2. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCION Y VITRIFICACION DE EMBRIONES BOVINOS

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
PARA LA PRODUCCION Y VITRIFICACION
DE EMBRIONES
BOVINOS
EN LABORATORIOS DE REPRODUCCION ANIMAL
AUTORES:
Jorge Leonardo García Arévalo
Silvia Juliana Restrepo González
Nelson Gómez Sánchez
Edgar Ricardo Moreno Jerez
Diego Fernando Dubeibe Marín
Edgar Mauricio Mogollón Waltero
Bucaramanga 2017
Servicio Nacional de Aprendizaje – SENA
Regional Santander
Centro Agroturistico
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
PARA LA PRODUCCION Y VITRIFICACION
DE EMBRIONES
BOVINOS
EN LABORATORIOS DE REPRODUCCION ANIMAL
AUTORES:
Jorge Leonardo García Arévalo
Silvia Juliana Restrepo González
Nelson Gómez Sánchez
Edgar Ricardo Moreno Jerez
Diego Fernando Dubeibe Marín
Edgar Mauricio Mogollón Waltero
Bucaramanga 2017
Servicio Nacional de Aprendizaje – SENA
Regional Santander
Centro Agroturistico
Jose Antonio Lizarazo Sarmiento
Director General
Claudia Johanna Gomez Perez
Subdirector Centro agroturistico
Emilio Eliecer Navia Zuñiga
Coordinador SENNOVA
Sergio Iván Vargas Tangua
Líder SENNOVA
Albert Ferney Giraldo Varon
Director Regional Santander
Grupo de investigación GITIP-MB
Centro Agroturistico
Regional Santander
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCIÓN Y VITRIFICACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS
EN LABORATORIOS DE REPRODUCCIÓN ANIMAL
Autores:
Editor:
Nelson Gómez Sánchez
Jorge Leonardo García Arévalo
Médico veterinario Zootecnista, MSc. Salud y
Producción Animal UCC (C)
Silvia Juliana Restrepo González
Médica Veterinaria Zootecnista UCC Bucaramanga
Nelson Gómez Sánchez
Médico Veterinario, MSc. Gestor línea biotecnología
TECNOPARQUE. SENA
Edgar Ricardo Moreno Jerez
Médico Veterinario, MSc (C), Docente Biotecnología
de la reproducción animal MVZ-UCC
Diego Fernando Dubeibe Marín
Médico Veterinario Zootecnista, MSc, PhD (C).
Investigador Corpoica Tibaitata
Edgar Mauricio Mogollón Waltero
Médico Veterinario, Esp., MSc, PhD. Docente
Investigador MVZ-UCC
Asesor editorial:
Clara Ines de la Roche
Corrección de texto:
Antonio Gómez Sánchez
Ilustración:
Silvia Juliana Restrepo Gonzalez
Diseño y diagramación:
Leidy Juliana Martinez Moreno
Servicio Nacional de Aprendizaje SENA
Universidad Cooperativa de Colombia UCC
Para citar este manual:
Garcia, J., Restrepo, S., Gòmez, N.,Moreno, E., Dubeibe, D., Mogollon, E,. (2017), Manual de procedimientos para
, San Gil,
Bucaramanga, Colombia. Servicio Nacional de Aprendizaje, Universidad Cooperativa de Colombia.
Hecho el depósito que exige la ley.
El manual es el resultado del trabajo llevado a cabo en docencia y formación por parte de los grupos GRICA – UCC,
GITIP – SENA en el marco del convenio 065 entre las dos entidades. Es un producto de distribución gratuita, por
tanto esta prohibida su venta y comercialización. No se permite la reproducción total o parcial de esta obra ni su
incorporación a un sistema informatico, ni su transmisión en cualquier forma o por cualquier medio (electrónico, mecanico, fotocopia, grabación u otros) sin citar la fuente. La infracción de dichos derechos puede constituir un delito
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Sede Bucaramanga
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Subdirectora Académica
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Jefe regional de investigaciones
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Decana Nacional MVZ-UCC
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCIÓN Y VITRIFICACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS
EN LABORATORIOS DE REPRODUCCIÓN ANIMAL
Autores:
Jorge Leonardo García Arévalo
Médico veterinario Zootecnista, MSc. Salud y Producción Animal UCC (C)
Silvia Juliana Restrepo González
Médica Veterinaria Zootecnista UCC Bucaramanga
Nelson Gómez Sánchez
Médico Veterinario, MSc. Gestor línea biotecnología TECNOPARQUE. SENA
Edgar Ricardo Moreno Jerez
Médico Veterinario, MSc (C), Docente Biotecnología de la reproducción animal MVZ-UCC
Diego Fernando Dubeibe Marín
Médico Veterinario Zootecnista, MSc, PhD (C). Investigador Corpoica Tibaitata
Edgar Mauricio Mogollón Waltero
Médico Veterinario, Esp., MSc, PhD. Docente Investigador MVZ-UCC
CONTENIDO
Introducción
13
Glosario
15
1. Objetivo
17
1.1. Objetivo general
1.2. Objetivo específico
17
17
2.Generalidades
17
2.1 Producción In Vitro de Embriones Bovinos
2.1.1 Obtención de los Complejos Cúmulos Ovocitos (CCOs)
2.1.2 Criterios para la selección de los ovocitos
2.1.3 Maduración del ovocito
2.1.4 Fertilización In Vitro
2.1.5 Fecundación
2.1.6 Desarrollo Embrionario
2.1.7 Co-cultivo con células del cúmulus
2.1.8 Cultivo In Vitro (CIV)
2.2 Evaluación de embriones
2.2.1 Estado de desarrollo embrionario
2.2.2 Calidad embrionaria
2.3 Criopreservación de embriones
2.3.1 Vitrificación
2.3.2 OPS (Open pulled Straw- Pajilla abierta y estirada)
2.3.3 Desvitrificación
17
17
18
19
20
21
21
21
21
23
23
24
25
25
25
26
3.Procedimientos
27
3.1 Maduración In vitro (MIV)
3.1.1 Montaje de las microgotas
3.1.2 Transporte de ovarios de vacas faenadas
3.1.3 Obtención del Complejo Cúmulus Ovocitos (CCOs)
3.1.4 Recuperación y selección de ovocitos
3.2 Fertilización In vitro (FIV)
3.2.1 Montaje de las microgotas
3.2.2 Gradientes de Percoll
3.2.3 Manejo y preparación del semen
27
27
27
28
29
30
30
30
30
3.3 Cultivo In Vitro (CIV)
3.3.1 Montaje de las microgotas
3.3.2 Estado de desarrollo según la IETS (International Embryo Transfer
Society)
