar individuos transgénicos homocigoto
Ratón
transgénico
heterocigoto
Ratón
transgénico
homocigoto
Ratón
transgénico
heterocigoto
La finalidad es analizar de qué manera influye en el fenotipo del ratón, el grado
de expresión del transgen.
Transgénico fundador
Ratón desarrollado a partir de un huevo inyectado con el DNA transgénico.
2. Células stem embrionarias (ES cells) son inyectadas en embriones
Inyección de las células stem embrionarias en un blastocisto
Se microinyectan con 10 a 12 células stem embrionarias modificadas
genéticamente y posteriormente son implantados en madres pseudopreñadas.
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Germ-line



Las moléculas se alinean una con otra en la orientación correcta.
Las moléculas de DNA son cortadas y unidas en los extremos que
corresponden a las zonas de homología.
La secuencia intermedia es reemplazada en el gen endógeno y no sufre
ninguna alteración.
Los ratones que nacen son quimeras
Estos ratones presentarán dos tipos diferentes de células; aquellas que
corresponden al genoma del ratón original microinyectado, así como las células
derivadas de las células stem embrionarias manipuladas, que llevan el gen
modificado integrado en su genoma.
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Bibliografía consultada:
 Ratón
transgénico
http://www.icampus.ucl.ac.be/courses/SBIM2520/document/genemol/bio
molespa/transgenico/Raton-transgonico.html
 Animales
transgénicos:
pasado,
presente
y
futuro
http://mingaonline.uach.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0301732X2004000200002&lng=pt&nrm=iso&tlng=es
 ¿Qué
nos
enseñan
los
ratones
transgénicos?
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/libro_25_aniv/capitulo_17.pdf
 INVESTIGACIÓN: Los ratones transgénicos son la clave de la nueva
medicina http://www.elmundo.es/salud/2000/386/00732.html
 http://www.revistanefrologia.com/mostrarfile.asp?ID=1571
9
PREGUNTAS: SECUENCIACIÓN Y RATONES TRANSGÉNICOS

¿Qué es secuenciación?

El
__________________del
método
consiste
en
la
_________________de una cadena complementaria al DNA que se
pretende secuenciar en condiciones que se pueda detener el
crecimiento de modo ____________en____________________.

Explica brevemente como se lleva a cabo la secuenciación.

¿Cómo se consigue controlar la posición en la que finaliza la síntesis de
secuenciación?
(a) Por la DNA polimerasa I.
(b) Por los desoxinucleótidos (dNTPs).
(c) Por los dideoxinucleótidos (ddNTPs).
(d) Por la síntesis de una cadena complementaria al molde.

Los _______________________ son componentes análogos a los
dNTPs, pero que carecen del grupo hidroxilo en la posición ___, el cual
es imprescindible para la formación del __________________ con otro
nucleótido.
Relaciona columnas.




Estrategia que nos permite
determinar la secuencia completa
a partir de varias reacciones.
El fragmento
de DNA
a
secuenciar es fraccionado al azar
mediante sonicación o digestión
controlada con la endonucleasa
DNAsa I
Obtención
de
deleciones
secuenciales a partir de un
extremo del fragmento que
queremos secuenciar.
Este es el método más eficiente,
ya que la información redundante
que se obtiene es mínima.
(a) Deleción secuencial de
fregmentos.
(b) Secuenciación mediante
síntesis
de
varios
iniciadores.
(c) Estrategias
de
secuenciación.
(d) Secuenciación
de
fragmentos al azar.
10

Menciona si lo que se dice el verdadero o falso.
-El método de secuenciación mediante síntesis de varios iniciadores puede ser
clonado entero en el vector……………………………………………………….(
)
-En delecion secuencial de freagmentos los parámetros de la digestión deben
ajustarse con objeto de obtener fragmentos delecionados que se diferencien en
aproximadamente 200 nucleótidos………………………………………………(
)
-El subclonaje mediante el uso de enzimas de restricción es un método que no
requiere un conocimiento previo del mapa de restricción del DNA que se quiere
secuenciar…………………………………………………………………………..(

)
Organismos vivos manipulados genéticamente mediante la inserción de
un gen que habitualmente no formaba parte de su repertorio genético
ORGANISMOS TRANSGÉNICOS

Relaciona las siguientes columnas:
a) Se realiza reemplazando
genes que no son
esenciales para el virus
por genes heterólogos.
b) Producción
mediante
inseminación artificial.
c) Conduce a la pérdida
de función de un gen.

( ) Transformación genética
mediante el uso de vectores
retrovirales.
( ) Eliminación de genes.
( ) Transformación
mediada por semen.
genética
Ratón desarrollado a partir de un huevo inyectado con el DNA
transgénico.
A) Ratón Mahogany.
B) Ratón fundador.
C) Ratón Hsiao.

Las siguientes son formas de realizar un ratón transgénico, EXCEPTO:
A) Cell stem embrionarias inyectadas en huevos fertilazados.
B) Inyectando el DNA en huevos fertilizados.
C) Células stem embrionarias (ES cells) inyectadas en embriones.

¿En qué día son aislados los embriones de las ratas?
A) 4
B) 5
C) 2
D) 3
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
Mediante que parámetro se identifica y selecciona al animal transgénico
en la actualidad
a) Analizando sus sentimientos
b) Piel, características morfológicas, comportamiento
c) Análisis de su ADN
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