UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS TÍTULO: “EFECTO ANTIFÚNGICO DEL ACEITE ESENCIAL DE CANELA (Cinnamomum zeylanicum) SOBRE CEPAS DE Aspergillus flavus Y Penicillium expansum” AUTORES: WISTON ADOLFO GALARZA SERRANO KAREN JOSELYNE QUIMI VERA TUTOR ACADÉMICO: Q.F. MARÍA AUXILIADORA ALARCÓN PERASSO, Mgs. GUAYAQUIL-ECUADOR 2019-2020 i FICHA DE REGISTRO DE TRABAJO DE TITULACIÓN REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA FICHA DE REGISTRO DE TRABAJO DE TITULACIÓN TÍTULO Y SUBTÍTULO: “Efecto antifúngico del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) sobre cepas de Aspergillus flavus y Penicillium expansum” AUTOR(ES) Galarza Serrano Wiston Adolfo. Quimi Vera Karen Joselyne REVISOR(ES)/TUTOR(ES) Q.F. Alarcón Perasso María Auxiliadora Mgs. INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil UNIDAD/FACULTAD: Ciencias Químicas GRADO OBTENIDO: Químicos Farmacéuticos FECHA DE PUBLICACIÓN: JUNIO 2020 ÁREAS TEMÁTICAS: PALABRAS CLAVES/KEYWORDS: No. DE PÁGINAS: 61 CIENCIAS BÁSICAS, BIOCONOCIMIENTO Y DESARROLLO INDUSTRIAL Canela, aceite, cinamaldehído, fungistático, fungicida. RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras): El presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto antifúngico del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) sobre Aspergillus flavus y Penicillium expansum. El aceite esencial de canela (AEC) se obtuvo a través del método de hidrodestilación y fue almacenado a 4 °C. Se emplearon cuatro concentraciones al azar (30, 60, 90 y 100%) usando como disolvente dimetilsufóxido. Las cepas se incubaron durante 7 días a 35°C en agar papa dextrosa para su crecimiento y formación de conidias, con excepción del control de calidad (Candida albicans ATCC 90028) que fue incubada durante 24 horas en agar Sabouraud dextrosa. Para determinar la actividad antimicótica se usó el método de difusión de disco en agar (Kirby-Bauer), concentración mínima inhibitoria (CMI) por microdilución en caldo y concentración mínima fungicida (CMF) mediante extendido en agar a partir de las respuestas de la CMI. Los resultados mostraron que todas las concentraciones presentaron inhibición del crecimiento para ambos hongos, siendo la concentración del 100% la que obtuvo mayor promedio en los halos de inhibición. La CMI fue de 0.0918 (AEC 90%) y 0.102 mg/ml (AEC 100%) solo para Penicillium expansum. En la CMF se transfirió 50 ul de cada pocillo inhibido sobre agar papa dextrosa durante 11 días a 25°C. No se presentó crecimiento después de ese tiempo. Demostrándose que el aceite esencial de canela no solo ejerce actividad como fungistático sino también como fungicida a determinadas concentraciones. Para el análisis estadístico se utilizó el programa Microsoft Excel 2016. ADJUNTO PDF: SI CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0989379431 CONTACTO CON LA INSTITUCIÓN: NO E-mail: Wiston.galarza@hotmail.com, Karenquimi@hotmail.com Nombre: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Teléfono: (04) 2293680 E-mail: www.fcq.ug.edu.ec ii iii iv v URKUND vi vii viii ix x DEDICATORIA Dedico a este trabajo a todos mis seres queridos, a mis padres y hermanos que siempre han ayudado en cada etapa de mi vida y me brindan su apoyo y amor incondicional, especialmente a mi mama que ha sido pilar fundamental para mi formación como ser humano y ahora como profesional. A todos los docentes que han formado parte de mi formación como profesional y a todas las personas que me acompañaron durante la carrera. A todos los profesionales que me ayudaron durante la realización de este trabajo principalmente a nuestra tutora Q.F. María Auxiliadora Alarcón. Wiston Galarza xi DEDICATORIA A Dios que me ha dado la fuerza necesaria para seguir adelante y poder culminar mis estudios y avanzar un escalón más en el ámbito profesional. A mis padres por estar siempre a mi lado brindándome su apoyo incondicional, sus consejos sabios y por haberme inculcado y transmitido sus valores para hacer de mí una mejor persona, especialmente a mi madre María Vera Vera que deposito toda su confianza en mí y ha estado conmigo en las buenas y en las malas siendo un pilar fundamental en mi formación profesional. A mis hermanos que han ido paso a paso conmigo dándome su cariño y acompañándome en los momentos especiales en mi vida. Karen Quimi xii AGRADECIMIENTO Gracias primeramente a Dios por guiarme y bendecirme a cada paso de mi vida. Agradezco a todos los que me han ayudado durante estos 5 años de etapa académica, a mi madre Cecibel Serrano Morán por siempre estar conmigo en todo momento, por sus consejos, por su amor, por su paciencia, por ser mi motivación para seguir adelante y superarme cada día. Gracias a todos los docentes por impartir todos sus conocimientos y experiencias durante toda la carrera. Gracias a nuestra tutora Q.F. María Auxiliadora Alarcón por habernos ayudado durante todo el proceso y realización de este trabajo, al Q.F. Pablo Chacón por habernos ayudado con los equipos para la extracción del aceite esencial. Agradezco también de manera muy especial a los profesionales de la institución pública que me ayudaron en la realización de la metodología del presente trabajo y adquisición de las cepas de estudio a la Q.F. Jennifer R. y al Q.F. Heráclito. Wiston Galarza xiii AGRADECIMIENTO Agradezco la colaboración para el desarrollo de la presente investigación: A la Q.F. María Auxiliadora Alarcón por la orientación brindada, por su enseñanza, su paciencia, supervisión de los procedimientos realizados en los laboratorios de microbiología de la facultad y su gran apoyo para la realización de esta investigación. Al Q.F. Pablo Chacón por la ayuda del préstamo del equipo de hidrodestilación para la obtención del aceite esencial de canela, por sus consejos y apoyo para la culminación de esta investigación. Karen Quimi xiv TABLA DE CONTENIDO RESUMEN ........................................................................................................ xx ABSTRACT ...................................................................................................... xxi INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1 CAPÍTULO I PROBLEMA................................................................................... 2 I.1 Planteamiento y Formulación del Problema .............................................. 2 l.1.1 Formulación del Problema ................................................................... 3 I.2 Justificación e importancia ......................................................................... 3 I.3 Hipótesis .................................................................................................... 3 I.4 Objetivos .................................................................................................... 4 l.4.1 Objetivo General.................................................................................. 4 l.4.2 Objetivos específicos........................................................................... 4 I.5 Operacionalización de las Variables .......................................................... 5 CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO ....................................................................... 6 ll.1 Canela ....................................................................................................... 7 ll.1.2 Descripción botánica de la canela ...................................................... 8 ll.1.3 Hábitat y distribución geográfica ......................................................... 8 ll.1.4 Recolección y obtención de corteza ................................................... 9 ll.2 Aceites esenciales .................................................................................... 9 II.2.1 Método de extracción de aceites esenciales .................................... 10 ll.2.2 Usos de los aceites esenciales ......................................................... 12 ll.2.3 Métodos para evaluar la capacidad antimicrobiana de los aceites esenciales ................................................................................................. 13 ll.3 Aceite esencial de canela Cinnamomum zeylanicum ............................. 14 ll.3.1 Composición química del aceite esencial de canela Cinnamomum zeylanicum ................................................................................................ 14 ll.3.2 Actividad biológica del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) ............................................................................................... 15 xv ll.4 Hongos .................................................................................................... 16 ll.4.1 Generalidades de los hongos ........................................................... 16 ll.4.2 Estructura ......................................................................................... 17 ll.4.3 Características generales de hongos en alimentos .......................... 17 ll.4.4 Clasificación de los hongos .............................................................. 17 ll.5 Género Aspergillus spp. .......................................................................... 18 ll.5.1 Aspergillus flavus .............................................................................. 19 ll.5.2 Características morfológicas de Aspergillus flavus ........................... 19 ll.5.3 Vías de exposición y toxicidad .......................................................... 20 ll.6 Género Penicillium .................................................................................. 20 ll.6.1 Características generales y morfológicas ......................................... 20 ll.6.2 Penicillium expansum ....................................................................... 20 ll.6.3 Características morfológicas del Penicillium expansum ................... 20 ll.6.2.3 Vías de exposición y toxicidad ....................................................... 21 ll.6.2.4 Especies de Penicillium que afectan a los alimentos..................... 22 CAPÍTULO III MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................... 23 lll.1Tipo de investigación ............................................................................... 23 lll.2 Diseño de la investigación ...................................................................... 23 lll.3 Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos ............................................ 23 lll.3.1 Materiales para la extracción del aceite esencial de canela ............ 23 lll.3.2 Reactivo ........................................................................................... 23 lll.3.3 Equipos de laboratorio para la actividad antimicrobiana .................. 23 lll.3.4 Material de vidrio.............................................................................. 24 lll.3.5 Medios de cultivo y reactivos ........................................................... 24 lll.3.6 Otros ................................................................................................ 24 lll.4. Muestra ................................................................................................. 25 lll.4.1 Vegetal............................................................................................. 25 xvi lll.4.2 Microbiana ....................................................................................... 