MICROBIOLOGÍA APLICADA PRÁCTICA Nº 09 Aislamiento de microorganismos útiles para la biorremediación Por definición, la biorremediación es el uso de organismos vivos, principalmente microorganismos, para degradar los contaminantes ambientales en formas menos tóxicas. Utiliza bacterias y hongos o plantas naturales para degradar o desintoxicar sustancias peligrosas para la salud humana y / o el medio ambiente. Los microorganismos pueden ser autóctonos de un área contaminada o pueden ser aislados de otros lugares y llevados al sitio contaminado. Los compuestos contaminantes son transformados por organismos vivos a través de reacciones que tienen lugar como parte de sus procesos metabólicos. La biodegradación de un compuesto es a menudo el resultado de la acción de múltiples organismos. Cuando se importan microorganismos a un sitio contaminado para mejorar la degradación, tenemos un proceso conocido como bioaumentación (Vidali , 2001). El fundamento bioquímico de la biorremediación se basa en que en la cadena respiratoria, o transportadora de electrones de las células, se van a producir una serie de reacciones de óxidoreducción cuyo fin es la obtención de energía. La cadena la inicia un sustrato orgánico (compuestos hidrocarburados) que es externo a la célula y que actúa como dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula acaba degradando y consumiendo dicha sustancia. Los aceptores más comúnmente utilizados por los microorganismos son el oxígeno, los nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dióxido de carbono. Cuando el oxígeno es utilizado como aceptor de electrones la respiración microbiana se produce en condiciones aerobias, y los procesos de biodegradación serán de tipo aerobio; sin embargo, si utiliza los sulfatos o el dióxido de carbono se produce en condiciones reductoras o anaerobias, y los procesos de biodegradación serán de tipo anaerobio (Maroto Arroyo & Rogel Quesada, 2004). La biorremediación no es un concepto nuevo en el campo de la microbiología aplicada. Los microorganismos se han utilizado para eliminar la materia orgánica y los productos químicos tóxicos de los efluentes de desechos domésticos y de fabricación durante muchos años. Lo que es nuevo, en las últimas décadas, es el surgimiento y expansión de la biorremediación como industria, y su aceptación como una alternativa eficaz y económicamente viable para limpiar suelos, aguas superficiales y subterráneas contaminadas con una amplia gama de sustancias químicas tóxicas, a menudo recalcitrantes. Pág. Nº 1 MICROBIOLOGÍA APLICADA La biorremediación se está convirtiendo en la tecnología de elección para la remediación de muchos ambientes contaminados, particularmente sitios contaminados con hidrocarburos de petróleo (Crawford & Crawford, 2005). Los procesos naturales de biorremediación y fitorremediación (remediación por plantas) se han usado desde hace siglos; tal es el caso de la desalinización de terrenos agrícolas por la acción de plantas capaces de extraer las sales (Silva Espitia, 2013). La biorremediación usando microorganismos fue inventada por el científico norteamericano George M. Robinson. Éste trabajó como ingeniero petrolero asistente de la compañía Santa María de California en la década de 1960 y se dedicó a experimentar con una serie de bacterias en frascos contaminados de petróleo. Se puede clasificar a la biorremediación como in situ o ex situ. La primera consiste en tratar el material contaminado en el lugar en que se encuentra sin trasladarlo a otra parte. Algunos ejemplos de estas tecnologías consisten en operaciones de compostaje, la ventilación biológica, la utilización de biorreactores, la filtración por raíces o la estimulación biológica. En los procesos ex situ el material contaminado es trasladado a otro lugar para