UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA DEPARTAMENTO ACADEMICO DE INGENERIA PESQUERA FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Practica de laboratorio Nº4 Preparación de Medios de cultivo DOCENTE: GRUPO: 03 INTEGRANTES: 1. Vilela Chuica Sandro Yomar (1;2;3) 2. Valladolid Chunga Elmer (4;5;6) 3. Villegas Mendoza Jamir Junior (7;8;9) 4. Jiménez Salazar Junior (Responsable) (10;11) 5. Fernandez Nuñez Lorena Marily (12;13;14) 6. Pasapera Patiño Gian Carlos (15;16;17) 1.¿Cuál es el proceso básico de la esterilización a vapor en autoclaves, de desplazamiento por gravedad o gravitacionales? Explique (Vilela Chuica Sandro Yomar) Los pasos son; calentamiento del agua y eliminación del aire, el agua se calienta hasta su temperatura de ebullición (es decir 100ºC) durante esta fase de calentamiento, el aire está siendo desplazado de la cámara, para mejorar la eliminación del aire se deja que el agua hierva durante algún tiempo después que haya alcanzado los 100º C; aumento de la presión la temperatura aumenta hasta la temperatura de esterilización indicada, cerrando la válvula se cierra el recipiente, permitiendo que la temperatura y la presión aumenten hasta el nivel requerido; tiempo de esterilización (fase de esterilización o mantenimiento) durante este tiempo, se mantienen la temperatura y la presión al nivel necesario para la esterilización. Por esto se conoce a esta fase como el tiempo de mantenimiento; reducción de la presión a la presión atmosférica se abre la válvula reguladora de presión permitiendo que el vapor escape y baje la presión en espera que el ciclo termine; enfriamiento de la carga se abre la válvula que permite la entrada de aire del exterior a través de filtros hacia la cámara, esta apertura permite el enfriamiento y el secado del material. 2. ¿Qué son agentes esterilizantes, desinfectantes y antisépticos? (Vilela Chuica Sandro Yomar) Agentes esterilizantes son aquellos que producen la inactivación total de todas las formas de vida microbiana (o sea, su "muerte" o pérdida irreversible de su viabilidad) ejemplo óxido de etileno; agentes desinfectantes (o germicidas) son agentes antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos (infecciosos) de un material, pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes, ejemplo hipoclorito; agentes antisépticos son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de materiales vivos, se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se aplican ejemplo etanol, tintura de Iodo. 3. ¿Un medio de cultivo se fraccionó en partes iguales en dos frascos 1 y 2, el frasco 1 se esterilizó en autoclave a una atmósfera conteniendo 100% de vapor de agua, el frasco 2 se esterilizó en autoclave pero a una atmósfera que contenía 60% de vapor de agua, durante el mismo tiempo, a) ¿Cuál de los dos procedimientos asegura la eliminación total de esporas b) ¿Cómo se comporta el vapor como agente esterilizante? Fundamente su respuesta (Vilela Chuica Sandro Yomar). a) El primer procedimiento, porque en su interior del autoclave el vapor de agua es un factor muy importante para la destrucción de las esporas, si el vapor de agua está al 100% nos va a asegurar la eliminación total de las esporas, la autoclave permite elevar la presión una o dos atmósferas sobre la presión atmosférica, elevándose con ello la temperatura de ebullición del agua que se encuentra en su interior, es por esta razón que durante el funcionamiento de la autoclave el agua en su interior se encuentra a una temperatura superior a los 100°C. b) el vapor como agente esterilizante; aporta la humedad necesaria para la destrucción de los microorganismos; como también aporta la temperatura necesaria para que esta destrucción se realice más rápido; por todas estas razones, la calidad del vapor generado es un factor decisivo a tener en cuenta para el éxito de este proceso. 4. ¿Qué son los sistemas amortiguadores en los medios de cultivo; para qué se adicionan agentes reductores y selectivos? Explique (Valladolid Chunga Elmer Jesús) Los sistemas amortiguadores son sales que son añadidas a un medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano, siendo los más usados fosfatos y acetatos ;los agentes reductores (cisteína, tioglicolato de sodio) son agregados con el fin de crear atmósferas óptimas para el crecimiento de gérmenes microaerófilos, anaerobios facultativos y estrictos; la adición de agentes selectivos (adición de cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc) a una concentración adecuada tiene función de frenar a determinados microorganismos. 