25 lll.5 Metodología Experimental ...................................................................... 25 lll.5.1 Extracción del aceite esencial .......................................................... 25 lll.5.2 Rendimiento del aceite esencial de canela ...................................... 26 lll.5.3 Determinación de densidad del aceite esencial de canela .............. 27 lll.5.4 Dilución del aceite esencial .............................................................. 27 lll.5.5 Evaluación del efecto antifúngico del aceite esencial de canela ...... 28 lll.5.6 Preparación del inóculo de Aspergillus flavus y Penicillium expansum para la técnica de difusión de disco en agar y concentración mínima inhibitoria (CMI). ........................................................................................ 28 lll.5.7 Preparación del inóculo de Candida albicans ATCC 90028 para el control de calidad ...................................................................................... 28 lll.5.8 Preparación del control positivo (Itraconazol) .................................. 28 lll.5.9 Método de difusión de disco en agar ................................................... 29 III.5.10 Concentración mínima inhibitoria (CMI) ............................................ 31 lll.5.11 Concentración mínima fungicida (CMF) ............................................ 32 Ill.5.12 Análisis estadístico ............................................................................ 32 CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIONES ............................................. 33 lV.1 Resultados............................................................................................. 33 lV.1.1 Efecto antifúngico del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en diferentes concentraciones 30, 60, 90 y 100 % ................ 33 lV.1.2 Concentración mínima inhibitoria (CMI) .......................................... 41 lV.1.3 Concentración mínima fungicida (CMF) .......................................... 42 IV.2 Discusión ............................................................................................... 43 CONCLUSIONES............................................................................................. 44 RECOMENDACIONES .................................................................................... 44 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 45 GLOSARIO....................................................................................................... 52 xvii ANEXOS .......................................................................................................... 54 ÍNDICE DE TABLAS Tabla I Conceptualización e indicadores de las variables. ................................. 5 Tabla II Descripción botánica de la canela ........................................................ 8 Tabla III Clasificación de los aceites esenciales ................................................ 9 Tabla IV Compuestos presentes en el aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) ...................................................................................................... 14 Tabla V Dilución del aceite esencial de canela ................................................ 27 Tabla VI Diluciones de los antifúngicos insolubles en agua. ............................ 29 Tabla VII Escala de Duraffourd ........................................................................ 30 Tabla VIII Puntos de corte clínicos para Aspergillus spp. ................................ 30 Tabla IX Rangos recomendados de diámetro de zona de control de calidad (mm) después de la incubación de 24 horas .................................................... 31 Tabla X Puntos de corte de la CMI para el control de calidad de Candida albicans ATCC 90028 ...................................................................................... 31 Tabla XI Puntos de corte clínicos de la CMI para Aspergillus flavus ............... 32 Tabla XII Puntos de corte clínicos de la CMI para Penicillium spp. ................. 32 Tabla XIII Diámetro del halo de inhibición en cepa de Aspergillus flavus frente a cuatro concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en un volumen de 10ul. ................................................................ 33 Tabla XIV Diámetro del halo de inhibición en cepa de Aspergillus flavus frente a cuatro concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en un volumen de 20ul. ................................................................ 34 Tabla XV Diámetro del halo de inhibición en cepa de Penicillium expansum frente a cuatro concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en un volumen de 10ul. ................................................................ 36 Tabla XVI Diámetro del halo de inhibición en cepa de Penicillium expansum frente a cuatro concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en un volumen de 20ul ................................................................. 37 Tabla XVII Diámetro del halo de inhibición en cepa de Aspergillus flavus y Penicillium expansum frente a un control positivo y negativo .......................... 39 xviii Tabla XVIII Determinación del grado de sensibilidad del Aspergillus flavus a distintas concentraciones de aceite esencial de canela ................................... 40 Tabla XIX Determinación del grado de sensibilidad del Penicillium expansum a distintas concentraciones de aceite esencial de canela ................................... 40 Tabla XX Determinación del grado de sensibilidad de Candida albicans ATCC 90028 ............................................................................................................... 41 Tabla XXI Determinación de la concentración mínima inhibitoria del control positivo (itraconazol) y cepas fúngicas ............................................................. 41 Tabla XXII Determinación de la concentración mínima inhibitoria de distintas concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepas de Aspergillus flavus, Penicillium expansum ........................................................................... 42 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Sistema de hidrodestilación .............................................................. 11 Figura 2 Estructura del hongo ........................................................................ 17 ÍNDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1 Comparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepa de Aspergillus flavus a un volumen de 10ul .................... 34 Gráfico 2 Comparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepa de Aspergillus flavus a un volumen de 20ul .................... 35 Gráfico 3 Comparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepa de Penicillium expansum a un volumen de 10ul ............. 37 Gráfico 4 Comparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepa de Penicillium expansum a un volumen de 20ul ............. 38 xix ÍNDICE DE ANEXOS Anexo A Preparación del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) ...................................................................................................... 54 Anexo B Cepas de estudio ............................................................................. 55 Anexo C Preparación de agar para analisis microbiologico............................ 55 Anexo D Efecto Antifúngico con diferentes concentraciones de aceite esencial de canela, método de difusión de discos ......................................................... 56 Anexo E Resultados de experimentación ....................................................... 57 Anexo F Discos control ................................................................................... 58 Anexo G Concentración mínima inhibitoria (MIC) ........................................... 59 Anexo H Concentración mínima fúngica ........................................................ 61 xx RESUMEN FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA “Efecto antifúngico del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) sobre cepas de Aspergillus flavus y Penicillium expansum” Autores: Wiston Adolfo Galarza Serrano, Karen Joselyne Quimi Vera. Tutor: Q.F. María Auxiliadora Alarcón Perasso Mgs. Resumen El presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto antifúngico del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) sobre Aspergillus flavus y Penicillium expansum. El aceite esencial de canela (AEC) se obtuvo a través del método de hidrodestilación y fue almacenado a 4 °C. Se emplearon cuatro concentraciones al azar (30, 60, 90 y 100%) usando como disolvente dimetilsufóxido. Las cepas se incubaron durante 7 días a 35°C en agar papa dextrosa para su crecimiento y formación de conidias, con excepción del control de calidad (Candida albicans ATCC 90028) que fue incubada durante 24 horas en agar Sabouraud dextrosa. Para determinar la actividad antimicótica se usó el método de difusión de disco en agar (Kirby-Bauer), concentración mínima inhibitoria (CMI) por microdilución en caldo y concentración mínima fungicida (CMF) mediante extendido en agar a partir de las respuestas de la CMI. Los resultados mostraron que todas las concentraciones presentaron inhibición del crecimiento para ambos hongos, siendo la concentración del 100% la que obtuvo mayor promedio en los halos de inhibición. La CMI fue de 0.0918 (AEC 90%) y 0.102 mg/ml (AEC 100%) solo para Penicillium expansum. En la CMF se transfirió 50 ul de cada pocillo inhibido sobre agar papa dextrosa durante 11 días a 25°C. No se presentó crecimiento después de ese tiempo. Demostrándose que el aceite esencial de canela no solo ejerce actividad como fungistático sino también como fungicida a determinadas concentraciones. Para el análisis estadístico se utilizó el programa Microsoft Excel 2016. Palabras Claves: Canela, aceite, cinamaldehído, fungistático, fungicida. xxi ABSTRACT FACULTY OF CIENCIAS QUÍMICAS CAREER OF CHEMISTRY AND PHARMACY “Antifungal effect of cinnamon essential oil (Cinnamomum zeylanicum) on strains of Aspergillus flavus and Penicillium expansum” Authors: Wiston Adolfo Galarza Serrano, Karen Joselyne Quimi Vera. Advisor: Q.F. María Auxiliadora Alarcón Perasso Mgs. Abstract The present work aimed to determine the antifungal effect of cinnamon essential oil (Cinnamomum zeylanicum) on Aspergillus flavus and Penicillium expansum. Cinnamon essential oil (CEO) was obtained through a hydro-distillation method and stored at 4° C. Four random concentrations (30, 60, 90 and 100%) were used with dimethyl sulfoxide as solvent. The strains were incubated for 7 days at 35° C in potato dextrose agar for growth and conidium formation, with exception of the quality control (Candida albicans ATCC 90028) which was incubated for 24 hours in Sabouraud dextrose agar. As a way to determine the antifungal activity, the method of diffusion of agar disk (Kirby-Bauer) was used in this investigation, minimum inhibitory concentration (MIC) by microdilution in broth and minimum fungicidal concentration (MFC) was used by spread in agar from the responses of the MIC. The results showed that all concentrations displayed growth inhibition for both fungi, in a concentration of 100% being the highest average in the inhibition halos. The MIC was 0.0918 (CEO 90%) and 0.102 mg/ml (CEO 100%) only for