realizar o completar su descontaminación. No todos los contaminantes son fáciles de biorremediar por medio de microorganismos. Por ejemplo, los metales pesados como el cadmio y el plomo y el mercurio no son absorbidos o capturados por estos organismos. La incorporación de algunos de estos metales dentro de la cadena alimentaria (bioacumulación) agrava el problema. Se puede usar la remediación por medio de plantas o fitorremediación. Es muy útil en estos casos porque es posible usar plantas transgénicas que concentren estas toxinas en sus partes aéreas (sobre la tierra), las cuales pueden ser cosechadas y eliminadas. Los metales pesados obtenidos de esta cosecha pueden ser concentrados aún más por incineración para ser desechados o bien reciclados para usos industriales. La eliminación de una gran variedad de contaminantes del medio ambiente requiere un conocimiento creciente de la relativa importancia de sus ciclos químicos y redes de regulación del ciclo del carbono en diversos ambientes y para cada compuesto en particular. Con seguridad que esta tecnología se desarrollará aún más en el futuro (SALAZAR MAYA , 2011). Las tecnologías de biorremediación in situ ofrecen varias ventajas sobre la remediación física y química, como se resume a continuación: • Se puede hacer en el sitio • Elimina el costo de transporte • Elimina residuos de forma permanente • La interrupción del sitio se puede minimizar • Aplicable a contaminantes diluidos y ampliamente difundidos • Asequible (Iwamoto & Nasu, 2001) Pág. Nº 2 MICROBIOLOGÍA APLICADA Microorganismos y contaminantes Los microorganismos son esenciales para una solución alternativa clave para superar los desafíos ya que sobreviven en todos los lugares de la biosfera debido a que su actividad metabólica es asombrosa; luego, nacen en toda la gama de condiciones ambientales. La capacidad nutricional de los microorganismos es completamente variada, por lo que se utiliza como biorremediación de contaminantes ambientales (Abatenh, Gizaw , Tsegaye , & Wssie, 2017) Tabla 1: Interacción de microorganismos e hidrocarburos (compuestos orgánicos). Microorganismo Compuesto Penicillium chrysogenum Hidrocarburos aromáticos monocíclicos, benceno, tolueno, etilbenceno y xileno, compuestos fenólicos P. alcaligenes P. mendocina y P. putida P. veronii, Achromobacter, Flavobacterium, Acinetobacter Gasolina y diésel hidrocarburos aromáticos policíclicos tolueno Pseudomonas putida Hidrocarburos aromáticos monocíclicos, p. Ej. benceno y xileno. Phanerochaete chrysosporium Bifenilo y trifenilmetano A. niger, A. fumigatus, F. solani and P. funiculosum Hidrocarbono Coprinellus radians HAP, metilnaftalenos y dibenzofuranos Alcaligenes odorans, Bacillus subtilis, Corynebacterium propinquum, Pseudomonas aeruginosa Fenol Tyromyces palustris, Gloeophyllum trabeum, Trametes versicolor Hidrocarburos Candida viswanathii Fenantreno, benzopireno cyanobacteria, green algae and diatoms and Bacillus Naftaleno licheniformis Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Ralstonia sp. y Microbacterium sp, hidrocarbonos aromáticos Pág. Nº 3 MICROBIOLOGÍA APLICADA Gleophyllum striatum estriado pireno, antraceno, 9- metil antraceno, dibenzotiofeno lignina peroxidassa Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Ralstonia sp. and Microbacterium sp, hidrocarbonos aromáticos Gleophyllum striatum estriado pireno, antraceno, 9- metil antraceno, dibenzotiofeno lignina peroxidassa Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Ralstonia sp. and Microbacterium sp, hidrocarbonos aromáticos Gleophyllum striatum estriado pireno, antraceno, 9- metil antraceno, dibenzotiofeno lignina peroxidassa Tabla 2: Grupos de microorganismos importantes para la biorremediación de hidrocarburos. Microorganismos Compuesto Fusariumsp. petróleo Alcaligenes