INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS LABORATORIO DE FISIOLOGÍA VEGETAL “PRODUCCIÓN DE HUITLACOCHE POR INDUCCIÓN DE LA INFECCIÓN EN MAÍZ CON Ustilago maydis BAJO CONDICIONES CONTROLADAS”. PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CURRICULAR QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO P R E S E N T A: CUAUHTÉMOC GONZÁLEZ TRINIDAD ASESOR DE TESIS: QBP SILVANO MONTES VILLAFÁN Ciudad de México 2016 LUGAR DE DESARROLLO El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Fisiología Vegetal del Departamento de Botánica en el Edificio de Biología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la asesoría del Químico Bacteriólogo Parasitólogo Silvano Montes Villafán. FRAGMENTO DE “HACE FALTA UN MUCHACHO” En cual fuere la obra en que te ensayes, si falla acaso tú primer intento no te descorazones ni desmayes, antes vuelve a empezar con nuevo aliento. No habrá dificultad ni resistencia que dominar no puedas con talento, con firme voluntad y con paciencia. “Es muy breve la vida, el arte es largo”; la perfección se alcanza, sin embargo a fuerza de trabajo y experiencia. ARTURO CUYÁS ARMENGOL AGRADECIMIENTOS A MI DIRECTOR DE TESIS, QBP SILVANO MONTES VILLAFAN Por su apoyo, confianza y enseñanzas que me brindo para mi formación académica, profesional y personal. Y sobre todo por su gran ayuda en el impulso y desarrollo de mis ideas. A MIS SINODALES BIÓLOGA SANDRA PÉREZ JIMÉNEZ Por su gran apoyo en mi formación académica y por despertar en mí el interés en la botánica BIÓLOGA ARCELIA PLIEGO AVENDAÑO Por su gran apoyo en mi formación académica y por despertar en mí el interés en la botánica BIÓLOGA ABIGAIL JARDINES MARTÍNEZ Por su gran apoyo en mi formación académica y por inspirar en mi la curiosidad en el estudio de la fitopatología y el gran potencial aprovechable en esta área M. EN C. ERIKA ROSALES CRUZ Por su guía y cada uno de sus valiosos consejos e impulsar mis capacidades profesionales y humanas. Por la revisión de este trabajo y sus valiosos comentario, sobre todo por el apoyo en mi formación académica, personal y profesional A TODO EL PERSONAL ACADÉMICO DEL DEPARTAMENTO DE BOTÁNICA Y DEL LABORATORIO DE HEMATOPATOLOGÍA POR EL APOYO Y LAS PALABRAS DE ALIENTO, ASÍ COMO A MIS COMPAÑEROS DE LABORATORIO, DE AULA Y DE PASILLO, MUCHAS GRACIAS. DEDICATORIAS A mi familia, en especial a mi madre Simona Trinidad Vásquez, por su cariño y apoyo incondicional, por impulsarme en cada reto y alentarme a nunca desistir en busca de mi desarrollo personal y profesional, sin ella cada uno de mis logros sería imposible; a mi padre Eugenio González Guzmán por enseñarme que la vida no es fácil y hay que esforzarse para logra tus metas; a mis hermanos por su compañía y cariño Lourdes, Eduardo, Xochilt, Ana y Jesús. A mi compañera, amiga y confidente Edith Johana Ortiz Reyes, gracias. Y a todos mis compañeros y amigos de escuela. Muchas gracias a todos. INDICE GENERAL ÍNDICE DE FIGURAS INDICE DE TABLAS ABREVIATURAS RESUMEN 1 INTRODUCCIÓN 1.1 Generalidades de los hongos 1.2 Hongos fitopatógenos 1.3 Basidiomicetos 1.4 Carbones 1.5 Huitlacoche 1.5.1 Agente etiológico 1.5.2 Taxonomía de Ustilago maydis 1.5.3 Signos y síntomas 1.5.4 Ciclo de vida 1.5.5 Factores que influyen en formación del huitlacoche 1.5.6 Producción de huitlacoche 1.5.7 Propiedades nutritivas de huitlacoche 1.6 Maíz 1.6.1 Taxonomía del maíz 1.6.2 Estructura de la planta de maíz 1.6.3 Estructura del grano de maíz 1.6.4 Clasificación de los tipos maíz 1.6.5 Etapas de desarrollo del maíz 1.7 Antecedentes 2 JUSTIFICACIÓN 3 OBJETIVOS 4 MATERIAL Y MÉTODOS 4.1 Selección de mazorcas con infección por Ustilago maydis 4.2 Selección de granos jóvenes de maíz sin infección 4.3 Selección de granos maduros para siembra 4.4 Evaluación de la eficiencia de infección de un macerado de teliospora de Ustilago maydis 4.4.1 Prueba en mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos infectados con Ustilago maydis 4.4.2 Pruebas de inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con suspensión de teliosporas de Ustilago maydis 4.4.3 Prueba de inoculación de mazorcas jóvenes y sanas con suspensión de teliosporas de Ustilago maydis 4.4.4 Determinación de la infectividad de la fase de teliosporas de Ustilago maydis por aspersión sobre granos de maíz germinando 4.5 Obtención de un concentrado de teliosporas puras de Ustilago maydis 4.5.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis 4.5.1.1 Prueba en medio líquido de extracto de maíz 4.5.1.2 Prueba en medio sólido de extracto de maíz 4.6 Aislamiento de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago maydis en agar extracto de maíz 4.7 Determinación de infectividad de los estadios de Ustilago maydis sobre plantas de maíz i iii iv v vi 1 1 1 2 3 5 5 5 7 7 9 9 10 12 13 13 13 17 18 19 22 23 24 24 24 24 24 24 25 25 26 26 27 27 27 27 28 4.8 5 6 7 8 9 10 Comparación y selección del medio de cultivo óptimo para la propagación de la cepa comprobada de Ustilago maydis 4.8.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido de extracto de maíz 4.8.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido de extracto de maíz 4.9 Preparado de inóculos de basidiosporas de Ustilago maydis a diferentes concentraciones 4.10 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de Ustilago maydis 4.11 Confirmación de la infectividad de las basidiosporas de Ustilago maydis obtenidas para producir huitlacoche DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO RESULTADOS 6.1 Evaluación de la eficiencia de infección de un macerado de teliospora de Ustilago maydis 6.1.1 Mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos infectados 6.1.2 Inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con suspensión de teliosporas de Ustilago maydis 6.1.3 Inoculación de mazorcas jóvenes y sanas con suspensión de teliosporas de Ustilago maydis 6.1.4 Aspersión de teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de maíz germinando 6.2 Obtención de un concentrado de teliosporas puras de Ustilago maydis 6.2.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis 6.2.1.1 Prueba en medio líquido y sólido de extracto de maíz 6.3 Aislamiento de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago maydis en agar extracto de maíz 6.4 Determinación de la infectividad de los estadios de Ustilago maydis sobre plantas de maíz 6.5 Comparación y selección del medio de cultivo adecuado para la propagación del hongo de la cepa comprobada de Ustilago maydis 6.5.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido 6.5.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido 6.6 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de Ustilago maydis DISCUSIÓN CONCLUSIÓN BIBLIOGRAFÍA ANEXO 10.1 Material 10.1.1 Material biológico 10.1.2 Medios de cultivo 10.1.3 Soluciones y reactivos 10.1.4 Material 10.1.5 Equipo 10.2 Preparación de medios de cultivo 10.2 Preparación de Soluciones reactivas ii 29 29 29 29 30 30 31 32 32 32 34 36 38 38 41 41 43 47 49 49 50 51 55 60 61 64 64 64 64 64 64 65 65 66 ÍNDICE DE FIGURAS Fig. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Titulo Estructura característica de basidiomicetos Estructuras características de Teliosporas y Basidiosporas de Ustilago maydis Ciclo de vida de Ustilago maydis Estructura y desarrollo de la planta de maíz Estructura del grano de maíz Etapas de desarrollo del maíz Evaluación de infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tierno, dilución (1:10) Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tierno, dilución (1:5) Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tierno, dilución (2:5) Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tiernos, control negativo Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:3 (agua-teliosporas) Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:2 (agua-teliosporas) Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:1.5 (agua-teliosporas) Mazorcas usadas para evaluar el efecto de las teliosporas de Ustilago maydis Efecto de teliosporas de Ustilago maydis sobre mazorcas jóvenes Efecto de la exposición con teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de maíz germinando después de cuatro semanas Separación de teliosporas por efecto del gradiente de concentración con NaCl Morfología microscópica de teliosporas de Ustilago maydis Germinación de teliosporas de Ustilago maydis Basidiosporas de Ustilago maydis en división Colonias levaduriformes evaluadas, presuntivas de basidiosporas de Ustilago maydis Colonia levaduriforme evaluada, presuntiva de basidiosporas de Ustilago maydis Efecto de las basidiosporas de Ustilago maydis sobre plántulas de maíz Ciclo de vida de Ustilago maydis detectado experimentalmente bajo este protocolo Placas de agar extracto de maíz con crecimiento de colonias de basidiosporas de Ustilago maydis Basidiosporas de Ustilago maydis teñidas con azul de metileno Efecto de las fase teliosporas y basidiosporas de Ustilago maydis sobre plántulas de maíz Colonias de Ustilago maydis en medio de cultivo sólido iii Pag. 3 4 8 14 16 18 33 33 33 35 35 35 36 37 37 38 39 41 42 43 44 44 45 46 47 48 48 49 29 30 31 32 33 34 35 Comparación en la generación de basidiosporas de Ustilago maydis en dos diferentes medios líquidos Basidiosporas de Ustilago maydis observadas en cámara de Neubauer Jilotes de maíz antes de ser inoculados con basidiosporas de Ustilago maydis Efecto de la inoculación por inyección de basidiosporas de Ustilago maydis en jilotes de maíz Crecimiento de basidiosporas de Ustilago maydis en agar extracto de papa Basidiosporas de Ustilago maydis Mazorca de maíz con huitlacoche 50 51 52 52 53 54 54 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Titulo Características de los reinos del dominio Eukaryota que contienen a los hongos Carbones más comunes que atacan a las plantas Características taxonómicas de Ustilago maydis Factores que influyen en la infección del maíz por Ustilago maydis Comparación de la concentración en peso seco de algunos nutrientes del huitlacoche y el maíz Partes de la planta de maíz Partes que conforman el grano de maíz Clasificación de los tipos de maíz Descripción de las etapas en el desarrollo del maíz Concentraciones finales de los medios de cultivo líquidos usados en esta prueba Resultados del gradiente de concentración con NaCl en suspensión de teliosporas de Ustilago maydis Resultados de la germinación de las teliosporas puras Ustilago maydis obtenidas, inoculadas en medio extracto de maíz Resultados del crecimiento en medio sólido extracto de maíz y extracto de papa iv Pag. 1 4 6 9 11 15 16 17 19 29 40 42 49 ABREVIATURAS NaCl CuSO4 °C g mg mL L vs V VE R DAS PDA UFC/mL Cda. INBio FAO Cloruro de sodio Sulfato cúprico Grados Celsius Gramos Miligramos Mililitros Litros Contra Fase Vegetativa Fase Vegetativa de Emergencia Fase Reproductiva Número aproximado de días después de la siembra Papa Dextrosa Agar Unidades Formadores de Colonias por mililitro Cordova Instituto Nacional de Biodiversidad Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura v RESUMEN Introducción El huitlacoche es el resultado de la infección de un Basidiomiceto parásito para el maíz llamado Ustilago maydis, formando agallas en los granos de maíz incrementando su volumen y formando una masa negra de teliosporas, la cual es un alimento de alto valor nutricional por su alto porcentaje proteínico comparado con los granos de maíz sin esta infección, con sabor único y atractivo en la cocina mexicana. El interés económico para la producción del hongo radica en sus costos elevados, que van de 40-140 pesos por kg. Además su producción artificial es baja, aunado a que pocas instituciones producen y comercializan el hongo en México. Objetivo Diseñar un protocolo que permita inducir la enfermedad en el maíz criollo de la localidad de San Francisco Chimalpa en Naucalpan, Estado de México, y conocer algunos factores que puedan ser controlados para mejorar el rendimiento en la producción del huitlacoche a bajo costo con el uso de una cepa silvestre de Ustilago maydis. Material y Métodos Se evaluó un método para la obtención de un concentrado de teliosporas puras, con el uso de métodos físicos y químicos (filtración, centrifugación, gradiente de concentración con NaCl, y el uso de CuSO4 al 1% como bactericida), comprobando su viabilidad al realizar su siembra en medio líquido de extracto de maíz. Así como, la identidad de las basidiosporas en agar extracto de maíz. Se comparó la eficacia de la infección de las fases de teliospora y basidiospora en plantas de maíz por aspersión y por inyección, se determinó el medio adecuado para el cultivo y la concentración más eficiente para la producción de inóculos, se evalúo la etapa de desarrollo de la planta más susceptible a ser infectada para formar huitlacoche, se determinó la concentración efectiva del inóculo para producir la formación del huitlacoche. Resultados Se logró obtener un concentrado puro de teliosporas con el método usado, así como un cultivo puro de basidiosporas y se determinó que la fase del hongo más eficaz para producir la infección en diferentes estadios de desarrollo del maíz fue la basidiospora, se encontró que el medio de cultivo óptimo para obtener biomasa de basidiosporas fue medio líquido con extracto de maíz diluido 1:2, se observó que al inocular por inyección vi en tejido en diferentes etapas de desarrollo resulto evidente como el jilote de la planta adulta del maíz es la más susceptible para producir la formación de masas de teliosporas en la mazorca, esto al inocular por inyección en el jilote de la planta a una concentración de 2x106 basidiosporas/mL. Conclusión De acuerdo a esta serie de pasos en conjunto se logró obtener un procedimiento a bajo costo para la formación de huitlacoche en maíz criollo de la localidad de San Francisco Chimalpa en Naucalpan, Estado de México. vii 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Generalidades de los hongos Los hongos forman un grupo de organismos talófitos, eucarióticos, desprovistos de clorofila (Alexopolous y col., 1996). Son organismos generalmente microscópicos heterótrofos, productores de esporas, pueden ser pluricelulares, ramificados y a menudo filamentosos con paredes celulares definidas que contienen quitina, celulosa, o ambos componentes (Sobrado y col., 2013). Los hongos son agrupados y/o clasificados de acuerdo a diversos criterios que convergen en la taxonomía según sus interrelaciones fisiológicas, morfológicas o moleculares. Algunas características de los reinos del dominio Eukarya que contienen a los diversos grupos de los hongos se describen en la Tabla 1 ya que son considerados polifiléticos, porque se reconocen tres líneas evolutivas independientes: reino fungi, reino protozoa y chromista. Los mixomicetos y mastigomicetos han sido reubicados en los reinos protozoa y chromista que incluyen a los protozoos y las algas respectivamente (Carrillo, 2003). Tabla 1 Características de los reinos del dominio Eukaryota que contienen a los hongos. Característica Nutrición Pared celular Reino Fungi Reino Chromista Heterotrófica (por absorción u osmotrófica) Autotrófica (fotosintética o por absorción) Celulosa con frecuencia, sin quitina ni β-glucanos Quitina y β-glucanos Reino Protozoa Heterotrófica (fagotrófica) o autotrófica (fotosintética) Ausente en forma trófica, variable si está presente Tomado de: Carrillo, 2003. La mayoría de las 100,000 especies de hongos conocidas, son estrictamente saprófitas y viven sobre la materia orgánica muerta, a la que descomponen. Alrededor de 50 especies de hongos producen enfermedades en el hombre y casi el mismo número ocasiona enfermedades en los animales, la mayoría son superficiales de la piel o de sus apéndices. Sin embargo, más de 8,000 especies de hongos producen enfermedades en las plantas (Agrios, 2005). 