METODOS OPTICOS, ELECTROQUIMICOS Y CROMATOGRAFICOS TRABAJO 5: RECONOCIMIENTO DE LA INSTRUMENTACIÓN DE UN HPLCDAD AGILENT TECHNOLOGIES 1200 SERIES. PROFESOR: ALFREDO ARAUJO LEON INTEGRANTES: DAVID FERNADO QUIJANO SANTIAGO SERGIO JESUS MAZUN LORIA IRVIN ISRAEL CASTILLO PINTO FECHA DE ENTREGA: 22/MAYO/2014 Reconocimiento de la Technologies 1200 series instrumentación de un HPLC-DAD Agilent La HPLC ha tenido una creciente difusión desde comienzos de la década de los 70 y hoy representa una de las herramientas más empleadas en el laboratorio analítico moderno, ya sea este dedicado a la investigación básica o aplicada, industrial, biológica o bromatológica. Modalidades de la cromatografía se pueden clasificar en función de varios parámetros: La naturaleza de la fase móvil La naturaleza de la fase estacionaria El fenómeno que ocurre dentro de la columna La cantidad de muestra aplicada Por su parte podemos clasificar la cromatografía liquida de las siguientes formas: Cromatografía Liquido-solido o de adsorción Cromatografía liquido-liquido o de partición Cromatografía de fase ligada Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de exclusión por tamaño Un cromatografo líquido está constituido por: Un reservorio de solventes que alimenta al sistema con la fase móvil Un sistema que permite la introducción de la muestra: el inyector Un sistema para forzar el pasaje de la muestra y la fase móvil a través de la columna: la bomba Un sistema de monitoreo de la solución que emerge de la columna: el detector Un sistema de registro de los datos provenientes del detector la señal del detector es siempre analógica y puede ser utilizada tal cual por un registrador grafico o por un integrador, o digitalizada, para que pueda ser interpretada y procesada por una computadora. Como resultado de análisis cromatografico se obtiene dos productos: Un gráfico, el cromatograma, que relaciona la concentración de soluto en función del tiempo (de elución). Un eluido o eluato, el fluido proveniente de la columna que, de recolectarse en forma secuencial o escalonada, contiene la fase móvil e, idealmente, los componentes de la muestra separados, Los equipos de HPLC pueden clasificarse integrados y modulares en los primeros, cada una de sus partes (reservorio de solventes, bomba, inyector y detector) están reunidos en un gabinete y su intercambio o conexión con otros componentes de la misma o diferente marca es difícil. En los segundos, los módulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo según la necesidad del analista sino aumentar su complejidad según esa necesidad varié. Reservorio de la fase móvil El reservorio es el recipiente que contiene la fase móvil. Puede ubicarse dentro de la caja del equipo integrado o externamente en un equipo modular. Al extremo del tubo de salida de solvente se conecta un filtro de acero con 2 o 10 mm de porosidad que impide el ingreso de partículas a la bomba. La capacidad del frasco depende, lógicamente, del consumo esperado: pocos mililitros en el modo microbore, 0.5 a 1 litro o más en los métodos convencionales y hasta varios litros en cromatografía preparativa. Tuberías Las tuberías conectan el reservorio de solvente con la bomba, la bomba con el inyector, este con uno o más detectores conectados en serie, y eventualmente con un colector de fracciones o válvulas de distribución. Estas deberán ser inertes, y de acuerdo a su ubicación en el sistema cromatografico, resistentes a altas presiones. Estas son importantes para permitir el transporte estéril de los solutos y disolventes puros de un componente a otro del equipo. Uniones Las uniones permiten conectar las tuberías y con ellas, los distintos componentes del sistema cromatografico. Una unión consiste en dos piezas de acople perfecto, la unión “macho”, consiste en una férula que se afirma la tubería conectora y un tornillo que se ajusta a la unión “hembra”, presente en un conector o componente de un módulo, dejando un volumen interno libre de solvente prácticamente nulo. Las uniones deben reunir determinadas características entre ellas: Deben ser inertes a las fases móviles y muestras Deben cerrar herméticamente No deben contribuir en forma notable al ensanchamiento de banda extracolumnar por la presencia de volúmenes muertos. Bombas Las bombas de HPLC impulsan la fase móvil proveniente del reservorio de solventes hacia el inyector, y desde allí hacia la columna. Su caudal de trabajo puede ser muy variable, según la escala de trabajo