Penicillium expansum. In the MFC, 50 μl of each inhibited well was transferred onto potato dextrose agar for 11 days at 25° C. There was no growth after that time. Proving that cinnamon essential oil not only works as a fungistatic but also as a fungicide at certain concentrations. For the statistical analysis the Microsoft Excel 2016 program was used. Keywords: Cinnamon, oil, cinnamaldehyde, fungistatic, fungicide. INTRODUCCIÓN Los alimentos están expuestos a la contaminación que se encuentra en el medio, generando sobre ellos agentes extraños que pueden producir la degradación de los mismos, además de ser perjudiciales para la salud del consumidor. La contaminación por hongos es una de las mayores problemáticas a nivel alimenticio, debido a que no solo ocasionan el deterioro de la calidad de los alimentos, sino que también conlleva a grandes pérdidas económicas (1). El Aspergillus flavus y Penicillium expansum son los principales mohos que causan la degradación de frutas, hortalizas, cereales y frutos secos. Crecen en ambientes de alta humedad, pueden adherirse a los alimentos por lesiones durante la cosecha y postcosecha, además de condiciones de almacenamiento y transporte inadecuados (2). Actualmente se han incrementado las investigaciones sobre los aceites esenciales que puedan coadyuvar en la defensa de los alimentos frente a estos fitopatógenos, siendo el aceite esencial de canela una gran alternativa contra ellos (3). El aceite esencial de canela se puede extraer de la hoja o de su corteza donde el ácido cinámico, cinamaldehído y el eugenol son unos de los principales metabolitos secundarios que ejercen la actividad antimicrobiana y antimicótica (4). La presente investigación pretende evaluar el efecto antifúngico del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de hongos filamentosos como Aspergillus flavus y Penicillium expansum. 1 CAPÍTULO I PROBLEMA I.1 Planteamiento y Formulación del Problema Los alimentos se pueden contaminar ya sea por aire, agua, suelo, almacenamiento, transporte, procesado y distribución; lo que conlleva a cambios microbiológicos, físicos y químicos sobre estos, afectando a la calidad del producto, enormes pérdidas económicas, además de propiciar condiciones idóneas para el desarrollo de microorganismos como bacterias, levaduras y mohos (5). Los mohos u hongos filamentosos son microorganismos causantes de la descomposición de los alimentos especialmente de frutas, cereales y hortalizas, la presencia de estos puede tener consecuencias diversas como la producción de metabolitos tóxicos para el ser humano conocidos como micotoxinas. Las especies más comunes pertenecen al género Fusarium, Alternaria, Penicillium y Aspergillus (6). Penicillium expansum es un moho, más conocido como moho azul que sobrevive como saprófito, siendo uno de los patógenos más comunes en frutas como manzanas y peras. Es fácilmente aislado a partir del suelo, de cámaras frigoríficas y de cajas de madera utilizadas en la cosecha, transporte y almacenamiento (7). Además de contribuir al deterioro de frutas y hortalizas, este hongo produce las micotoxinas que se encuentran presentes como contaminantes de alimentos de consumo humano y animal (8). El Aspergillus flavus es un hongo termotolerante, microtermofílico que afecta principalmente a cereales, semillas y frutos secos como maíz, sorgo, cebada, trigo, centeno, millo, arroz, nueces y semillas de algodón. Se encuentra generalmente en los suelos y vegetales en descomposición, puede crecer incluso en alimentos con actividad de agua de 0.85. Es el principal productor de aflatoxinas; metabolito tóxico que ingerido en grandes cantidades produce efectos carcinógenos y mutagénicos (9). 2 l.1.1 Formulación del Problema ¿Tendrá efecto antifúngico el aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) sobre cepas de Aspergillus flavus y Penicillium expansum? I.2 Justificación e importancia La necesidad de encontrar nuevas alternativas antifúngicas y que no sean tóxicas para el ser humano se ha vuelto una problemática debido a que existe una mayor tendencia a consumir alimentos más frescos y que no posean aditivos, la presente investigación se justifica en las limitaciones y efectos negativos que tienen los antifúngicos de origen sintético sobre los alimentos (10). Los aceites esenciales han demostrado tener propiedades antimicrobianas, antioxidantes, antiparasitarias, antiinflamatorias, antidiarreicas y antifúngicas (11). El aceite esencial de canela posee actividad antifúngica (10) siendo el aldehído cinámico (cinamaldehído) el principal componente antimicrobiano en la canela, no solo exhibe actividad antimicrobiana, sino que también inhibe el crecimiento de levaduras y mohos, incluyendo Aspergillus spp. y Penicillium spp. (12). Actualmente la industria alimenticia ha optado por los aceites esenciales como alternativa viable; dado a que estos compuestos naturales pueden llegar a ser efectivos, selectivos, biodegradables y menos tóxicos (11). La importancia del presente proyecto se basa en el uso de nuevos agentes antifúngicos de origen natural, como una alternativa para inhibir el crecimiento y desarrollo de hongos sobre los alimentos, siendo los consumidores los principales beneficiados. En Ecuador la aplicación de estos extractos vegetales podría contribuir a disminuir efectos negativos ocasionados por los fungicidas sintéticos (13). I.3 Hipótesis El aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) actuará como antifúngico sobre cepas de Aspergillus flavus y Penicillium expansum. 3 I.4 Objetivos l.4.1 Objetivo General Evaluar el efecto antifúngico del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) sobre cepas de Aspergillus flavus y Penicillium expansum. l.4.2 Objetivos específicos Obtener el aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) mediante el método de extracción de hidrodestilación. Determinar la actividad fungistática del aceite obtenido mediante la técnica de difusión de disco en agar (Kirby-Bauer) y concentración mínima inhibitoria (CMI). Determinar la actividad fungicida del aceite obtenido mediante la concentración mínima fungicida (CMF). 4 I.5 Operacionalización de las Variables Tabla I Conceptualización e indicadores de las variables. TIPO Dependiente VARIABLE CONCEPTUALIZACIÓN Efecto Difusión de disco en agar antifúngico (Kirby-Bauer): prueba de susceptibilidad INDICADORES Halo de inhibición 0,0306, de microorganismos frente agentes antimicrobianos. CMI: concentración 0.0612, mínima que permite inhibir el crecimiento de 0.0918, un 0.102 microorganismo. mg/ml CMF: agente antimicrobiano capaz de del 99.9% inhibir el crecimiento del del hongo hongo en su totalidad. Independiente Aceite esencial canela Líquido aromático en agar de de aspecto aceitoso extraído de la Inhibición Corteza 30% 60% 90% 100% especie Cinnamomum zeylanicum. Concentración Son del aceite las diferentes concentraciones expresada en porcentaje del aceite esencial. Fuente: Autores 5 CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO En la actualidad cada vez surgen más estrategias para combatir el crecimiento de hongos en los alimentos, donde ha surgido un notable interés en los aceites esenciales de plantas aromáticas, los mismos que presentan compuestos activos que ejercen una actividad antifúngica y antibacteriana, como es el caso del aldehído cinámico presente en el aceite esencial de canela (14). Diversos estudios han demostrado la actividad antifúngica del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum), entre unos de ellos se encuentra el estudio desarrollado por Santos E, Oliveira E, Leite E, Barbosa F. 2008, en la que se evaluaron la interferencia que causaba el aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum en el crecimiento y la morfogénesis de especies patógenas de Aspergillus spp. (15). En las concentraciones de 80, 40 y 20 µL/mL del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum se observó una inhibición significativa en el radio de crecimiento micelial del A. niger, A. flavus y A. fumigatus durante un período de 14 días, las concentraciones de 80 y 40 µL/mL del aceite esencial de canela causo una inhibición de la germinación de esporas fúngicas en un 100%. Con respecto a los cambios morfológicos que se observaron por medio de la microscopia, se pudo determinar que el aceite esencial de canela sobre las cepas de hongos produjo la disminución de conidización, la pérdida de pigmentación y la estructura celular alterada señalando la degeneración de la pared fúngica, por lo que el aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum puede considerarse como un compuesto antifúngico, específicamente para evitar el crecimiento de especies de Aspergillus spp. En la investigación desarrollada por Caballero A, Villacorta L, Vásquez C. 2011, estudiaron el efecto del aceite esencial de clavo de olor (Syzygium aromaticum), canela (Cinnamomum zeylanicum) y su combinación sobre la acción antifúngica en Aspergillus flavus en agar chicha de maíz (Zea mays L.) variedad morado (16), en la cual se usó un extracto concentrado del maíz con almidón de papa blanca, glucosa y agar, añadiéndose a esta preparación aceites esenciales separados y combinados con concentraciones de 0,05; 0,10 y 0;20% 6 respectivamente, se determinó que el clavo de olor y la canela en conjunto o por separado actúan de manera significativa en la acción antifúngica sobre Aspergillus flavus. Un tercer estudio realizado por Xing, Li, Xu, Yun, & Lu, 2010, investigaron las actividades antifúngicas in vitro e in vivo del aceite esencial de canela para inactivar Rhizopus nigricans, Aspergillus flavus y Penicillium expansum (17), en donde las concentraciones mínimas inhibitorias del aceite de canela contra Rhizopus nigricans, Aspergillus flavus y Penicillium expansum fueron 0.64%, 0.32% y 0.16% (v ⁄ v). La actividad antifúngica del aceite de canela contra A. flavus y P. expansum fue mucho mayor a la de R. nigricans en donde la actividad mejoró al incrementar proporcionalmente su concentración. Estos resultados revelaron que el aceite de canela tiene un buen potencial para ser un agente antifúngico (17). Un último estudio que brinda sustento a la investigación es la realizada por Landero N, Lara F, Aguado G, Hoyos A, Encarnación D, y Pérez Y. 2016 ,titulada: Aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum: alternativa de control para Penicillium expansum sobre pera en postcosecha (18), en este trabajo se evaluó el efecto in vitro e in vivo de diferentes concentraciones del aceite esencial de canela en Penicillium expansum sobre la pera en postcosecha, por medio del experimento se pudo conocer que la concentración de 300 µl/L inhibió el crecimiento micelial del patógeno durante un período de 81 horas posterior a la siembra realizada en medio del cultivo, por lo cual se puede explicar que dicho aceite puede ser un antifúngico útil para preservar la vida de frutos como la pera en la postcosecha. ll.1 Canela La canela es una de las especias más antiguas y populares utilizadas por la humanidad. La presentación comercial de la canela es la corteza interna seca del árbol, o la corteza molida. El aceite de corteza, la oleorresina de corteza y el aceite de hoja son importantes productos de valor añadido (19). 