Biología Laboratorio Metabolismo Producción de ATP: 2. Fotosíntesis Prof. Diana Cárdenas Caro MARCO CONCEPTUAL El número de organismos heterótrofos que vivió en la Tierra primitiva debió ser muy limitado porque la producción espontánea de moléculas orgánicas es muy lenta. La evolución de la vida en el planeta recibió un impulso tremendo con la aparición de organismos que empleaban una nueva estrategia metabólica. A diferencia de sus predecesores, estos organismos podían fabricar sus propios nutrimentos orgánicos a partir de tipos más sencillos de moléculas inorgánicas, como el dióxido de carbono (CO2) y el sulfuro de hidrógeno (H2S). Los organismos capaces de sobrevivir con CO2 como su principal fuente de carbono se denominan autótrofos o específicamente fotoautótrofos (Karp, 2009). Los fotoautótrofos son los encargados de capturar la energía que impulsa las actividades de la mayor parte de los organismos de la Tierra y utiliza esta energía radiante del sol para convertir el CO2 en compuestos orgánicos (Karp, 2009). Este proceso denominado fotosíntesis, es realizado por células que poseen clorofila, incluye células vegetales, protistas tipo algas, cianobacterias y otras bacterias fotosintéticas (Ángulo et al., 2012). Todos estos organismos realizan fotosíntesis, un proceso en el que la energía de la luz solar o lumínica es capturada por la clorofila y se transforma en energía química que se almacena en carbohidratos como la glucosa, otras moléculas orgánicas y oxígeno (Karp, 2009, Ángulo et al., 2012). El proceso es complejo y tiene lugar en dos etapas distintas. En la primera, llamada reacciones luminosas o dependientes de la luz, la energía absorbida de la luz solar promueve la síntesis de ATP y NADPH, acoplada a la oxidación de H2O a O2. El ATP y el NADPH generados en las reacciones luminosas promueven la síntesis de carbohidratos a partir de CO2 y H2O en un segundo conjunto de reacciones llamadas las reacciones oscuras o no dependientes de la luz, porque no requieren luz solar. En células eucariotas, los dos conjuntos de reacciones tienen lugar en los cloroplastos (Cooper y Hausman, 2011). Los cloroplastos son organelos verdes, grandes, que se encuentran sólo en las células de plantas y algas; las células de animales y de hongos carecen de ellos. Presentan una estructura compleja ya que además de las dos membranas que lo rodean, poseen membranas internas apiladas que contienen el pigmento verde clorofila. Estas membranas conforman sacos aplanados en forma de discos, denominados tilacoides (Ángulo et al., 2012). Los cloroplastos se encuentran principalmente en células del mesófilo, el tejido del interior de la hoja. El CO2 entra en la hoja y el O2 sale vía los poros microscópicos denominados estomas. El agua absorbida por las raíces es enviada hasta la hojas mediante los fascículos vasculares (Campbel y Reece, 2007). De esta forma las hojas se proveen de los sustratos que requieren para iniciar el proceso fotosintético. Biología Laboratorio Metabolismo Producción de ATP: 2. Fotosíntesis Prof. Diana Cárdenas Caro OBJETIVOS • Reconocer el proceso de fotosíntesis, a través del cual, los organismos fotoautótrofos producen O2 y moléculas orgánicas. • Identificar cuáles organismos realizan fotosíntesis, las estructuras celulares y las moléculas tipo pigmento donde se lleva a cabo el proceso. • Diferenciar entre las dos etapas del proceso fotosintético, sus sustratos, reacciones y productos. MATERIALES Materiales que debe llevar el estudiante Materiales que se encuentran en el laboratorio • Bata de laboratorio, guantes, cofia y