5. ¿Cuál es el criterio válido para saber que un microorganismo está "muerto" como se suele comprobar? Explique (Valladolid Chunga Elmer Jesús) El criterio válido con el que se puede saber que un microorganismo está muerto es la perdida irreversible de la capacidad de división celular, es decir la pérdida de viabilidad; y esto se puede comprobar mediante unas técnicas de crecimiento en placas de Petri (confirmando que no crecen en medios adecuados). 6. Usted decide esterilizar mediante el uso de la autoclave y realizar un control biológico del proceso, en el laboratorio cuenta con los MOs, cuyo punto térmico mortal se detalla a continuación: Escherichia coli = 55º C; Mycobacterium tuberculosis = 60ºC; Endosporas de Bacillus steanothermophilus, = 120º C ¿Cuál de los tres elegiría para efectuar el control? fundamente su respuesta en base a los datos dados. (Valladolid Chunga Elmer Jesús) Se está realizando un control biológico que utiliza indicadores biológicos como controladores del proceso de esterilización que son preparaciones estandarizadas de microorganismos relativamente resistentes (esporas) al método de esterilización que se emplea; el microorganismo que elegiría, Endosporas de Bacillus steanothermophilus ya que tiene un punto térmico mortal 120 °C (temperatura mínima que mata todas las bacterias en un determinado tiempo), además que es un organismo muy resistente asegurando de esta manera eliminar toda forma de vida microbiana. 7. Elabore un cuadro resumen del proceso de la esterilización por vapor considerando: Proceso físico de reducción microbiana, condiciones de esterilización, duración del ciclo aplicaciones, ventajas, inconvenientes. (Villegas Mendoza Jamir Junior) Actividad del proceso Proceso físico de reducción microbiana Teoría Consiste en un aparato (autoclave) que cierra herméticamente y que en su interior desarrolla vapor bajo presión, el cual se presuriza y eleva la temperatura, proporcionando que el calor húmedo destruya los microorganismos. Una esterilización segura con calor húmedo requiere temperaturas mayores Condiciones de a las del punto de ebullición del agua. Estas temperaturas son comúnmente alcanzadas por el vapor bajo presiones elevadas en una autoclave. Cuando la esterilización presión de un gas aumenta, la temperatura del gas aumenta proporcionalmente. Duración del ciclo Aplicaciones Riesgos A una temperatura de 121ºC y una humedad de 90%, el tiempo para el llenado de la cámara hasta alcanzar la temperatura adecuada es de 5´, para exposición del vapor 20´, para la penetración de vapor a los paquetes, expulsión de vapor 5´ finalmente el secado y enfriamiento de los paquetes 15´, total de tiempo 45´ Esterilización de soluciones parenterales o soluciones acuosas simples (como el agua), productos biomédicos en general, instrumental quirúrgico, materiales para medio de cultivo para laboratorio de microbiología, para uso alimenticio. Si el agua utilizada en el autoclave es de mala calidad puede provocar oxidación en el material provocando también el efecto de piel de serpiente en estos, así mismo la mala manipulación puede traer consecuencias graves para el que lo utiliza. El material debe ser menor a la capacidad de la autoclave es decir que los Inconvenientes materiales se rigen al volumen del autoclave. Elimina los MO por desnaturalización de las proteínas, el método de esterilización (vapor) más efectivo en la actualidad debido a que es rápido, Ventajas eficiente, seguro, certificable, no toxico y bajo costo, es considerado la primera opción en métodos de esterilización. 8. ¿Cuáles son los componentes de una autoclave básica? (Villegas Mendoza Jamir Junior) Básicamente una autoclave consiste en una cámara hermética construida en acero inoxidable, de forma cuadrangular o cilíndrica, dispuesta horizontal o verticalmente, la cámara puede estar equipada con sólo una puerta para la carga y descarga de materiales o bien dos puertas ubicadas en las áreas de carga y descarga de los materiales, tiene que tener una cámara donde se pone el material, un burlete que le dará hermeticidad a la autoclave puede ser de silicona, un carro transportador o rejillas que pueden ser fijas o móviles es aquí donde ubicaremos el material, tiene que tener separadores internos, un calderin que generará el vapor, una bomba de vacío, una válvula de seguridad y un nanómetro. 