7 ll.1.2 Descripción botánica de la canela Esta corteza de árbol denominada canela posee en el mundo alrededor de 250 especies reconocidas (19), pese a ello solo 4 de estas especies se aprovechan específicamente como una especia, siendo estas: Cinnamomum burmannii, proveniente de islas de Indonesia, Cinnamomum loureiroi Nees, originaria de Vietnam, Cinnamomum Zeylanicum Blume o Cinnamomum verum J. Presl siendo la más utilizada la que proviene de Sri Lanka y la Cinnamomum aromaticum Nees o Cinnamomum cassia J. Presl que se halla en China (20). Tabla II Descripción botánica de la canela Clasificación Descripción Nombre científico Cinnamomum zeylanicum Ness Sinonimia Cinnamomum verum cinnamomum L., J. S. Presl, Cinnamomum Laurus zeylanicum Blume, Cinnamomum verum Nombre común Canela, cinammon (inglés), canelo, canela de Ceilán (España) Clasificación botánica Familia Lauraceae. Clase Magnoliophyta Género Cinnamomum Orden Laurales Reino Plantae Fuente: Yucra, 2019. ll.1.3 Hábitat y distribución geográfica El hábitat de la canela se sitúa en climas cálidos y húmedos, generalmente cultivados en Sri Lanka, China, India y algunos países de América del Sur, su crecimiento y distribución geográfica se basan en las condiciones ambientales y en el terreno en el que crece (21). 8 ll.1.4 Recolección y obtención de corteza La canela (Cinnamomum zeylanicum) perteneciente a la familia Lauraceae es una especia proveniente de la corteza interna de varias especies de árboles del género Cinnamomum. La obtención de la corteza se realiza en temporadas de lluvia, por lo que el tronco adquiere humedad y esto hace más sencillo la extracción de la corteza, para poder sustraerla se debe realizar una incisión que se inicia en la base del tronco, a medida que se poda se va obteniendo cortezas finas. La canela está disponible en forma tubular (palitos de canela) o en polvo molido. ll.2 Aceites esenciales Se definen como líquidos aromáticos y de naturaleza volátil, que se obtienen a partir del material vegetal (22). Se le denomina aceite esencial, debido a que se constituyen principalmente por células grasas o lipídicas, estas pueden modificarse dependiendo del clima y distribución geográfica. La constitución de cada aceite depende del tipo de especie del cual se obtiene. Una de la característica que se les atribuye a los aceites esenciales es el ser responsable del aroma de las plantas, además de esto pueden actuar como repelentes para insectos y formar parte de la defensa química de la planta (23). Tabla III Clasificación de los aceites esenciales Clasificación Descripción Esencias fluidas Consistencia Bálsamos Oleorresinas Naturales Origen Sintéticos Artificiales Fuente: Jácome (2019). 9 II.2.1 Método de extracción de aceites esenciales ll.2.1.1 Extracción por prensado: Es uno de los métodos más antiguos para la extracción de aceites, empleado especialmente para los aceites de consumo humano, su procedimiento se basa específicamente en aplicar presión en una cantidad de material vegetal, previamente contenido en fundas, telas e incluso mallas (24). ll.2.1.2 Arrastre de vapor: Este método permite sustraer aceites esenciales, por medio de este procedimiento se puede aprovechar las propiedades que posee las moléculas de agua cuando se encuentra como vapor, para realizar la extracción de la especie que se emplee se inicia por medio del vapor de agua al hacer contacto con material vegetal, de allí se inicia la liberación de la esencia, posterior a ello se condensa y así se puede proteger el producto. El proceso que se realiza generalmente ocurre por caldera externa, a través de tubos difusores, que se encuentran ubicados en la zona inferior de lo que se denomina masa vegetal, descansando sobre la parrilla del tanque extractor. Por medio del vapor de agua los aceites esenciales de la especie se difunden por las membranas que se encuentran en las células que están hacia el exterior, cuando esto ocurre el vapor y lo aceites son enfriados hasta que se transformen en estado líquido y así se puede separar por decantación (25). ll.2.1.3 Extracción con fluidos supercríticos: Se realiza por medio de material de arrastre como sustancias químicas mediante varias etapas, la primera consiste en equilibrar la temperatura a través de resistencia que aportan energía térmica, se calienta el solvente hasta llevarlo por encima de su temperatura critica, la segunda etapa se basa en la presurización del disolvente previamente calentado, llegando a un valor superior de su presión crítica, en la siguiente etapa se realiza el proceso de extracción; en la cual el fluido permanece en contacto con la muestra arrastrando consigo el soluto. La última etapa es la de separación para ello el gas se descomprime por debajo de su presión crítica liberando al soluto en el recipiente del equipo (26). ll.2.1.4 Extracción con solventes: Esta extracción se caracteriza por la facilidad que poseen los disolventes orgánicos de extraer los aceites del material vegetal, 10 esto se realiza con disolventes adecuados a una determinada temperatura y agitación, en este método se utiliza disolvente con base soluble generalmente el agua y disolventes orgánicos (27). ll.2.1.5 Hidrodestilación: Este método se emplea por medio del agua en su punto de ebullición, sea por fuego directo, camisa de aceite o de vapor, para sumergir el material, es recomendable que este se encuentre en polvo de esa manera el vapor de agua puede tener más presión y ejercer mayor acción en las partículas vegetales. Aunque este proceso sea similar al vapor de arrastre, no lo es. El vapor producido debe llevar el aceite esencial de un recipiente a otro para que pueda ser condensado y luego separado. Un detalle importante de resaltar es el inconveniente que este presenta en relación con la temperatura, ya que puede producir compuestos que degraden la planta. En base a lo ya descrito, es importante que el material vegetal este siempre en contacto con el agua, de esa manera no hay sobrecalentamiento y carbonización de este, del mismo modo se debe tener una agitación constante para que no se sedimente o se adhiera a las paredes del tanque y se pueda cuidar de existir degradación térmica. Los aceites que se producen por destilación de agua suelen ser de menor calidad y esto se debe a que tiene componentes sensibles a la hidrólisis o a la proliferación, también porque son solubles en agua y por último porque representan mucho tiempo para ser destilados (25). Figura 1 Sistema de hidrodestilación Fuente: Angulo, Kardona, Lozano, Montañez, Salcedo (2012). 11 ll.2.2 Usos de los aceites esenciales El empleo de aceites esenciales en los alimentos ha tenido mayor presencia con el paso de los años, por lo que se ha comprobado la efectividad de estos en diferentes tipos de alimentos, como productos cárnicos, pescados, mariscos, lácteos, frutas, vegetales y cereales, tal como se observa a continuación: ll.2.2.1 Productos cárnicos: Por medio de varios estudios realizados años atrás se pudo conocer que de los aceites esenciales (AE) el que mejor resultados ofrecen es el compuesto por clavo de olor, orégano y tomillo en concentración de 5 a 20 µL/g, pues actúan como inhibidores de cepas como: Listeria monocytogenes , Aeromonas hydrophila y otros microorganismos que deterioran los alimentos, sin embargo, este último dio resultado al ser aplicado a la carne y almacenado bajo una atmósfera modificada. Ocurriendo lo mismo con el aceite de clavo de olor y canela en la bacteria Listeria monocytogenes, con concentración de 10% y 5% respectivamente (28). ll.2.2.2 Pescados y mariscos: Para este tipo de alimento el avance de aceites esenciales que ayuden a inhibir la actividad microbiana no es muy variada, pese a ello el uso del AE de orégano dio mayor efectividad contra la Photobacterium phosphoreum, en una concentración de 0,5 µL/g, el aceite esencial de clavo, de comino y de menta en concentraciones de 1, 4 o 8 µL/L en filetes de rodaballo, del cual se conoció que el más efectivo fue el aceite de menta a una temperatura de 2 ºC en un lapso de 20 días, sin embargo un aumento mayor a 4 µL/L afecta considerablemente el color y la textura del pescado (28). ll.2.2.3 Productos lácteos: Para este tipo de alimentos se ha hecho uso del eneldo y la alcaravea del cual se pudo conocer que L. monocytogenes fue más sensitiva, el aceite esencial de menta presento un CMI de 0.2% (v/v), mientras que el aceite esencial (AE) de estragón genera actividad inhibidora contra L. monocytogenes, del cual tiene un efecto aditivo de 0.6% AE de estragón. En la leche descremada el uso de AE de salvia y limón fue efectiva en las cepas de Saccharomyces Cervisiae y Geotrichum Candidum. (28). ll.2.2.4 Frutas y vegetales: El aceite esencial empleado para disminuir la actividad microbiana en las frutas y vegetales son básicamente de romero, clavo, 12 limoncillo, tomillo y menta, sin embargo, la efectividad del AE de romero y clavo resulta más efectivo en forma de vapor contra las esporas de Botrytis cinérea. El AE de romero resulta ser más efectivo en el crecimiento micelar con una concentración de 300 ppm, a diferencia de la concentración del aceite de clavo de olor que es mayor a (450ppm). El aceite de limoncillo actúa frente al crecimiento de hongos (28). ll.2.2.5 Cereales: Para el efecto de los AE en la proliferación de microorganismos se encuentra los bálsamos de limón, salvia, cilantro, tomillo, canela y menta, estos poseen efectos antifúngicos en semillas de trigo contra los microorganismos como Fusarium y Aspergillus, el aceite esencial de menta presento un efecto fungistático en todas las concentraciones probadas de 50, 100, 200, 300, 500 o 700 µL/100 g de maíz, al elevarse las concentraciones de 300, 500 e incluso 700 µL/100 g los efectos fueron fungicidas. (28) ll.2.3 Métodos para evaluar la capacidad antimicrobiana de los aceites esenciales ll.2.3.1 Técnica de difusión en agar: El método de difusión de disco en agar de Kirby-Bauer es uno de los métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos. Este consiste en depositar sobre la superficie de una placa Petri con agar, los microorganismos previamente inoculados con el microorganismo, luego se impregna los discos de papel secante con los diferentes antimicrobianos. El disco impregnado de antimicrobiano se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antimicrobiano difunde al agar (29). ll.2.3.2 Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI): Se define como la concentración mínima antimicrobiana que permite inhibir el crecimiento de un microorganismo, este método es el más utilizado en los laboratorios de microbiología clínica obteniendo como resultado la información de sensibilidad de los microorganismos S (sensible), I (intermedia) y R (resistente) (30). ll.2.3.3 Concentración mínima fungicida (CMF): La concentración mínima fungicida (CMF) se refiere al agente antimicrobiano o solución que disminuye el 13 crecimiento del hongo en un 99.9%, este se realiza partir de un inóculo de subcultivo puro (31). ll.3 Aceite esencial de canela Cinnamomum zeylanicum El aceite de canela está compuesto de mezclas de metabolitos, estas poseen propiedades organolépticas y biológicas como cualquier aceite, su origen proviene de la corteza del árbol de canelo, se caracteriza por su olor aromático. ll.3.1 Composición química del aceite esencial de canela Cinnamomum zeylanicum La constitución de la corteza de la canela se caracteriza por contener aceites esenciales, los mismos que se conforman principalmente de aldehído cinámico (cinamaldehído), benzaldehido, eugenol y pocas cantidades de terpenos y mucílagos, también