Mortero con pistilo Vaso de precipitado tapabocas • Cuaderno de laboratorio y guía de Vidrio de reloj Gasa laboratorio Papel filtro • Hojas de espinacas frescas • 2 Jeringas plásticas nuevas desechables Tubo capilar Etanol (95%) de 10 mL Acetona • Jabón líquido • • • • • • Marcador vidriográfico Portobjetos y cubreobjetos Tijeras Bombilla (fuente de luz) Una hojilla de bisturí Una tira de lana Solución de bicarbonato de sodio (0,2%) Tubo taparosca con 10 mL de solución de glucosa (1%) Tubo taparosca con 10 mL de agua destilada Frasco lavador con agua destilada Oradador o sacabocados Reactivos de Fehling A y B Cocineta con baño María Pinzas para tubo de ensayo Biología Laboratorio Metabolismo Producción de ATP: 2. Fotosíntesis Prof. Diana Cárdenas Caro METODOLOGÍA I. SEPARACIÓN DE PIGMENTOS DE LA HOJA POR CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Procedimiento En un vaso de precipitado de 250 mL adicionar etanol hasta alcanzar 1 cm de profundidad y cubrirlo con un vidrio reloj para crear una atmósfera alcohólica en el interior. Cortar hojas de espinaca y colocarlas en un mortero. Adicionar 5 mL de acetona y macerar hasta tener una mezcla homogénea. Cuando la acetona esté bien verde, tomar este macerado y fíltrar usando una gasa o muselina para obtener el líquido. Recortar un fragmento de papel filtro de 2 cm de ancho por 10 cm de largo, marque con un lápiz dos líneas paralelas a cada borde. Con un tubo capilar, adicionar la muestra en una de las líneas marcadas (Figura 1). Esta operación puede repetirse has 7 u 8 veces. Introducir el papel filtro con la muestra hacia abajo dentro del vaso de precipitado con alcohol, evitando tocar las paredes del vaso y procurando que la muestra no entre en contacto con el solvente (etanol). El papel debe quedar en forma vertical. Figura 1. Montaje para cromatografía de papel Fuente: Uribe, 2011 https://bioquimicaunisarc.files.wordpress.com/2011/10/manual.pdf Dejar correr por absorción el solvente sobre el papel filtro hasta que alcance la línea superior. Retirar el papel y dejar secar a temperatura ambiente. Biología Laboratorio Metabolismo Producción de ATP: 2. Fotosíntesis Prof. Diana Cárdenas Caro Resultados y discusiones Tenga presente la Figura 2 para la toma e interpretación de los resultados obtenidos. Los pigmentos presentes en las hojas se habrán separado y permitirán reconocerlos de acuerdo al color observado en el papel filtro. Pegue la tira del papel en el cuaderno de laboratorio o una foto de ella. Cuál pigmento representa cada color observado? Cuál espectro de absorción presenta cada uno de estos pigmentos? Describa la función de cada pigmento observado. Cuáles de ellos son más eficientes en los procesos fotosintéticos y porqué? Figura 2. Separación de los pigmentos en el papel filtro Fuente: Prácticas de Fisiología Vegetal http://www3.uah.es/bartolomesabater/Guiones%20de%20Practicas.pdf Biología Laboratorio Metabolismo Producción de ATP: 2. Fotosíntesis Prof. Diana Cárdenas Caro II. DISCO FLOTANTE PARA DETERMINAR LA FIJACIÓN DE CARBONO EN LA FASE OSCURA O INDEPENDIENTE DE LA LUZ En un vaso de precipitado adicionar 20 mL de una solución de bicarbonato de sodio al 0,2%. En otro vaso de precipitado adicionar 20 mL de agua destilada, este vaso será utilizado como CONTROL del experimento. Adicione 5 mL de jabón líquido al vaso con la solución de bicarbonato. El jabón líquido humedecerá la superficie hidrofóbica de la hoja de espinaca, permitiendo que las soluciones penetren el interior de los tejidos. Cortar con un sacabocados 20 o más discos uniformes de hoja de espinaca