9. ¿Qué factores afectan la esterilización por autoclave? Fundamente su respuesta (Villegas Mendoza Jamir Junior) Número de microorganismos es un factor fundamental ya que es uno de los dos factores que miden la efectividad de los diferentes procesos de esterilización se utiliza en función de la evaluación de los diferentes métodos de esterilización; materia orgánica, dificulta la eliminación de los microorganismos pero es uno de los factores fácilmente modificables esto justifica la importancia de la limpieza antes de la esterilización; tiempo, medio por el cual se evalúa la función de los métodos de esterilización es el tiempo necesario para que una suspensión a temperatura de 121ºC elimine todas las esporas bacterianas; temperatura, al aumentar la temperatura en un proceso específico de esterilización, su efectividad aumenta pues cuando ésta es superior a la temperatura óptima de crecimiento de un microorganismo generalmente provoca la muerte del mismo; estandarización de la carga, los paquetes deben tener las medidas (28 x 28 x 47 cm.) y los envoltorios normados internacionalmente, la carga a esterilizarsees variable y puede cambiar, respecto al número de instrumentos, volumen de carga, tamaño de los instrumentos y contenido de los paquetes. 10. ¿Cómo se ajusta el pH en un medio de cultivo? Explique (Jimenez Salazar Junior) El pH de los medios de cultivo se ajusta durante su fabricación a los valores descritos en cada uno de ellos; para este ajuste se toma una muestra del medio de cultivo preparado y estéril, se mide el Ph (por medio de un potenciómetro o con un papel pH 4.0-7.0) y luego se ajusta con volúmenes de soluciones acidas (HCl) o básicas (NaOH) 1N o 0.1N que sea requerido para el total del medio; si el medio es liquido la medición y el eventual ajuste se hace a temperatura ambiente (25°C). 11. El técnico en microbiología de un laboratorio de microbiología cometió los siguientes errores en el transcurso de su carrera profesional, explique por qué son errores y cuáles son las consecuencias de los mismos, a) puso a esterilizar material y la autoclave no tenía agua en el interior, b) puso a esterilizar medios de cultivos líquidos en una autoclave con las tapas de los frascos cerradas en forma hermética, c) abrió la puerta del autoclave una vez terminados los 15 min a 121°C, pero la tº aún estaba a 110°C y la presión por encima de la presión atmosférica, d) ¿cuál fue la situación si el autoclave tenia soluciones? de recomendaciones para cada caso ( 2 puntos) .(Jimenez Salazar Junior) a) es un error porque lo que se debe de hacer , es comprobar el nivel de agua en el interior de la autoclave y en caso de estar bajo, rellenar con agua destilada hasta el nivel óptimo (cubriendo la parrilla de la parte inferior); la consecuencia, es que no se generaría vapor para llevar a cabo la esterilización, e incluso puede provocar averías en la autoclave; lo recomendable es verificar diariamente que la autoclave se encuentre con los niveles necesarios de agua destilada para su funcionamiento. b) es un error porque las tapas de los frascos no deben de quedar cerrados de forma hermética, para que el vapor pueda entrar y salir; la consecuencia, es que no se producirá un intercambio de vapor, por ende, no se llevara a cabo la esterilización requerida; lo recomendable es dejar las tapas a rosca flojas, y deben cubrirse con papel. c) es un error porque no se debe de abrir la puerta de la autoclave sin asegurarse que la temperatura baje y que la presión sea igual a la presión atmosférica; las consecuencias serán quemaduras debido a que los materiales están todavía muy calientes; lo recomendable es que, transcurridos los 15 minutos a 1 atmósfera de presión, apagar la fuente de calor y dejar que la autoclave se enfríe sólo (no abrir la válvula de salida de vapor), hasta que la presión haya bajado a 0. d) la situación es que al tener la temperatura y presión elevadas origina que parte de la solución pueda llegar al punto de ebullición y evaporarse, o incluso los frascos pueden estallar debido a esta ebullición, por eso es recomendable abrir la autoclave a una presión y temperatura ambiente. 12. ¿Qué se debe hacer si se derrama algún cultivo líquido o se rompe un tubo inoculado? (Fernandez Nuñez Lorena Marily) Se debe cubrir el área con papel toalla y desinfectante por lo menos por 15 min; luego deberá remover y descartar éste según las instrucciones del instructor; si se vierte algún cultivo en la mesa, piso o encima de su ropa, se tiene que notificar inmediatamente al instructor, profesor o técnico de laboratorio 13. ¿Qué son medios selectivos diferenciales? Fundamente y explique con dos medios de cultivo. (Fernandez Nuñez Lorena Marily) Los medios selectivos diferenciales es la combinación en un mismo medio las características de ser selectivo y diferencial; por ejemplo el agar Mac Conkey, contiene sales biliares y cristal violeta, que inhiben el crecimiento de las bacterias gram positivas; pero también contiene lactosa y un indicador de pH permite distinguir