3.3.3 Grados de calidad según la IETS (International Embryo Transfer Society)
3.4 Co-cultivo con células del cúmulus.
33
33
34
4. Protocolo de Vitrificación por método OPS
4.1 Preparación del sistema OPS
4.2 Preparación de las soluciones
4.2.1 Preparación del medio de mantenimiento o medio holding
4.2.2 Preparación de la solución de vitrificación 1
4.2.3 Preparación de la solución de vitrificación 2
4.3 Procedimiento de vitrificación
37
37
37
38
38
38
38
5. Desvitrificación o calentamiento de los embriones vitrificados
40
5.1 Preparación de solución de Sucrosa
5.1.1 Procedimiento
40
40
6. ANEXO
41
Maduración In vitro de ovocitos
Medio de lavado de ovocitos
Medio de maduración de ovocitos
Fertilización In vitro de ovocitos
Medio de fertilización TALP-FEC ESTOQUE
Medio de fertilización Final
Cultivo In vitro
46
46
47
48
48
49
52
7. Bibliografía
53
34
36
LISTA DE
FIGURAS
Ilustración 1. Montaje de microgotas de medio de maduración, gasificación en incubadora ............27
Ilustración 2. Termo contenedor de ovarios-Debridación de tejidos adjuntos del ovario con
ayuda de tijeras- lavado de los ovarios en recipiente con NaCl. .............................................................................................28
Ilustración 3. Penetración de la aguja en el folículo- aspiración del folículo- retirada de la
aguja acoplada a la jeringa- liquido folicular depositado en tubo de centrifuga. ................................................28
Ilustración 4. Depósito de líquido folicular en placa Petri con ayuda de pipeta
Pasteur-búsqueda y recuperación de ovocitos-lavado de ovocitos en medio de
lavado y de maduración-ovocitos seleccionados ...................................................................................................................................29
Ilustración 5. Ovocitos seleccionados sumergidos en gotas de medio de
maduración - ovocitos colocados dentro de incubadora-Pasadas 20-22 horas
visualizamos ovocitos madurados. .........................................................................................................................................................................29
Ilustración 6. Montaje de microgotas con medio de fertilización. ......................................................................................30
Ilustración 7. Columnas de gradientes de Percoll en tubos de microcentrifuga puestos dentro
de la incubadora para darles temperatura. ....................................................................................................................................................31
Ilustración 8. Una vez terminada la 1 centrifugación del lavado del semen en las columnas de
Percoll, se observa- En el fondo del tubo se observa el pellet (espermatozoides vivos), en la
parte intermedia espermatozoides muertos y en la parte superior plasma seminal
y crioprotector. .............................................................................................................................................................................................................................31
Ilustración 9. Cámara de neubauer en la cual se señalan los 5 cuadros a tomar para el
conteo espermático................................................................................................................................................................................................................31
Ilustración 10. Ovocitos madurados lavados en gotas de medio de lavado y de fertilizaciónimagen de micromanipulador donde se observa un ovocito con espermatozoides pegados
en la zona pelúcida..................................................................................................................................................................................................................33
Ilustración 11. Montaje de microgotas con medio de cultivo ..................................................................................................33
Ilustración 12. A: Ovocito no fecundado. B: Ovocito con división 2 células. C: Mórula
temprana. D: Mórula compacta. E: Blastocisto temprano. F: Blastocisto. G: Blastocisto
expandido 8 días. H: Blastocisto expandido eclosionando 8-9 días. I: Blastocisto
eclosionado y zona pelúcida 8-9 días. ................................................................................................................................................................35
Ilustración 13. Soluciones de vitrificación sobre plancha térmica. .....................................................................................38
Ilustración 14. OPS dentro de pajilla de 0.5, sumergida en nitrógeno liquido-termo de
nitrógeno donde se guardan los embriones vitrificados. ................................................................................................................39
LISTA DE
TABLAS
Tabla 1. Clasificación de los grados de calidad ovocitaria ..........................................................................................18
Tabla 2. Desarrollo y Clasificación embrionaria.....................................................................................................................23
Tabla 3. Clasificación y Grados de calidad embrionaria................................................................................................23
Tabla 4. Calidad Embrionaria ....................................................................................................................................................................24
Tabla 5. Estado de desarrollo y clasificación embrionaria .........................................................................................34
Tabla 6. Grados de Calidad y clasificación embrionaria. ..............................................................................................34
LISTA DE
ECUACIONES
Ecuación 1. *n= promedio del conteo de la cámara
superior e inferior de la cámara de Neubauer. .......................................................................................................... 32
Ecuación 2. Cálculo del volumen de semen para
cada gota de fertilización................................................................................................................................................................. 32
Ecuación 3. Cantidad de espermatozoides para
cada gota de FIV ....................................................................................................................................................................................... 32
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
INTRODUCCIÓN
Latinoamérica está entrando a grandes pasos en la utilización de biotecnologías reproductivas, destacándose entre ellas las
que involucran la producción de embriones liderada por países como Brasil que, en la actualid ad, es considerado el principal
productor de embriones de FIV Fertilización in Vitro en el mundo. El interés por las biotecnologías reproductivas en esta
parte del mundo está cimentado en la ventaja de que nuestra producción ganadera será alimentada casi con exclusividad
basada en gramíneas sin los riesgos inherentes al uso de materias primas que puedan trasmitir enfermedades como la
encefalitis espongiforme bovina. En Colombia la producción de embriones aún es incipiente y se realiza principalmente
en grandes ganaderías, pero cada vez más las instituciones educativas y gubernamentales están intentando democratizar
dichas tecnologías para ponerlas al servicio de medianos y pequeños productores. Se pretende con este manual establecer los procedimientos de la producción in vitro de embriones bovinos para su uso en laboratorios de biotecnología de la
reproducción animal, de manera que pueda convertirse en un documento apropiado para la realización de procedimientos
técnicos acordes con la normatividad vigente. A continuación se mencionan algunos de los temas que trataremos al interior
del presente libro. La producción in vitro de embriones (PIVE) es una herramienta biotecnológica asequible y aplicable a las
especies domésticas de interés económico, siendo una alternativa para el mejoramiento genético de animales y aceleración
de los procesos reproductivos de animales sobresalientes. A pesar del gran desarrollo que ha sufrido la PIVE, su eficiencia
todavía sigue siendo baja con una media de producción de embriones en torno al 35%, (Gottardi & Mingoti, 2009), llegando
sólo el 30% de las preñeces a término post-transferencia de los embriones a las receptoras (Park, Kim, Kim, Park, & Byun,
2005).
Gracias a esta técnica es posible obtener diversas ventajas productivas, como por ejemplo: determinación y control del sexo
de los productos, aumento de la eficiencia de los programas de producción, mayores posibilidades para ejecutar programas
de cruzamientos, adecuada estimación del efecto materno sobre la descendencia, rápida multiplicación de las razas, facilidad
de la importación y exportación del material genético o el estudio y desarrollo de otras biotécnicas reproductivas a partir de
la manipulación de gametos y embriones (Cromcomo, Wolf, Fernanda, & DB, 2012).
La PIVE comprende diferentes procesos: la maduración ovocitaria, la capacitación espermática, la fecundación y el cultivo
embrionario, ocurriendo diferentes modificaciones bioquímicas y estructurales en los gametos y los embriones a lo largo de
cada una de estas etapas (Garcia Diaz, Romero Aguirregomezcorta, Astiz blanco, & Ruiz Lopez, 2013).
Se ha demostrado que uno de los principales factores que actúa de manera negativa en el desarrollo inicial de los embriones
13
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
producidos en condiciones in vitro, es el estrés oxidativo debido a la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno
(ROS, por su sigla en inglés).
Las ROS pueden causar pobre desarrollo embrionario y, en consecuencia, una baja eficiencia en la PIVE (Garcia Diaz, Romero
Aguirregomezcorta, Astiz blanco, & Ruiz Lopez, 2013). La búsqueda de alternativas para contrarrestar el estrés oxidativo ha
venido tomando gran relevancia con el propósito de aumentar el rendimiento de la técnica. La suplementación de los medios
de cultivo con cisteamina ha mostrado efectos benéficos, una vez que participa en la síntesis de glutationa (GSH), siendo este
el principal antioxidante natural, de esta manera su uso garantiza las condiciones micro ambientales adecuadas con bajo
estrés oxidativo, viéndose reflejado en el mejoramiento de la calidad y tasa de producción de embriones en el laboratorio
(Guérin P, 2001).
La implementación de sistemas de co-cultivo, hace referencia a una clase de alternativa metodológica, mediante la cual se
colocan diferentes tipos de células (oviductuales, Vero, granulosa, cúmulus, etc.) en cultivo con los presuntos embriones una
vez que ha sido demostrado que esta interacción celular tiene factores que presentan un efecto embríotrófico y una disminución importante en la producción de ROS (Lopez A, 2007).
La criopreservación de embriones bovinos producidos in vitro, simplifica el uso de programas de transferencia de embriones,
la instauración de bancos de material genético de un determinado individuo o raza, asimismo favorece las biotecnologías
asociadas como clonación y transgénesis (Albarracín, 2005).
La importancia de la criopreservación en la reproducción asistida en bovinos es manifiestamente ilustrada por el gran número de embriones congelados y transferidos cada año (Thibier M, 2007). Sin embargo, la criopreservación de esta clase de
embriones por medio de métodos convencionales de congelamiento no ha alcanzado tasas de sobrevivencia satisfactorias
(Vajta G, 2000), lo que ha llevado a la utilización de otros métodos como la vitrificación.
Este método, con curvas de enfriamiento superiores a las de congelación lenta, permite la reducción del tiempo de exposición del embrión en los puntos críticos de temperatura, disminuyendo así los daños térmicos y mecánicos causados durante la formación de cristales de hielo y aumentando la viabilidad de los embriones posterior a su desvitrificación (Cuello et al,
2007 y Guerra et al, 2011).
14
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
GLOSARIO
ANAFASE:
Tercera fase de la mitosis (división celular), en la cual los cromosomas se separan formando dos grupos o estrellas, uno en cada
polo de la célula.
ATRESIA FOLICULAR:
Es un proceso de degeneración y reabsorción de folículos ováricos que
ocurre de manera normal en los ovarios de todos los vertebrados, incluidos los peces.
BIOTECNOLOGIA:
Rama de la tecnología que se ocupa de la aplicación de la biología
y la ingeniería para el estudio de animales.
BLASTOCELE:
Cavidad de la blástula rellena de líquido que se forma con la separación de los blastómeros.
CAPACITACIÓN
ESPERMÁTICA:
Cambios bioquímicos y estructurales que permiten al espermatozoide adquirir la capacidad de unirse a la zona pelúcida del ovocito y de llevar a cabo la reacción acrosómica.
CENTRÓMERO:
es la zona más angosta de los cromosomas, cuya posición resulta
característica en cada uno de los pares.
CIGOTO:
Se denomina cigoto a la célula que resulta de la fusión del gameto
femenino con el gameto masculino en el proceso de reproducción sexual Adicionalmente puede afirmarse que es un embrión
unicelular.
CINETOCORO:
Es una estructura proteica que permite a los cromosomas anclarse a los microtúbulos del huso mitótico.
BLASTOCISTO:
Fase del desarrollo del embrión de los mamíferos, equivalente a
la blástula, que constituye una estructura celular compleja derivada de la mórula; está formada por una masa celular interna de la
que se origina el embrión y de una capa periférica de células que
formará la placenta.
BLASTÓMERO:
Cada una de las células que se originan de las divisiones de un
óvulo fecundado.
CITOPLASMA:
Parte de la célula que rodea el núcleo y que contiene a las demás
organelas. Está limitada por la membrana celular.
CLIVAJE:
Se define como la serie de divisiones celulares mitóticas que experimenta el cigoto.
COMPLEJO CUMULUS:
Conjunto de células que rodean al ovocito.
CORPÚSCULO POLAR:
Célula haploide no funcional, producto de las divisiones meióticas
que llevan a la formación del óvulo; tiene un núcleo pero poco
citoplasma.
15
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
CRIOPRESERVACIÓN:
es el proceso en el cual las células son congeladas a bajas temperaturas para disminuir las funciones vitales de una célula o un
organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo.
DIPLOTENO:
Cuarto estadio de la profase de la primera división meiótica.
EMBRIÓN:
El embrión es la etapa inicial del desarrollo de un ser vivo mientras
se encuentra en el huevo o en el útero de la madre
ESPACIO PERIVITELINO:
Espacio que queda entre la zona pelúcida y el ovocito o las células
que constituyen un embrión (blastómeros).