1.2 Hongos fitopatógenos Todas las plantas son atacadas por algún tipo de hongo, y cada uno de los hongos parásitos ataca a uno o más tipos de plantas. Algunos hongos crecen y se reproducen sólo cuando establecen una infección con las plantas que les sirven de hospedero, 1 durante todo su ciclo de vida estos hongos se conocen como parásitos obligados o biótrofos. Otros requieren de una planta hospedera durante una cierta etapa de su ciclo de vida, el cual lo pueden concluir desarrollándose en materia orgánica muerta o bien creciendo y reproduciéndose tanto en materia orgánica muerta como en plantas vivas (Agrios, 2005). Gran parte de los hongos fitopatógenos pasan una porción de su ciclo de vida en las plantas hospederas, y otra en el suelo o en los residuos vegetales depositados. Algunos hongos pasan todo su ciclo de vida sobre el hospedero y sólo sus esporas alcanzan el suelo, donde permanecen en reposo hasta que son llevadas a un hospedero en el que germinan y se reproducen. Otros hongos deben pasar parte de su ciclo de vida como parásitos de su hospedero y parte de él como saprófitos en tejidos muertos en el suelo, a fin de poder concluir su ciclo de vida en la naturaleza. Sin embargo, este último grupo de hongos se mantiene en estrecha asociación con los tejidos vivos o muertos de su hospedero y, en la naturaleza, no se desarrollan en otro tipo de materia orgánica. Otro grupo de hongos viven como parásitos de sus hospederos, pero continúan viviendo, desarrollándose y reproduciéndose en los tejidos muertos de esos hospederos, incluso pueden abandonar esos tejidos y depositarse en el suelo u otros órganos vegetales en proceso de descomposición, donde se desarrollan y reproducen como saprófitos obligados. Es indispensable que los tejidos vegetales muertos en los que se desarrollen esos hongos no pertenezcan al hospedero que han parasitado. Por lo común, ese grupo de hongos son patógenos que habitan en el suelo, que tienen una amplia gama de hospederos y que sobreviven en el suelo durante varios años en ausencia de sus hospederos (Agrios, 2005). 1.3 Basidiomicetos Los basidiomicetos son un grupo de gran importancia entre los hongos, pues tienen participación esencial en la naturaleza por la versatilidad de las especies que lo constituyen, unas forman ectomicorrizas, otras son causantes de enfermedades como las royas y los carbones, se encuentran también las especies comestibles como setas que se cultivan con fines nutritivos. Pertenecen al grupo de especies con importancia en la medicina por presentar metabolitos con actividad biológica contra una amplia gama de patologías clínicas (Rojas, 2013). La clase de los Basidiomycetes se considera que agrupa los hongos más evolucionados, donde están algunos de los patógenos de plantas más importantes. Esta clase se caracteriza por la formación de basidios estructuras tubulares o en forma de clava y sus esporas sexuales las basidiosporas como se muestra en la Figura 1 (Islas, 1994). 2 Figura 1. Estructura característica de basidiomicetos. Se observa la estructura del basidio en forma de clava y gemando sobre este las basidiosporas. Tomado de: INBio, 2014. 1.4 Carbones Los Ustilaginales son hongos fitopatógenos de importancia económica debido a que ocasionan enfermedades en monocotiledoneas de todo el mundo, se consideran la primera causa potencial del carbón en las plantas (Tamayo, 2009). Las enfermedades que producen masas carbonosas en órganos aéreos de la planta, reciben el nombre de “carbones”. Estos hongos son parásitos muy importantes causantes de grandes pérdidas a los agricultores. Tienen un ciclo de vida menos complicado que los hongos que ocasionan los chahuistles o royas y pueden sobrevivir en los desechos de las cosechas (materia orgánica muerta) o en cultivos de laboratorio. Sus esporas son diseminadas por el viento, la lluvia, e implementos de labranza o por medio de los insectos (García, 1994). Los carbones de las plantas se encuentran en todo el mundo y son la causa de graves pérdidas en los granos. Los carbones de los cereales son temidos por los agricultores en mayor grado que las royas debido a que muchos de ellos atacan a los granos y reemplazan sus contenidos con masas de esporas polvorientas y negras que se asemejan al hollín o carbón. Además de los distintos cereales, los carbones atacan también a la caña de azúcar, cebollas y algunas plantas de ornato tales como el clavel, en la Tabla 2 se mencionan los carbones más comunes que atacan a las plantas. La mayoría de los carbones atacan los ovarios de gramíneas y pastos desarrollándose en ellos o en sus frutos, destruyendo por completo los granos de las gramíneas. Sin embargo, varios carbones atacan a las hojas, tallos o verticilos florales. Algunos carbones infectan semillas o plántulas antes de que emerjan del suelo y se desarrollan en el interior de las plántulas hasta que alcanzan la inflorescencia; otros sólo producen infecciones locales en las hojas, tallos y otros órganos. La mayoría de estos hongos producen sólo dos tipos de esporas: teliosporas y basidiosporas. Sus teliosporas se forman comúnmente a partir de células miceliales a lo largo de todo el micelio localizado dentro de las agallas del carbón y sus basidiosporas geman lateralmente de las células del basidio o se forman a manera de racimo en la punta de un basidio 3 cenocítico como se observa en la Figura 2, en los carbones no se forman las basidiosporas sobre esterigmas (Agrios, 2005). Tabla 2. Carbones más comunes que atacan a las plantas Genero Especie U. maydis U. avenae U. nuda U. tritici Ustilago U. nigra U. hordei U. scitaminea T. caries y T. foetida T. contraversa Tilletia T. indica S. sorghi y S. cruenta Sphaceloteca S. reiliana U. cepulae Urocystis U. occulta N. barclayana Neovossia E. oryzae Entyloma E. ellisii Enfermedad Carbón del maíz Carbón volador de la avena Carbón de la cebada Carbón del trigo Carbón semivolador de la cebada Carbón cubierto de la cebada y de la avenas Carbón de la caña de azúcar Carbón cubierto o hediondo del trigo Añublo del enanismo del trigo Añublo del trigo Carbón cubierto del sorgo Carbón de las espigas del sorgo y del maíz Carbón de la cebolla Carbón del tallo y hojas del centeno carbón del grano del arroz carbón foliar del arroz Carbón de plantas de hoja como la espinaca Tomado de: Agrios, 2005. Basidiospora Basidio A) Teliospora B) Teliospora Figura 2. Estructuras características de Teliosporas y Basidiosporas de Ustilago maydis. A) Teliospora de Ustilago maydis con pared gruesa y ornamentada. B) Teliospora germinado con basidiosporas gemando del basidio. Tomado y modificado de: Alexopolous y col., 1996. 4 1.5 Huitlacoche El carbón común del maíz también conocido como “huitlacoche” o “cuitlacoche”, es un hongo comestible causado por la infección de Ustilago maydis en cultivos de maíz (Zea mays) y de su probable antecesor el teozintle “Zea mays ssp parviglumis” (Ruiz, 2008). Etimológicamente significa “suciedad que duerme”, esto indica que una parte del vegetal no creció como debía, sino que dormía “cuitlacochtli”, de “cuitla” (excremento, suciedad, basura) y “cochtli” (dormir) (López, 1988; Leal, 1996; Martínez y col., 2000). 1.5.1 Agente etológico Ustilago maydis pertenece a la división Amastogomycota que son los hongos verdaderos y la subdivisión Basidiomycotina que se caracterizan por producir esporas en estructuras especializadas llamadas basidios y al orden Ustilaginales, también conocido como carbón común del maíz (Alexopolous y col., 1996; Ruiz, 2008). Es un hongo polimórfico, con una forma saprofita, la cual se desarrolla como células haploides levaduriformes (basidiosporas) las cuales son hialina, ovalada y se caracteriza por ser no patógena, y una fase patógena, la cual se desarrolla como células dicarioticas miceliales y que es la forma patógena que crece en la planta de maíz formando tumores o agallas en las partes aéreas de la planta, donde se forma una tercera forma, las teliosporas negras, esféricas o elipsoidales que presentan protuberancias prominentes y en forma de espina las cuales son las forma de propagación y de resistencia (Agrios, 2005; Calderón, 2010). 1.5.2 Taxonomía de Ustilago maydis Clasificación taxonómica de Ustilago maydis según R. H. Whittaker en 1969 (Leal, 1996), las características taxonómicas se describen en la Tabla 3. Reino Fungí Subreino Eumycota Rama Amastigomycota Filo Basidiomycota Clase Basidiomycetes Subclase Heterobasidiomycetidae Orden Ustilaginales Familia Ustilaginaceae Género Ustilago Especie maydis 5 Tabla 3. Características taxonómicas de Ustilago maydis Taxón Reino: Fungi o Mycetae División: Amastygomycota Subdivisión: Basidiomycotina Clase: Basidiomycete Subclase: Teliomycetidae Orden: Ustilaginales Género: Ustilago Especie: maydis Características No poseen clorofila, su alimentación es por absorción, son eucariontes, son pluricelulares. Pierden su fase móvil, no se adaptan a sistemas acuáticos, tienen hifas septadas, forman grandes cantidades de micelio. Son hongos que producen esporas sexuales denominadas basidiosporas o esporidias, sobre una estructura tubular o en forma de clava denominada basidio constituida por una o cuatro células, su estado diploide el basidio es muy corto, su estado dicariotico es muy prolongado, la mayoría son heterotalicas. Son parásitos de plantas, y no forman basidiocarpo. Constituyen el segundo grupo en importancia entre los hongos superiores que se caracterizan por tener núcleo dicariótico. Se diferencian de los Ascomicetos por la mayor importancia y duración de la fase dicariótica y, ante todo, porque las esporas que se originan después de la meiosis no son endosporas, sino exosporas (llamadas basidiosporas), que se forman en general en número de cuatro en la superficie de la célula esporífera (denomina basidio). Forman esporas de resistencia llamadas teliosporas con pared gruesa se encuentran envueltas en grupos en unas estructuras llamadas soros. En estas estructuras de resistencia se produce cariogamia y meiosis, después de la cual germinan, originando un basidio. Hongos comúnmente conocidos como carbones. Atacan principalmente las estructuras reproductoras. Producen poco micelio, con promicelio septado transversalmente. Forman soros o agallas contienen teliosporas café obscuras o negras. Ataca a plantas de importancia económica como: avena, trigo, cebada, maíz, etc. Sus teliosporas son lisas, con espinas o reticuladas, atacan al maíz y al teosinte Tomado de: Garibaldi, 2003; Cota, 2004; Agrios, 2005. 6 1.5.3 Signos y síntomas El desarrollo de la enfermedad se caracteriza por clorosis, disminución del crecimiento y formación de tumores que pueden desarrollarse en hojas, espiga, tallos y mazorcas, debido a la proliferación celular del meristemo de los tejidos. En el tumor el tejido de la planta es reemplazado por esporas (teliosporas) cubiertas por una membrana blanca y verdosa que más tarde se oscurece y forma una masa polvorienta color café. La membrana gris-plateada se rompe liberando teliosporas, principal mecanismo de diseminación de los carbones (Tamayo, 2009). 1.5.4 Ciclo de vida El hongo hiberna en forma de teliosporas en los restos del cultivo del maíz y en el suelo, donde se mantiene viable durante muchos años. En las estaciones de primavera y verano, las teliosporas si encuentra las condiciones óptimas de temperatura y humedad relativa germinan produciendo un basidio de cuatro células haploides (el promicelio), de cada una de las cuales se desarrolla una basidiospora hialina, ovalada uninucleada que son llevadas por las corrientes de aire y son salpicadas o arrastradas por la lluvia hasta los tejidos jóvenes y en proceso de desarrollo de las plantas de maíz donde germinan sobre la superficie del hospedero y producen una hifa fina (pseudomicelio monocariotico), el cual puede vivir saprofito sobre la superficie del hospedero y se introduce en las células epidérmicas por penetración. Sin embargo, después de un desarrollo inicial, su crecimiento se detiene y la hifa por lo general se marchita y en ocasiones muere, a menos que entre en contacto y se fusione con una hifa haploide proveniente de una basidiosporas del tipo de apareamiento compatible. En caso de que ocurra la fusión, la hifa resultante aumenta su diámetro y se vuelve dicariótica. Esta hifa se desarrolla en los tejidos de la planta principalmente a nivel intercelular. Las células que rodean a la hifa son estimuladas para que sufran hipertrofia e hiperplasia y comienzan a formarse las agallas, estas pueden empezar a formarse incluso antes de que el hongo invada a los tejidos (Agrios, 2005). El micelio en la agalla permanece intercelularmente durante la formación de la misma, pero antes de la esporulación, las células alargadas del maíz son invadidas por el micelio, por lo que se colapsan y mueren. El micelio del hongo utiliza los contenidos de la célula para desarrollarse, y la agalla consiste principalmente de micelio dicariótico y restos de células de los granos de maíz. La mayoría de las células dicarióticas posteriormente, se transforman en teliosporas y durante el proceso parecen absorber y utilizar el protoplasma de las demás células miceliales, las cuales quedan vacías. Estas teliosporas se agrupan en masas denominadas soros, las cuales se mantienen firmemente unidas por medio de una membrana la cual cubre a la agalla y no es afectada por el hongo, pero finalmente se rompe y las teliosporas son liberadas. Algunas de éstas llegan a los tejidos jóvenes meristemáticos del maíz, produciendo 7 nuevas infecciones y agallas durante la misma estación, pero la mayoría de ellas caen al suelo o permanecen en los restos del maíz, donde pueden sobrevivir durante años, en la Figura 3 se esquematiza el ciclo de vida de Ustilago maydis (Agrios, 2005). Figura 3. Ciclo de vida de Ustilago maydis. Al romperse el soro se liberan las teliosporas y de cada una de ellas germinara un basidio que producirá cuatro basidiosporas haploides cada una de estas podrá dividirse y formar pseudomicelio, al encontrar a su par sexual compatible podrá producir la infección formando un micelio dicariótico que penetrara en todo el tejido propiciando la hipertrofia e hiperplasia del tejido y la formación de teliosporas nuevamente. Tomado de: Tamayo, 2009. 8 1.5.5 Factores que influyen en formación del huitlacoche Para que se produzca la infección tienen que estar presentes algunos factores que propiciaran la germinación del hongo y su diseminación en el tejido de la planta de maíz los cuales se describen en la Tabla 4. Tabla 4. Factores que influyen en la infección del maíz por Ustilago maydis Factores Características Las temperaturas relativamente altas favorecen la germinación de basidiosporas, el crecimiento del micelio y formación de nuevas Temperatura teliosporas, el hongo se desarrolla muy bien entre 20-30°C. Sin embargo, la temperatura no es un factor importante en la infección de este hongo en el campo. La humedad es necesaria para la germinación y crecimiento del tubo germinativo antes de que el hongo invada la planta. Se han observado Humedad buenos resultados a una humedad relativa entre un 77-80%. Aunque en general se considera que la lluvia y el clima húmedo son factores críticos para el desarrollo del hongo. El desarrollo de la planta es de vital importancia en el crecimiento del hongo, se sabe que las plantas que crecen vigorosamente entre 6090cm de alto son más susceptibles al ataque de este microorganismo. Huésped En lotes fertilizados con nitrógeno se ha observado una mayor incidencia de la infección, debido a que acelera el crecimiento del maíz al mismo tiempo que aumenta la posibilidad de que un hongo infecte a la planta, lo contrario ocurre en lotes fertilizados con potasio. La inyección de basidiosporas al jilote de la planta produce un alto índice Vía de de infección, comparada con otras como: la inyección de teliosporas, inoculación aspersión de teliosporas en la planta, mezcla de teliosporas con semillas de maíz. Tomado de: Garibaldi, 2003; Valdez, 2010. 1.5.6 Producción de huitlacoche La más temprana mención al huitlacoche o cuitlacoche la encontramos en una obra del siglo XVI: “Historia General de las Cosas de Nueva España”, escrita por Fray Bernardino de Sahagún, con el objetivo de salvaguardar el conocimiento indígena ante la llegada de la cultura europea y solo se hace una muy breve mención al respecto, indicando que es una anormalidad del maíz que lleva a que la mazorca adquiera un color negruzco y se transforme en algo como lodo. Es aquí donde encontramos la más antigua denominación del hongo “cujtlacochi”, que significa algo como mugre que crece 9 encima del maíz y que es molesto. En otros lugares, por ejemplo en la zona maya, se le conocía como “Ta´wa nal chaak”, es decir, excremento del dios de la lluvia “Chaak” (Valdez, 2012). Recientemente, el huitlacoche ha sido considerado como un cultivo alternativo debido al incremento de su popularidad como alimento, y ha sido introducido en la alta cocina. El incremento en la aceptabilidad de este hongo podría estar relacionado, por un lado, a su alto valor nutricional, pero, principalmente por su excelente sabor (Martínez y col., 2008). El aumento en el consumo de huitlacoche en el país y en el extranjero ha motivado el desarrollo de tecnologías que conduzcan a la producción masiva de este hongo. Los agricultores han tratado de producir huitlacoche desde siempre y se han utilizado muchas estrategias un tanto rudimentarias. El huitlacoche para consumo y comercialización en gran medida sigue siendo recolectado de campos de maíz donde se presenta la infección de forma fortuita sin ningún procedimiento técnico establecido donde la infección es menor al 5% del total de los cultivos de maíz (Ruiz, 2008). Se estima que en la Ciudad de México, los principales puntos de distribución de huitlacoche son los mercados donde se venden entre 4-500 toneladas de agallas frescas de huitlacoche al año procedentes principalmente del centro y sur del país. Pocas empresas son las encargadas de la comercialización de huitlacoche enlatado, entre las que se encuentran Herdez, La Costeña, Monteblanco, San Miguel. (Al súper en casa.com, 2016). La compañía Herdez procesa cerca de 100 toneladas de huitlacoche al año. Para muchas personas de México este es considerado un manjar a pesar de su apariencia, pues tiene un sabor y una textura exquisitos, los principales estados de la República Mexicana donde se cosecha y es ampliamente consumido son: el Estado de México, Puebla, Oaxaca, Morelos, Veracruz, Michoacán y Distrito Federal. Actualmente, está teniendo gran interés en el extranjero a pesar que sea considerado un fitopatógenos para el maíz y reduzca la producción de maíz (Cota, 2004). 