posee sales minerales como hierro, magnesio y calcio y adicionalmente fibras y vitaminas, de la cual se encuentra la B1 y la C, dependiendo de la extracción o procesamiento de la canela se puede obtener diferentes compuestos químicos, situación que puede ocurrir también por la ubicación geográfica y el tiempo de cultivo, así como la edad que pose a la planta, y la porción que se sustrae de la planta, pese a esto se puede señalar que el aceite esencial de corteza se encuentra constituido por los siguientes componentes: - Cinamaldehído en un rango de 60 a 80% - Eugenol y metil eugenol en 2% También se encuentra muchos otros como el cinamil acetato, el cinamil alcohol y la cumarina, además de los expuestos a continuación: Tabla IV Compuestos presentes en el aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) Compuesto Extracto de la corteza Alfa-Pineno 3.02% Beta-Pineo 1.23% 14 P-Cimeno 0.81% Limoneno 2.53% Linalol 4.82% Alfa-Terpineol 0.26% Benzaldehído 1.80% Cinamaldehído 64.49% Eugenol 16.57% Beta-Cariofileno 1.10% Acetato de cinamilo 1.15% Alfa-Humuleno 0.20% Acetil Eugenol 0.48% Benzoato de bencilo 0.49% Canfeno 2.7% Alfa-Felandreno 2.1% Alfa-Terpineno 1.8% Beta-Felandreno 6.3% Alfa-Terpinoleno 0.2% Óxido de cariofileno 0.5% Cumarina 0.9% Fuente: Riberiro, Andrade, Madella, Martinazzo, de Aquino, de Melo, Silva, (2017). ll.3.2 Actividad biológica del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) ll.3.2.1 Actividad antioxidante: La canela inhibe la ranciedad de los lípidos y se utiliza en los alimentos como conservante durante muchos siglos. Los polifenoles de canela poseen un fuerte potencial antioxidante, que se atribuye 15 debido a la actividad de eliminación de radicales libres, y procesos de desintoxicación e inhibición de ciertas enzimas prooxidantes, como lipoxigenasas y óxido nítrico sintasa (32). ll.3.2.2 Actividad antibacteriana: Las propiedades de los componentes del aceite esencial de canela como eugenol y cinamaldehído permiten la actividad antibacteriana contra las bacterias grampositivas y gramnegativas que producen la degradación de los alimentos, además de enfermedades infecciosas. El aldehído cinámico es el compuesto más bactericida de la canela, siendo este efectivo contra cepas de Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Salmonella anatum. Las proantocianidinas son componentes bioactivos no volátiles que contribuyen también a las propiedades antibacterianas de la canela (32). ll.3.2.3 Actividad antifúngica: Los componentes como geraniol, eugenol, cinamaldehído y benzoato de bencilo son responsables de la alta actividad antifúngica del aceite de canela contra levaduras como Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, Cryptococcus neoformans (32), así mismo afecta a hongos dermatofitos: Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus terreus, Histoplasma capsulatum, Malassezia furfur, Microsporum audouinii, Microsporum canis, Penicillium spp., Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes (33). ll.4 Hongos ll.4.1 Generalidades de los hongos Los hongos son denominados como miembros unicelulares o multicelulares heterotróficos, de los que no es posible diferenciar las raíces, tallos e incluso hojas, estos hongos también son conocidos como parásito obligados por lo que poseen requerimientos nutritivos similares a las bacterias, tienen la propiedad de crecen un rango amplio de temperatura que comprende de los 2 a los 50 ºC y en un pH de 1 a 8 (34). 16 ll.4.2 Estructura Se conforman por 2 capas, tal como se observa a continuación: Figura 2 Estructura del hongo Fuente: Moreno (2016). ll.4.3 Características generales de hongos en alimentos Dentro de las características que poseen los hongos en los alimentos se tiene la susceptibilidad al suave calor, la pasteurización a alta presión en caso de bebidas, el plasma atmosférico frío y rayos ultravioletas (34). ll.4.4 Clasificación de los hongos ll.4.4.1 Levaduras: Son hongos que poseen forma unicelular esférico o en algunos casos elípticas de 3 a 15 µm, su reproducción se da por medio de gemación o brotación del cual se forma las seudohifas que es la cadena de levaduras, para diferenciarlas es necesario realizar pruebas fisiológicas. Dentro de los tipos de levadura se observa la Candida albicans, Candida krusei, Geotrichum spp., Trichosporon spp. y Cryptococcus neoformans (34). ll.4.4.2 Mohos: Los mohos son microorganismos que poseen forma multicelular, se encuentran estructurados por tubos o filamentos denominados hifas, las mismas que se pueden subdividir en cadenas de células de paredes 17 transversales, su reproducción es sexuada o asexuada de acuerdo a la especie y las condiciones del ambiente en el cual se desarrolle (34). ll.5 Género Aspergillus spp. En el área de alimentos los mohos causan un deterioro considerable en varios alimentos especialmente en aquellos con contenido alto de azucares y crecen en condiciones de alta humedad, de acuerdo con los tipos de Aspergillus se tiene los siguientes grupos: A. glaucus A. candidus A. cervinus A. ochraceus A. clavatus A. carneus A. flavipes A. flavus A. fumigatus A. nidulans A. niger A. ornatus A. restrictus A. sparsus A. terreus A. ustus A. versicolor A. wentii 18 Dentro del área del diagnóstico microbiológico la mayoría de las especies crecen sobre agar Czapek-Levadura, respecto a la temperatura de incubación se tiene que para la corriente es de 25 ºC, pese a esto no todos actúan con esta temperatura, en el caso de Aspergillus fumigatiaffinis se recomienda 37ºC, para la ornamentación de los conidios esta sufre un cambio con la edad, luego de dos semanas las esporas se encuentran maduras en su totalidad (35). ll.5.1 Aspergillus flavus Es un hongo filamentoso que afecta principalmente a frutas, hortalizas, granos y cereales. En determinadas condiciones produce metabolitos tóxicos conocidos como aflatoxinas, siento los causantes de la mayoría de intoxicaciones alimentarias y aspergilosis (9). ll.5.2 Características morfológicas de Aspergillus flavus Esta especie se caracteriza por producir hifas especializadas como conidióforo, expulsando de allí esporas asexuales conocido como conidios, que pude definirse como estructura unicelular con 3 partes como la vesícula, el estipe y la célula pie que puede separarse por el septo. Las células conidiógenas se encuentran sobre la vesícula (35). ll.5.2.1 Características macroscópicas: Las colonias en agar Czapek-extracto de levadura (CYA) y agar Czapek extracto de levadura más 20% de sacarosa (CY20S) son de color verde olivo con un micelio blanco y un reverso incoloro, amarillento, verde rojizo; también con micelio blanco esclerocios, varia en forma y tamaño, particularmente textura terciopelada. Las colonias en agar extracto de malta (MEA) es de color olivo, a veces verde oscuro con micelio blanco apenas detectable, su forma y tamaño es variable, la colonia se ubica en la zona del centro (35). ll.5.2.2 Características microscópicas: Posee cabezas conidiales uniseriadas y biseriadas, particularmente radiales, con estipes rugosos, hialinos con color marrón pálido (35). 19 ll.5.3 Vías de exposición y toxicidad las condiciones óptimas para el crecimiento de especies productoras de toxinas son consistentes con aquellas que promueven la producción de micotoxinas. Por lo tanto, el desarrollo óptimo de A. flavus ocurre a 36 ° C con una actividad de agua de 0.95 y la producción de aflatoxinas es de una temperatura de 33 ° C con 0,99 de actividad, pero aún se puede formar a 15 ° C con actividad de agua de 0,95 (36). ll.6 Género Penicillium El género del Penicillium pertenece a la clase Deuteromycetes y Orden Moniliales, de la familia Phialosporae y Moniliaceae. Para la clasificación del Penicillium es importante destacar que este se origina principalmente de una morfología microscópica, dividiéndose en fialidos que poseen elementos que producen conidias, por elementos que soportan fialidos además de células principales del tallo que son estípites (37). Las especies de Penicillium que causan el deterioro de los alimentos se pueden dividir en tres grandes grupos: aquellos que infectan alimentos frescos, especialmente frutas; los que infectan cereales, principalmente después de la cosecha y durante el secado; y aquellos que probablemente se encuentren en alimentos procesados (37). ll.6.1 Características generales y morfológicas Se caracteriza por la formación de conidióforos simples, largos y erectos, poseen ramificaciones de forma simétrica o asimétrica con forma de pincel. ll.6.2 Penicillium expansum Penicillium expansum es un moho que afecta a diversos alimentos siendo las manzanas las principales afectadas, se lo conoce también como el moho verde o azul debido a la coloración característica que produce sobre los alimentos (8). ll.6.3 Características morfológicas del Penicillium expansum Desde su primera descripción por Link en 1809, los investigadores han estado refinando la identificación de especies del género Penicillium basándose en las 20 características morfológicas, y la ramificación de los conidióforos. Los conidióforos son densos como cepillos con estructuras portadoras de conidios. Los conidióforos son simples o ramificados y están terminados por grupos de fialidas en forma de matraz. Los conidios se producen en cadenas secas desde las puntas de los fialidos, con la espora más joven en la base de la cadena, y casi siempre son verdes. Según el tipo de sistemas portadores de esporas, P. expansum se clasificó como terverticilato, ramas que llevan un segundo orden de ramas, que a su vez tienen un grupo de fialidas (38). ll.6.2.1.1 Características macroscópicas: Las colonias de Penicillium (que no sean Penicillium marneffei) crecen con rapidez, de mucha textura peluda y con filamentos, de lana o algodón. Al principio son blancas luego varían a turquesa, gris verde, gris oliva, amarillento o rosa con el tiempo. La parte posterior de la colonia es pálida o amarillenta (37). ll.6.2.1.2 Características microscópicas: Especies de Penicillium (excepto P. marneffei) presentan conidióforos simples o ramificados, fialidos y conidios. La métula es una rama secundaria formada en el conidióforo. La métula lleva fiálide en forma de botella, tejido fiálide avanzado. El conidióforo es típico (llamado "penicilli" o cepillo). Conidias circular de celda única, observada como cadenas no ramificadas al final de las fiálides (38). ll.6.2.3 Vías de exposición y toxicidad Las especies de Penicillium incluyendo P. expansum son habitantes ubicuos del suelo y generalmente están presentes en la vegetación en descomposición materia en el suelo o suelo del huerto. Aunque el patógeno puede acumularse como esporas en el aire, en la superficie de la fruta durante la temporada de crecimiento, es probable que la mayoría de los propágulos son transportados al suelo y escombros en la fruta. Los contenedores, equipos y esporas se transmiten a las heridas de la fruta a través del manejo del agua. La contaminación también puede ocurrir desde el aire en los cuartos de almacenamiento. Algunos de los factores para una 21 infección exitosa por un patógeno incluyen el tiempo, heridas en la superficie de la fruta y en la susceptibilidad relativa de la fruta (38). ll.6.2.4 Especies de Penicillium que afectan a los alimentos ll.6.3.1 Frutas y verduras frescas: Las especies de Penicillium spp. son los principales hongos que causan el deterioro de los cítricos y las frutas de semilla. Estas especies causan pudriciones visibles en la fruta y son responsables de enormes pérdidas en el mundo. ll.6.3.2 Cereales: Los cereales son un hábitat importante para las especies de Penicillium, particularmente aquellas que pertenecen al subgénero Penicillium. La mayoría de las especies clasificadas en este subgénero son poco frecuentes en suelo o vegetación en descomposición, nichos ecológicos importantes para especies en otros subgéneros. Sin embargo, no existe evidencia real de que las especies de Penicillium invadan plantas de cereales antes de la cosecha, por lo que no se consideran patógenos ni comensales, sino invasores postcosecha (37). ll.6.3.3 Alimentos refrigerados: Muchas especies de Penicillium tienen la capacidad de crecer a bajas temperaturas, incluso por debajo de 0 °C, por lo que son una causa principal del deterioro de los alimentos refrigerados. Algunas especies también tienen la capacidad de crecer bajo tensiones reducidas de oxígeno, y también son la causa principal del deterioro de los productos envasados y refrigerados (37). ll.6.6 Jugos y bebidas pasteurizados: La pasteurización es letal para los conidios de la mayoría de los tipos de hongos, incluyendo Penicillium, Sin embargo, algunas especies de Penicillium, y algunas de otros géneros estrechamente relacionados, producen ascosporas que tienen resistencia al calor. Algunas ascosporas fúngicas pueden seguir siendo viables por tiempos apreciables a 90 °C o más, suficientes para sobrevivir a los procesos de pasteurización (37). 