FECUNDACIÓN:
La fecundación o singamia, consiste en el proceso de unión de
dos gametos (masculino y femenino) en la ampolla de las trompas
uterinas durante la reproducción sexual para crear un nuevo individuo con un genoma derivado de ambos progenitores
FOLÍCULO:
Es un pequeño elemento en forma de bolsa en la cual el ovocito
es almacenado hasta su maduración y liberación. El folículo está
conformado por el ovocito, las células de la granulosa y las tecas.
HORMONAS
GONADOTRÓFICAS:
METAFASE:
La metafase es la fase de la mitosis y meiosis que sucede después
de la profase (meta = más allá), en ella los cromosomas muestran
el máximo acortamiento y condensación, y son desplazados sobre
los microtúbulos hasta que los centrómeros quedan en el plano
ecuatorial formando la denominada placa metafásica.
OVARIO:
Es la gónada u órgano reproductor femenino productor y secretor
de hormonas sexuales y óvulos.
OVOCITO:
Los ovocitos son células germinales femeninas que se generan en
los ovarios. Se trata de una fase del desarrollo del óvulo, cuando
aún no ha madurado.
POLIESPERMIA:
Es la penetración de más de un espermatozoide dentro del óvulo
en un evento de fertilización
PROFASE:
Primera fase de la mitosis (división celular), en la cual se vuelven
distinguibles los cromosomas.
TELOFASE:
Cuarta y última fase de la mitosis (división celular), en la cual se
forman los dos nuevos núcleos y el citoplasma se divide en dos.
ZONA PELÚCIDA:
se denomina a la capa externa que rodea el ovocito de los mamíferos, separándole del espacio perivitelino.
Las gonadotropinas o gonadotrofinas son hormonas secretadas
por la glándula hipófisis o pituitaria, que regulan el ciclo estral en
los mamíferos vertebrados. Existen tres gonadotropinas: la hormona luteinizante (abreviada HL o LH), la hormona estimulante
del folículo (abreviada HFE o FSH) y la gonadotropina coriónica
humana (abreviada GCH o HCG).
16
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
1. OBJETIVO
1.1. Objetivo general
Establecer los procedimientos de la producción in vitro de embriones bovinos para su uso en laboratorios de biotecnología
de la reproducción animal, de manera que pueda convertirse en un documento apropiado para la realización de procedimientos técnicos acordes con la normatividad vigente.
1.2. Objetivo específico
Reconocer los procedimientos para incrementar rápidamente la ganancia genética realizando una mayor selección de las
hembras bovinas
Conocer las diferentes técnicas que se utilizan en la producción y vitrificación de embriones bovinos
Identificar las diferentes preparaciones para la producción y vitrificación de embriones
2. G E N E R A L I D A D E S
2.1 Producción In Vitro de Embriones Bovinos
La Producción in vitro de Embriones (PIVE), también conocida como fertilización in vitro (FIV), es una técnica para la multiplicación de material genético de forma más rápida, abarcando una combinación de los procesos de maduración de los
ovocitos, capacitación espermática, fertilización y cultivo in vitro.
La PIVE contribuye de una manera decisiva a una mayor eficiencia reproductiva como herramienta para la multiplicación
rápida del material genético de interés económico, acortando el intervalo de generaciones e intensificando la selección.
Además de su interés comercial, brinda una característica importante que es la producción a escala de ovocitos madurados
y fecundados y se constituye como una herramienta indispensable para otras biotecnologías como la clonación, la transgénesis, la preservación de ovocitos, entre otras. La FIV permite un mayor aprovechamiento de células primordiales presentes
en los ovarios.
La PIVE es una tecnología que en su mayor parte se ejecuta en el laboratorio, como es el caso de la maduración, fecundación del ovocito y cultivo de embriones, mientras que en el animal son efectuadas la colecta de ovocitos en la donadora y la
transferencia del embrión producido fresco o congelado a la receptora. Según Peterson & Lee (2003) las tasas de partos para
embriones producidos in vitro está por debajo de los resultados obtenidos mediante monta natural o inseminación artificial.
Para Gutiérrez et al. (2004) los embriones producidos in vitro de 2 a 4 días de desarrollo tienen menor expresión de ARNm
para interferón, lo que puede ser uno de los motivos de mayor tasa de muerte embrionaria.
17
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Tabla 1. Clasificación de los grados de calidad ovocitaria
2.1.1 Obtención de los Complejos Cúmulos
Ovocitos (CCOs)
Los ovocitos bovinos pueden ser obtenidos in vivo, a partir de vacas vivas mediante aspiración folicular transvaginal guiada
por ultrasonografía (OPU Ovum Pick Up),
o de ovarios extraídos de vacas faenadas, siendo esta última la manera menos
costosa de obtener ovocitos de forma
numerosa y viable. Sin embargo, como lo
comentan Gonçalves et al. (2002), en este
caso no es posible controlar el estatus
de los animales donadores de las células,
pues en su gran mayoría, los ovocitos obtenidos de esta fuente tienen la capacidad
de ser madurados, fecundados y cultivados in vitro hasta llegar a estado de blastocisto.
El aprovechamiento de animales con alto
valor genético se puede generar con esta
técnica en eventos tales como accidentes
donde se encuentra comprometida la vida
del animal o en hembras sacrificadas por
motivos sanitarios o de reposición. Sin embargo, de manera general, los ovocitos se
obtienen de animales con bajo valor genético, lo cual hace a la técnica adecuada
para propósitos de investigación. Dependiendo de diversos factores de cada hembra sacrificada es posible obtener de 15 a
20 ovocitos.
El transporte de los ovarios se debe realizar en un recipiente que ayude a mantener
la temperatura para no afectar la viabilidad
de los ovocitos (Gustavo, 2001). Algunas
de las desventajas de esta técnica son que
no se tiene control total del manejo de los
ovarios previo a su recuperación, dado
que no siempre es posible tener acceso a
las instalaciones de la planta de beneficio
lo cual podría contar para la variabilidad
en los resultados posteriores. Además de
lo anterior, no se tiene información de la
edad ni del estado sanitario, reproductivo
y fisiológico de los animales, parámetros
que podrían tener un efecto deletéreo en
la producción de embriones in vitro.
GRADOS
CALIDAD
1
2
Cúmulus compacto presente,
más de 3 capas de células, citoplasma con gránulos finos y
homogéneos.
Cúmulus compacto, menos de
3 capas de células, citoplasma
con gránulos distribuidos heterogéneamente, concentrados
más hacia el centro y claros en
la periferia.
3
Cúmulus presente, expandido,
citoplasma contraído con aumento del espacio previtelino,
presencia de vacuolas y/o fragmentación.
4
Ovocito desnudo o con citoplasma bastante irregular
Fuente: autor
18
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Al momento de aspirar los folículos es importante tener en
cuenta el tamaño de los mismos, folículos mayores de 8mm
se pueden encontrar en proceso de atresia y los ovocitos en
un estado de maduración, perjudicando así la viabilidad de
estos para la PIVE (Bols, Van Soom, Ysebaert, Vandenheede,
& de Kruif, 1996).
2.1.2 Criterios para la selección de los ovocitos
La morfología del citoplasma y las células del cúmulus son
los primeros criterios para discriminar entre ovocitos competentes e incompetentes para el desarrollo embrionario,
la calidad del complejo cúmulus ovocitos (CCOs) y la apariencia homogénea del núcleo y citoplasma son los mejores
indicadores para determinar si el ovocito posee potencial
para madurar y fecundar in vitro (Palma, 2008). En la Tabla
N°1 está descrita la clasificación según los grados de calidad
ovocitaria.
2.1.3 Maduración del ovocito
La maduración ovocitaria es el proceso del cual se deriva la
obtención de una aceptable tasa embrionaria, ya que es durante esta etapa donde se presentan todos los eventos necesarios para que los ovocitos puedan expresar su máximo
potencial para poder alcanzar su desarrollo hasta el estado
de blastocisto. De esta manera, garantizar un proceso de
maduración adecuado al ovocito, es requisito fundamental
para adquirir la competencia celular necesaria para avanzar
exitosamente en las subsiguientes fases del proceso de producción de embriones.
Durante la maduración, el ovocito presenta modificaciones
bioquímicas y metabólicas que le permiten ser reconocido y
penetrado por el espermatozoide, asegurando la formación
de los pronúcleos masculino y femenino y crea reservas de
(ARNm, ribosomas y proteínas necesarias) para dar inicio al
desarrollo embrionario. Durante el crecimiento del folículo
ovulatorio, además de la maduración del ovocito, también
las células de la granulosa del cúmulus secretan ácido hialurónico que, entre otras funciones, confieren mayor capacidad de adhesión a estas células (Moraes, 2010)
Si el ovocito no posee ARN suficiente, el embrión formado
se degenera o es de peor calidad. En bovinos, el embrión de
8-16 células comienza a tener expresión de genes y produce
su propio material de subsistencia, pero antes de esto depende de la calidad del ovocito y de sus reservas almacenadas. (Lonergan, Rizos, Ward, & Boland, 2001)
La maduración ovocitaria es un evento complejo donde el
ovocito presenta diversos cambios, algunos aún no cono-
cidos en su totalidad. La maduración nuclear corresponde
al avance del ovocito desde el estado de profase I hasta la
metafase II (Gottardi & Mingoti, 2009). En condiciones in vivo
mientras los ovocitos sean mantenidos en el ambiente folicular, estos irían a permanecer en estado de vesícula germinativa (VG) hasta que se presenta el pico preovulatorio
de gonadotropinas, que estimula su maduración e induce
cambios fisiológicos en la actividad de las células del cúmulus. Bajo la influencia de las hormonas gonadotrópicas, el
ovocito reanuda el ciclo celular a partir de la etapa de diploteno de la profase I, pasa a través de las etapas de metafase
I, anafase I, telofase I (final de la primera división meiótica) y
progresa hasta la metafase de la segunda división meiótica.