1.5.7 Propiedades nutritivas de huitlacoche En la época prehispánica era considerado como algo “indeseable”, porque significaba la pérdida de la mazorca. En la época de la Colonia y hasta el siglo XIX, el huitlacoche fue alimento de subsistencia para los indígenas y campesinos, y no es sino hasta el siglo XX que comienza a adquirir “autonomía cultural”, pero no por ello deja de ser considerado un manjar. El huitlacoche, además de un exquisito sabor, contiene ácidos grasos esenciales (Omega 3 y Omega 6), es rico en aminoácidos, aporta fibra y es bajo en grasas, contiene fósforo, vitamina C, varios minerales y sustancias con propiedades antitumorales (Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, 2016). El huitlacoche contiene carbohidratos, proteínas, grasas, minerales y vitaminas que contribuyen a su valor nutricional. El contenido de proteínas varía entre 10-20% de 10 material seco. Se puede decir que el huitlacoche tiene proteínas de muy buena calidad, con un extraordinariamente alto contenido de lisina; muy elevado en relación a lo que se ha reportado para el maíz y otros vegetales. Aquí vale la pena insistir que las proteínas del maíz son deficientes en lisina, por lo que fue un inteligente acierto nutricional la complementación histórica que hicieron las distintas culturas mexicanas al consumir huitlacoche con tortilla. El contenido de carbohidratos 55.1-66.5% y fibra 16.023.5% es muy alto y contiene poca grasa 1.6-2.3%; no obstante tiene gran cantidad ácidos grasos como: linolenico, linoleico (conocido como omega 3) y palmítico, esencial para el consumo humano, en la Tabla 5 se comparan las concentraciones de algunos nutrientes del huitlacoche y el maíz en peso seco (Valdez y col., 2009; Juárez y col., 2011). Tabla 5. Comparación de la concentración en peso seco de algunos nutrientes del huitlacoche y el maíz Huitlacoche (Ustilago maydis) 14.8% 10.4% 11.3% 8.2% 0.69% 41-46% 27-34% 1.2-1.8% 14% 2-4.4% 140-180 mg/g 60-100 mg/g 8.82 mg/g 3.17 mg/g 4.45 mg/g No es encontrada 40-60% 10-30% 30-50% Nutriente Lisina Leucina Aminoácidos Glicina Acido aspártico Metionina Oleico Linoneico Ácido graso Linolenico Palmítico Ácido araquidico Glucosa Fructuosa Monosacárido Glicerol Manitol Sorbitol Sacarosa Total de fibra dietética Polisacárido Fibra dietética soluble Fibra dietética insoluble Maíz (Zea mays) 2.6-3.5% 12.0-15.8% 2.6-4.7% 5.8-7.2% 1.98% 20-46% 35-70% 0.8-2% 7-19% 0.1-2% 0.1-8.9 mg/g Hasta 7.6 mg/g No determinada No determinada Hasta 3.7 mg/g 4.4-94.6 mg/g 7-12% 1.5% 5-10% Tomado de: Juárez y col., 2011. Se ha reportado que este hongo produce vitaminas del complejo B como: riboflavina, biotina, niacina y ácido fólico, con excepción de la vitamina B12, al igual se han encontrado compuestos fenólicos en altas concentraciones, los cuales poseen propiedades antioxidantes que son muy útiles para la prevención de enfermedades 11 como el cáncer y la arteriosclerosis, se le puede incluir en lo que ahora se les conoce como alimentos nutracéuticos (Valdez y col., 2009; Jiménez, 2013). 1.6 Maíz Maíz, significa literalmente “lo que sustenta la vida”. Botánicamente, el maíz (Zea mays) pertenece a la familia de las gramíneas y es una planta anual alta dotada de un amplio sistema radicular fibroso (FAO, 1993). El maíz es uno de los cereales utilizados por el hombre desde épocas remotas y una de las especies vegetales más productivas, tanto en su producción global (cerca de 600 millones de toneladas por año) como en su productividad (más de 4 t/ha). Su centro de origen está en México desde donde se difundió a todo el mundo después del primer viaje de Cristóbal Colón a fines del siglo XV (Paliwal, 2015). El maíz es la forma domesticada de una subespecie de teocintle (Zea mays ssp. parviglumis), un pasto silvestre, la domesticación del teocintle ocurrio aproximadamente entre los 4 – 3,000 años A.C. El maíz que actualmente conocemos es un pasto gigante domesticado (Zea mays ssp. mays) de origen mexicano. La planta es usada para producir granos y forraje, los cuales constituyen la base para la elaboración de un buen número de alimentos tanto para nuestra especie como para otros animales, así como para la industria farmacéutica y manufacturera. El cultivo del maíz, y la elaboración de diversos productos alimenticios están ligados con el surgimiento y evolución de las civilizaciones mesoamericanas pre-colombinas. Debido a su adaptabilidad y productividad el cultivo del maíz se expandió rápidamente alrededor del mundo después de que los españoles y otros europeos exportaron la planta de las Américas en los siglos XV y XVI. Actualmente el maíz es producido en la mayoría de los países del mundo siendo el tercer cultivo por la superficie involucrada después del trigo y del arroz (Salvador, 2001). La mayor parte de la producción de maíz ocurre en los Estados Unidos, China y Brasil, países que en conjunto obtienen un aproximado de 60% de la producción global anual estimada en 1,000 millones de toneladas. México, ocupa el octavo lugar de producción mundial, actualmente produce alrededor de 23 millones de toneladas (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, 2015). 12 1.6.1 Taxonomía del maíz Clasificación taxonómica del maíz R. H. Whittaker en 1969 (Sánchez, 2014). Reino Plantae Phylum Magnoliophyta Clase Lilipsida Orden Cyperales Familia Poaceae Subfamilia Panicoideae Género Zea Especie mays 1.6.2 Estructura de la planta de maíz La planta de maíz es de porte robusto de fácil desarrollo y de producción anual. Se puede definir la planta del maíz como un sistema metabólico cuyo producto final es fundamentalmente el almidón depositado en unos órganos especializados: los granos. (FAO, 1993). Se trata de una especie que se reproduce por polinización cruzada y la flor femenina (elote, mazorca, choclo o espiga) y la masculina (espiguilla) se hallan en distintos lugares de la planta. En la Tabla 6 y en la Figura 4 se describen y muestran las partes de la planta de maíz (FAO, 1993). 1.6.3 Estructura del grano de maíz Los granos de maíz se desarrollan mediante la acumulación de los productos de la fotosíntesis, la absorción a través de las raíces y el metabolismo de la planta de maíz en la inflorescencia femenina denominada espiga. Posee de 10-22 líneas de granos por mazorca de y de 18-42 granos por línea. Esta estructura puede contener de 300 a 1,000 granos según el número de hileras y el diámetro y longitud de la mazorca. El peso del grano puede variar mucho, de aproximadamente 19-30g por cada 100 granos. El color del grano de maíz es muy variado pero el más común es amarillo, al igual que su forma que puede ser prismática, ovoide, liso, picudo. (FAO, 1993). En la Tabla 7 se describen las partes del grano de maíz y en la Figura 5 se observa su estructura. 13 Figura 4. Estructura y desarrollo de la planta de maíz. Se observa el desarrollo de una planta de maíz desde la germinación de un grano hasta observar una planta adulta de maíz. A) Raíces seminales, B) Raíces permanentes, C) Raíces adventicias, D) Tallo, E) Hoja, F) Flor femenina y G) Flor masculina. Tomado de: Condori, 2014. 14 Tabla 6. Partes de la planta de maíz Parte Descripción La raíz de una planta de maíz es fasciculada con un potente desarrollo. Tienen tres tipos de raíces: A) Seminales: Nacen en la semilla después de la radícula. No son permanentes. B) Permanentes: En este grupo están incluidas las principales y Raíz secundarias. Están nacen por encima de las primeras raicillas en una zona llamada corona. Este grupo constituye el llamado sistema radicular principal. C) Adventicias: Nacen de los nudos inferiores del tallo y actúan de sostén en las últimas etapas del crecimiento, absorbiendo a la vez agua y sustancias nutritivas. Es erguido, sencillo y nudoso. Tiene surcos longitudinales en la parte inferior. Tiene una altura de unos 2 metros (lo más común aunque hay de Tallo mayor altura) con una serie de entrenudos de unos 16cm. El primer tallo que emerge de la semilla se llama mesocotilo, que se alarga más o menos según la profundidad de siembra, al final de este tallo se forma la corona y luego el tallo final y las raíces. Las hojas son alternas, abrazadoras, anchas, paralelinervias, lanceoladas y Hoja ásperas. Su longitud es de 40-45cm y 6-8cm de ancho. La planta tiene de cuatro a cinco hojas embrionarias que van protegidas hasta que salen a la superficie por el coleoptilo, que se rompe saliendo la primera hoja. Es una planta monoica, en la cual se distinguen dos tipos de flores: Las flores femeninas, se encuentran en la axila de algunas hojas, están formando una inflorescencia en espiga rodeada por largas bracteas que la cubren por completo. La espiga llamada mazorca está formada por una serie de espiguillas, cada una de las cuales está formada por dos flores de Flor las cuales la inferior aborta. Cada espiguilla, en caso de fecundación dará un grano. En el extremo de la mazorca se desarrollan unos estilos largos llamados sedas en los cuales cae el polen y se desarrolla el tubo polínico. La flor masculina está en la extremidad del tallo agrupada en panículas que se llaman penachos. Está formada por 3 a 10 filas de espiguillas emparejadas, cada una de ellas compuesta por dos glumas y contiene dos flores con tres estambres cada una siendo las dos flores fértiles. El grano se dispone en hileras longitudinales y hay varios cientos en una Grano mazorca. Es generalmente aplastado en un plano perpendicular al eje de la mazorca, como es el caso de la mayoría de los híbridos actuales. El grano se inserta a la mazorca por el pedúnculo de la flor. Tomado de: Pavón, 2003. 15 Tabla 7. Partes que conforman el grano de maíz Estructura Característica Protege la semilla antes y después de ser sembrada impidiendo la Pericarpio entrada de hongos. La lesión en la cubierta puede inutilizar la semilla. Es la reserva nutricional del grano, está compuesto por un 90% de almidón, 7% de proteína y el resto son aceites minerales. La función principal consiste en proporcionar nutrientes al embrión durante su Endospermo germinación y sustenta las etapas primarias del crecimiento, hasta amiláceo que sus raíces y hojas estén bien desarrolladas para satisfacer sus necesidades nutricionales. En el endospermo, las proteínas conforman una matriz córnea en cuyo interior se hallan los gránulos de almidón. Está formado por el eje embrionario y por el escutelo. El eje Embrión embrionario está formado por la plúmula (de 4-5 hojas) y radícula. El escutelo corresponde al cotiledón. Tomado de: Pavón, 2003. Figura 5. Estructura del grano de maíz. Se observa cada una de las partes que conforma la estructura de un grano de maíz, la porción más externa y que protege al grano el pericarpio, seguida del endospermo y la porción central el embrión o germen. Tomado de: FAO, 1993. 16 1.6.4 Clasificación de los tipos maíz La característica variable del maíz que más se relaciona con sus usos como alimento es la composición de su endospermo. En la Tabla 8 se describe una sencilla clasificación del maíz se basa en las características del endospermo donde se distinguen cinco tipos de maíz. Tabla 8. Clasificación de los tipos de maíz Tipo Descripción Consiste de pequeños frutos esféricos con un núcleo de almidón harinoso (suave) y una capa de endospermo compacto (duro). La Palomero humedad atrapada en el almidón harinoso se expande mediante la aplicación de calor haciendo que el almidón salga a través de dicha capa endurecida, produciendo así las populares palomitas. Similar al maíz palomero, pero con frutos más largos. El maíz cristalino probablemente fue desarrollado a partir de maíces palomeros mediante Cristalino la selección de frutos de mayor tamaño y rendimiento. Este tipo de maíz (Duro) es producido en áreas donde puede requerirse tolerancia al frío o bien en zonas donde las condiciones de germinación y almacenaje son pobres. El descubrimiento y selección de esta característica constituyó un paso esencial para la amplia dispersión, desarrollo y adopción de una gran cantidad de alimentos elaborados a base de maíz. La harina de maíz Harinoso continua siendo la forma preferida para la elaboración de productos de (Blando) consumo humano directo, debido a que consiste de almidón blando que es fácilmente utilizable para producir alimento que puede consumirse directamente (pinole), o bien para elaborar pan plano (tortilla), masa cocida (tamal) o bebidas (atole). Consiste de un núcleo de almidón harinoso con inclusiones laterales de almidón duro. Debido a que el ápice del fruto consiste de almidón harinoso, la pérdida de humedad de esta área al alcanzar la madurez Dentado causa un ligero colapso en el volumen lo cual le brinda la típica apariencia de un diente. Este es el tipo de maíz que se produce más a nivel mundial, siendo usado en la alimentación del ganado así como para diversos productos industriales (almidón, jarabe, aceite, alcohol). El endospermo consiste principalmente de azúcar soluble, con un poco Dulce de almidón y una forma intermedia de un polímero de azúcar llamado fitoglicógeno. Tomado de: Salvador, 2001. 17 1.6.5 Etapas de desarrollo del maíz El desarrollo de la planta se puede dividir en dos fases fisiológicas. En la primera, o fase vegetativa, se desarrollan y diferencian distintos tejidos hasta que aparecen las estructuras florales. La fase vegetativa consta de dos ciclos. En el primero se forman las primeras hojas y el desarrollo es ascendente; en este ciclo, la producción de materia seca es lenta y finaliza con la diferenciación tisular de los órganos de reproducción. En el segundo ciclo se desarrollan las hojas y los órganos de reproducción; este ciclo acaba con la emisión de los estigmas. La segunda fase, también llamada fase de reproducción, se inicia con la fertilización de las estructuras femeninas que se diferenciarán en espigas y granos. La etapa inicial de esta fase se caracteriza por el incremento de peso de las hojas y otras partes de la flor; durante la segunda etapa, el peso de los granos aumenta con rapidez, se describen cada una de las etapas del desarrollo del maíz en la tabla 9 y se observan en la Figura 6 (FAO, 1993). Además, las etapas de crecimiento se pueden agrupar en cuatro grandes períodos: Crecimiento de las plántulas (etapas VE y V1) Crecimiento vegetativo (etapas V2, V3... Vn) Floración y la fecundación (etapas VT, R0, y R1) Llenado de grano y la madurez (etapas R2 a R6) Floración masculina VT Floración femenina R1 R6 V12 V6 Siembra VE V2 V3 Figura 6. Etapas de desarrollo del maíz. Se observa el desarrollo de la planta de maíz, donde: VE) es la fase de emergencia donde el coleoptilo emerge del suelo, V2) es la fase vegetal se hace visible el cuello de la segunda hoja, V3) es la fase vegetal se hace visible el cuello de la tercera hoja V6) es la fase vegetal donde es visible el cuello de la hoja número 6, V12) es la fase vegetal donde es visible la hoja número 12, VT) fase vegetal donde comienza la floración masculina es visible la última rama de la panícula, R1) fase reproductiva donde comienza la floración femenina y son visibles los estigmas del jilote, R6) se alcanza la madures de la planta del maíz. Tomado de: Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz Y Trigo [CIMMYT], 2015. 