22 CAPÍTULO III MATERIALES Y MÉTODOS lll.1Tipo de investigación El tipo de investigación es de carácter descriptivo, correlacional. lll.2 Diseño de la investigación El diseño de investigación es de tipo no experimental. lll.3 Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos lll.3.1 Materiales para la extracción del aceite esencial de canela ⁻ Matraz de fondo plano de 1 litro. ⁻ Refrigerante. ⁻ Conectores de vidrio. ⁻ Mangueras para entrada y salida de agua. ⁻ Hornilla eléctrica. ⁻ Dos soportes universales. ⁻ 2 Pinzas de acero. ⁻ 2 Nueces de acero. ⁻ Beaker de 1000 ml. ⁻ Mortero y pilón. lll.3.2 Reactivo ⁻ Agua destilada. lll.3.3 Equipos de laboratorio para la actividad antimicrobiana ⁻ Autoclave ⁻ Balanza ⁻ Incubadora de aire ⁻ Agitador vórtex 23 lll.3.4 Material de vidrio ⁻ Tubos de ensayo ⁻ Placas Petri de 10 x100 mm ⁻ Pipetas ⁻ Vasos precipitados ⁻ Frasco de vidrio color ámbar de 30 ml de capacidad. ⁻ Probeta ⁻ Tubos de escala de McFarland. lll.3.5 Medios de cultivo y reactivos ⁻ Agar Sabouraud ⁻ Agar papa dextrosa ⁻ Agar Müller-Hinton ⁻ Caldo Sabouraud dextrosa ⁻ Dimetilsulfóxido (DMSO). ⁻ Alcohol de 70°C lll.3.6 Otros ⁻ Discos de antibióticos en blancos ⁻ Asa de Kholle ⁻ Gradillas ⁻ Espátulas ⁻ Malla de plástico ⁻ Pinzas ⁻ Mascarilla ⁻ Guantes 24 ⁻ Cofia ⁻ Algodón ⁻ Fósforo ⁻ Papel aluminio ⁻ Calculadora ⁻ Marcadores ⁻ Cinta de papel ⁻ Regla lll.4. Muestra lll.4.1 Vegetal La corteza de Cinnamomum zeylanicum se obtuvo del mercado central de Guayaquil, se adquirió 4 kilogramos del material vegetal para la extracción del aceite esencial. La corteza fue analizada verificando que no presente algún tipo de contaminante o residuos no deseados que interfieran con el proceso de extracción. Posteriormente fue almacenada en bolsas de plástico para su traslado y conservación. lll.4.2 Microbiana Las cepas Aspergillus flavus, Penicillium expansum y Candida albicans ATCC 90028 fueron proporcionadas por una institución pública. lll.5 Metodología Experimental lll.5.1 Extracción del aceite esencial La corteza de canela fue triturada a tamaños más pequeños con la ayuda de un mortero para facilitar la extracción. Para la obtención del aceite esencial se empleó el método de extracción por hidrodestilación (39). Debido a la gran cantidad de corteza se realizaron varios ensayos; en los cuales por cada extracción se pesaron 100 gramos de la corteza y se agregaron en un matraz de destilación de fondo plano con capacidad de un litro. Posteriormente se midió 500 mililitros (ml) de agua destilada los cuales fueron transferidos al matraz de 25 destilación. Después se conectó al equipo de hidrodestilación. Luego el matraz fue sometido a calentamiento en una hornilla eléctrica. El refrigerante recibía los vapores de agua condensándolo y dando como resultado 300 ml de una mezcla de agua y aceite. El total de extracciones fueron 40, obteniéndose como producto final de la hidrodestilación una cantidad de 12 litros, los mismos que fueron almacenados y conservados en los recipientes vacíos de agua destilada a una temperatura de 4 a 8 ºC; para la observación de las dos fases entre el agua y el aceite esencial de canela ocasionado por la diferencia de densidades. Empleando una pipeta graduada se separó el aceite esencial y se almaceno en un tubo de vidrio con tapa rosca cerrado herméticamente, además se cubrió con papel aluminio para protegerlo de la luz del medio hasta su utilización. lll.5.2 Rendimiento del aceite esencial de canela Mediante el método de hidrodestilación se consiguió 17 ml de aceite esencial de canela (40 destilaciones usando 4 kilogramos de corteza) obteniendo un rendimiento de % aplicando la siguiente ecuación: (40) %𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = (ml de aceite esencial) 𝑥 100 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 %𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 17 𝑚𝑙 𝑥 100 = 0.42 4000𝑔 %𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 0.42 % Dónde: %Rendimiento: Rendimiento porcentual del aceite esencial de canela obtenido. 100: Factor matemático 26 lll.5.3 Determinación de densidad del aceite esencial de canela Se midió el aceite esencial en una probeta y por diferencia de pesos se obtuvo la densidad mediante la siguiente fórmula (41): 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ( (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 + 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ) − (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒)(𝑔) 𝑔 )= 𝑚𝑙 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ( (66,1 ) − (48,75)𝑔 𝑔 )= 𝑚𝑙 17 𝑚𝑙 𝑔 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ( ) = 1.020 = 1020 𝑚𝑔/𝑚𝑙 𝑚𝑙 lll.5.4 Dilución del aceite esencial A partir del aceite esencial de canela puro (100%) con una densidad de 1,0205 g/ml se diluyó con dimetilsulfóxido obteniendo las concentraciones de 30%, 60% y 90% respectivamente. Al transformarse en unidades de mg/mL se obtuvo los valores que se muestran en la tabla 5. Se transfirió cada concentración en frascos ámbar para protegerlo de la luz hasta el momento de su aplicación. Tabla V Dilución del aceite esencial de canela Volumen Volumen de Volumen Concentración Concentración de aceite Dimetilsulfóxido final % mg/ml 1.5ml 3.5ml 5ml 30 306 3ml 2ml 5ml 60 612 4.5ml 0.5 5ml 90 918 5ml - 5ml 100 1020 esencial Fuente: Autores 27 lll.5.5 Evaluación del efecto antifúngico del aceite esencial de canela Se determinó mediante la técnica de difusión de disco en agar (42), concentración mínima inhibitoria y concentración mínima fungicida (43). lll.5.6 Preparación del inóculo de Aspergillus flavus y Penicillium expansum para la técnica de difusión de disco en agar y concentración mínima inhibitoria (CMI). El inóculo se preparó a partir de un cultivo de 7 días a 35 °C en agar papa dextrosa, esto induce a que los hongos se desarrollen en su totalidad, además de la formación de conidios (42). Se utilizó caldo Sabouraud dextrosa para la suspensión que posteriormente se estandarizó a 0.5 x 108 células/ml según la escala de McFarland para Aspergillus flavus (43) y 1.0 x108 cél/ml para Penicillium expansum (18). Para la concentración mínima inhibitoria se hizo una dilución seriada en caldo Sabouraud dextrosa adicionado con DMSO 2% hasta obtener 0.5 x104 células/ml según la escala de McFarland para Aspergillus flavus (43) y 1.0 x104 cél/ml para Penicillium expansum. lll.5.7 Preparación del inóculo de Candida albicans ATCC 90028 para el control de calidad Se incubó la cepa de Candida albicans ATCC 90028 en agar Sabouraud a 35 °C durante 24 horas. La suspensión se preparó a partir de solución salina al 0.9% Luego se estandarizó a 0.5 x106 cél/ml según la escala de McFarland. Para la CMI se realizó una dilución seriada usando caldo Infusión cerebro corazón hasta obtener 0.5 x103 cél/ml según la escala de McFarland (42). lll.5.8 Preparación del control positivo (Itraconazol) lll.5.8.1 Concentración mínima inhibitoria (CMI): La solución madre se preparó a una concentración cien veces mayor a la que se va a emplear (1600 ug/ml), utilizando como disolvente dimetilsulfóxido. La CMI de itraconazol es de 16 a 0.03 ug/ml (44) por lo que se realizó diluciones seriadas dobles empleando caldo Sabouraud dextrosa. En el control de crecimiento se debe llenar 100 ul de caldo combinado con DMSO 2%. 28 A las soluciones obtenidas se le realizaron una última dilución 1:50 con caldo Sabouraud, obteniendo como resultado la concentración de antifúngico dos veces mayor a la concentración final (32 – 0,0626 μg/ml). El esquema de dilución se muestra en la tabla VI (42): lll.5.8.2 Difusión de disco en agar: Se utilizo como referencia el método empleado para la CMI. A partir una solución madre de 1000 ug/ml, se transfirió 10 microlitros de esta solución que son equivalentes a 10 microgramos de carga del antifúngico en él disco. Tabla VI Diluciones de los antifúngicos insolubles en agua. Concentración Transferir A un tubo con Concentración resultante 1600 µg/ml 0,5 ml 0,5 ml de DMSO 800 µg/ml 1600 µg/ml 0,25 ml 0,75 ml de DMSO 400 µg/ml 1600 µg/ml 0,25 ml 1,75 ml de DMSO 200 µg/ml 200 µg/ml 0,5 ml 0,5 ml de DMSO 100 µg/ml 200 µg/ml 0,25 ml 0,75 ml de DMSO 50 µg/ml 200 µg/ml 0,25 ml 1,75 ml de DMSO 25 µg/ml 25 µg/ml 0,5 ml 0,5 ml de DMSO 12,5 µg/ml 25 µg/ml 0,25 ml 0,75 ml de DMSO 6,25 µg/ml 25 µg/ml 0,25 ml 1,75 ml de DMSO 3,12 µg/ml Fuente: Pemán, Estrella, Rubio (2007) lll.5.9 Método de difusión de disco en agar Se utilizaron discos de antibióticos en blanco a los cuales se le adicionaron 10 y 20 microlitros (ul) de las concentraciones de 30%,60%,90% y 100% del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum), un grupo control positivo con itraconazol y un control negativo con solución salina al 0.9%. Para la inoculación de los hongos se empleó la técnica de siembra por inundación. Luego se colocaron los discos sobre las placas de Müller-Hinton con la ayuda de una pinza estéril presionando suavemente el disco sobre el agar (45). Después las placas se incubaron a 35° C en estufa de aire por 48 horas. La lectura de las placas se realizó a las 48 horas, en la cual se midieron los halos de inhibición de cada concentración y los grupos control mediante una regla milimetrada (46). 29 Los controles y las concentraciones se hicieron por triplicado para evitar errores durante la técnica (45). Para interpretar los resultados se empleó los puntos de corte propuestos en la escala de Duraffourd. Esta escala es utilizada para determinar el efecto inhibitorio in vitro, según el diámetro de inhibición (47). Tabla VII Escala de Duraffourd Nula (-) Diámetro inferior a 8 mm. Sensibilidad límite (sensible +) Diámetro comprendido entre 8 a 14 mm. Medio (muy sensible ++) Diámetro entre 14 y 20 mm. Sumamente sensible (+++) Diámetro superior a 20 mm. Fuente: García, (2015). Para los controles se empleó los puntos de corte clínicos propuestos por Fernández, 2015 y García,2007 en la siguiente tabla: (48). Tabla VIII Puntos de corte clínicos para Aspergillus spp. Antimicótico Diámetro del halo de inhibición (mm) S Itraconazol I ≥ 17 16-14 R ≤ 13 10 ug S: sensible; I: sensibilidad intermedia; R: resistente; mm: milímetros Fuente: Fernández (2015). En la actualidad no se han establecidos puntos de corte para Penicillium expansum por lo que se usó como referencia los establecidos para Aspergillus flavus. Así mismo no se han propuestos puntos para el control de calidad con itraconazol, por lo que se tomó de referencia los diámetros con posaconazol propuestos por el manual del CLSI M44-A para Candida albicans ATCC 90028 (36). 