Al término de la profase I se produce la ruptura de la envoltura nuclear -también conocida como ruptura de la vesícula germinal- y los microtúbulos del huso se unen a los
cinetocoros. En la metafase I, los cromosomas homólogos
se hallan dispuestos en el plano ecuatorial, unidos entre sí
por los extremos, mientras que son halados hacia los polos
opuestos por los centrómeros.
En la anafase I los cromosomas homólogos se separan dirigiéndose a los respectivos polos. Una vez que llegan a los
polos, en la telofase I, uno de los grupos de cromosomas
homólogos es expulsado del ovocito como corpúsculo polar
mientras que el otro grupo continúa con la segunda división
meiótica. Al llegar al estadio de metafase II los cromosomas
se encuentran dispuestos en el plano ecuatorial con cada
cromátida hermana unida por el centrómero a polos opuestos del huso. En este punto la meiosis se detiene nuevamente. Finalmente, la segunda división meiótica se completa
(metafase II hasta la telofase II y la extrusión del segundo
cuerpo polar) con la fusión de membranas entre el ovocito y
el espermatozoide.
En el proceso de maduración ovocitaria que ocurre dentro
del laboratorio, desde el momento en que los ovocitos son
aspirados y por lo tanto retirados del ambiente folicular, estos automáticamente reanudan la meiosis. En este caso, el
proceso de maduración debe ocurrir bajo condiciones adecuadas dadas mediante el uso de medios de cultivo apropiados, influenciados por hormonas gonadotrópicas y un
ambiente controlado dentro de una incubadora, simulando
de esta manera las condiciones de maduración in vivo (Gallí,
et al., 2003).
Finalmente, para que los ovocitos bovinos alcancen el estado de metafase II en condiciones in vitro, es necesario un
periodo de 20-24 horas (Gottardi & Mingoti, 2009) y únicamente después de este tiempo pueden ser fecundados. En
condiciones óptimas de cultivo in vitro, el 90% de los ovocitos podría llegar a la metafase II (Gallí, et al., 2003).
19
.
24
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
1
2
1
La maduración citoplasmática y molecular se refiere a una
serie de eventos simultáneos, entre los que se cuentan la
síntesis de proteínas, cambios moleculares, reorganización
de las organelas en el citoplasma, producción de proteínas
específicas que desempeñan papeles cruciales en la regulación del ciclo celular, entre otros.
2.1.4 Fertilización In Vitro
La fertilización es el proceso mediante el cual las células
espermáticas logran penetrar la zona pelúcida y unirse al
ovocito. Para esto, las células espermáticas previamente
deben sufrir una serie de cambios bioquímicos, moleculares
y metabólicos. A esta serie de eventos se le conoce como
capacitación espermática.
Los espermatozoides capacitados adquieren cambios que a
simple vista, a través del microscopio, el único evento observado es el aumento en la motilidad y velocidad (hipermotilidad). Hay que agregar que también ocurren alteraciones en
la membrana, cambio en la composición lipídica y aumento
de la permeabilidad, siendo estos los que someten a la célula espermática a proceso de reacción acrosómica para
lograr así la unión a la zona pelúcida y matriz del ovocito,
con la finalidad de garantizar la fusión de los núcleos de los
gametos para la formación del nuevo individuo (Gustavo,
2001 y Brucker & Lipford, 1995).
El tiempo para que ocurra este proceso es de aproximadamente 6 horas, en las cuales sucede la hiperactivación espermática (movimientos más intensos del flagelo) y liberación
de hialuronidasa para romper la matriz de ácido hialurónico que mantienen adheridas las células del cúmulus alrededor del ovocito. Además, como lo demuestran Lawrence
& Fowler (2002), sin capacitación no ocurre la reacción del
acrosoma. Este procedimiento es inducido cuando el espermatozoide entra en contacto con las diferentes soluciones
utilizadas para la selección de gametos viables, potencializándose en el momento en el que el espermatozoide se sumerge en medio de fertilización y se une a la membrana del
ovocito (Cabrera, Yoong & Gamarra, 2009).
En condiciones in vitro el proceso de fecundación se puede llevar a cabo con semen congelado/descongelado. Sin
embargo, para este propósito, el semen debe ser sometido
a un procedimiento de selección y lavado mediante el cual
se logre obtener los espermatozoides de mayor viabilidad
(Palma, 2008 y Machatkova et al., 2008).
Las metodologías de mayor uso en los laboratorios para el
aislamiento y selección de los espermatozoides más aptos
son la técnica de Swim up y los gradientes de Percoll. La
técnica de Swim up consiste en la selección de los espermatozoides por medio de su motilidad intrínseca. Para llevarla
a cabo, el semen es depositado en el fondo de un tubo para
centrífuga e incubado en condiciones adecuadas durante 1
hora. Transcurrido este tiempo, en la parte superior del tubo
se encuentran los espermatozoides vivos y de mayor motilidad rectilínea progresiva siendo estos los seleccionados
para la FIV (Parris, 2014).
Por su parte, la técnica de los gradientes de Percoll: consiste en la selección de los espermatozoides por medio de su
densidad. El semen es colocado dentro de unas columnas
de gradientes de diferentes densidades y llevado a centrifugación, donde finalmente en el gradiente más denso queden
los espermatozoides viables y en los gradientes menos densos las células no espermáticas, espermatozoides no viables,
plasma seminal y diluyente (Machaty, Peippo, & Peter, 2012).
En la FIV la adición de sustancias como la heparina presenta
efectos importantes en la modificación de la membrana del
espermatozoide, siendo utilizada para la producción comercial de embriones bovinos, dado que esta aumenta la capacidad de fecundar los ovocitos in vitro (Parris, 2014).
20
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
En el laboratorio, es necesario simular el ambiente in vivo, de tal manera que para el proceso de fecundación se
utilizan medios de cultivo suplementados con substancias tales como el calcio, el bicarbonato, la hipotaurina, epinefrina, penicilamina, substancias que también ayudan al proceso de capacitación de los espermatozoides, pero
que además favorecen su motilidad (Hasler, 2000).
El cultivo de los ovocitos madurados con las células espermáticas es realizado por un período de 18 a 20 horas en
ambiente controlado con ayuda de incubadora (Ward, Enright, Rizos, Boland, & Lonergan, 2002). Los espermatozoides son colocados en cultivo a una concentración 1 a 5 X 106 /ml de medio (Gonçalves, Barreta, Sandri, Ferreira,
& Antoniazzi, 2007); sin embargo, para obtener resultados satisfactorios, es necesario ajustar la concentración de
heparina y la concentración espermática para muestra seminal a ser utilizada (Lu & Seidel Jr, 2004).
2.1.5 Fecundación
La penetración de la zona pelúcida por el espermatozoide ocurre dentro de 5 a 15 minutos, la reacción del acrosoma puede ocurrir antes o después de la fijación de la cabeza del espermatozoide a los receptores glicoproteicos
sobre la zona pelúcida. Este es un requisito indispensable para la fusión de los gametos, mediante la liberación de
enzimas que permiten al espermatozoide el movimiento por la zona pelúcida hasta el interior del ovocito (Hafez
E. S. E. & Hafez, B. 2000).
Inmediatamente es efectuada la fertilización, es producida la reacción cortical en la membrana plasmática del
ovocito impidiendo la poliespermia. Cuando se fusionan el ovocito con el espermatozoide se originan los pronúcleos masculino y femenino y estos migran hacia el centro del ovocito para formar el cigoto, proceso denominado
singamia, seguidamente es producida la primera división del embrión (Senger, 2003).
2.1.6 Desarrollo Embrionario
Después de la singamia el cigoto se convierte en un embrión, definido como un organismo en estado de desarrollo
temprano (Senger, 2003). Posterior a la fusión de los pronúcleos, la célula embrionaria sufre una serie de divisiones
mitóticas denominada clivaje, generando cada vez más blastómeros. En el clivaje, ocurre una división celular sin
crecimiento del tamaño celular -aumento sucesivo de células sin aumento del volumen (González, 2002).
El embrión pasa a ser denominado blastocisto cuando presenta una cavidad llena de fluido, denominada blastocele. En esta fase, el embrión presenta también el botón germinal, que va a dar origen al nuevo organismo para
formar sus membranas fetales, además del trofoblasto, que forma la mayor parte de la placenta (Lawrence &
Fowler, 2002).
2.1.7 Co-cultivo con células del cúmulus
En la producción in vitro de embriones hay diversos factores que influyen en el desarrollo y calidad embrionaria.
El éxito en los procesos de maduración, fertilización y de cultivo dependen del microambiente en el que se desarrollen, el cual es de vital importancia para que los futuros embriones sean aptos y viables para transferir (López
& Olivera, 2007).
Es ineludible incluir nuevas metodologías que ayuden al incremento de las tasas de blastocistos en la especie bovina. Una de las técnicas empleadas para mejorar la producción embrionaria es el co-cultivo, el cual puede derivarse
de distintos tipos de células somáticas como: células oviductales, células de la granulosa y células del cúmulus; estas contribuyen al desarrollo embrionario, ya que ayudan a disminuir la formación de especies reactivas de oxigeno
(EROs) y suministran sustancias ricas en carbohidratos, proteínas y factores embriotróficos (Bosch et al., 2006).