18 Tabla 9. Descripción de las etapas en el desarrollo del maíz Etapa VE V1 V2 DAS* Características 5 El coleoptilo emerge de la superficie del suelo 9 Es visible el cuello de la primera hoja. 12 Es visible el cuello de la segunda hoja. Es visible el cuello de la hoja número "n". ("n" es igual al número definitivo de hojas que tiene la planta; "n" generalmente fluctúa entre Vn 16 y 22, pero para la floración se habrán perdido las 4 a 5 hojas de más abajo.) VT 55 Es completamente visible la última rama de la panícula. R0 57 Antesis o floración masculina. El polen se comienza a arrojar. R1 59 Son visibles los estigmas saliendo del jilote. Etapa de ampolla. Los granos se llenan con un líquido claro y se R2 71 puede ver el embrión. R3 80 Etapa lechosa. Los granos se llenan con un líquido lechoso blanco. Etapa masosa. Los granos se llenan con una pasta blanca. El R4 90 embrión tiene aproximadamente la mitad del ancho del grano. Etapa dentada. La parte superior de los granos se llena con almidón sólido y, cuando el genotipo es dentado, los granos adquieren la R5 102 forma dentada. En los tipos tanto cristalinos como dentados es visible una "línea de leche" cuando se observa el grano desde el costado. Madurez fisiológica. Una capa negra es visible en la base del grano. R6 112 La humedad del grano es generalmente de alrededor del 35%. * DAS: Número aproximado de días después de la siembra en tierras bajas tropicales, donde las temperaturas máximas y mínimas pueden ser de 33°C y 22°C, respectivamente. En los ambientes más fríos, se amplían estos tiempos. Tomado de: CONACYT, 2014. 1.7 Antecedentes El huitlacoche es un alimento de alto valor nutricional por su alto contenido proteínico de buena calidad que van del 10-20%, su rico contenido de carbohidratos del 55.166.5% y de fibra 16.0-23.5%. Así como, baja cantidad de grasas del 1.6-2.3%, aunado a sus propiedades antioxidantes (Valdez y col., 2009; Juárez y col., 2011), comparado con los granos de maíz sin infección con tan solo 9% de contenido proteínico y una mayor concentración de grasas que es de un 5% (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, 2016). Debido a su importancia económica, el costo va de 40-140 pesos por kg (Central de Abastos de la Ciudad de México, 2007). Por lo cual, se han 19 buscado metodologías para la producción de este hongo para mejorar el rendimiento y lograr la infección con el uso de diferentes cepas y estadios del hongo. Actualmente, se busca la forma de producir a gran escala este hongo ya que los métodos para la inducción aún siguen siendo rudimentarios como la aspersión de teliosporas sobre la mazorcas o el campo, a pesar que ya excitan algunos métodos para mejorar los resultados en la infección estos son caros y necesitan de instalaciones adecuadas para manipular al hongo. Por lo tanto se busca lograr una metodología sencilla y económica para lograr la infección inducida, otro punto importante para su producción es su remuneración económica ya que es más elevada comparada con la venta del maíz sin infección. Leal (1996) evaluó el tipo de inóculo para obtener mejores resultados para inducir la infección de plantas de maíz comparando teliosporas y basidiosporas de Ustilago maydis, la frecuencia de inoculación, vía de inoculación y la concentración del inóculo, obteniendo las teliosporas a partir de una mazorca infectada triturando las agallas y tamizándolas con mallas del número 80mm hasta obtener solo teliosporas y germinandolas en el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) posteriormente se obtuvo biomasa de basidiosporas en un medio mínimo mineral líquido, se encontró que es conveniente usar inóculo de basidiosporas en lugar de teliosporas encontrando mayor incidencia de formación de agallas con el uso de basidiosporas, al comparar la aplicación de una solo dosis de inóculo o dos, se encontró que al aplicar dos dosis de basidiosporas incrementan el porcentaje de formación de agallas la primera al formarse el jilote y la segunda cuando emergieron los estigmas, al comparar una concentración de 1x105/mL y otra de 1x106/mL de teliosporas y basidiosporas, no se encontró diferencia en la incidencia de infección, se determinó que la aplicación endógena (inyección) es mejor la aplicación exógena (aspersión sobre la planta). Martínez y col. (2000) evaluaron y seleccionaron cepas de Ustilago maydis con alta virulencia sobre el maíz partiendo de teliosporas obtenidas de mazorcas totalmente cubiertas con agallas de huitlacoche desinfectando las agallas y sembrando las teliosporas en el medio de cultivo PDA hasta obtener basidiosporas generando biomasa en este medio y ajustando los inóculos de basidiosporas a 106/mL con agua destilada y con estas últimas inocular plantas de maíz, de 100 cepas de basidiosporas aisladas se encontraron 12 cepas con un porcentaje de infección mayor al 70%. Cota (2004) evaluó cepas locales de Ustilago maydis del Valle de Yaqui en Sonora en plantas de maíz para la producción de huitlacoche en esa localidad, en su investigación evaluó cruzas de cepas y cepas solas de basidiosporas seleccionadas de un trabajo previo del Instituto Tecnológico de Sonora recolectadas en el 2004 por Clavero de distintos puntos de la localidad, adaptadas a condiciones de laboratorio y reactivadas en caldo dextrosa de papa, encontrando mayor porcentaje de infección en las mazorcas de maíz usando las cruzas de cepas de basidiosporas. Valdez y col. (2009) evaluaron la susceptibilidad de 15 diferentes genotipos de maíz criollo de Guanajuato para la producción de este hongo usando basidiosporas de 20 Ustilago maydis a una concentración de 1x106/ml adaptadas a condiciones del Laboratorio de Biotecnología de Alimentos del CINVESTAV-Irapuato reactivándolas en medio PDA y generando biomasa en medio líquido extracto de Papa obteniendo porcentajes de infección mayores al 90% en el maíz criollo de la localidad de Loma de Cabra Guanajuato. Madrigal y col. (2010) realizaron ensayos bajo condiciones de invernadero para la producción de huitlacoche en hidropónia, evaluó la producción del hongo en híbridos comerciales de maíz con cepas de teliosporas provenientes de los mismos tipos de híbridos de maíz para considerarlos apropiadas cada uno de ellos, germinado las teliosporas en medio PDA y así generar los inóculos de basidiosporas ajustando la concentración a 1x106/mL con agua destilada, encontrando mayor incidencia de infección en el hibrido comercial 30G40. Jiménez (2013) obtuvo teliosporas de la localidad de Miahuatlán Veracruz las cuales fueron sembradas en medio PDA para que estas germinaran en basidiosporas, posteriormente generó biomasa en medio PDA y ajustó un inóculo de basidiosporas a 1x106/mL con agua destilada, conservándolas a 4°C hasta su uso, con esto produjo un inóculo artificial de Ustilago maydis. Escalante (2013) evaluó la infectividad de las teliosporas y basidiosporas de Ustilago maydis en diferentes híbridos comerciales de maíz, obteniendo las basidiosporas de un experimento anterior conservadas desde el 2001 en un cepario del laboratorio de fitotecnia de la Universidad Autónoma de Chapingo estas se reactivaron en PDA y ajustando los inóculos de basidiosporas a una concentración de 1x106/mL con agua destilada y cloranfenicol, y las teliosporas obtenidas a partir de mazorcas con agallas donde se trituraron las agallas en una licuadora domestica para así obtener el concentrado de teliosporas, encontrando que se obtienen los mejores resultados en infección con el uso de un inóculo de teliosporas a una concentración de 1x106/mL sobre los híbridos de maíz. Moncada (2014) evaluó un método para la obtención de teliosporas purificadas de Ustilago maydis para encontrar cepas patógenas y así producir huitlacoche, recolectando mazorcas con agallas las cuales fueron trituradas y filtradas, posteriormente, lavadas con agua destilada y desinfectadas con sulfato de cobre al 0.5% sembrando las teliosporas lavadas, en medio de cultivo completo descrito por Holliday en 1974, obteniendo colonias de basidiosporas sexualmente compatibles por tener crecimiento de aspecto algodonoso al mezclar colonias levaduriformes. 21 2. JUSTIFICACIÓN La realización de este trabajo se basa en que el huitlacoche a pesar de ser un hongo fitopatógeno para el maíz es considerado como alimento en la comida mexicana con alto valor nutricional, al tener controlados algunos factores ambientales y microbiológicos se puede lograr la producción a gran escala para su comercialización. En la actualidad, pocas son las empresas encargadas de su comercialización entre las que se encuentran: Herdez, La Costeña, Monteblanco, San Miguel, aunado a que la obtención de este hongo se da por el crecimiento dado en los cultivos de maíz de manera fortuita, y no son específicos, con un desarrollo en condiciones normales menor al 5%. Actualmente, el costo de este producto oscila entre los 40-140 pesos por kg reportado por la Central de Abastos de la Ciudad de México, de acuerdo a la temporada del año, en temporada de lluvia es la épocas del año en donde es fácil conseguirlo e incluso es más económico. Este trabajo estuvo encaminado en realizar un procedimiento donde se controlen algunos factores que alteran el desarrollo del hongo en forma natural, como vía de inoculación, concentración del inóculo con esporas, y la producción de inóculo adecuado, de forma eficiente y económica para su posterior uso en la producción del huitlacoche bajo condiciones controladas. 22 3. OBJETIVOS Objetivo general Desarrollar un protocolo para la inoculación de Ustilago maydis en maíz bajo algunas condiciones controladas para la producción de huitlacoche a bajo costo. Objetivos particulares Obtener un concentrado puro de teliosporas de Ustilago maydis. Determinar la viabilidad de las teliosporas de Ustilago maydis. Aislar una cepa pura de basidiosporas de Ustilago maydis. Evaluar las condiciones óptimas para el crecimiento de la fase de basidiospora de Ustilago maydis. Comparar y seleccionar el medio de cultivo adecuado para la propagación del hongo y generación del inóculo. Evaluar la eficiencia de infección del hongo Ustilago maydis en diferentes etapas de desarrollo del maíz con el uso de teliosporas y basidiosporas. Determinar la vía de inoculación más adecuada para obtener mayor eficiencia en la infección de maíz, así como la concentración de inóculo adecuado. 23 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1 Selección de mazorcas con infección por Ustilago maydis Los criterios para la selección de las mazorcas infectadas por Ustilago maydis fueron: mazorca sin estado de descomposición, evidente presencia de agallas color grisáceas al abrir estas agallas debían tener una masa negra de teliosporas, y que aun estuvieran cubiertas por las hojas y que estas siguieran verdes, se evitó aquellas que tuvieran hojas con polvo, secas o marchitas para disminuir carga microbiana externa, posteriormente se desinfectaron. 4.2 Selección de granos jóvenes de maíz sin infección Los granos utilizados para las primeras pruebas tenían que ser de mazorcas recién cortadas de cultivo de la localidad de San Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de México, las mazorcas tenían que estar aún cubiertas por las hojas que lo recubre y estás hojas sin marchitez, sin polvo y sin presencia de insectos, posteriormente se desinfectaron. 4.3 Selección de granos maduros para siembra Los granos ocupados tenían que ser granos de la recolección del año anterior, sin evidencia de insectos e intactos, evitando aquellos rotos o con insectos, posteriormente se desinfectaron. 4.4 Evaluación de la eficiencia de infección de un macerado de teliospora de Ustilago maydis 4.4.1 Prueba en mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos infectados con Ustilago maydis La primer prueba realizada fue determinar si era posible infectar granos de maíz jóvenes, realizando una mezcla de granos de maíz jóvenes sanos y un macerado de granos infectados con Ustilago maydis (fase de teliospora), lo primero fue la selección de una mazorca infectada con Ustilago maydis aquella que presentara evidente hipertrofia y una masa negra de teliosporas, retirando las hojas que lo cubrían y lavando al chorro de agua corriente para eliminar restos de hojas, polvo y otros artefactos contaminantes de la muestra, se desgrano y seleccionaron los granos en mejores condiciones los más grandes y con abundancia en teliosporas, estos se lavaron con solución jabonosa preparado con agua corriente más jabón líquido comercial, se eliminó el exceso de jabón con agua corriente, posteriormente se sumergieron en hipoclorito de 24 sodio al 1% por 15 minutos y después se realizaron tres lavados con agua corriente escurrieron perfectamente y posteriormente se trituraron los granos en un recipiente con una cuchara previamente desinfectados con hipoclorito de sodio al 1%, hasta obtener una masa homogénea. Posteriormente, se lavaron las mazorcas sanas con granos jóvenes de la misma forma que a las agallas hasta obtener los granos limpios. Con este macerado de los granos infectados más los granos sanos se realizaron mezclas por triplicado en proporciones volumen a volumen (V:V), infectado vs sano en diferentes diluciones 1:10, 1:5 y 2:5 y se colocaron en vasos de plástico de 250mL cubriendo los recipientes con una malla de plástico, y se observaron periódicamente durante un mes para observar los cambios en los granos sano. 4.4.2 Pruebas de inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con suspensión de teliosporas de Ustilago maydis Se obtuvieron las teliosporas de la misma forma a lo antes mencionado (4.4.1), y se prepararon diferentes diluciones (1:3, 1:2 y 1:1.5) del concentrado de teliosporas y agua potable volumen a volumen (V:V), de cada dilución se inocularon por inyección 0.2mL en granos jóvenes sanos utilizando siete granos por cada dilución, dichos granos se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% y otra serie de siete granos utilizada como control negativo se inocularon 0.2mL de agua potable en las mismas condiciones. Posteriormente, se colocaron los granos en cajas Petri a temperatura ambiente, observando periódicamente durante un mes observando los cambios sobre los granos de maíz. 4.4.3 Prueba de inoculación de mazorcas jóvenes y sanas con suspensión de teliosporas de Ustilago maydis Se seleccionaron mazorcas jóvenes, las cuales se limpiaron a chorro de agua para eliminar los restos de polvo o artefactos, sin retirar las hojas que cubren los granos para mantenerlos protegidos, se desinfectaron sumergiendo en una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 15 minutos, después se realizaron 3 lavados con agua corriente y se escurrieron perfectamente. Se realizaron diferentes diluciones (1:3, 1:2 y 1:1.5) de un concentrado de teliosporas más agua potable (V:V), se tomó 1mL de cada dilución y se usó como inóculo por inyectar en la base de las mazorcas, otra mazorca fue usada como control negativo a la cual se le inyecto 1mL de agua potable, posterior a la inoculación las cuatro mazorcas se colocaron en un recipiente incubando a temperatura ambiente y se observó periódicamente durante un mes, transcurrido este tiempo se retiraron las hojas que protegían las mazorcas y se evaluó el efecto de cada concentrado. 25 4.4.4 Determinación de la infectividad de la fase de teliosporas de Ustilago maydis por aspersión sobre granos de maíz germinando Se desinfectaron granos de maíz y se colocaron en caja Petri con algodón humedecido hasta observar su germinación, cuando tenían dos semanas de desarrollo se les agrego una suspensión de teliosporas que los cubriera dejando actuar por una semana, después se sembraron en vasos de 250mL con suelo estéril y se observó periódicamente el efecto producido. 