30 Tabla IX Rangos recomendados de diámetro de zona de control de calidad (mm) después de la incubación de 24 horas Antimicótico Carga Candida albicans ATCC 90028 del disco Posaconazol 24 – 31 mm 5 ul Fuente: Pemán, Estrella, Rubio (2007). III.5.10 Concentración mínima inhibitoria (CMI) Se utilizo de igual manera itraconazol con las cepas y el control de calidad (Candida albicans ATCC 90028), para ello se transfirió 100 µl de solución de antifúngico por cada dilución seriada y 100 µl de la suspensión de conidias. En la columna 11 se usó para el control de crecimiento (100 ul de caldo + 100 ul de la suspensión de conidias) y en la columna 12 para control de esterilidad (200 ul de caldo Sabouraud dextrosa). Para el aceite esencial se tomaron 10 ul de cada concentración más 90 µl de la suspensión de conidias obteniendo concentraciones finales de 0,0306, 0.0612, 0.0918, 0.102 mg/ml. La lectura se hace visualmente a las 48 horas de incubación comparando la turbidez y los pocillos del control de crecimiento. Para el control de calidad (Candida albicans ATCC 90028) se leyó a las 24 horas (49). Tabla X Puntos de corte de la CMI para el control de calidad de Candida albicans ATCC 90028 Itraconazol Candida albicans ATCC 90028 Referencia CLSI CMI 48 horas 0.0312 Fuente: Morón (2019). 31 Tabla XI Puntos de corte clínicos de la CMI para Aspergillus flavus CIM (ug/ml) S≤ Aspergillus Itraconazol I 1 R≥ - 4 flavus Fuente: Castro, García, Martín-Mazuelos (2019) (50). Para Penicillium expansum se usaron como referencia los puntos de corte clínicos propuestos por Singh & Khuraijam, 2018 para Penicillium spp. Los puntos de resistencia aún no se han establecido (51). Tabla XII Puntos de corte clínicos de la CMI para Penicillium spp. Droga antifúngica Itraconazol Análisis (ug/ml) Sensible Rango del MIC 0.125 - 0.25 Fuente: Singh, Khuraijam (2018). lll.5.11 Concentración mínima fungicida (CMF) Se tomo 50 ul de los pocillos con aceite esencial de canela en los que hubo inhibición de Aspergillus flavus y Penicillium expansum. Luego se inocularon en placas Petri con agar Sabouraud dextrosa e incubaron durante 11 días a 25 °C (52). Ill.5.12 Análisis estadístico Para el análisis estadístico se emplearon hojas de cálculo en el programa de Microsoft Excel 2016. 32 CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIONES lV.1 Resultados lV.1.1 Efecto antifúngico del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en diferentes concentraciones 30, 60, 90 y 100 % Tabla XIII Diámetro del halo de inhibición en cepa de Aspergillus flavus frente a cuatro concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en un volumen de 10ul. Volumen del aceite (ul) Concentr Concentra ación del ción aceite en del aceite los (%) discos (mg/ml) Repetici ones Diámetro de inhibición (mm) 10 30 3.06 1 40 10 30 3.06 2 50 10 30 3.06 3 45 10 60 6.12 1 55 10 60 6.12 2 53 10 60 6.12 3 60 10 90 9.18 1 53 10 90 9.18 2 60 10 90 9.18 3 59 10 100 10.2 1 55 10 100 10.2 2 57 10 100 10.2 3 62 Promedio (mm) 45 56 57.33 58 Fuente: Autores En la tabla XIII se muestran los promedios de los halos de inhibición (mm) de las tres repeticiones producidas por las diferentes concentraciones del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) mediante el método de difusión del disco en agar (Kirby-Bauer), los resultados mostraron un mayor promedio de halo de inhibición con el volumen de 10 ul a la concentración de 100%. 33 Promedio de halos de inhibición Gráfico 1Comparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepa de Aspergillus flavus a un volumen de 10ul 50 58 57,33 56 60 45 40 30 20 13,33 10 0 0 30% 60% 90% 100% control + cotrol - Concentración del aceite esencial de canela Fuente: Autores La gráfica 1 refleja los promedios de los halos de inhibición de las diferentes concentraciones del aceite esencial de canela frente Aspergillus flavus con un volumen de 10 ul obteniendo como resultado que la concentración de 100% tiene un promedio mayor a comparación con las demás concentraciones con 58mm, seguido de la concentración de 90% con un promedio de 57,33, mientras que las concentraciones de 60% y 30 % cuentan con un promedio de 56 mm y 45 mm respectivamente. Tabla XIV Diámetro del halo de inhibición en cepa de Aspergillus flavus frente a cuatro concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en un volumen de 20ul. Volumen del aceite (ul) 20 Concentr Concentrac ación ión del Repe del aceite en ticio aceite los discos nes (%) (mg/ml 30 6.12 1 Diámetro de inhibició n (mm) 53 20 30 6.12 2 46 20 30 6.12 3 47 34 Promedio (mm) 48.66 20 60 12.24 1 57 20 60 12.24 2 54 20 60 12.24 3 60 20 90 18.36 1 59 20 90 18.36 2 55 20 90 18.36 3 63 20 20 100 100 20.40 20.40 1 2 56 61 20 100 20.40 3 Fuente: Autores 57 59 59.66 62 La tabla XIV indica el promedio de las tres repeticiones de los diámetros de los halos de inhibición producido por las diferentes concentraciones del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) que se realizó mediante el método de difusión del disco (Kirby-Bauer), obteniendo resultados donde se muestra un mayor promedio empleando un volumen de 20 ul a la concentración de 100%. Promedio de halos de inhibición Gráfico 2 Comparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepa de Aspergillus flavus a un volumen de 20ul 60 57 59 59,66 48,66 50 40 30 13,33 20 10 0 0 30% 60% 90% 100% control + cotrol - Concentración del aceite esencial de canela Fuente: Autores La gráfica 2 muestra los promedios de los halos de inhibición de las diferentes concentraciones del aceite esencial de canela frente Aspergillus flavus empleando un volumen de 20 ul obteniendo como resultado que la concentración de 100% tiene un promedio mayor a comparación con las demás 35 concentraciones con 59,66 mm, seguido de la concentración de 90% con un promedio de 59, mientras que las concentraciones de 60% consta con un promedio de 57 mm y la concentración de 30 % tiene un promedio de 48.66. Tabla XV Diámetro del halo de inhibición en cepa de Penicillium expansum frente a cuatro concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en un volumen de 10ul. Volumen del aceite (ul) Concentr ación del aceite (%) Repetici ones Diámetro de inhibición (mm) 30 Concent ración del aceite en los discos (mg/ml) 3.06 10 1 56 10 30 3.06 2 53 10 30 3.06 3 46 10 60 6.12 1 56 10 60 6.12 2 55 10 60 6.12 3 54 10 90 9.18 1 61 10 90 9.18 2 60 10 90 9.18 3 57 10 100 10.2 1 58 10 10 100 100 2 10.2 3 10.2 Fuente: Autores 63 62 Promedi o (mm) 51.66 55 59.33 61 La tabla XV se muestra el promedio de las tres repeticiones de los diámetros de los halos de inhibición producido por las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) que se realizó mediante el método de difusión del disco (Kirby-Bauer), obteniendo resultados donde se indica que el mayor promedio se obtuvo con un volumen de 10ul a la concentración de 100%. 36 Promedio de halos de inhibición Gráfico 3 Comparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepa de Penicillium expansum a un volumen de 10ul 70 59,33 60 51,66 61 55 50 40 30 20 14,33 10 0 0 30% 60% 90% 100% control + cotrol - Concentración del aceite esencial de canela Fuente: Autores La gráfica 3 refleja los promedios de los halos de inhibición de las diferentes concentraciones del aceite esencial de canela frente a cepa de Penicillium expansum con un volumen de 10 ul obteniendo como resultado que la concentración de 100% tiene un promedio de 61mm, seguido de la concentración de 90% con un promedio de 59,33, mientras que las concentraciones de 60% y 30 % cuentan con un promedio de 55 mm y 51.66 mm respectivamente. Tabla XVI Diámetro del halo de inhibición en cepa de Penicillium expansum frente a cuatro concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) en un volumen de 20ul Volumen del aceite (ul) Concentra ción del aceite (%) 20 20 20 20 20 30 30 30 60 60 Concentr Repet ación del icione aceite en s los discos (mg/ml 6.12 1 6.12 2 6.12 3 12.24 1 12.24 2 37 Diámetro de inhibición (mm) 57 58 55 56 60 Promedio (mm) 56.66 58.66 20 20 20 20 20 20 20 60 90 90 90 100 100 100 12.24 3 18.36 1 18.36 2 18.36 3 20.40 1 20.40 2 20.40 3 Fuente: Autores 60 63 55 63 64 61 62 60.33 62.33 La tabla XVI muestra los promedios de las tres repeticiones de los diámetros de los halos de inhibición producido por las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum), obteniendo resultados donde se muestra un mayor promedio con un volumen de 20 ul a la concentración de 100%. Promedio de halos de inhibición Gráfico 4 Comparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepa de Penicillium expansum a un volumen de 20ul 70 60 56,66 58,66 60,33 62,33 50 40 30 14,33 20 10 0 0 30% 60% 90% 100% control + cotrol - Concentración del aceite esencial de canela Fuente: Autores La gráfica 4 muestra los promedios de los halos de inhibición de las diferentes concentraciones del aceite esencial de canela frente a cepa de Penicillium expansum con un volumen de 20 ul obteniendo la concentración de 100% un promedio de 62,33 mm, seguido de la concentración de 90% con un promedio de 60,33, mientras que las concentraciones de 60% consta con un promedio de 58,66 mm y la concentración de 30 % tiene un promedio de 56,66. 38 Tabla XVII Diámetro del halo de inhibición en cepa de Aspergillus flavus y Penicillium expansum frente a un control positivo y negativo Cepa Aspergillus flavus Penicillium expansum Candida albicans ATCC Control Positivo (+) Itraconazol (Solución stock 2000 ug/ml) Negativo () solución salina 0.9% Positivo (+) Itraconazol (Solución stock 2000 ug/ml) Negativo () solución salina 0.9% Positivo (+) Itraconazol (Solución stock 2000 ug/ml) Negativo () solución salina ul Repetici ones Diámetro de inhibición (mm) 5 1 14 5 2 13 5 3 13 10 10 1 2 - 10 3 - 5 5 1 2 14 14 Promedio (mm) 13.33 - 14.33 5 3 15 10 10 10 1 2 3 - 5 1 24 5 2 25 5 3 27 10 1 10 2 10 3 Fuente: Autores - - 25.33 - La tabla XVII indica los diámetros de los halos de inhibición de las cepas Aspergillus flavus y Penicillium expansum en una solución stock de itraconazol utilizada como control positivo y solución salina 0.9% como control negativo. 