TÉCNICAS GENERALES DE LA MICROBIOLOGÍA MICROSCOPÍA MICROSCOPIO Según el principio en qué se basa la amplificación,los microscopios pueden ser : Microscopio de luz (ópticos) Microscopios electrónicos Pueden ser : Simples Microscopio de luz Compuestos Los microscopios compuestos son: de campo luminoso de campo oscuro de contraste de fase de luz ultravioleta de fluorescencia Microscopio de luz de campo luminoso El campo microscópico aparece intensamente iluminado y los objetos aparece más oscuros . Una propiedad importante de los microscopios es el poder de resolución ,que es la capacidad de distinguir dos puntos adyacentes como distintos y separados . PR λ de luz AN objet. ᵻ AN condensa Microscopio de luz de campo luminoso AN: abertura numérica es la medida de la capacidad de captación de la luz por la lente. Se puede observar a 1000 X. Aumento total: aumento del ocular x aumento del objetivo (de 10 a 15X ) por ( de 5 a 100X) El límite de resolución del microscopio óptico o microscopio de luz es 0.2 micrómetros Efecto del aceite de cedro Microscopio de campo oscuro Se observa el fondo negro y los objetos brillantes. Utiliza un condensador especial El aceite de cedro se coloca entre condensador y la lámina portaobjeto y entre la lámina portaobjeto y el objetivo. La luz incide sobre la muestra desde los lados Microscopio de campo oscuro Trayectoria de la luz en un microscopio de campo oscuroUn tope de campo oscuro evita que la luz entre directamente en la muestra; solo los rayos de luz dispersos por la muestra alcanzan la lente del objetivo y puede ser vista. Resulta imagen de alto contraste: una muestra muy iluminada contra un fondo oscuro mejora la resolución. Microscopio de contraste de fases Aumenta la diferencia de contraste entre la célula y el medio que la rodea Utiliza : Un condensador de fase Un objetivo de fase Un ocular auxiliar Comparación de imágenes Principios de la microscopía de fase Microscopio de luz ultravioleta Uiliza la luz ultravioleta de longitud de onda 180 a 400nm. Las imágenes se hacen visibles sobre pantallas de televisión o a través de fotografías Microscopio de fluorescencia Algunas sustancias químicas absorben la energía de la luz ultravioleta y la emiten como ondas visibles de mayor longitud . Un material aparece de un color con la luz ordinaria y con otro color con la luz ultravioleta. Entre las sustancias fluorescentes tenemos el naranja de acridina ,aurominaO y la clorofila . Los microscopios de fluorescencia se usa en diagnóstico y en Ecología Inmunofluorescen cia Microscopio electrónico Los electrones que viajan como ondas tienen longitudes de onda entre 0.01 nm y 0,001 nm. El poder resolutivo del microscopios electrónicos es mucho mayor que la de los microscopios de luz. Generalmente, los microscopios electrónicos amplían objetos 10 000X a 100 000 X Microscopio electrónico de transmisión Los microscopios electrónicos proporcionan información detallada de las bacterias más pequeñas, virus, estructuras celulares internas e incluso moléculas y átomos grandes. Estructuras celulares que solamente se pueden ver mediante microscopía electrónica se refieren como ultraestructura de una célula Hay dos tipos generales de microscopios electrónicos: microscopios electrónicos de transmisión y microscopios electrónicos de barrido.. Microscopios electrónicos de transmisión Se utilizan para estudiar las estructuras internas de las células Se puede observar estructuras moleculares como proteínas y ácidos nucleicos . Una célula es demasiado gruesa para su observación y debe ser sometida a cortes ultrafinos. Para los cortes ultrafinos las células bacterianas se incluyen en plástico y se emplea el ultramicrótomo. Colorantes especiales como el uranio y lantano acentúan el contraste. La tinción negativa usa ácido fosfotungstico No puede usarse MET para estudiar células vivas Microscopios electrónicos de barrido Para estudiar estructuras externas .la muestra se recubre con una fina capa de metal pesado como oro o platino.La profundidad de campo es extraordinaria y se obtiene amplio rango de magnificaciones que van desde 15x hasta 10,000x Microscopios electrónicos de barrido Microscopios de sonda de barrido Permiten ver características de la superficie al mover una sonda fina sobre la superficie de un objeto. Ejemplos de estos microscopios son: El microscopio de túnel de barrido El microscopio de fuerza atómica Microscopio de túnel de barrido Un microscopio de efecto túnel mide el flujo de electrones hacia y desde la sonda y la superficie del espécimen. La cantidad de flujo de electrones,llamada corriente de túnel, es directamente proporcional a la distancia de la sonda a la superficie de la muestra. Microscopio de túnel de barrido Un microscopio de efecto túnel puede medir distancias tan pequeñas como 0.01 nm y revelan detalles en la superficie de un espécimen a nivel atómico Un requerimiento para la microscopía de túnel de barrido es que la muestra sea conductora de electricidad. Aumentos hasta 100 000 000 Microscopio de fuerza atómica Se emplean para estudiar superficies que no conducen bien la electricidad Se usa para hacer mapas genéticos de plásmidos localizando unión de enzima de restricción Microscopio de fuerza atómica Microscopio confocal de barrido con laser Acopla fuente de luz láser a la microscopía óptica . Da imágenes digitales tridimensionales de los microorganismos . Las células se tiñen con colorantes fluorescentes para hacerlas más fácilmente visibles .Se pueden crear faIsos coIores Se obtienen imágenes de las diferentes capas que se pueden almacenar y luego superponer digitalmente para dar imágenes tridimensionales de la muestra completa Resolución de 0.1 micrómetro Microscopio confocal de barrido con laser Microscopio confocal de barrido con laser