21
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2.1.8 Cultivo In Vitro (CIV)
La etapa de cultivo comprende el período de desarrollo de
los ovocitos ya fecundados hasta llegar al estado de blastocisto.
La evaluación de la tasa de blastocisto es determinada aproximadamente el día 7, contando como día 0 el día de la fecundación. Es en esta etapa que los embriones son implantados en una hembra receptora para que puedan continuar
con su desarrollo. En caso de ser necesaria la estimación
de la tasa de eclosión, los embriones deben mantenerse en
cultivo hasta aproximadamente el día 9.
Sin embargo, excesos en la suplementación de los medios
de cultivo pueden traer efectos contraproducentes. Por
ejemplo ha sido determinado que la adición excesiva de SFB
al medio genera el fenómeno que recibe el nombre de “síndrome del becerro gigante”, que se caracteriza por el desarrollo del feto de forma acelerada y exagerada. De la misma
manera el exceso de SFB en los medios, baja la resistencia a
la Criopreservación de los embriones obtenidos (Farin, Crosier, & Farin, 2001).
Dependiendo de su formulación, han sido clasificados tres
tipos de medios de cultivo: 1) Medios indefinidos, que hacen
referencia a aquellos de los cuales no se tiene certeza de
su composición exacta y consecuentemente de la concentración de cada uno de sus componentes. Aquí se incluyen
todos aquellos que contienen suero fetal bovino (SFB) o células somáticas en co-cultivo; 2) Medios semidefinidos: son
aquellos en los cuales se reemplaza el SFB y el co-cultivo
con otros tipos de células por alguna proteína semipurificada, como por ejemplo la albumina sérica bovina (ASB); y 3)
Medios definidos: son formulaciones de las cuales se tiene
pleno conocimiento de cada uno de los componentes y de
sus cantidades (Herradón, Quintela, Becerra, Rubial, & Fernández, 2007).
Durante el período de cultivo los embriones presentan una
demanda exigente de nutrientes y fuentes energéticas necesarias para lograr su desarrollo hasta estados preimplantatorios. Estos suplementos deben ser adicionados al medio
de cultivo para así garantizar la viabilidad de los presuntos
embriones (Gustavo, 2001).
Las principales fuentes de energía son la glucosa y el piruvato, siendo la glucosa en etapas iniciales de los embriones
no necesaria dado que a dicha edad el embrión no posee las
vías enzimáticas necesarias para desdoblarla y utilizarla, llegando incluso a tener un efecto negativo para el desarrollo
embrionario.
En estados más avanzados del desarrollo embrionario, ha
sido demostrado que la glucosa juega un papel importante como fuente primaria de energía para las células. Por su
parte los aminoácido esenciales y no esenciales hacen parte
de varias formulaciones de medios de cultivo, una vez que
actúan como precursores de proteínas, son fuente energía
y participan en la regulación del pH en los medios de cultivo, aumentando así la viabilidad de los embriones (Gustavo,
2001).
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Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
2.2 Evaluación de embriones
2.2.1 Estado de desarrollo embrionario
Según la propuesta de la International Embryo Transfer Society (IETS), deben ser usados códigos numéricos para determinar
el estado de desarrollo de los embriones, señalando de esta manera los días transcurridos desde el momento de la fecundación. La codificación de los diferentes estados de desarrollo embrionarios se muestran en la Tabla 2 (Stringfellow & Givens,
2010). Los embriones son clasificados según la morfología y estado de desarrollo, para ello existen unas categorías que se
describen a continuación:
Tabla 2. Desarrollo y Clasificación embrionaria
ESTADO DE DESARROLLO
CLASIFICACION
No fecundado
1 a 2 células
Mórula temprana
Mórula
Blastocisto temprano
1
2
3
4
5
Blastocisto expandido
7
Blastocisto
6
Blastocisto eclosionado
8
Blastocisto eclosionado expandido
9
Adaptado de (Bó y Mapletoft, 2013)
Tabla 3. Clasificación y Grados de calidad embrionaria
CALIDAD
CLASIFICACION
Excelente:
Ningún efecto visible, al menos más del 85% intacto
1
Regular:
Irregularidades moderadas, 50% debe permanecer intacto
2
Mala:
Irregularidades mayores, 25% permanece intacto
3
Degenerado:
No viables
4
Adaptado de (Palma, 2008)
23
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2.2.2 Calidad embrionaria
Según lo propuesto por la IETS, los códigos para la evaluación de la calidad embrionaria están basados en la integridad morfológica de los embriones y clasificados en escala de 1 a 4, siendo estas descritas en la Tabla 4 (Stringfellow & Givens, 2010
y Bó & Mapletof, 2013) .
Tabla 4. Calidad Embrionaria
CÓDIGO
ESTADO
1
Excelente o bueno.
2
Regular.
3
Malo.
4
Muerto o en degeneración.
CARACTERÍSTICAS
Masa embrionaria esférica y simétrica, con blastómeros uniformes en
cuanto a tamaño, color y densidad, Las irregularidades deberían ser relativamente menores, y al menos el 85% del material celular debería ser una
masa embrionaria intacta y viable.
Irregularidades moderadas en cuanto al aspecto, forma, tamaño, color y
densidad de las células. Al menos el 50% del material celular deberá encontrarse intacto y correspondería con una masa embrionaria viable.
Irregularidades mayores en la forma y tamaño de la masa embrionaria. Al
menos el 25% del material celular deberá encontrarse intacto y correspondería con una masa embrionaria viable.
Masa embrionaria con blastómeros en desorden, las irregularidades son
relativamente mayores, y al menos el 85% del material celular es una masa
embrionaria degenerada y no viable.
24
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2.3 Criopreservación de embriones
La criopreservación de embriones se ha dado como el
resultado del incremento en la productividad de animales
de alto valor genético, así como la necesidad de conservación y comercialización de este material alrededor del
mundo (Vajta G, 2000b). El número de embriones producidos ha aumentado de forma considerable, creando
la necesidad de guardar los embriones excedentes por
tiempo prolongado manteniendo su viabilidad. De igual
forma, la oportunidad de crear bancos genéticos, ha permitido no sólo el almacenamiento, sino también facilitar
el transporte y la programación de actividades para la utilización de dichas estructuras (Luster SM, 2004).
Uno de los principios más importantes de la criopreservación de embriones es poder conservar a bajas temperaturas (-196°C), procurando mantener su integridad, a través
de la remoción del volumen máximo de agua antes de su
congelamiento, evitando así la formación de cristales de
hielo (Wowk B, 2010 y Saragusty & Arav, 2011).
Dentro de los métodos más utilizados para la criopreservación se encuentran el método de congelación lenta
y, como alternativa posible, un método de congelación
ultrarrápida denominado vitrificación. El método de congelación lenta es, en la actualidad, el más utilizado comercialmente (Vajta G, 2000b). Su curva de congelación lenta
permite mantener el equilibrio entre los factores que pueden causar daño celular, como son la formación de cristales de hielo, la fractura de la zona pelúcida del embrión, el
daño tóxico y osmótico, así como las alteraciones de las
organelas intracelulares y del citoesqueleto, (Dobrinsky et
al, 2000 y Vajta G & Kuwayama M, 2006)
Durante este procedimiento, los embriones son equilibrados dentro de bajas concentraciones de crioprotectores,
en pajillas de 0.25 ml, con tasas de refrigeración entre los
0.3 a 1 °C/min, hasta alcanzar los -30 a -35°C, para posteriormente poder ser sumergidos en el nitrógeno líquido.
2.3.1 Vitrificación
La vitrificación pertenece a una técnica de congelación
ultrarrápida fundamentada en el contacto directo entre
la solución de vitrificación y los embriones (exposiciones
cortas a altas concentraciones de crioprotectores de
aproximadamente 4-6 mol/L), creándose una solidificación para formar un estado vítreo o similar al cristal, sin
la formación de cristales de hielo durante el enfriamiento
a tasas muy rápidas (tasa de congelación >2000ºC/min,
hasta 14000ºC/min), permaneciendo en este estado durante todo el proceso de cambio de temperatura (Albarracín M, 2005 y Molina et al, 2004).
La vitrificación al ser una técnica que consiste en la
criopreservación a través del aumento de la viscosidad
de las soluciones crioprotectoras, necesita de concentraciones de crioprotectores mayor (4- 8 M) a las utilizadas
normalmente en el congelamiento (1-2 M) (Woods et al,
2004). Por lo tanto, la disminución de estos efectos deletéreos, va a ser obtenida a través de la utilización de
crioprotectores menos tóxicos y el establecimiento de
volúmenes y niveles de concentración menores, así como
su temperatura y tiempos de exposición (Liebermann et
al, 2003).
El uso de soluciones crioprotectoras con bajo peso molecular es una de estas estrategias. Los crioprotectores al
tener una mayor permeabilidad, van a permitir la reducción de los tiempos de exposición, y la minimización de
los niveles de concentración, previniendo el daño osmótico causado en las células (Kasai & Mukaida, 2004).
En la vitrificación de ovocitos, algunos autores reportan
que las tasas de supervivencia para bovinos (Lazar L,
Spak J, Dávid V, 2000) y humanos (Picton et al, 2002) son
cercanas al 70%. Por lo tanto, se ha evidenciado que el
método de vitrificación es superior al procedimiento de
congelación lenta convencional para criopreservación de
embriones de bovinos, humanos y otras especies animales (Otoi et al, 1998 y Molina et al, 2004).