4.5 Obtención de un concentrado de teliosporas puras de Ustilago maydis Se realizó la selección de una mazorca infectada con Ustilago maydis, ya presentaban una evidente hipertrofia y una masa negra de teliosporas, se prepararon como en el apartado (4.4.1), se desgranó y se seleccionaron los granos en mejores condiciones aquellos que fueran más grandes y con abundancia en teliosporas, a partir de este punto se trabajó en condiciones asépticas en campana de flujo laminar, se lavaron los granos con solución jabón líquido comercial, se eliminó el exceso de jabón con agua destilada estéril, se sumergieron los granos en hipoclorito de sodio al 1% por 15 minutos, posteriormente se eliminó el exceso de hipoclorito con tres lavados de agua destilada estéril escurriendo perfectamente, se procedió a realizar el macerado de estos en un tubo para centrifuga de 15mL con ayuda de un aplicador de vidrio El macerado obtenido se separó en tubos para centrifuga de 15mL, cada tubo con un volumen de la mezcla de teliosporas y macerado del maíz de 5mL se aforaron a un volumen final de 10mL con agua destilada estéril, y posteriormente se centrifugó por 15 minutos y decantó el sobrenadante, después se realizaron dos lavados más con agua destilada estéril y centrifugando por el mismo tiempo, el concentrado de teliosporas se retó ante diferentes concentraciones de NaCl, para generar un gradiente de concentración y separar los restos de tejido vegetal de las teliosporas, partiendo de una solución al 0.85%. Posteriormente a diferentes concentración de: 1%, 1.5%, 2%, y aumentando gradualmente la concentración en 0.5%, hasta una concentración del 30% de NaCl, se centrifugó cada una por 15 minutos y retiraron los restos vegetales que quedaban en el sobrenadante. Se evaluaron las diferentes concentraciones de NaCl para determinar la óptima para lograr separar el tejido vegetal de las teliosporas. Después de encontrar la concentración óptima para separar tejido vegetal de las teliosporas para su posterior evaluación de viabilidad, se realizaron tres lavados con solución fisiológica al 0.85% de NaCl y se centrifugaron en cada caso por 15 minutos. Posteriormente, al concentrado de teliosporas se le agregó una solución de CuSO 4 al 1% como agente bactericida y se dejó actuando por 24 horas, se realizó un lavado con solución fisiológica estéril para eliminar el exceso de la solución de CuSO4, se conservaron las teliosporas en refrigeración a 4°C hasta su uso. 26 4.5.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis 4.5.1.1 Prueba en medio líquido de extracto de maíz De los concentrados de teliosporas retadas con concentraciones de 4% y 30% de NaCl, se prepararon dos tubos para cada concentración y se colocó un volumen de 2mL del concentrado de teliosporas por tubo, se les adicionó 8mL de medio líquido de extracto de maíz a cada uno hasta obtener un volumen final de 10mL, se incubo el tubo con la suspensión de 4% de NaCl y el de 30% de NaCl a 37°C mientras que la otra serie de tubos se incubo a 27°C, cada 24 horas en la campana de flujo laminar se tomó una gota y se colocó en un portaobjetos más una gota de azul de metileno y se observó al microscopio a (40X), hasta observar la germinación de las teliosporas. 4.5.1.2 Prueba en medio sólido de extracto de maíz De los concentrados de teliosporas retadas con concentraciones de 4% y 30% de NaCl, se prepararon dos tubos para cada concentración y se colocó un volumen de 2mL del concentrado de teliosporas por tubo, se le adicionaron 8mL de solución salina al 0.85% a cada tubo hasta obtener un volumen final de 10mL. Después, se tomó 1mL de cada uno de los cuatro tubos preparados y se inocularon por duplicado placas de agar extracto de maíz por cada tubo, se incubo una serie que constaba de dos placas con la suspensión de 4% de NaCl y dos placas con la suspensión de 30% NaCl a 37°C y la otra serie se incubo a 27°C, se realizaron observaciones cada 24 horas, hasta observar crecimiento. 4.6 Aislamiento de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago maydis en agar extracto de maíz Se realizó la selección de una mazorca infectada con Ustilago maydis, que ya presentaban una evidente hipertrofia y una masa negra de teliosporas, se prepararon como se mencionó anteriormente en el punto (4.4.1), se desgrano y se seleccionaron los de granos en mejores condiciones aquellos que fueran más grandes y con abundancia en teliosporas, a partir de este punto se trabajó en condiciones asépticas en campana de flujo laminar, se realizó un corte transversal y uno longitudinal pasando por el centro de los granos con ayuda de bisturí, aguja y pinzas estériles. Asimismo, se tomó una asada de teliosporas y se sembraron cuatro placas de agar extracto de maíz por estría cruzada, dos placas se incubaron a 27°C y dos a 37°C, realizando observaciones cada 24 horas hasta observar crecimiento, después de obtener colonias, se realizaron las observaciones macroscópicas y microscópicas de cada colonia obtenida, se descartaron las colonias con crecimiento micelial y bacteriano, se seleccionaron solo las colonias con morfología microscópica 27 levaduriforme, resembrando cada colonia levaduriforme en agar extracto de maíz por estría simple (una colonia por placa), se incubó a 37°C por 96 horas, para generar biomasa, transcurrido este tiempo se realizó una suspensión de cada placa de agar tomando cinco colonias por placa y resuspendiendo en 5mL de solución salina al 0.85%, después se tomó 1mL de cada suspensión en jeringa hipodérmicas y se inocularon por inyección a plantas de maíz de un mes de desarrollo, se esperó observar los efectos en las plántulas así inoculadas y posiblemente infectadas por este método. Tres semanas después de los ensayos de infección con Ustilago maydis se realizaron cortes de las zonas afectadas, se tiñeron con azul de metileno, se realizó la observación al microscopio a (40X) y (100X), buscando el micelio y las teliosporas para confirmar infección y la presencia del hongo, seleccionando las colonias que presentaran las mismas características morfológicas macroscópicas y microscópicas que produjeron la infección y se resembraron en medio agar extracto de maíz para su posterior uso. 4.7 Determinación de infectividad de los estadios de Ustilago maydis sobre plantas de maíz Se realizaron tres pruebas para evaluar los dos estadios del hongo (teliosporas y basidiosporas), así como, la combinación de colonias de basidiosporas: 1) Se resembraron seis colonias provenientes de la misma placa de agar extracto de maíz con las mismas características levaduriformes, por lo tanto, la misma cepa confirmadas de Ustilago maydis (cepa haploide) en un tubo con 10mL de medio líquido de extracto de maíz y se incubo a 37°C por 96 horas. 2) Después se seleccionaron seis colonias provenientes de diferentes placas con morfologías levaduriformes y también seleccionando aquella que presentaba pseudomicelio y con morfología microscópica idéntica, por lo tanto se consideraban diferentes cepas confirmadas de Ustilago maydis para generar un apareamiento sexual y formar un inoculo con cepas diploides, se resembraron en un tubo con 5mL de medio líquido de extracto de maíz y se incubo a 37°C por 96 horas. 3) Por último se tomó un volumen de 1mL del concentrado de teliosporas, obtenidas anteriormente como se mencionó en el punto (4.5) y se resuspendieron en 4mL de solución salina estéril para obtener un volumen final de 5mL. Se inoculó 1mL de cada uno de los tres preparados en el tallo de plantas de maíz de un mes de desarrollo, observando periódicamente los efectos producidos. 28 4.8 Comparación y selección del medio de cultivo óptimo para la propagación de la cepa comprobada de Ustilago maydis 4.8.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido de extracto de maíz Se resembró una colonia de basidiosporas en 50mL de medio líquido de extracto de maíz y se incubo a 37°C por 24 horas. Y después se sembraron cinco placas de agar extracto de maíz y cinco de extracto de papa 1mL del medio anterior a cada una de las placas incubando a 37°C hasta obtener crecimiento, comparando los medios para observar cual presentaba mayor desarrollo. 4.8.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido de extracto de maíz Se prepararon diluciones con agua destilada estéril de los medios líquidos extracto de maíz y de papa, obteniendo tres tubos por cada medio (concentrado, y diluciones de 1:1, y 1:3), las concentraciones finales en un volumen de 10mL se observan en la Tabla 10. A partir del medio líquido de extracto de maíz inoculado con basidiosporas mencionado en el punto anterior (4.8.1) incubado por 96 horas, se inocularon con 1mL los tubos con medio concentrado, diluido al 50% 1:1 (V:V) y el diluido al 25% 1:3, después se dejó incubando por 24 horas a 37°C y se evaluó el crecimiento por conteo celular en cámara de Neubauer. Tabla 10. Concentraciones finales de los medios de cultivo líquidos usados en esta prueba. Medio de cultivo líquido Extracto de maíz Harina de maíz Concentrado Sacarosa 0.5% Harina de maíz Diluido 1:1 (V:V) Sacarosa 0.25% Harina de maíz Diluido 1:3 (V:V) Sacarosa 0.125% Extracto de papa 40%, Extracto de papa 20%, Sacarosa 0.5% 20%, Extracto de papa 10%, Sacarosa 0.25% 10%, Extracto de papa 5%, Sacarosa 0.125% 4.9 Preparado de inóculos de basidiosporas de Ustilago maydis a diferentes concentraciones De un cultivo de 96 horas de basidiosporas de Ustilago maydis en medio líquido de extracto de maíz (1:1) se tomó una alícuota y se colocó en una cámara de Neubauer para realizar el conteo del número de levaduras obteniendo un conteo de 6x10 5 basidiosporas/mL. Posteriormente, se realizaron diluciones para obtener las concentraciones de 6x104 basidiosporas/mL y 6x103 basidiosporas/mL. 29 4.10 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de Ustilago maydis Se tomaron 3mL de las tres diferentes concentraciones de basidiosporas preparadas en el punto anterior (4.2.9) en jeringas hipodérmicas y se procedió a inocular tres plantas adultas de maíz que fueron sembradas en macetas de un volumen de 20L con suelo de cultivo de maíz de la localidad de San Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de México por cada concentrado, inyectando en la base, centro y ápice del jilote 1mL por cada porción, se realizó la observación después de tres semanas de su inoculación, retirando las hojas que cubría la mazorca. 4.11 Confirmación de la infectividad de las basidiosporas de Ustilago maydis obtenidas para producir huitlacoche Los resultados anteriores no fueron tan representativos al no presentase la evidencia de agallas en la mazorca, por lo tanto se procedió a realizar una nueva prueba en plantas de maíz de la misma localidad usando suelo de compostaje. Se colocaron a germinar granos de maíz en cajas de Petri humedecidas con agua potable, dos semanas después cuando emergieron se sembraron en macetas de 20L con suelo de compostaje, hasta tener una planta adulta con el jilote emergiendo. Las teliosporas tratadas con el gradiente de concentración de NaCl conservadas a 4°C se sembraron en agar extracto de papa y se incubaron a 37°C por 72 horas, después del crecimiento de las colonias de Ustilago maydis se seleccionaron cuatro colonias las cuales presentaron evidencia de pseudomicelio confirmado en observaciones al microscopio. Las cuatro colonias seleccionadas se resembraron en medio líquido de extracto de maíz y se incubaron a 37°C por 72 horas, se confirmó su pureza al tomar una alícuota y observarla al microscopio tiñendo con azul de metileno, por la abundancia de pseudomicelio se procedió a realizar diluciones decimales las cuales fueron 10-1, 10-2 y 10-3 a un volumen final de 10mL, se tomó 0.1mL de cada dilución sembrar por dispersión con varilla acodada en medio agar almidón incubando a 37°C por 48 horas para realizar el conteo de UFC/mL, obteniéndose el número de UFC/mL. Posteriormente, se tomaron 3mL de la suspensión de basidiosporas y se inoculó 1mL de la suspensión en la base del jilote de la planta de maíz en estadio R1 (11 días después de la salida del estigma de los jilotes), 1mL en la base y 1mL en el ápice del jilote, después de cuarta semanas se realizaron las observaciones de la mazorca. 30 5. DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO Selección de material biologico Mazorcas infectadas por Ustilago maydis Mazorcas jovenes sanas de maíz Obteción de granos jovenes sanos Obtención de un concentrado de teliosporas Evaluación de la eficiencia de infección de teliosporas Purificación de teliosporas Determinación de la viabilidad de las teliosporas Obtención de basidiosporas Granos maduros de maíz Determinación de infectividad en plantulas de maíz Determinación de infectividad en plantas adultas de maíz Comparación y selección del medio de cultivo óptimo para la propagación de basidiosporas Germinación de granos de maíz Plántulas de maíz Plantas adultas de maíz OBTENCIÓN DE HUITLACOCHE 31 6. RESULTADOS 6.1 Evaluación de la eficiencia de infección de un macerado de teliospora de Ustilago maydis 6.1.1 Mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos infectados La primera prueba consistió en evaluar la posibilidad de producir la infección típica de Ustilago maydis formando agallas y masas negra de teliosporas en granos jóvenes de maíz sin la manipulación de plantas adultas de maíz, por lo tanto se evaluó la capacidad de producir infección en granos de maíz tierno usando altas concentraciones de teliosporas de Ustilago maydis, comparando el efecto que se produjo en las mezclas (V:V) granos infectado vs sano en diferentes diluciones 1:10, 1:5 y 2:5. La primera mezcla (Figura 7) fue una parte de granos infectados con diez partes de granos sanos colocados en vasos de plástico, en la imagen A se muestran los granos antes de agregar el macerado de granos infectados al día cero dichos granos se encuentran en condiciones normales, en la imagen B se observan granos de maíz con teliosporas en la segunda semana de exposición los granos se observan con un ligero estado de descomposición, sin observarse hipertrofia o masas negras dentro de los granos, en la imagen C se observan granos de maíz con teliosporas en la tercera semana de exposición los granos ya se aprecian con un evidente estado de descomposición sin cambios característicos de agallas de huitlacoche. De igual forma se prepara una mezcla (Figura 8) con una parte de granos infectados con cinco partes de granos sanos colocados en vasos de plástico, la imagen A nos muestran los granos antes de agregar el macerado de granos infectados al día cero dichos granos se encuentran en condiciones normales, en la imagen B se observan granos de maíz con teliosporas en la segunda semana de exposición los granos se observan con un ligero estado de descomposición, sin observarse hipertrofia o masas negras dentro de los granos, en la imagen C se observan granos de maíz con teliosporas en la tercera semana de exposición donde los granos ya se aprecian con un mayor estado de descomposición sin cambios característicos de agallas de huitlacoche. Por último mezcla número tres (Figura 9) que fue con dos partes de granos infectados con cinco partes de granos sanos colocados en vasos de plástico, la imagen A nos muestran los granos antes de agregar el macerado de granos infectados al día cero dichos granos se encuentran en condiciones normales, en la imagen B se observan granos de maíz con teliosporas en la segunda semana de exposición los granos se observan con un ligero estado de descomposición, sin observarse hipertrofia o masas negras dentro de los granos, en la imagen C se observan granos de maíz con teliosporas en la tercera semana de exposición donde los granos ya se aprecian destruidos en su mayoría pero sin cambios característicos de agallas de huitlacoche. 32 A) Día 0 B) Semana 2 C) Semana 3 Figura 7. Evaluación de infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tierno, dilución (1:10). A) Al día cero, se observan granos de maíz, tiernos y sanos, B) En la semana dos de exposición de los granos de maíz con teliosporas, se observan un ligero estado de descomposición en los granos y C) En la semana tres, los granos ya se aprecian con un evidente estado de descomposición sin formación de hipertrofia. C) Semana 3 A) Día 0 B) Semana 2 Figura 8. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tierno, dilución (1:5). A) En el día cero, se observan granos de maíz, tiernos y sanos, B) En la semana dos de exposición de los granos de maíz con teliosporas, se observan con un ligero estado de descomposición en los granos y C) En la semana tres de exposición, los granos ya se aprecian con mayor estado de descomposición sin formación de hipertrofia. C) Semana 3 B) Semana 2 A) Día 0 Figura 9. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tierno, dilución (2:5). A) En el día cero se observan granos de maíz, tiernos y sanos, B) En la semana dos de exposición de los granos de maíz con teliosporas, observan con un ligero estado de descomposición los granos y C) En la semana tres se observan los granos con mayor estado de descomposición sin formación de hipertrofia. 