odorans, Bacillus subtilis, Corynebacterium propinquum, Pseudomonas aeruginosa petróleo Bacillus cereus A gasóleo Aspergillus niger, Candida glabrata, Candida krusei y Saccharomyces cerevisiae petróleo crudo B. brevis, P. aeruginosa KH6, B. licheniformis y B. sphaericus petróleo crudo Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Arthobacter sp y Bacillus sp gasóleo Pseudomonas cepacia, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Citrobacter koseri y Serratia ficaria gasóleo, petróleo crudo Tablas traducidas de (Abatenh, Gizaw , Tsegaye , & Wssie, 2017) Pág. Nº 4 MICROBIOLOGÍA APLICADA 1. Referencias Abatenh, E., Gizaw , B., Tsegaye , Z., & Wssie, M. (2017). The Role of Microorganisms in Bioremediation- A Review. Open Journal of Environmental Biology, 2(1), 038-046. Crawford, R., & Crawford, D. (2005). Bioremediation: principles and applications (No. 6). Cambridge University Press. Electricidad, C. F. (2012). Biorremediación de acuífero contaminados con hidrocarburos. Iwamoto, T., & Nasu, M. (2001). Current bioremediation practice and perspective. Journal of Bioscience and Bioengineering, 92(1), 1–8. Maroto Arroyo, M., & Rogel Quesada, J. (2004). Aplicación de sistemas de biorremediación de suelos y aguas contaminadas por hidrocarburos. Geocisa. División de Protección Ambiental, 4(5), 297-305. SALAZAR MAYA , E. (2011). UTILIZACIÓN DE LA BIORREMEDIACIÓN EN PISCINAS CONTAMINADAS CON PETRÓLEO EN LOS CAMPOS PETROLEROS DE LA REGIÓN AMAZÓNICA. Quito. Silva Espitia, P. A. (2013). PROCESOS DE BIORREMEDIACIÓN MICROBIANA EMPLEADOS EN SUELOS DE PRODUCCIÓN AGRÍCOLA. Tunja. Vidali , M. (2001). Bioremediation. An overview. Pure and applied chemistry, 73(7), 1163-1172. Pág. Nº 5 MICROBIOLOGÍA APLICADA MATERIALES: Compost Tierra agrícola Agua residual (proveniente de una PTAR) Petróleo Diesel. Medios de cultivo: Bushnell Hass, Agar nutritivo, Agar Sabouraud, Frascos estériles. Tubos de dilución Tubosmedianos Placas de Petri Gradillas Asas de Kolle Papel de platino PROCEDIMIENTO: a. Pesar 10 g de una muestra de compost, o de tierra agrícola, y llevar a 90 ml de agua peptonada estéril. b. A partir de esta dilución, tomar con una pipeta 1 ml e inocular a cada frasco conteniendo medio Bushnell Hass enriquecido con petróleo a concentraciones de 1% y 10%. En caso de emplear agua residual, tomar 1 ml directamente e inocular en los frascos conteniendo medio Bushnell Hass enriquecido con petróleo a concentraciones de 1% y 10%. c. Realizar este procedimiento a la vez que se elabora un blanco de tratamiento que no presentará la adición de la muestra ambiental, únicamente el medio Bushnell Hass enriquecido con petróleo a concentraciones de 1% y 10%. d. Incubar a temperatura ambiente por 7 - 14 días en agitación. e. Evaluar la actividad degradativa y crecimiento microbiano mediante la comparación de turbidez entre los diferentes tratamientos y el blanco. f. Realizar la coloración Gram a partir de una asada obtenida de cada uno de los tratamientos. g. Sembrar una asada de cada frasco en Agar nutritivo y Agar Sabouraud, incubar a temperatura ambiente por 7 días, luego observar características culturales y realizar coloración Gram de las colonias aisladas. Pág. Nº 6 MICROBIOLOGÍA APLICADA Pág. Nº 7 MICROBIOLOGÍA APLICADA ESQUEMAS Y RESULTADOS: Pág. Nº 8 MICROBIOLOGÍA APLICADA CUESTIONARIO: 1. Cuál es la diferencia entre el empleo de dispersantes químicos y el empleo de microorganismos para la remediación. Cuáles son las limitantes? 2. Qué efectos negativos genera el derrame de petróleo en el suelo. 3. Qué efectos negativos genera el derrame de petróleo en el agua. 4. Describa 10 especies de bacterias y 10 especies de hongos degradadores de petróleo. 5. Explique un proceso de biorremediación de suelos contaminados con pesticidas químicos. Pág. Nº 9