2.3.2 OPS (Open pulled Straw- Pajilla abierta y estirada)
Para la vitrificación el tamaño de la muestra debe ser lo
más pequeña posible para aumentar la velocidad de congelación. Con dicho fin se ha descrito un soporte físico
para la vitrificación como pajillas convencionales de 0,25
ml.
El uso de la técnica OPS ha permitido incrementar la
velocidad de los cambios de temperatura, lo cual ofrece
ciertas ventajas para la congelación como son la disminución de los tiempos de exposición a los crioprotectores
utilizados, con los consecuentes menores efectos osmóticos y tóxicos, lo que produce menores daños por enfriamiento (Silva & Berland, 2004). Los índices de supervivencia de embriones vitrificados son todavía muy bajos en la
especie bovina, lo que podría ser debido al daño de las
membranas plasmáticas o a la comunicación intracelular,
perjudicando así su posterior implantación. (Carvalho E,
2006)
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Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
2.3.3 Desvitrificación
Los protocolos de desvitrificación deben tratar de disminuir la posibilidad de recristalización mediante una apropiada transferencia térmica.
El método de desvitrificación más común para ovocitos es un método
rápido y directo (Mucci et al, 2006 y Moore, 2007). Mientras se realiza
la descongelación de las estructuras puede causarse un choque osmótico debido a la rápida influencia de agua al interior de la célula,
cuya sensibilidad por la célula es dependiente de la permeabilidad de
la célula al agua y los solutos, y que puede ser reducido por el uso de
un buffer osmótico no tóxico e impermeable como la sucrosa.
La tasa de calentamiento óptima depende de los crioprotectores y su
concentración, al igual que la tasa de descenso de las temperaturas
utilizadas (Cabrera et al, 2006). Para calentar una muestra vitrificada,
se sumerge el soporte de vitrificación en un medio a temperatura fisiológica (37,5 - 39ºC), obteniendo velocidades de calentamiento entre
3000 a 8000 ºC/minuto, dependiendo del soporte utilizado. Los embriones son puestos en una solución para calentamiento entre 20ºC a
37ºC, para posteriormente rehidratarlos y remover los crioprotectores
utilizados (Mucci et al, 2006).
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3. P R O C E D I M I E N T O S
3.1 Maduración In vitro (MIV)
Cuando se va a trabajar con ovarios de vacas faenadas se debe antelar la preparación del medio de maduración de ovocitos
y el medio de lavado de ovocitos (ver Anexo).
3.1.1 Montaje de las microgotas
Dentro de una caja de Petri de 100 x15 mm, introducir 2 placas de Petri de 33 mm, en las cuales se podrán hacer de 4 a 6
gotas en c/u dependiendo el número de ovocitos a madurar; el tamaño inicial de cada gota es de 50 µl de medio de maduración, las cuales deben ser cubiertas por 1 mL de aceite mineral, completar cada gota adicionando otros 50 µl de medio de
maduración y finalizar con la adición de 3 mL de aceite mineral. Una vez acabado el montaje de las placas se deben estabilizar en la incubadora a una temperatura de 38.5°C con 5% de CO2 y humedad relativa alta durante mínimo 3 horas para su
respectiva gasificación.
Ilustración 1. Montaje de microgotas de medio de maduración, gasificación en incubadora
3.1.2 Transporte de ovarios de vacas faenadas
Los ovarios una vez colectados en planta de beneficio animal, son transportados en un recipiente con aislamiento térmico
que contenga solución NaCl al 0.9%. Si el transporte de los ovarios al laboratorio es menor a una hora es conveniente mantener esta solución a una temperatura de 37°C. En caso de tiempos de transporte prolongados, la solución debería mantenerse a temperatura ambiente (~25°C). En el laboratorio, los ovarios son lavados con solución NaCl 0.9% a 37°C, con tijeras
desinfectadas se hace debridación de tejidos adjuntos para evitar contaminación y luego son introducidos en un beaker con
la misma solución a 37°C para su posterior aspiración.
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Ilustración 2. Termo contenedor de ovarios-Debridación de tejidos adjuntos del
ovario con ayuda de tijeras- lavado de los ovarios en recipiente con NaCl.
3.1.3 Obtención del Complejo Cúmulus Ovocitos (CCOs)
La obtención del CCOs se realiza mediante aspiración folicular con aguja de calibre 18G acoplada a una jeringa de 5 mLara
la manipulación de los ovarios es indispensable el uso de guantes. El líquido folicular se obtiene de la punción de folículos
entre 2 a 8mm y es vertido en tubos cónicos para centrifuga (Falcon®, Franklin Lakes, USA) de 15 o 50mL dependiendo el
volumen de ovarios para aspirar. Terminada la aspiración se espera 10 minutos que decanten los ovocitos para poder hacer
la selección de los mismos.
Ilustración 3. Penetración de la aguja en el folículo- aspiración del folículo- retirada de la aguja
acoplada a la jeringa- liquido folicular depositado en tubo de centrifuga.
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3.1.4 Recuperación y selección de ovocitos
El sedimento recuperado del líquido folicular se deposita en una placa de Petri de 100 x 15 mm con la ayuda de una pipeta
pasteur. La recuperación y selección de los ovocitos se hace bajo lupa estereoscópica (NIKON SMZ-745T MODEL C-DS).
Los ovocitos seleccionados son sumergidos en medio de lavado (TCM/HEPES) y pasados al menos 5 veces en gotas de 100µl
del mismo medio de lavado. Únicamente ovocitos tipo I y II son usados para la maduración in vitro.
Bajo cámara de flujo laminar son transferidos los ovocitos del medio de lavado al medio de maduración. Para este propósito
se toman máximo grupos de 20 ovocitos en gotas de 100µl de medio de maduración (TCM/SFB). Se recomienda marcar cada
caja con fecha (dd/mm/aa), número (1, 2, 3, etc.) y cohorte de la semana (I, II, III) siempre y cuando esto aplique.
Ilustración 4. Depósito de líquido folicular en placa Petri con ayuda de pipeta Pasteur
- Búsqueda y recuperación de ovocitos - Lavado de ovocitos en medio de lavado y de
maduración - Ovocitos seleccionados
Ilustración 5. Ovocitos seleccionados sumergidos en gotas de medio de maduración - Ovocitos
colocados dentro de incubadora - Pasadas 20-22 horas visualizamos ovocitos madurados.
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Mantener los ovocitos seleccionados durante 22 a 24 horas
en maduración bajo tensión del 5% de CO2, 38.5 °C y alta
humedad relativa (la proporción del medio por ovocito es de
5µl:1 ovocito).
3.2 Fertilización In vitro (FIV)
Antes de cumplirse el tiempo determinado para la maduración ovocitaria es necesario preparar medio de fertilización y
de lavado de ovocitos (ver Anexo A).
3.2.2 Gradientes de Percoll
Se preparan 3 gradientes de Percoll (90%, 60%, 30%) para el
lavado de los espermatozoides. Para preparar los gradientes
(ver Anexo 6). En un tubo de microcentrífuga se hace el montaje de las columnas de Percoll cada una de 300 µl, depositando el de mayor densidad (90%) en el fondo, el de (60%)
en la mitad y en la superficie el de (30%) evitando las mezclas entre las mismas. Después de realizadas las columnas
de Percoll, se colocan dentro de la incubadora a una temperatura de 38.5°C por un lapso de 2 horas.
3.2.1 Montaje de las microgotas
Bajo cabina de flujo laminar se prepararan microgotas (100
µL c/u) de medio de fertilización distribuidas en placas de
Petri de 33 mm (Falcon®, Franklin Lakes, USA). Hacer gotas
de 50µL, luego cubrir con 1 ml de aceite mineral, completar la gota hasta 100µL y cubrir con 3 mL de aceite mineral.
Marcar cada caja con fecha (dd/mm/aa), número (1, 2, 3 etc.)
y cohorte de la semana (I, II, III) siempre y cuando esto aplique- Se preincuban por un tiempo de 3 horas en las mismas
condiciones descritas anteriormente.
Ilustración 7.Columnas de gradientes de Percoll en tubos de microcentrifuga puestos dentro de la incubadora para darles temperatura. .
3.2.3 Manejo y preparación del semen
Se coloca agua a baño maría a una temperatura de 35°C durante al menos 15 minutos. Del termo de nitrógeno se toma
una pajilla de semen con el que va hacer realizada la fertilización y se introduce en el agua ya atemperada durante 40
segundos. Seguidamente el semen descongelado se deposita en un tubo de microcentrifuga con capacidad de 1.5 ml
y desde ahí, es colectado y agregado en la parte superior de
las tres columnas de Percoll.
Ilustración 6. Montaje de microgotas con medio de fertilización
En esas condiciones, el semen se centrifuga durante 3 minutos a 11.0 rpm (centrifuga minispin, Eppendorf®, Hamburg).
Pasada la primera centrifugación, se toma del fondo del tubo
100µl de pellet (espermatozoides vivos) formado por el semen, en un nuevo tubo para microcentrifuga que contiene
1 ml de medio para lavado de espermatozoides, se deposita
los 100µL de semen y es sometido a centrifugar por segunda
vez durante 45 segundos a 5.5 rpm.
30
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Ilustración 8.Una vez terminada la 1 centrifugación del lavado del semen en las columnas de Percoll,
se observa ENUNCIADO SIN TERMINAR- En el fondo del tubo se observa el pellet (espermatozoides vivos), en la parte intermedia espermatozoides muertos y en la parte superior plasma seminal y
crioprotector.
Al finalizar la segunda centrifugación, se recupera del fondo del tubo 70µL de semen el cual será utilizado para la fertilización
de los ovocitos madurados. Para determinar la concentración espermática se realiza dilución 1:20 (95 µL de agua con 5 µL
de semen seleccionado).