33 6.1.2 Inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con suspensión de teliosporas de Ustilago maydis Este experimento consistió en optimizar la metodología de inoculación de granos de maíz con teliosporas de Ustilago maydis y mantener controlados los factores externos a los granos inoculados manteniendo estos granos en cajas Petri para evitar el contacto con el exterior y se mantuvieron hidratados al colocar los granos sobre algodón humedecido con agua potable dentro de la caja Petri. Se evaluó la capacidad de producir infección en granos de maíz tiernos con el uso de teliosporas de Ustilago maydis, se obtuvo una masa de teliosporas, y se prepararon diferentes concentrados de (teliosporas-agua) V:V, para ser inoculadas en granos de maíz tiernos. En la Figura 10 se observa el control negativo, donde solo se les inyecto agua potable a los granos, la imagen A corresponde al día cero de la inoculación, en B se observan los granos una semana después de inoculadas, en C se observan dos granos ya con brotes de germinación después de dos semanas de la inoculación y en D se observan los granos después de tres semanas de inoculados con la cuatro granos germinados. Los granos inoculados con la dilución (1:3) del concentrado de teliosporas y agua potable (V:V) se observan en la Figura 11, la imagen A corresponde al día cero de la inoculación observándose un área negra en la zona de inoculación esas son las teliosporas inoculadas, en B se observan los granos una semana después de inoculadas, en C se observan tres granos ya con brotes de germinación después de dos semanas de la inoculación y en D se observan los mismos tres granos germinados con el brote más grande después de tres semanas de inoculados y algunas zonas de los granos se observan en estado de descomposición. Se observan los granos inoculados con la dilución (1:2) del concentrado de teliosporas y agua potable (V:V) en la Figura 12, la imagen A corresponde al día cero de la inoculación observándose una área negra en la zona de inoculación esas son las teliosporas inoculadas, en B se observan los granos una semana después de inoculadas, en C se observan dos granos con brotes de germinación después de dos semanas de la inoculación y en D se observan tres granos germinados con el coleoptilo de mayor tamaño después de tres semanas de inoculados y algunas zonas de los granos se observan en estado de descomposición. Mientras que en la Figura 13 se observan los granos inoculados con la dilución (1:1.5) del concentrado de teliosporas y agua potable (V:V), la imagen A corresponde al día cero de la inoculación observándose una área negra en la zona de inoculación esas son las teliosporas inoculadas, en B se observan los granos una semana después de inoculadas, en C se observa un grano germinando después de dos semanas de inoculación y en D se observa que solo un grano logró germinar después de tres semanas de inoculación y todos los granos se observan en estado de descomposición. 34 A) Día 0 B) Semana 1 C) Semana 2 D) Semana 3 Figura 10. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tiernos, control negativo. A) Día cero de inoculación, B) Granos después de una semana de inoculación con teliosporas, C) Granos después de dos semanas de inoculación con teliosporas y D) Granos después de tres semanas de inoculación con teliosporas. A) Día 0 C) Semana 2 B) Semana 1 D) Semana 3 Figura 11. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:3 (agua-teliosporas). A) Día cero de inoculación, se observa una pequeña porción negra en el sitio de inoculación de las teliosporas, B) Granos después de una semana de inoculación con teliosporas, C) Se observan tres granos germinando después de dos semanas de inoculación con teliosporas y D) se observan los tres granos con su coleoptilo más grande después de tres semanas de inoculación con teliosporas, algunos granos con evidente estado de descomposición. A) Día 0 B) Semana 1 C) Semana 2 D) Semana 3 Figura 12. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:2 (agua-teliosporas). A) Día cero de inoculación, se observa una pequeña porción negra en el sitio de inoculación de las teliosporas, B) Granos después de una semana de inoculación con teliosporas, C) Se observan tres granos germinando después de dos semanas de inoculación con teliosporas y D) Se observan los tres granos con su coleoptilo de mayor tamaño después de tres semanas de inoculación con teliosporas, pero todos los granos con evidente estado de descomposición. 35 A. Día 0 B. Semana 1 C. Semana 2 D. Semana 3 Figura 13. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:1.5 (agua-teliosporas). A) Día cero de inoculación, se observa una pequeña porción negra en el sitio de inoculación de las teliosporas, B) Granos después de una semana de inoculación con teliosporas, C) Se observa un grano germinando después de dos semanas de inoculación con teliosporas, los demás en estado de descomposición y D) solo un grano germino después de tres semanas de inoculación con teliosporas, todos los granos con evidente estado de descomposición. 6.1.3 Inoculación de mazorcas jóvenes y sanas de maíz con suspensión de teliosporas de Ustilago maydis Se evaluó la capacidad de producir infección en mazorcas tiernas con el uso de teliosporas de Ustilago maydis, obteniendo una masa de teliosporas y preparando diferentes diluciones (1:3, 1:2 y 1:1.5) de un concentrado de teliosporas más agua potable (V:V), inoculando 1mL de cada dilución en la base de las mazorcas jóvenes, otra mazorca fue usada como control negativo a la cual se le inyecto 1mL de agua potable, a las mazorcas no se les deshojo para protegerlas de infecciones no deseadas, estas mazorcas se colocaron en un recipiente con volumen de agua constante para hidratar a las mazorcas y se cubrió con una malla para evitar la entrada de insectos pero que se mantuvieran ventilados y se incubo a temperatura ambiente (imagen A, Figura 14), a la tercera semanas se revisaron las mazorcas, retirando las hojas que protegían a los granos, dichas hojas presentaban clorosis (imagen B, Figura 14), en la zona de inoculación solo se observó un ligero estado de descomposición en la mazorca inoculada con la dilución (1:1.5) el resto de las mazorcas en el sitio de inoculación no presentaron cambios, solo en la porción apical de la mazorca se observó un estado de descomposición en todas las mazorcas como se puede apreciar en la Figura 15. 36 A B Figura 14. Mazorcas usadas para evaluar el efecto de las teliosporas de Ustilago maydis. A) Mazorcas en un recipiente humedecido con agua potable para mantenerlas hidratadas y cubiertas por sus hojas para protegerlas de infecciones no deseadas y B) Una de las mazorcas inoculadas con teliosporas con las hojas cloróticas a la tercera semana de incubación. D) Control Negativo E) Dil. 1:3 G) Dil. 1:1.5 F) Dil. 1:2 Figura 15. Efecto de teliosporas de Ustilago maydis sobre mazorcas jóvenes de maíz. D) Control negativo, E) Mazorca inoculada dilución 1:3 de las teliosporas, F) Mazorca inoculada dilución 1:2 de las teliosporas y G) Mazorca inoculada dilución 1:1.5 de las teliosporas. Se aprecia un estado de descomposición en la porción más distal del sitio de inoculación señalas por las flechas tanto en el control negativo como en las inoculadas con las diluciones 1:3, 1:2 y 1:1.5 de las teliosporas. Solo la mazorca inoculada con la dilución 1:5 presenta un ligero estado de descomposición en la base (zona de inoculación). 37 6.1.4 Aspersión de teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de maíz germinando Al dejar actuar las teliosporas sobre plántulas de maíz, transcurridas cuatro semanas de contacto las plántulas comenzaron a presentar evidencia de clorosis y a las cinco semanas necrosis y muerte (Figura 16), en la sexta semana todas las plántulas murieron. Figura 16. Efecto de la exposición con teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de maíz germinando después de cuatro semanas. Se observan hojas necróticas y el tallo clorótico en plántulas de maíz, después de cinco semanas de ser expuestas a una suspensión de teliosporas. 6.2 Obtención de un concentrado de teliosporas puras de Ustilago maydis Se evaluó un método para lograr obtener un concentrado de teliosporas libres de tejido vegetal aplicando un gradiente de concentración con diferentes concentraciones de NaCl partiendo de una concentración de 0.85%, luego una de 1%, 1.5%, 2% y aumentando gradualmente la concentración en 0.5%, hasta una concentración del 30% de NaCl, después de aplicar la solución de NaCl se centrifugó y se observaron tres fases (fondo con las teliosporas, centro una solución acuosa y la superficie con el tejido vegetal) como se muestra en la Figura 17, este gradiente al mismo tiempo tenía como 38 objetivo eliminar la microbiota bacteriana asociada que pudiera estar presente para obtener teliosporas puras. A B S S M M F F Figura 17. Separación de teliosporas por el efecto del gradiente de concentración con NaCl. A) Suspensión de teliosporas al 8% de NaCl, B) Suspensión de teliosporas al 10% de NaCl, S) Superficie con restos de tejido vegetal, M) Medio con solución acuosa y F) Fondo concentrado de teliosporas. 39 En la Tabla 11 se observan los resultados de la separación de los restos de tejido vegetal usando las concentraciones 0.85%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 5%, 6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25% y 30% de NaCl, marcando con un signo negativo (-) aquellas que no lograron separar los restos vegetales de la suspensión de teliosporas y con un signo positivo (+) las que sí lograron separa los restos vegetales de la suspensión de teliosporas, la cantidad de signos positivos (+) es proporcional a la concentración de tejido vegetal separado de la suspensión, por lo tanto, a mayor cantidad de signos positivos mayor cantidad de tejido vegetal separado, esta cantidad de tejido vegetal separado se media en volumen al ocupar tubos para centrifuga graduados. Se aprecia que a una concentración de 4% de NaCl se logró separa el tejido vegetal y a la concentración de 6% de NaCl fue mayor la concentración de tejido vegetal separado, a medida que aumentaba la concentración de NaCl no solo el tejido vegetal se iba a la superficie también las teliosporas, este efecto se hizo evidente a la concentración de 10% de NaCl como se observa en la Figura 17. Tabla 11. Resultados del gradiente de concentración con NaCl en suspensión de teliosporas de Ustilago maydis Concentración de NaCl 0.85% 1% 1.5 % 2% 2.5% 3% 3.5% 4% 5% Resultado de separación - - - - - - - + + Concentración de NaCl 6% 8% 10% 15% 20% 15% 20% 25% 30% Resultado de separación +++ +++ +++* +++* +++* +++* +++* +++* +++ * (-): sin efecto en la separación de los desechos de tejido vegetal y las teliosporas; (+): efecto positivo en la separación de los desechos de teliosporas y restos de tejido vegetal;* las teliosporas se quedaron en la superficie. De cada suspensión de teliosporas con las diferentes concentraciones de NaCl se tomó una alícuota y se colocaba entre portaobjetos y cubreobjetos realizando la observación al microscopio en la Figura 18 se observan teliosporas de Ustilago maydis características por su pigmento café, su ornamentación crenada señalada por la flecha en la letra (B) y su doble pared señalada por la flecha con la letra (A), cabe destacar que en todas las diferentes concentraciones de NaCl no se observó destrucción de las teliosporas, solo malformación debidas al cambio de turgencia de las teliosporas en las concentraciones salinas por arriba del 20% por lo tanto se evaluaría la viabilidad de estas al sembrar en medio líquido y sólido de extracto de maíz. 40 A B Figura 18. Morfología microscópica de teliosporas de Ustilago maydis. Se observan las teliosporas pigmentadas observadas a (100X). A) Señala la doble pared y B) Señala la ornamentación espiculada. 6.2.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis Después del tratamiento al que fueron expuestas las teliosporas por el gradiente con las diferentes concentraciones de NaCl para su separación y purificación, se tenía que evaluar si las teliosporas al pasar por el estrés osmótico aun eran viables, así es que se procedió a confirmarlo sembrando las teliosporas en medio extracto de maíz, utilizando extracto de maíz ya que es el sustrato natural de este hongo. 6.2.1.1 Prueba en medio líquido y sólido de extracto de maíz Se determinó la viabilidad de las teliosporas usando medio extracto de maíz líquido y sólido y se compararon las condiciones óptimas de temperatura y tiempo para su germinación. Solo se observó desarrollo con las teliosporas tratadas con 4% de NaCl, mientras que las tratadas con 30% NaCl no tuvieron desarrollo. Los resultados se muestran en la Tabla 12, donde se puede apreciar que en el medio líquido y en el medio sólido germinaron las teliosporas a 37ºC, mientras que a 27ºC no se observó crecimiento, en el medio sólido el crecimiento se hizo evidente a las 72 horas con el desarrollo de colonias, mientras que en el medio líquido se observó crecimiento hasta las 96 horas evidenciado al tomar alícuotas cada 24 horas para realizar observaciones microscópicas. 41 Tabla 12. Resultados de la germinación de las teliosporas puras Ustilago maydis obtenidas, inoculadas en medio extracto de maíz Medio de cultivo Temperatura Tiempo de crecimiento y germinación Agar extracto de maíz 27°C - 37°C + 72 horas Medio líquido extracto de maíz 27°C 37°C + 96 horas (-) sin crecimiento; (+) con crecimiento Al tubo incubado a 27ºC y al incubado a 37ºC se le realizaron revisiones periódicas, cada 24 horas se tomaban alícuotas para ser observadas al microscopio, colocando una gota del medio inoculado más una gota de azul de metileno entre portaobjetos y cubreobjetos, se observó que solo el tubo incubado a 37ºC presento crecimiento a las 96 horas de incubación. En la Figura 19 se muestran teliosporas germinando del medio líquido de extracto de maíz a las 96 horas de incubación vistas al microscopio, las flechas en la imagen A y B señalan basidios gemando de las teliosporas a un aumento de (40X). Igualmente se observa una preparación de una alícuota tomada del medio líquido de extracto maíz inoculado con teliosporas incubada por 120 horas a 37°C en la Figura 20, donde se aprecian basidiosporas dividiéndose formando pseudomicelio teñido con azul de metileno observado a (100X). A Figura 19. Germinación de teliosporas de Ustilago maydis. Observaciones del concentrado de teliosporas incubado a 37°C en medio líquido extracto de maíz por 72 horas, preparaciones teñidas con azul de metileno; A) se observa un conjunto de teliosporas y las flechas señalan la germinación de estas a (40X) y B) se observa una teliosporas al centro germinando una de ellas a (40X). 42 B Figura 20. Basidiosporas de Ustilago maydis en división. Basidiosporas dividiéndose teñidas con azul de metileno vista a inmersión, se encuentran formando pseudomicelio después de 120 horas de incubación a 37°C. 6.3 Aislamiento de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago maydis en agar extracto de maíz Para la obtención de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago maydis se realizó seleccionando solo las colonias con morfología levaduriforme, evaluando tres cepas levaduriformes para determinar si tenían la capacidad de producir la infección característica de Ustilago maydis en plántulas de maíz de un mes de desarrollo. Por lo tanto, después de 96 horas en las placas de agar extracto de maíz donde se observó el crecimiento de colonias con aspecto de levadura se les realizó la observación macroscópica y microscópica, descartando las colonias con crecimiento micelial y las colonias bacterianas. Se continuó trabajando solo con las colonias levaduriformes, a estas colonias obtenidas se les realizó observación microscopia a (40X) tomado una asada de cada colonia y se observaron en fresco agregando una gota de azul de metileno, en la Figura 21 se observan levaduras en forma ovalada (imagen A) y levaduras polimórficas (imagen B), en la Figura 22 se observan células alargadas con artefactos refringentes en su citoplasma, cada una de estas se resembraron por estría cruzada en placas de agar extracto de maíz para generar biomasa y ocuparlas en experimentos posteriores. 