entre las bacterias fermentadoras de lactosa y las que no lo son; y el agar EMB o eosina azul de metileno, utilizado para el crecimiento de bacilos gram negativos de la familia Enterobacteriaceae, la eosina y el azul de metileno inhiben el crecimiento de bacterias gram positivas y permiten diferenciar los microorganismos capaces de hidrolizar la lactosa y/o sacarosa de aquellos que no lo son. 14. ¿Qué microorganismo crece en cada uno de los medios de cultivo: agar cistina - telurito, agar BHI con antibióticos, agar verde brillante? Fundamente sobre su crecimiento. (Fernandez Nuñez Lorena Marily) Agar cistina-telurito: crecen microrganismos del genero Corynebacterium, medio utilizado para el aislamiento de Corynebacterium diphtheriae; la reducción del telurito de potasio por C. diphtheriae produce colonias negras; agar BHI con antibióticos: crece Helicobacter pylori; el agar BHI adicionado de cloranfenicol y cicloheximida se utiliza para el aislamiento selectivo de hongos patógenos; la cicloheximida inhibe el crecimiento de hongos saprófitos mientras que el cloranfenicol actúa como agente antibacteriano tanto de bacterias Gram positivas como Gram negativas; la incorporación de ambos antimicrobianos proporciona una mayor selectividad frente a hongos saprófitos y bacterias; agar verde brillante: crecen microorganismos del genero Salmonella, es un medio altamente selectivo para el aislamiento de especies de Salmonella excepto S. typhi y S. paratyphi; no se recomienda para el aislamiento de Shigella; incluye lactosa, sacarosa y rojo fenol; siendo el agente inhidor el verde brillante; las colonias de Salmonella se ven de color rosa o blanco, o transparentes, sobre un fondo rojo. 15. Cuáles son los agentes inhibidores y selectivos de los siguientes medios de cultivo: BHI, TCB, agar Salino Manitol, agar de Mac Conkey, Kligler? Explique los posibles resultados obtenidos. (Pasapera Patiño Gian Carlos) El BHI (Brain Heart Infusión), medio rico que permite el crecimiento de una gran mayoría de los microorganismos, menos los muy exigentes, se puede usar como base para Agar sangre, sus agentes inhibidores son la infusión de tejidos animales, peptonas, glucosa ; TCB es altamente selectivo, cumple con los requisitos nutritivos de las especies de Vibrio y permite que los vibrios compitan con la flora intestinal; el Agar salino manitol su agente inhibidor son; cloruro sódico al 7,5, es un medio selectivo utilizado en el aislamiento de Staphylococcus ; Agar de MacConkey, medio primario selectivo y diferencial que se emplea más a menudo para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos fermentadores y no fermentadores de lactosa; las sales biliares y el cristal violeta actúan como inhibidores de gram positivos; las bacterias que fermentan lactosa producen colonias color rojo y las no fermentadoras dan colonias incoloras más o menos transparente; agar Kliger medio rico y diferencial, permite ver 4 características de las enterobacterias; fermentación de la glucosa, fermentación de la lactosa, producción de sulfuro y formación de gases. 16. Elabore un mapa conceptual sobre los tipos de esterilizadores a vapor y sus características (2 puntos). (Pasapera Patiño Gian Carlos) TIPOS DE ESTERILIZADORES A VAPOR Y SUS CARACTERISTICAS ESTERERILIZADORES DE PRE-VACIO AUTOCLAVES DE DESPLAZMIENTO DE GRAVEDAD O GRAVITACIONAL En estos equipos el aire es removido por gravedad, ya que el aire frío es más denso y tiende a salir por un conducto colocado en la parte inferior de la cámara cuando el vapor es admitido. CARACTERISTICAS Estos equipos tienen una bomba de vacío, o sistema de Venturi, para retirar el aire de la cámara rápidamente en forma de pulsos, de modo que el vapor ingrese a la cámara a mayor velocidad, mejorando la eficiencia de la autoclave al eliminar las bolsas de aire e incrementar la velocidad del proceso AUTOCLAVES INSTANTANEAS (FLASH) Son esterilizadores especiales de alta velocidad que generalmente los ubican entre las salas de operaciones para procesar los instrumentos desempaquetados y para usos de urgencia extrema. CARACTERISTICAS CARACTERISTICAS Este tipo de equipo es obsoleto. Facilita la operación y aumentan el nivel de seguridad por medio de controles automáticos, bombas de vacío y microprocesadores. Operan en forma similar a los de desplazamiento por gravedad. Su equipamiento es más seguro en relación con la remoción del aire de la cámara y de la carga antes de que penetre el vapor. Estos esterilizadores operan a 134°C durante 3 ó 4 minutos 17. Elabore un mapa mental sobre los tipos de esterilizadores a vapor y sus características (2 puntos) (Pasapera Patiño Gian Carlos)