Realizada la dilución se monta la cámara de Neubauer en la cual se adiciona 10 µL en la parte superior y 10 µL en la inferior
y es llevada bajo luz de microscopio a 400X, donde se lleva a cabo el conteo de las células espermáticas. Mediante la observación de 5 cuadros, los cuales deben ser los 4 extremos y el medio, se determina el total de espermatozoides en ambos
lados de la cámara.
Ilustración 9. Cámara de Neubauer en la cual se señalan los 5
cuadros a tomar para el conteo espermático.
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La diferencia en el conteo de las células espermáticas entre
las dos cámaras no debe ser superior al 10%. Si llegara a
serlo deberá repetirse toda la operación desde el llenado de
la cámara. El valor promedio del conteo de los dos lados de
la cámara se lleva a la siguiente ecuación:
Ecuación 1. *n= promedio del conteo de la cámara superior e inferior de la cámara de Neubauer.
A partir de la concentración calculada, el volumen de semen
necesario a ser aplicado en las gotas de fertilización, se determina mediante la siguiente fórmula:
Ecuación 2. Cálculo del volumen de semen
para cada gota de fertilización.
Teniendo en cuenta que la fertilización in vitro se realiza en gotas de 100 µL, la cantidad de espermatozoides para agregar a
cada gota se calcula de la siguiente manera: colocando como ejemplo una concentración de 2 millones de espermatozoides
por mL
Volumen 1: desconocido (el que se va a hallar)
Concentración 1: concentración obtenida en cámara
de Neubauer
Volumen 2: volumen de la gota de FIV
Concentración 2: Concentración ideal mínima para la FIV
Ecuación 3. Cantidad de espermatozoides para cada gota de FIV
Lavar los ovocitos al menos en 5 gotas, 3 gotas de 100µL correspondientes al medio de lavado y las dos últimas gotas correspondientes al medio de fertilización también de 100µL preincubados. Colocar grupos de máximo 20 ovocitos en cada
gota de fertilización y guardar inmediatamente en la incubadora al terminar el procedimiento. Los ovocitos madurados deben permanecer en co-incubación con los espermatozoides durante 18 a 20 horas. El día de la FIV es considerado día 0 de
la producción de embriones.
32
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Ilustración 10. Ovocitos madurados lavados en gotas de medio de lavado y de fertilización- imagen de micromanipulador donde se observa un ovocito con espermatozoides pegados en la zona pelúcida.
3.3 Cultivo In Vitro (CIV)
Inmediatamente después de finalizar la fertilización se debe
preparar el medio de cultivo y lavado de ovocitos y llevar
dentro de la incubadora con las mismas condiciones atmosféricas (ver Anexo).
3.3.1 Montaje de las microgotas
En una caja de Petri de 100 x 15 mm introducir 2 placas de
Petri de 33 mm. En estas realizar el mismo número de gotas
que se hizo durante todas las fases; cada gota de un tamaño
inicial de 50µl de medio de cultivo, en cada caja de Petri adicionar 1 mL de aceite mineral, luego cada gota se completa
con 50 µl del medio y cubrir en totalidad con otros 3 mL
de aceite mineral. Marcar cada caja con fecha (dd/mm/aa),
número (1, 2, 3, etc.) y cohorte de la semana (I, II, III) siempre
y cuando esto aplique. Estas placas se deben llevar a la incubadora junto con el sobrante de medio de cultivo y lavado.
Transcurridas las 20 horas de la fertilización retirar los ovocitos fecundados, hacer gotas de medio de cultivo y lavado
para su respectivo lavado; cada grupo de cigotos se debe
lavar en 3 gotas de medio de lavado y en 2 gotas de medio de
cultivo; después se deben colocar los presuntos embriones
en las gotas preincubadas; llevar a incubar por 7 días.
Ilustración 11. Montaje de microgotas
con medio de cultivo
33
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
3.3.2 Estado de desarrollo según la IETS (International Embryo Transfer Society)
ESTADO DE DESARROLLO
CLASIFICACION
No fecundado
1 a 2 células
Mórula temprana
1
2
3
Mórula
4
Blastocisto
6
Blastocisto eclosionado
8
Blastocisto temprano
5
Blastocisto expandido
7
Blastocisto eclosionado expandido
9
Estado de desarrollo y clasificación embrionaria
3.3.3 Grados de calidad según la IETS (International Embryo Transfer Society)
CALIDAD
CLASIFICACION
Excelente:
Ningún efecto visible, al menos más del 85% intacto
1
Regular:
Irregularidades moderadas, 50% debe permanecer intacto
2
Mala:
Irregularidades mayores, 25% permanece intacto
3
Degenerado:
No viables
4
Tabla 6. Grados de Calidad y clasificación embrionaria.
34
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Ilustración 12. A: Ovocito no fecundado. B: Ovocito con división 2 células. C: Mórula temprana. D: Mórula
compacta. E: Blastocisto temprano. F: Blastocisto. G: Blastocisto expandido 8 días. H: Blastocisto expandido
eclosionando 8-9 días. I: Blastocisto eclosionado y zona pelúcida 8-9 días.
35
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
3.4 Co-cultivo con células del cúmulus.
Durante la búsqueda de los ovocitos fueron seleccionados aquellos acordes a lo descrito en la Tabla 1 siendo tomados en cuenta el tipo I y II. Al
momento de agregar los ovocitos al medio de maduración se garantizó
que presentaran células de cúmulus para así lograr obtener las futuras
células que serán co-cultivadas.
Pasado el período de maduración son retirados los ovocitos siempre dejando células del cúmulus en dicha placa la cual permanece en la incubadora manteniendo en cultivo las células del cúmulus. El día que los
presuntos embriones serán sometidos al medio de cultivo, el medio de
maduración presente en la placa que contiene las células del cúmulus
con las gotas allí dispuestas será recambiado por medio de cultivo previamente gasificado y atemperado, sin retirar las células del cúmulus que se
adhieren a la superficie de la placa. El recambio de medio se debe hacer
de la siguiente forma: con micropipeta se hace una renovación del medio,
retirando 50µL del medio de maduración el cual es desechado en un recipiente de descarte y, agregando 50µL del medio de cultivo nuevo, este
procedimiento se realiza tres veces por cada gota presente en la placa,
preservando de esta manera las células del cúmulus que serán co-cultivadas pero, antes de agregar los presuntos embriones, dejar estabilizar la
placa durante al menos 2 horas.
Transcurridas 20 horas de la fertilización los posibles cigotos se pasan a
través de gotas de medio de lavado y cultivo para finalmente ser sumergidos en la placa de cocultivo, donde estarán por 8 días. El día 4 de cultivo
se realiza la evaluación de la tasa de clivaje y se renueva el 50% del volumen de la gota de medio de cultivo y el día 7 se realiza la evaluación de
la tasa de blastocistos.
36
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
4. P R O T O C O L O D E
VITRIFICACIÓN POR MÉTODO OPS
4.1 Preparación del sistema OPS
El sistema OPS recibe su nombre de las siglas en inglés Open Pulled Straw, que significa, pajilla abierta y estirada, una vez
que, justamente es en una pajilla previamente estirada y con sus dos extremos completamente abiertos, donde se envasan
los embriones para poder llevarlos directamente al nitrógeno líquido y de esta manera realizar su vitrificación a -196°C.
Para realizar las OPS, es necesario tener pajillas de 0,25 ml y una platina de calentamiento. Tomándolas una a una, las pajillas
se sujetan de los extremos y sobre la platina precalentada a 200°C, las pajillas se aproximan y se hacen girar sobre esta, sin
llegar a hacer un contacto directo. El objetivo inicial es convertir el material plástico del cual están hechas las pajillas en un
material maleable. Una vez logrado este objetivo, se realiza una leve tracción de manera simultánea de cada extremo de la
pajilla hasta lograr estirarla levemente.
Este procedimiento se repite varias veces, hasta conseguir que cada pajilla haya doblado su longitud original, y consecuentemente, su diámetro interior haya sido reducido a la mitad. Las pajillas ya estiradas son cortadas en el centro y los extremos,
esto con el objetivo de dejar los extremos completamente libres (sin tapón).
4.2 Preparación de las soluciones
Para la preparación de las soluciones utilizadas durante el procedimiento de vitrificación es necesario tener listos los siguientes reactivos:
- Solución de TCM-HEPES
- Suero fetal Bovino (SFB)
- Etilenglicol
- Dimetilsulfóxido (DMSO)
37
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
4.2.1 PREPARACIÓN
DEL MEDIO DE
MANTENIMIENTO
O MEDIO HOLDING
A 8 mL de solución de TCM-HEPES, adicionar 2 mL de suero fetal bovino, de esta manera se preparan 10 mL de una solución
al 20% de SFB. Filtrar la solución con membrana de 0,22µm, alicuotar y almacenar en la nevera (4°C).
4.2.2 Preparación de la solución de vitrificación 1
A 800 µL de medio de mantenimiento, adicionar 100 µL de etilenglicol y 100 µL de Dimetilsulfóxido. De esta forma cada
crioprotector debe quedar al 10% en la solución.
4.2.3 Preparación de la solución de vitrificación 2
A 800 µL de medio de mantenimiento, adicionar 200 µL de etilenglicol y 200 µL de Dimetilsulfóxido. De esta forma cada
crioprotector debe quedar al 20% en la solución.