escogido. Básicamente existen dos tipos de bomba: las de pistón (bombas reciprocantes) y las de desplazamiento continuo (bombas jeringa). Características de las bombas: Caudal Exactitud en el caudal Ruido Deriva Sistema de corte. Las bombas reciprocantes utilizan bombas con pistón, permiten varias el caudal entregado por alguno de los siguientes mecanismos: variando el recorrido del pistón y variando la velocidad de movimiento del pistón. La bomba a diafragma es un tipo de bomba reciprocante en lugar del pistón contiene un diafragma que separa el mecanismo de la cámara de bombeo. La bomba jeringa a diferencia de las bombas reciprocantes, un dispositivo de desplazamiento continúo. Es decir, el solvente contenido en un cilindro es impulsado hacia el inyector por medio de un movimiento continuo y hacia adelante del pistón. Sistemas de gradientes La HPLC isocratica es capaz de separar un número limitado de picos, tipicamente10 o 12. Para sistemas más complejos, o cuando la polaridad de los componentes a separar es muy diferente, es posible que la modalidad isocrática no sea capaz de resolverlos. El gradiente de solventes es comparable a la programación de temperaturas en cromatografía gaseosa. Existen dos tipos de formadores de gradientes: los de baja presión y los de alta presión. Los primeros emplean, en general, solo una bomba y válvulas solenoides que entregan cada solvente en una cámara de mezclado de pequeño volumen. Las segunda utilizan una bomba de alta presión para cada solvente individual cada bomba es comandada por un programador, y el solvente entregado se mezcla a alta presión en una cámara de bajo volumen y dirigido hacia el sistema. Inyector El inyector es el dispositivo que permite introducir la muestra en solución sin interrumpir el caudal de solvente a través del sistema. Debe reunir una serie de características importantes, entre ellas: Debe ser fácil de operar Debe ser inerte al ataque químico y capaz de soportar altas presiones. Debe ser preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida en el sistema. No debe provocar disoluciones importantes de la solución inyectada. En casos especiales puede requerirse que opere a altas temperaturas. Las válvulas de intercambio se emplean para agilizar o automatizar operaciones: preparaciones de la muestra, cambio de columnas, enriquecimientos de trazas, cromatografía de reciclo y operación de contracorriente. Detectores Es la parte del equipo cromatografico que permite ver y ubicar en tiempo y espacio la posición de cada componente de una muestra a la salida de la columna cromatográfica. Los detectores deben reunir ciertas características: Tener un amplio rango dinámico de respuesta Poseer una respuesta lineal No contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar Responder a todos los solutos Tener la sensibilidad apropiada no afectarse por cambios de temperatura Poseer una buena relación señal/ruido No destruir la muestra Tener una constante de tiempo baja. Los detectores pueden clasificarse en generales miden el cambio de alguna propiedad física de la fase móvil que contiene el analito en comparación con la misma fase móvil pura y los detectores selectivos son aquellos sensibles alguna propiedad propia del soluto, por ejemplo el UV. Volumen muerto: es el volumen total de solventes entre el punto de inyección y el de detección, exceptuando el correspondiente a las partículas de la fase estacionaria. Volumen elución: Es el volumen de fase móvil eluida entre la inyección y la elución de la concentración máxima del soluto. Línea base: es la porción del cromatograma donde solo se aprecia la elución de la fase móvil, sin señal debido al soluto. Tiempo de retención: es el tiempo medido entre la inyección y la elución de la concentración máxima del soluto enésimo. Factor de capacidad: es el cociente entre el número de moles de soluto en la fase estacionaria y el número de moles de soluto en la fase móvil y está relacionado con el coeficiente de distribución entre amabas fases. Factor de selectividad: es el cociente entre los factores de capacidad de un par de picos. El pequeño recorrido que hicimos en el laboratorio de cromatografía fue entrar en grupos de 6 a 5 integrantes ya que el laboratorio es pequeño ahí el maestro nos enseñó y explico cada parte del cromatografo de líquidos descrito anteriormente así como los disolventes miscibles. Referencias Quattrocchi, O., Abelalra de Andrizzi, S., Laba, R. Introducción a la HPLC, Aplicación y práctica. 1992.