43 B A Figura 21. Colonias levaduriformes evaluadas, presuntivas de basidiosporas de Ustilago maydis. A) Primera colonia levaduriforme evaluada con células en forma ovalada observadas al microscopio a (40X) y B) Segunda colonia levaduriforme evaluada se observan células polimórficas al microscopio a (40X). Figura 22. Colonia levaduriforme evaluada, presuntiva de basidiosporas de Ustilago maydis. Se observa la preparación al microscopio de la tercera colonia levaduriforme seleccionada teñida con azul de metileno, con células alargadas y en su citoplasma se observan artefactos refringentes a (40X). Posterior a la selección de las colonias levaduriformes se tomaron cinco colonias de cada cepa y se resuspendieron en 5mL de solución fisiológica, cada una de las colonias 44 en tubos diferentes, se tomó 1mL de cada suspensión de células y se inoculó por inyección a plantas de maíz de un mes de desarrollo, hasta observar algún cambio sobre las plantas, dos semanas después de la exposición en la planta inoculada con la cepa número tres (Figura 23) se señalada con una flecha la zona hipertrófica en el sitio de inoculación (imagen A), también se muestra una planta a las tres semanas de la explosión donde se aprecia la planta con una malformación severa con el tallo doblado (imagen B), en dicha zona se realizó un corte y se observó al microscopio a (40X) en donde se aprecia la presencia de teliosporas (imagen C) confirmando con esto la obtención de la cepa de Ustilago maydis. Se logró completar el ciclo de vida del hongo Ustilago maydis al obtener un concentrado de teliosporas puras y viables, capaces de germinar y producir basidiosporas infectivas para plantas de maíz (Figura 24), donde se observan las teliosporas obtenidas por el método de purificación usando un gradiente de concentración del 4% de NaCl (imagen A), dichas teliosporas germinaron en medio líquido de extracto de maíz (imagen B), y en medio agar extracto de maíz obteniendo basidiosporas (imagen C), al ser pasadas a medio liquido de extracto de maíz se observó división de las basidiosporas formando pseudomicelio (imagen D), la biomasa de basidiosporas generada fue usada para inocular plántulas de maíz (imagen E), después de dos semanas de exposición al inóculo de basidiosporas se aprecia una zona hipertrófica en la planta de maíz (imagen F), tres semanas después de la exposición al inóculo con basidiosporas la planta de maíz presento un notable daño al tallo el cual se encuentra malformado debido a la hipertrofia (imagen G) a dicho sitio se le realizaron cortes los cuales fueron observados al microscopio encontrando teliosporas (imagen H), con esto se logró confirmar que la colonia usada para infectar a la plántula era una cepa de Ustilago maydis. A B C Figura 23. Efecto de las basidiosporas de Ustilago maydis sobre plantas de maíz. Se evaluó la cepa levaduriforme número tres sobre una planta de maíz con un mes de desarrollo, A) Corresponde al efecto producido después de dos semanas de exposición, la flecha señala una zona hipertrófica en el sitio de inoculación, B) corresponde al efecto producido después de tres semanas de exposición la flecha señala la zona hipertrófica que produjo malformación severa de la planta y C) Donde se observan teliosporas en un corte de tejido afectado de la planta de maíz. 45 A H B G C F E D Figura 24. Ciclo de vida de Ustilago maydis detectado experimentalmente bajo este protocolo. A) Teliosporas purificadas, B) Teliosporas germinando en medio liquido extracto de maíz, C) Basidiosporas en medio sólido extracto de maíz, D) Basidiosporas con pseudomicelio en medio líquido de extracto de maíz, E) Plantas de maíz de un mes, F) Zona hipertrófica y G) Tallo atrofiado, H) Teliosporas en corte de hoja de maíz. 46 6.4 Determinación de la infectividad de los estadios de Ustilago maydis sobre plántulas de maíz Se determinó que estadio del hongo Ustilago maydis produce los mejores resultados en infección en plantas de maíz, comparando si existe diferencia entre una cepa de basidiosporas y una mezcla de cepas de basidiosporas, así como comparar la fase de teliosporas inoculando plantas de un mes de desarrollo con 1mL de las suspensiones preparadas. Las colonias de basidiosporas seleccionadas se observan en las placas de agar extracto de maíz (Figura 25), la suspensión de basidiosporas de la misma cepa se realizó tomando seis colonias con aspecto levaduriforme (imagen A), microscópicamente se aprecian basidiosporas alargadas teñidas con azul de metileno (imagen A, Figura 26), la suspensión de basidiosporas de diferente cepa se realizó tomando seis colonias de placas diferentes dos colonias fueron tomadas de las dos placas observadas en las (imágenes B y C, Figura 25) las colonia tomadas de estas placas señaladas por las flechas son crateriformes y con pseudomicelio también observadas al microscopio en donde se aprecia la presencia de pseudomicelio (imagen B, Figura 26). C A B Figura 25. Placas de agar extracto de maíz con crecimiento de colonias de basidiosporas de Ustilago maydis. A) Placa de agar extracto de maíz con colonias levaduriformes de basidiosporas de Ustilago maydis. B) Placa de agar extracto de maíz con colonias cerebriformes de basidiosporas de Ustilago maydis. C) Placa de agar extracto de maíz con colonias pigmentadas con pseudomicelio de basidiosporas de Ustilago maydis. 47 B A Figura 26. Basidiosporas de Ustilago maydis teñidas con azul de metileno. A) basidiosporas unicelulares. B) Basidiosporas dividiéndose formando pseudomicelio señaladas por las flechas. En la Figura 27 se observan las plantas inoculadas, en la planta inoculada con la suspensión de teliosporas se observa que la zona del tallo donde se realizó la inoculación ya se ha marchitado (imagen A), la planta inoculada con la suspensión de seis colonias de basidiosporas de la misma cepa se encuentra de menor tamaño y marchita, en el sitio de inoculación se observa un ligero estado de hipertrofia señalado por la flecha (imagen B), la planta inoculada con la mezcla de seis cepas de basidiosporas de diferentes placas se observa completamente marchita y en el sitio de inoculación una agalla prominente señalado con la flecha (imagen C). A B C Figura 27. Efecto de las fase teliosporas y basidiosporas de Ustilago maydis sobre plantas de maíz. Se observa el efecto producido por cada uno de los concentrados de las fases de Ustilago maydis después de un mes de la inoculación. A) corresponde a la planta inoculada con el concentrado de teliosporas, donde las hojas más viejas señaladas con la flecha se observan marchitas y cloróticas, B) Corresponde a la planta inoculada con una suspensión de una sola cepa de basidiosporas, donde se observa que las zonas de las hojas más viejas se encuentran necróticas, cloróticas y de menor tamaño a la primera y C) Corresponde a la planta inoculada con la mezcla de las seis cepas de basidiosporas, donde se observa la plántula completamente marchita y en la sitio de inoculación hipertrofia. 48 6.5 Comparación y selección del medio de cultivo adecuado para la propagación del hongo de la cepa comprobada de Ustilago maydis Se comparó el crecimiento de la fase de basidiospora de Ustilago maydis en los medios de cultivo líquido y sólido a partir de partir de extracto de papa y extracto de maíz. 6.5.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido En la Tabla 13 se observan los resultados obtenidos del crecimiento en los medios sólidos sembrados por publicado, se calculó el promedio y se obtuvo que en el agar extracto de maíz el crecimiento fue de 6 UFC/mL y en el agar extracto de papa el crecimiento fue de 20 UFC/mL (Figura 28), se observan mayor crecimiento en el medio agar extracto de papa (imagen B) y un menor desarrollo en el medio agar extracto de maíz (imagen A). Tabla 13. Resultados del crecimiento en medio sólido extracto de maíz y extracto de papa Medio de cultivo Agar extracto de maíz Agar extracto de papa UFC/mL 6 20 A B Figura 28. Colonias de Ustilago maydis en medio de cultivo sólido. Se muestra el desarrollo de las colonias de basidiosporas de Ustilago maydis después de 72 horas de incubación a 37°C. A) Corresponde al medio agar extracto de maíz donde se observa clara mente menor crecimiento y B) Corresponde al medio agar extracto de papa donde se observa una mayor cantidad de colonias. 6.5.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido 49 Para la determinación del crecimiento de basidiosporas en medio líquido se realizó el conteo celular con ayuda de una cámara de Neubauer, evaluando el medio líquido extracto de maíz y el medio líquido extracto de papa, cada medio líquido se diluyo con solución fisiológica al doble teniendo un medio concentrado un medio diluido 1:1 (V:V) y un medio diluido 1:3 (V:V) de cada uno, encontrando que el mayor crecimiento celular se presentó en el medio extracto de maíz diluido 1:1 con 1.28x107 basidiosporas por mililitro, seguido por el medio líquido extracto de maíz concentrado con 4.22x106 basidiosporas/mL, el medio que presento menor crecimiento fue el medio líquido extracto de maíz diluido 1:3 con 8.4x105 basidiosporas/mL (Figura 29). 1.28x107 1.4E+07 Basidiosporas/mL 1.2E+07 Medio líquido extracto de maíz 1.0E+07 8.0E+06 6.0E+06 4.22x106 3.12x106 4.0E+06 2.20x106 1.21x106 2.0E+06 Medio líquido extracto de papa 8.40x105 0.0E+00 Concentrado 1:1 1:3 Concentración del medio Figura 29. Comparando la generación de basidiosporas de Ustilago maydis en dos diferentes medios líquidos. Se comparó el crecimiento en medio líquido extracto de maíz representado con las barras azules y el crecimiento en medio líquido extracto de papa representado con barras naranjas a diferentes concentraciones de los medios. Se observa que el mayor desarrollo se presentó en el medio líquido extracto de maíz diluido 1:1, y el menor desarrollo se presentó en el medio líquido extracto de maíz diluido 1:3. 50 En la Figura 30 se aprecian las basidiosporas de Ustilago maydis contadas al microscopio en cámara de Neubauer a un aumento de (40X) para realizar el cálculo de basidiosporas/mL, se señalas las basidiosporas con flechas. Figura 30. Basidiosporas de Ustilago maydis observadas en cámara de Neubauer. Observación al microscopio en cámara de Neubauer a (40X) de las basidiosporas de Ustilago maydis las flechas señalan las formas levaduriformes en un cuadrante de la cámara. 6.6 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de Ustilago maydis Se prepararon los inóculos a partir del medio de cultivo líquido con extracto de maíz dilución 1:1 (V:V) (Concentración de harina de maíz del 20% y de sacarosa del 0.25%) incubado por 96 horas, se tomó una alícuota de este medio de cultivo y se le realizó el conteo celular al microscopio en cámara de Neubauer encontrando que se tenían 6x10 5 basidiosporas/mL del medio. Posteriormente, se realizaron diluciones para obtener las concentraciones de 6x104 basidiosporas/mL y 6x103 basidiosporas/mL, teniendo un volumen final de 10mL de cada concentrado de basidiosporas. Se tomaron 3mL de cada concentrado de basidiosporas en jeringas hipodérmicas para inocular el jilote de plantas adultas de maíz en estadio R1 (una a dos semanas después de la salida del estigma del jilote) fueron sembradas en macetas de un volumen de 20Lt (0=0.02m3) con suelo de cultivo de maíz de la localidad de San Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de México (Figura 31), tres plantas fueron 51 inoculadas con la concentración de 6x105 basidiosporas/mL (imagen 1B), tres con la concentración de 6x104 basidiosporas/mL (imagen 2B) y otras tres con la concentración de 6x103 basidiosporas/mL (imagen 3B). Figura 31. Jilotes de maíz antes de ser inoculados con basidiosporas de Ustilago maydis. 5 1B). Jilote antes de ser inoculado con una suspensión de 6x10 basidiosporas/ml, 2B) Jilote antes 4 de ser inoculado con una suspensión de 6x10 basidiosporas/ml y 3B) Jilote antes de ser inoculado 3 con una suspensión de 6x10 basidiosporas/ml. A los 24 días de inoculación se retiraron las hojas que protegían a la mazorca de prueba se encontró únicamente efecto sobre las mazorcas inoculadas con una concentración de 6x105 basidiosporas/mL (Figura 32) se aprecia una zona negra (imagen A) a la cual se le realizó un corte para confirmar la presencia del hongo, observando en fresco de micelio con azul de metileno (imagen B). A B Figura 32. Efecto de la inoculación por inyección de basidiosporas de Ustilago maydis en 5 jilotes de maíz. A) Mazorca después de 24 días de inoculación con concentrado de 6x10 basidiosporas/mL, la flecha señala la zona afectada por el hongo y B) Micelio del hongo tenido con azul de metileno. 52 La prueba anterior no fue tan representativa como se esperaba esto por factores ambientales que afectaron el desarrollo de la planta de maíz por la temporada del año de siembra (como temperatura y humedad relativa), así como la calidad del suelo de cultivo, pero se demostró la infección en una de las mazorcas infectadas, por lo cual se procedió a realizar una nueva prueba en plantas de maíz de la misma localidad usando suelo de compostaje. Se tomó una alícuota de 0.1mL del concentrado de teliosporas tratadas con el gradiente de concentración de NaCl conservado a 4°C y se sembró en placa en agar extracto de papa incubando a 37°C por 72 horas (Figura 33) las colonias presentaban un aspecto crateriforme (imagen A), se seleccionaron cuatro colonias con evidencia de pseudomicelio (imagen B) para resembrarlas en medio líquido de extracto de maíz. A B Figura 33. Crecimiento de basidiosporas de Ustilago maydis en agar extracto de papa. A) Colonias cerebriformes con crecimiento pseudomicelial y B) Basidiosporas formando pseudomicelio tenidas con azul de metileno observadas aun aumento de (40X). Las colonias seleccionadas se sembraron en medio líquido extracto de maíz a 37°C por 72 horas, tomado una alícuota para observar el crecimiento observando abundantes basidiosporas en división formando pseudomicelio (Figura 34), después de confirmar la pureza y calidad del inoculo del medio de cultivo líquido se procedió a realizar el conteo de las UFC/mL por dispersión con varilla acodada en medio agar almidón, obteniendo un conteo de 2x106 UFC/mL con esto se obtuvo un conteo de las células viables capaces de producir la infección, se inyectaron 3mL de la suspensión de basidiosporas de Ustilago maydis en el jilote de una planta adulta de maíz en estadio R1(11 días después de la salida de los estigmas del jilote) y a la cuarta semana se realizó la 53 observación de la mazorca de maíz encontrando las agallas típicas del huitlacoche (Figura 35). Figura 34. Basidiosporas de Ustilago maydis. Se observan abundantes basidiosporas dividiéndose y formando pseudomicelio en medio líquido de extracto de maíz. Figura 35. Mazorca de maíz con huitlacoche. Se observa la infección característica de Ustilago maydis sobre una mazorca de maíz formando agallas grisáceas. 54 7. DISCUSIÓN El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo que permitiera la producción de huitlacoche a bajo costo y con algunas condiciones controladas en maíz criollos de la localidad de San Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de México, los parámetros que lograron manipularse fueron la fase del hongo, el estadio de desarrollo del maíz más susceptible a la infección así como la concentración de inóculo óptima para producir el huitlacoche y la vía de inoculación de la planta de maíz. La primer pregunta que nos realizamos fue ¿se podrá producir la infección con Ustilago maydis y como tal la forma conocida como huitlacoche a partir de granos jóvenes de maíz, sin la necesidad de infectar la etapa adulta del maíz?, esto conllevaría a economizar en tiempo y costos de producción, ya que se reduciría el tiempo, no se tendría la necesidad de esperar el tiempo necesario para que crecieran las plantas de maíz, tampoco se tendría la necesidad de mantener en condiciones óptimas toda la planta, con esta pregunta se realizó la primer metodología en la cual se mezcló un concentrado de teliosporas con granos jóvenes de maíz, realizando observaciones periódicas donde el criterio a evaluar fue si se producida la infección típica en el maíz ocasionada por Ustilago maydis con aumento en el volumen de los granos y la formación de una masa negra de teliosporas, pero conforme transcurrían los día solo se observaba un evidente estado de descomposición de los granos de maíz los que demuestra la necesidad imperiosa de la implantación del hongo sobre la planta viva, quedando como evidencia la necesidad de aislar y purificar al agente etiológico y se continuo con ensayos más refinados donde se usó un concentrado de teliosporas en cual se diluyó en 1:3, 1:2 y 1:1.5 inoculando granos jóvenes de maíz manteniéndolos en cámara húmeda en caja Petri aislados de un ambiente externo que pudiera producir contaminación. Pero al igual que el procedimiento anterior no se observó evidencia de la infección característica de Ustilago maydis pero se logró observar que a medida que aumenta la concentración de las teliosporas inoculadas disminuía la capacidad de germinación de los granos de maíz, por lo tanto se comprobó que a etapas tempranas de desarrollo del maíz las teliosporas de Ustilago maydis tiene un efecto letal sobre la germinación. El mismo procedimiento de inoculación con diferentes diluciones del concentrado de teliosporas se extrapolo aplicándolo en mazorcas