39 Tabla XVIII Determinación del grado de sensibilidad del Aspergillus flavus a distintas concentraciones de aceite esencial de canela Volum Concentr en del ación del aceite aceite ul % Grado de sensibilidad Concentraci ón del aceite Sumame Muy Sensibi nte sensib lidad Nula sensible le 14- limite 8- ≤8 >20 mm 20 mm 14 mm de canela en los discos (mg/ml) 30 10 0.612 45 - - - 60 10 1.224 56 - - - 90 10 1.836 57.33 - - - 100 10 2.04 58 - - - 30 20 1.224 48.66 - - - 60 20 2.248 57 - - - 90 20 3.672 59 - - - 100 20 4.08 59.66 - - - Fuente: Autores Tabla XIX Determinación del grado de sensibilidad del Penicillium expansum a distintas concentraciones de aceite esencial de canela Grado de Concentr Volum Concentraci sensibilidad ación del en del ón del aceite Sumame Muy Sensibi aceite aceite de canela en nte sensib lidad Nula % ul los discos sensible le 14- limite 8- ≤8 (mg/ml) >20 mm 20 mm 14 mm 30 10 0.612 51.66 - - - 60 10 1.224 55 - - - 90 10 1.836 59.33 - - - 100 10 2.04 61 - - - 30 20 1.224 48.66 - - - 60 20 2.248 57 - - - 40 90 20 3.672 59 - 100 20 4.08 59.66 - - - - Fuente: Autores Tabla XX Determinación del grado de sensibilidad de Candida albicans ATCC 90028 Carga del Control Grado de sensibilidad disco ul 24-31 5 25.33 Itraconazol (Solución stock 2000 ug/ml) Fuente: Autores La tabla XVIII, XIX y XX determinan el grado de sensibilidad de acuerdo a los promedios de halo de inhibición según la guía práctica de identificación y diagnóstico en micología clínica, indicando que todas la concentraciones de aceite esencial de canela dan halos mayor a 17 mm lo cual el Aspergillus flavus y Penicillium expansum son sensibles a todas las diferentes concentraciones del aceite esencial de canela, mientras el control de calidad con Candida albicans está dentro de los rangos recomendados de sensibilidad. lV.1.2 Concentración mínima inhibitoria (CMI) La lectura se realizó a las 48 horas después de la incubación. Con excepción de Candida albicans ATCC 90028 que fue a las 24 horas. Tabla XXI Determinación de la concentración mínima inhibitoria del control positivo (itraconazol) y cepas fúngicas Cepas Repeticio Diluciones de itraconazol + caldo nes Sabouraud (ug/ml) 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 CC CE 0,06 0,03 Candida 1 - - - - - - - - - - + - albicans 2 - - - - - - - - - - + - ATCC 3 - - - - - - - - - - + - 1 + + + + + + + + + + + - 90028 41 Penicillium 2 + + + + + + + + + + + - expansum 3 + + + + + + + + + + + - Aspergillus 1 + + + + + + + + + + + - flavus 2 + + + + + + + + + + + - 3 + + + + + + + + + + + - Turbidez (+), no turbidez (-), CC control de crecimiento, CE control de esterilidad Fuente: Autores El control de calidad presento CMI en 0.03 ug/ml. Demostrándose que se trabajó en condiciones óptimas y asegurando la calidad de los resultados. Tabla XXII Determinación de la concentración mínima inhibitoria de distintas concentraciones de aceite esencial de canela frente a cepas de Aspergillus flavus, Penicillium expansum Cepas Repeti Concentración del aceite ciones esencial de canela 0.030 0.0612 0.0918 0.102 CC CE 6 Aspergillus 1 + + - - + - flavus 2 + + - - + - 3 + + - - + - Penicillium 1 + + - - + - expansum 2 + + - - + - 3 + + - - + - Turbidez (+), no turbidez (-), CC control de crecimiento, CE control de esterilidad Fuente: Autores lV.1.3 Concentración mínima fungicida (CMF) La lectura de las placas Petri con agar papa dextrosa después de los 11 días no presentó crecimiento de los hongos. 42 IV.2 Discusión El presente estudio se evaluó el efecto antifúngico del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) sobre cepas de Aspergillus flavus y Penicillium expansum mediante la técnica de difusión de disco en agar (KirbyBauer), mostrando sensibilidad en todas las concentraciones del aceite (30, 60, 90 100%) después de las 48 horas de incubación. Los halos de inhibición se compararon según la escala de Duraffourd siendo la concentración del 100% la que obtuvo mayor promedio en los halos de inhibición empleado un volumen de 20 ul. Resultados similares se mostraron en el estudio de Caballero, Villacorta, & Vásquez, 2011 en el cual usaron concentraciones distintas de aceite esencial sobre Aspergillus flavus inhibiendo el crecimiento significativamente del hongo en agar chicha de maíz. En otro estudio realizado por Landero, et al., 2016 usaron aceite de canela a una concentración de 300 ul/L observándose inhibición del crecimiento micelial del Penicillium expansum. En la concentración mínima inhibitoria ambos hongos presentaron resistencia con el antimicótico control (itraconazol), en cambio con el aceite esencial de canela mostró inhibición solo para Penicillium expansum en concentraciones de 0.0918 (AEC 90%) y 0.102 mg/ml (AEC 100%) respectivamente, esto es debido al que el aceite esencial de canela contiene concentraciones altas de aldehído cinámico. El aldehído cinámico o cinamaldehído es el principal componente antimicrobiano en la canela, no solo exhibe actividad antibacterial, sino que también inhibe el crecimiento de mohos (14). En la concentración mínima fungicida no se presentó crecimiento de Penicillium expansum después de los 11 días de incubación en agar papa dextrosa. Demostrando que el aceite ejerce actividad fungicida. Así también el estudio de Ramírez, López, Espinosa, & Wong, 2016 con respecto a los aceites el de canela, inhibió totalmente el crecimiento y formación de conidias a concentración de 0.05% mostrando ser poseer efecto fungicida (53). 43 CONCLUSIONES El aceite esencial de canela posee efecto antifúngico in vitro sobre cepas de Aspergillus flavus y Penicillium expansum. Se logró obtener el aceite esencial de canela a partir de la corteza de (Cinnamomum zeylanicum) mediante el método de extracción de hidrodestilación. Ambos hongos presentaron sensibilidad frente a las concentraciones del aceite esencial de canela (30, 60, 90, 100%), siendo el 100% la que mostró mayor promedio en los halos de inhibición. Determinándose así la actividad fungistática del aceite de canela. La concentración mínima inhibitoria en donde no existió crecimiento solo fue para Penicillium expansum con la concentración del aceite al 90 y 100%. El aceite de canela posee actividad fungicida al inhibir el hongo Penicillium expansum por completo después de varios días de incubación. RECOMENDACIONES Se recomienda seguir el esquema de diluciones propuesto por el CLSI para la microdilución en caldo. Continuar con la investigación, comparando el efecto del hidrodestilado que se obtuvo después de la extracción frente al aceite esencial obtenido. Realizar estudios in vivo en biomodelos induciendo una dermatosis por Aspergillus flavus y Penicillium expansum utilizando aceite esencial de canela como posible tratamiento. Realizar más estudios in vitro del aceite esencial de canela frente a otros hongos que ocasionen el deterioro en alimentos. 44 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 Amezqueta D. Evaluación del potencial antifúngico de los aceites esenciales . comerciales de Canela (Cinnamomum verum J. Presl) y Laurel (Laurus nobilis L.) 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Son esporas producto de la reproducción sexual, cariogamia y división meiótica en las ascas de los hongos de la clase de los Ascomycota. ⁻ Basidiosporos. Espora reproductiva producida por los hongos de la división de los basidiomicetes. Las basidiosporas contienen típicamente un núcleo haploide que nace de la meiosis, producida por un tipo especializado de células de los hongos llamadas basidios. ⁻ Biseriadas. Dispuesto en dos series o filas. ⁻ Cenocitico. No tabicado. Micelio en el cual los núcleos incluidos en un citoplasma común no están separados por tabiques que delimiten células. ⁻ Conidia. Esporas asexuales no móviles, que se forman (exógenamente) en el ápice o en el lado de una célula esporógena. ⁻ Dermatifitos. Hongos hialinos que parasitan el tejido queratinizado. ⁻ Esclerocio. Masa compacta de micelio endurecido que contiene reservas alimenticias. ⁻ Esporangios. Órgano de las plantas que produce y contiene las esporas; puede ser unicelular o pluricelular. ⁻ Esporangiosporas. Esporas asexuales típicas de los hongos inferiores. Las esporangiosporas se forman en el interior de una célula modificada llamada esporangio, del cual son liberadas tras su maduración a través de un poro. ⁻ Estipes. Estructura de soporte que puede comportarse como un tallo ⁻ Fiálide. Estructura con forma de botella, ubicada en el extremo de un conidióforo, sobre la cual se producen esporas. ⁻ Flocosa. Capa de pelos cortos, suaves y entrelazados que cubre la superficie. ⁻ Heterotrófos. Hongos que no tienen clorofila por lo que no pueden desarrollar su propio alimento a partir de la energía de la luz y las sustancias del suelo (fotosíntesis). ⁻ Hialinos. Hongo de tipo de textura, delgado y casi transparente. 52 ⁻ Hifa. Son una red de filamentos cilíndricos que conforman la estructura del cuerpo de los hongos pluricelulares. ⁻ Métulas. Célula de un conidióforo que lleva las fiálides. ⁻ Micelio. Conjunto de hifas que forman la parte vegetativa de un hongo. ⁻ Pitt. Método de Pitt para identificación de Penicillium, Aspergillus y otros hongos. ⁻ Proantocianidinas. Son una clase de polifenoles que se encuentran en una variedad de plantas. ⁻ Saprofito. Hongo que se alimenta de materia orgánica muerta o en descomposición. ⁻ Seudohifas. Tienen un gran parecido con las verdaderas hifas, pero difieren de ellas en que no presentan regularidad en la abertura de los ángulos. ⁻ Uniseriadas. Dispuesto en una sola serie o fila. 53 ANEXOS Anexo A Preparación del aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) Fotografía 1 Triturado y pesado de la canela. Fotografía 2 Preparación del equipo de hidrodestilación. Fotografía 4 Separación del aceite esencial de canela del hidrolato. Fotografía 1 Obtención de hidrolato + aceite esencial de canela. Fotografía 5 Aceite esencial de canela. 54 Anexo B Cepas de estudio Fotografía 7 Cepa de Aspergillus flavus. Fotografía 6 Cepa de Penicillium expansum. Fotografía 8 Cepa de Candida albicans ATCC 90028. Anexo C Preparación de agar para análisis microbiológico Fotografía 9 Preparación de cajas Petri con agar Müller Hilton. 55 Anexo D Efecto antifúngico con diferentes concentraciones de aceite esencial de canela, método de difusión de discos Fotografía 10 Concentraciones del aceite esencial de canela. Fotografía 11 Solución stock de itraconazol. Fotografía 12 Preparación de cajas para colocación de discos con diferentes concentraciones. Fotografía 13 Colocación de las diferentes concentraciones en los discos. Fotografía 14 Diluciones de cepas a concentraciones especificas en McFarland. Fotografía 15 Inundación de la suspensión en agar. 56 Fotografía 16 Incubación de las cajas Petri a 35°C. Anexo E Resultados de experimentación Fotografía 17 Halos de inhibición del Aspergillus flavus en diferentes concentraciones de aceite esencial de canela. Fotografía 18 Halos de inhibición del Penicillium expansum en diferentes concentraciones de aceite esencial de canela. 57 Anexo F Discos control Fotografía 20 Halo de inhibición en control positivo y negativo en cepa de Penicillium expansum. Fotografía 19 Halo de inhibición en control positivo y negativo en cepa de Aspergillus flavus. Fotografía 21 Control de esterilidad. Fotografía 22 Halos de inhibición de Candida albicans ATCC 90028 frente a itraconazol. 58 Anexo G Concentración mínima inhibitoria (MIC) Fotografía 24 Diluciones seriadas del control positivo. Fotografía 23 Preparación de diluciones del control positivo. Fotografía 25 Sensibilización e inoculación en placa. 59 0 Fotografía 26 Resultado de la CMI de Candida albicans, Aspergillus flavus y Penicillium expansum frente a itraconazol. Fotografía 27 Resultado de la CMI de Aspergillus flavus y Penicillium expansum frente a las concentraciones de aceite esencial de canela (30,60,90,100%). 60 Anexo H Concentración mínima fúngica Fotografía 28 Colocación de concentraciones en agar Sabouraud Fotografía 29 Resultado CMF después de 11 días de incubación para Penicillium expansum 61