fresca para cada ensayo (10 para el vaso con bicarbonato) 10 para el vaso control (Evitar discos con venas centrales) (Figura 3). Seleccionar los discos de hojas, remover el pistón de la jeringa y colocar los discos de hoja dentro de la jeringa, deberá incorporar nuevamente el pistón cuidando de no dañar los discos de hoja. Empuje suavemente el pistón hasta dejar solo un pequeño volumen de aire para los discos de hoja (< 10%) entre el extremo de la jeringa y la barrera de goma del pistón. Figura 3. Preparación del montaje de los discos flotantes Fuente: Uribe, 2011 https://bioquimicaunisarc.files.wordpress.com/2011/10/manual.pdf Biología Laboratorio Metabolismo Producción de ATP: 2. Fotosíntesis Prof. Diana Cárdenas Caro Succionar un pequeño volumen de bicarbonato de sodio y resuspender allí los discos de las hojas. Poner su dedo índice en la abertura de la jeringa y halar el pistón, de esta forma se creará vacío el cual deberá conservar por 10 segundos. Así pues, el bicarbonato de sodio se infiltrará en los espacios de aire de la hoja. Repetir este procedimiento unas 2 ó 3 veces. Colocar los discos y la solución dentro de un vaso precipitado y adicionar 10 mL en el fondo del vaso de una solución de bicarbonato de sodio. Para el tratamiento control, infiltrar los discos solo con agua y jabón líquido. NO adicionar bicarbonato. Colocar los discos y la solución dentro de un vaso precipitado y adicionar 10 mL de agua destilada en el fondo del vaso. Colocar ambos tratamientos, previamente marcados, con una fuente de luz y empezar a contabilizar el tiempo. Contar el número de discos que flotan en cada minuto. Continuar el conteo hasta que todos los discos floten. Resultados: Los datos deberán ser registrados en la Tabla 1. Tabla 1. Registro del número de discos que flotan en cada minuto Minutos Discos que han flotado Observaciones Fuente: Uribe, 2011 https://bioquimicaunisarc.files.wordpress.com/2011/10/manual.pdf Análisis: Con estos datos es muy importante identificar, el punto donde el 50% de los discos flotan. Por qué los discos de hoja flotan? Por qué los discos se mueven hacia arriba? Cuál es la función de lámpara? Qué factores podrían influir en la tasa fotosintética? Explique Biología Laboratorio Metabolismo Producción de ATP: 2. Fotosíntesis Prof. Diana Cárdenas Caro III. DETERMINACIÓN FOTOSÍNTESIS DE GLUCOSA COMO PRODUCTO DE LA Preparar un tubo patrón con 10 mL de una solución de glucosa (1%) y otro con 10 mL de agua destilada. Adicionar 2 mL de Fehling A y 2 mL de Fehling B en cada tubo de ensayo. Agitar suavemente y luego calentar en baño María hasta la ebullición y observar el cambio de color en cada tubo. Tomar todos los discos de cada vaso de precipitado y trituralas por separado en un mortero. Mezclar 2 mL de Fehling A y 2 mL de Fehling B en dos tubos de ensayo que se rotularán “Sin bicarbonato” y “Con bicarbonato”, colocar el macerado de los discos. Llevarlos a calentamiento en baño María hasta la ebullición y observar el cambio de color en cada tubo. La observación de un precipitado de color naranja, indica positivo para la presencia de glucosa. DISCUSIONES A partir de sus observaciones elabore un mapa conceptual donde organice los procesos que se realizaron en el laboratorio y reconozca cuál etapa de la fotosíntesis demuestran. Tenga en cuenta el lugar de la célula donde ocurren, los sustratos o requerimientos, los productos y reacciones en cada etapa del proceso de fotosíntesis. CONCLUSIONES Redacte mínimo tres conclusiones del trabajo que se hizo en el laboratorio. Deben ser personales. BIBLIOGRAFÍA En construcción