desarrolladas y observar el efecto de las teliosporas sobre las mazorcas sin retirar las hojas que protegen a la mazorca de microorganismos no deseados y evitar el efecto de descomposición observado en las pruebas anteriores, pero al término de la evaluación de este procedimiento no se observó ningún efecto esperado como hipertrofia e hiperplasia o que se generara una masa de teliosporas negras, tan solo se observó un estado de descomposición en el ápice y la base de la mazorca inoculada con el suspensión de teliosporas diluida 1:5 (Figura 15), esto nos demuestra que la infección de Ustilago maydis requiere de condiciones específicas para poderse manifestar con las características que las 55 distinguen y que no en cualquier etapa o estadio de crecimiento de la planta de maíz esta infección se puede implantar. Se evaluó otro método de infección de maíz utilizando una suspensión de teliosporas donde se sumergieron granos germinando, encontrando que a medida que crecía la plántula se presentaban zonas de clorosis y necrosis y a las seis semanas del contacto con las teliosporas todas las plantas jóvenes murieron por lo tanto esto demuestra que aun en granos germinados la infección por Ustilago maydis causa el mismo daño que en el caso anterior confirmando que en etapas tempranas del crecimiento del maíz este hongo resulta nocivo para la planta. Por lo anterior, se procedió a la obtención de un concentrado de teliosporas por medio de un macerado de granos infectados con Ustilago maydis, limpiando y desinfectando con hipoclorito de sodio al 1% y purificando las teliosporas, utilizando un gradiente de concentración de NaCl logrando obtener solo teliosporas libres de restos vegetales y con ayuda de una solucion al 1% de CuSO4 como agente bactericida igual al usado por Moncada en el 2014 se eliminó la microbiota asociada, encontrando que la concentración a partir de la cual se lograron separar los restos vegetales fue al 4% de NaCl y a la concentración de 6% de NaCl fue mayor la concentración de tejido vegetal separado, a medida que aumentaba la concentración de NaCl no solo el tejido vegetal se mantenía en la superficie sino también las teliosporas, este efecto se hizo más evidente a la concentración del 10% de NaCl, se evaluó la viabilidad de las teliosporas después de este tratamiento donde se compararon las teliosporas tratadas con NaCl al 4% y con 30% de NaCl, donde solo se obtuvo germinación de teliosporas en medio líquido extracto de maíz y agar extracto de maíz con el tratamiento al 4% de NaCl, en tanto con el tratamiento usando NaCl al 30% no se logró observar germinación en medio líquido extracto de maíz de las teliosporas tampoco su desarrollo en agar extracto de maíz. Al evaluar la viabilidad de las teliosporas se determinaron las condiciones óptimas de incubación, donde la temperatura optima de desarrollo y germinación de las teliosporas en medio líquido extracto de maíz fue después de 96 horas a 37°C y en agar extracto de maíz se comenzó a observar crecimiento a las 72 horas a 37°C, sin observar desarrollo ni germinación de las teliosporas en los medios incubados a 27°C por lo tanto la germinación se da a 37°C y con este dato se comenzó a trabajar en los siguientes procedimientos. Para confirmar que las colonias obtenidas eran realmente de Ustilago maydis, se tuvieron que comparar las cepas aisladas con características levaduriformes, al obtenerlas por estría cruzada en agar extracto de maíz y así obtener colonias aisladas y de fácil obtención de la siguiente fase del hongo Ustilago maydis la basidiospora, se consideraron los postulados de Koch para lograr la confirmación de la cepa, se obtuvo la fase de resistencia del hongo logrando aislar formas levaduriformes presuntivas de la fase de basidiospora, inoculando plantas sanas jóvenes, y volviendo a aislar la fase de resistencia (teliosporas), con esto se confirmaba la identidad de la cepa y la infectividad, esto por carecer de una cepa tipo de Ustilago maydis para su comparación. 56 Al lograr obtener la cepa de la fase de basidiospora de Ustilago maydis, se tenía que evaluar con cuál de las dos fase se lograba una eficiente infección, así es que se comparó inoculando en plantas de maíz en estadio V5 (Tabla 4) la fase de teliospora y la fase de basidiospora, logrando observar mejores resultados al inocular la fase de basidiospora obteniendo una zona tumoral donde se encontraba una masa de teliosporas nuevamente (imagen B, Figura 27), mientras que al inocular la fase de teliospora solo se observaba clorosis y necrosis en las planta (imagen A, Figura 27), confirmando lo que había encontrado Leal en 1996 y Cota en 2004, contrario a lo que encontró Esclante en el 2013. De igual forma se comparó la combinación de cepas para observar el efecto infectante sobre las plantas, esto ya que Ruiz en el 2008 cita la necesidad que una basidiospora debe estar en contacto con su par sexual compatible para que forme un micelio dicariótico y penetre al tejido del hospedero originando así la infección, por lo tanto se comparó inoculando tres plantas de maíz con una solo colonia y otras tres plantas con una combinación de 6 colonias, al final de esta prueba se observó que al inocularse la combinación de 6 cepas se obtenía una zona hipertrófica en el lugar de la lesión y una masa de teliosporas en la misma (imagen C, Figura 27), mientas que al inocular con una sola colonia se observaban zonas cloróticas en el lugar de la lesión y zonas necróticas en las zonas de las hojas más maduras de las plantas con una ligera hipertrofia no tan marcada como la anterior (imagen B, Figura 27). Por lo tanto la combinación de cepas resulto más eficiente para inducir la infección, al producir una agalla y una masa de teliosporas abundante y con un efecto letal sobre las plantas jóvenes en estadios V5 de maíz (Figura 27), mientras que con la fase de teliospora no se logró observar los efectos de interés, como son la agalla y obtener nuevamente teliosporas, de igual forma no se observó este efecto al inocular una sola colonia de basiodiosporas, confirmando lo que describió Cota en el 2004 con el uso de cepas sexualmente compatibles. Las colonias confirmadas de Ustilago maydis crecidas en medio agar extracto de maíz eran color crema y tomaban una coloración café conforme envejece el cultivo, son circulares, con bordes enteros, convexas, con superficie lisa, y de aspecto húmedo con consistencia suave (imagen A, Figura 25), con una morfología microscópica levaduriforme con cuerpos refringentes como se muestra en la Figura 22 se tiene la hipótesis que estas colonias son haploides. Las colonias apareadas con su par sexual compatible presentaban una morfología microscópica con el mismo tipo de levaduras refringentes pero formadoras de pseudomicelio (imagen B, Figura 26) presentaban una coloración crema, circulares, con bordes filamentosos, con elevación crateriforme y superficie rugosa con aspecto seco y consistencia suave (imagen B y C, Figura 25). Se comprobando que es más eficiente la infección con la fase de basidiospora y es más fácil obtenerla por un cultivo en medio sólido y/o líquido, en comparación con la fase de teliosporas que necesitan un método físico-químico, es indispensable aplicar este método de separación para obtener las teliosporas puras y poder realizar su cultivo y obtener a las basidiosporas y con ello lograr inóculos eficientes para la infección de 57 Ustilago maydis y producción del huitlacoche. Por lo tanto, la fase de interés para infectar a las plantas de maíz son las basidiosporas, por lo que se procedió a comparar medios de cultivo con los cuales se obtendría una mayor cantidad de biomasa de basidiosporas, primero evaluando que medio de cultivo sólido presentaba mayor crecimiento de las basidiosporas al inocular 1mL de medio líquido crecido por 24 horas a placas de agar extracto de maíz y agar de extracto de papa, encontrando que se obtiene mayor desarrollo en agar extracto de papa al tener un desarrollo de 20 UFC/ml mientras que en agar extracto de maíz se obtienen 6 UFC/ml como se muestra en la Figura 28, de igual forma se comparó el medio a base de extracto de maíz y medio a partir de extracto de papa, cada uno se diluyo en 1:1 y 1:3. determinando en cuál de los seis diferentes medios líquidos se obtenía el mejor resultado, el cual fue el medios extracto de maíz diluido 1:1 con 1.28x107 basidiosporas/mL, seguido del medio extracto de maíz concentrado con 4.22x106 basidiosporas/mL, después el medio extracto de papa diluido 1:1 con 3.12x106 basidiosporas/mL, luego el medio extracto de papa diluido 1:3 con 2.2x106 basidiosporas/mL, hasta llegar a los que obtuvieron el menor desarrollo el extracto de papa concentrado con 1.21x106 basidiosporas/mL y extracto de maíz diluido 1:3 con 8.4x105 basidiosporas/mL como se muestra en la Figura 29. Con los datos obtenidos como se menciona anteriormente se prosiguió a generar biomasa para tener los inóculos y con ellos infectar plantas adultas de maíz en los jilotes, aplicando inóculo de 6x105, 6x104 y 6x103 basidiosporas/mL, inyectando 1mL por zona de la mazorca; en la base, en el centro y en el ápice. Después de 24 días se evaluó la presencia de infección, en donde solo se observó evidencias de la formación de micelio y algunas teliosporas en la mazorca inoculada con la concentración de 6x105 basidiosporas/mL, mientras que a la concentración de 6X104 y 6x103 basidiosporas/mL no se logró observar la evidencia de teliosporas, solo un estado de descomposición en el sitio de inoculación (imagen A, Figura 32). Los resultados anteriores no fueron tan representativos al no presentase la evidencia de agallas en la mazorca esto influenciado por factores ambientales que pudieron afectar el desarrollo de la planta y la calidad del suelo, pero se tenía la evidencia del crecimiento micelial y producción de teliosporas en la mazorca inoculada, por lo tanto se procedió a realizar una nueva prueba en plantas de maíz de la misma localidad usando suelo de compostaje rico en nutrientes, ya que Garibaldi en el 2003 menciona que los suelos ricos en nitrógeno son propicios para la formación del huitlacoche, por lo tanto se volvió a generar basidiosporas a partir de las teliosporas obtenidas por el tratamiento con el gradiente de concentración de NaCl las cuales se habían conservado en refrigeración, al obtener las colonias de basidiosporas se seleccionaron cuatro diferentes cepas por sus diferentes características macroscópicas en especial aquellas que presentaran pseudomicelio, se generó biomasa con estas y un inóculo de 2x106 UFC/mL con las que se inoculó en el jilote de una planta adulta de maíz estadio R1 (11 días después de la salida de los estigmas del jilote), después de cuatro semanas de 58 inoculación se observó la infección típica de Ustilago maydis con la formación de agallas grisáceas y la presencia de abundaste teliosporas (Figura 35). 59 8. CONCLUSIÓN Se logró obtener un concentrado puro de teliosporas a partir de una mazorca infectada con Ustilago maydis. Se comprobó la viabilidad de las teliosporas obtenidas después del tratamiento de purificación. Se logró obtener la fase de basidiosporas en cultivo puro. Las condiciones óptimas para generar el inóculo de basidiosporas fueron a 37°C, incubando por 48 horas como mínimo. El medio de cultivo adecuado para generar el inóculo es agar extracto de maíz diluido 1:1. Se logró obtener un medio de cultivo económico y eficaz para la generación de biomasa para producir inóculos de basidiosporas. La vía de inoculación más eficiente para generar la infección típica del maíz con Ustilago maydis para la formación del huitlacoche es por inyección directa en la etapa adulta del maíz etapa R1 (después de una a dos semanas de la salida del estigma del jilote). La concentración adecuada para generar la infección típica del maíz con Ustilago maydis para la formación del huitlacoche fue con 2x106 basidiosporas/mL. 60 9. BIBLIOGRAFÍA 1. Agrios, G. N. (2005). Fitopatología. (5ª ed.). México. Editorial Limusa. pp. 273-285, 493-498. 2. Alexopoulos, C. J., Mims, C.W., Blackwell. (1996). Introductory Micology. (4ª ed.). E.U.A. Ed. John Wiley and Sons. Inc. pp. 421-433, 508-540, 646. 3. Al super en casa.com (2016). Verduras enlatadas. Recuperado de: http://alsuper.com/alsuperencasa/catalog.pl?page=3&id=79&orderby=0&showby=0 4. Calderón, F. M. L. (2010). Características clásicas y moleculares del huitlacoche [Ustilago maydis D.C.], hongo de importancia social y económica en la región central de México. (Tesis de doctorado). Instituto de enseñanza e investigación en ciencias agrícolas. México. pp. 8, 21-25, 35-39. 5. Carrillo, L. (2003). Hongos. Microbiología agrícola. Recuperado de : http://www.bionica.info/biblioteca/Carrillo2003Hongos.pdf 6. 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Medios de cultivo Medio líquido de extracto de maíz (Harina de maíz 40%, Sacarosa 0.5%) Medio líquido de extracto de papa (Extracto de papa 20%, Sacarosa 0.5%) Agar extracto de maíz (Harina de maíz 4%, Sacarosa 0.5 %, Agar 2%) Agar extracto de papa (Extracto de papa 20%, Sacarosa 0.5%, Agar 2%) Soluciones y reactivos Agua destilada estéril Agua corriente Agua potable Alcohol al 70% NaCl Azul de metileno CuSO4 Hipoclorito de sodio comercial (Cloralex) Jabón líquido comercial (Axión) Material Gasas estériles Algodón Cinta adhesiva Diurex Papel aluminio Papel Craft Tijeras para cortar papel Cerillo Encendedor 64 Agujas de disección Tijeras de disección Pinzas de disección Bisturí Asa bacteriológica Asa micológica Mechero Bunsen Mecheros Fisher Matraces Enlenmeyer de (50, 100, 250, 500 y 1000/mL) 10.1.5 10.2 Buretas de (25, 50, 100, 250, 500, 1000 y 2000/mL) Pipetas Pasteur Pipetas volumétricas de (1, 5 y 10/mL) Tubos de ensaye de vidrio Tubos para centrifuga de plástico con tapón de rosca Cubreobjetos Portaobjetos Cámara de Neubauer Cajas Petri de vidrio Cajas Petri de plástico Varilla de vidrio Varilla acodada de vidrio Espátula Jeringas hipodérmicas con agujas de 5 y 10mL Frascos de vidrio de 250mL con tapón de rosca Vasos de plástico de 250mL Vasos de unisel de 250mL Macetas con volumen de 20L Suelo de cultivo de un maíz de la localidad de San Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de México. Suelo de compostaje Vórtex Balanza granataria Autoclave Potenciómetro Equipo Campana de flujo laminar Centrifuga Incubadora a 37°C Refrigerador a 4°C Microscopio óptico Preparación de medios de cultivo Agar extracto de maíz Composición Harina de maíz……....................................….40g Sacarosa………………...………..…….….……10g Agar…………………………..…………..………20g Agua destilada……………………..…….…1000mL Preparación Hervir por una hora 40g de harina de maíz en 1L de agua, filtrar con gasa y agregar sacarosa y agar, ajustando a 1L, esterilizar a 15 libras por 15 minutos. Agar extracto de papa Composición Papas…………..…………………………..…..200g Sacarosa……………………………..………….10g 65 Agar……………………………..………...……..20g Agua destilada…………………………...…1000mL Preparación Hervir por una hora 200 g de papas cortadas en trozos pequeños en 1L de agua, filtrar con gasa y agregar sacarosa y agar, ajustando a 1L, esterilizar a 15 libras por 15 minutos. Medio líquido extracto de maíz “concentrado” Composición Harina de maíz………….……………………….40g Sacarosa……………………………..…….……10g Agua destilada…………………………...…1000mL Preparación Hervir por una hora 40g de harina de maíz en 1L de agua, filtrar con gasa y agregar sacarosa, ajustando a 1L, esterilizar a 15 libras por 15 minutos. Medio líquido extracto de papa “concentrado” Composición Papas…………………………………..….…..200g Sacarosa………………………………...….….10g Agua destilada………………………….…1000mL Preparación Hervir por una hora 200 g de papas cortadas en trozos pequeños en 1L de agua, filtrar con gasa y agregar sacarosa, ajustando a 1L, esterilizar a 15 libras por 15 minutos. Medios líquidos diluidos (1:2 y 1:4) Se obtenían a partir de los medios líquidos concentrados se usando agua destilada como diluyente. 10.3 Preparación de soluciones reactivas Solución salina Composición Cloruro de sodio (NaCl)……………..…...…0.85g Agua destilada………………...………..….100mL Preparación El NaCl pesado se afora a 100 mL y se disuelve. 66 Soluciones salinas (diferentes concentraciones porcentuales) Composición Cloruro de sodio (NaCl)……………………...….Xg Agua destilada………………….………...…..10mL Preparación X = a la concentración de NaCl dependiendo del porcentaje de la solución. El NaCl pesado se aforaba a 10mL y se disuelve. Solución de sulfato cúprico (CuS04) al 1% Composición CuS04…….………………………...…….…...…..1g Agua destilada...…………………...………..100mL Preparación El CuS04 pesado se afora a 100mL y se disuelve. 67