4.3 Procedimiento de
vitrificación
Las soluciones preparadas son colocadas en volúmenes de 500 µL, de forma organizada en placas de cuatro pozos. De esta
manera, en los dos primeros pozos es colocada la solución de mantenimiento, en el tercer pozo la solución de vitrificación 1 y
en el cuarto pozo la solución de vitrificación 2. Es necesario que todas las soluciones y los materiales sean trabajados sobre
platina térmica y mantenidos a una temperatura de 39°C.
38
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Ilustración 13. Soluciones de vitrificación sobre plancha térmica.
Con ayuda de una micropipeta y tomando pequeños volúmenes, los embriones a ser vitrificados son lavados en los dos primeros pozos, correspondientes a la solución de mantenimiento. Posteriormente, son colocados durante 1 min en la solución
de vitrificación 1 y finalmente colocados durante 20 segundos en la solución de vitrificación 2.
Antes de completar los 20 segundos en la solución final, los embriones deben ser cargados es las OPS por capilaridad, teniendo presente no colectar junto con los embriones un volumen mayor a 2 µL. Inmediatamente después de haber cumplido
el tiempo, los embriones en las OPS son sumergidos directamente en el nitrógeno líquido.
Ilustración 14.OPS dentro de pajilla de 0.5, sumergida en nitrógeno líquido-termo
de nitrógeno donde se guardan los embriones vitrificados.
39
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
5. DESVITRIFICACIÓN O
CALENTAMIENTO DE LOS EMBRIONES VITRIFICADOS
5.1 Para el calentamiento de los embriones que hayan sido vitrificados, es necesario preparar una nueva solución.
5.1 Preparación de solución de Sucrosa
Son adicionados 1.7115 g de sucrosa a 4,5 mL de solución de TCM-HEPES, esta solución debe ser calentada a 40-45°C para
facilitar su dilución, y finalmente se completa con más TCM-HEPES, hasta alcanzar un volumen de 6 mL. De esta solución
inicial se toman 4 mL y a estos se les debe adicionar 1 mL de suero fetal bovino.
5.1.1 Procedimiento
Antes del calentamiento, las soluciones de mantenimiento y de sucrosa deben ser colocadas de forma organizada en una
placa de 4 pozos. De esta manera, en los pozos 1 y 2 son colocados 800 µL de medio de mantenimiento, mezclados con 400
µL de solución de sucrosa; en el pozo 3 se colocan 800 µL de medio de mantenimiento, mezclados con 200 µL de solución
de sucrosa; y finalmente en el pozo 4 se colocan 800 µL de únicamente medio de mantenimiento.
Durante el procedimiento, todas las soluciones son mantenidas en platina térmica a 39°C. Inmediatamente después de
retirar la OPS con los embriones del termo de nitrógeno, esta es sumergida en la solución del pozo 1 hasta lograr su descongelamiento; de aquí es retirada y colocada durante 5 min en el pozo 2. Posteriormente es dejada otros 5 min. en el 3er pozo
y finalmente es llevada al pozo 4 hasta su uso.
40
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
6. ANEXO
MEDIOS DE CULTIVOS Y SOLUCIONES
Soluciones Stock
41
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Solución TCM S/H. (solución base para el medio de MIV)
REACTIVO
MARCA
REFERENCIA
CANTIDAD
TCM 199 S/H
Sigma
M5017
9.5 g
NaHCO3
Sigma
56297
2.2 g
H2O
Sigma
W1503
1000 ml
Filtrar, refrigerar a 5°C, filtrar, empacar en tubos de 50 ml (falcón), duración máxima 15 días.
Solución TCM C/H. (solución de lavado)
REACTIVO
MARCA
REFERENCIA
CANTIDAD
TCM 199 C/H
Sigma
M2520
14.9 g
NaHCO3
Sigma
56297
2.2 g
H2O
Sigma
W1503
1000 ml
Filtrar, refrigerar a 5°C, filtrar, empacar en tubos de 50 ml (falcón), duración máxima 15 días.
Solución FSH
REACTIVO
MARCA
CANTIDAD
TCM 199
Sigma
10 ml
FSH
Sigma
10 mg
Hacer alícuotas de 10µl. proteger de la luz. Congelar. Duración 3 meses
42
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Solución LH
REACTIVO
MARCA
CANTIDAD
TCM 199
Sigma
15 ml
LH
Sigma
30.000UI
Hacer alícuotas de 10µl. proteger de la luz. Congelar. Duración 3 meses
Solución Penicilina/Estreptomicina.
REACTIVO
MARCA
REFERENCIA
H2O
Millipore
Direct-Q 3
5ml
10ml
Penicilina
Sigma
P3032
0.304 g
0.608 g
Estreptomicina
Sigma
S1277
0.25 g
0.5 g
CANTIDAD
Filtrar, hacer alícuotas de 30 µL. Proteger de la luz, congelar. Duración 3 meses
Solución Cysteamina
REACTIVO
MARCA
REFERENCIA
CANTIDAD
Cysteamina
Sigma
M6500
11.3 mg
TCM S/H Solución stock
Sigma
M5017
10 ml
Filtrar, hacer alícuotas de 30 µL, proteger de la luz, congelar, duración 3 meses
43
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Solución Heparina
CANTIDAD
REACTIVO
MARCA
NaCl 0,9%
Gibco
5 ml
10 ml
Heparina
Sigma
0.005 g
0.010 g
Solución Penicilamina
REACTIVO
MARCA
CANTIDAD
NaCl 0,9%
Gibco
5 ml
10 ml
Penicilamina
Sigma
1,5 mg
3,0 mg
Hacer alícuotas de 30 µL. Proteger de la luz. Congelar
Solución Cysteamina
REACTIVO
MARCA
REFERENCIA
CANTIDAD
Cysteamina
Sigma
M6500
11.3 mg
TCM S/H Solución stock
Sigma
M5017
10 ml
Filtrar, hacer alícuotas de 30 µL, proteger de la luz, congelar, duración 3 meses
44
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Solución Hipotaurina
REACTIVO
MARCA
CANTIDAD
NaCl 0,9%
Gibco
5 ml
10 ml
Hipotaurina
Sigma
0,545 mg
1,09 mg
Hacer alícuotas de 30 µL. Proteger de la luz. Congelar
Solución Epinefrina
REACTIVO
MARCA
CANTIDAD
H2O milli-Q
Gibco
10 ml
50 ml
Ácido láctico
Sigma
33 mg= 26 µL
165 mg= 130 µL
Metabisulfito (Na2SO5)
Sigma
10 mg
50 mg
pH 4,0
Del volumen de 50 ml, retirar 40 ml y añadir la epinefrina o del volumen de 10 ml retirar 8
ml y añadir la epinefrina
Epinefrina
Sigma
0,36 mg
1,83 mg
Hacer alícuotas de 15 µL. Proteger de la luz. Congelar
45
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Solución PHE
MARCA
REACTIVO
CANTIDAD
NaCl 0,9%
100 µL
200 µL
40 µL
80 µL
Penicilamina
Sigma
25 µL
50 µL
Hipotaurina
Sigma
25 µL
50 µL
Epinefrina
Sigma
10 µL
20 µL
Proteger de la exposición a la luz.
Maduración In vitro de ovocitos
Medio de lavado de ovocitos
REACTIVO
CONCENTRACIÓN
TCM 199 C/H
MARCA
Sigma
REFERENCIA
M2520
SFB*
5%
Solución
50 UI/ml
Sigma
P3032
Penicilina
50 µg/ml
Sigma
S1277
VOLUMEN
5.0 ml
10.0 ml
4.745 µL
9.490 µL
250 µL
500 µL
5 µL
10 µL
Estreptomicina
*SFB: Suero Fetal Bovino
46
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Medio de maduración de ovocitos
REACTIVO
CONCENTRACIÓN
MARCA
REFERENCIA
VOLUMEN
5 ml
TCM 199 S/H
Sigma
M5017
4385 µL
SFB
10%
Sigma
500µL
FSH
0.05 µg/ml
Sigma
50,0 µL
LH
5,0 µg/ml
Sigma
50,0 µL
Solución
50 UI/ml
Sigma
P3032
Penicilina
50 µl/ml
Sigma
S1277
5,0 µL
100mM
Sigma
M9768
10 µL
Estreptomicina
Cisteamina
47
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Fertilización In vitro de ovocitos
Medio de fertilización TALP-FEC ESTOQUE
REACTIVO
MARCA
CANTIDAD 50 ML
H2O
Ultra pura
50 ml
NaCL
Sigma
0,333g
NaH2PO4
Sigma
0,002g
NaHCO3
Sigma
0,105g
KCL
Sigma
0,012g
MgCl2.6H2O
Sigma
0,005g
CaCl2.2H2O
Sigma
0,015g
Ácido láctico 98%
Sigma
44 µL
Rojo fenol
Sigma
0,001g
Piruvato de sodio
Sigma
0,0011g
Solución
Penicilina
streptomicina
Sigma
50 µL
Ph
7.7-7.9
48
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Medio de fertilización Final
REACTIVO
VOLUMEN
CONCENTRADO
TALP-FEC
ESTOQUE
1350 µL
450 µL
PHE
60 µL
20 µL
30 µL
10 µL
Heparina
20 µg/mL
Proteger de la exposición a la luz.
Medio para preparar los gradientes de Percoll
Solución TALP-10X
CANTIDAD
REACTIVO
MARCA
H2O
Ultra-pura
10 ml
50 ml
NaCl
Gibco
0,584 g
2,7 g
NaH2PO4
Sigma
0,0048 g
0,024 g
NaHCO3
Sigma
0,21 g
1,05 g
KCL
Sigma
0,0235 g
0,117 g
Ácido Láctico 98%
Sigma
230 µL
1133 µL
Piruvato de sodio
Sigma
0,011 g
0,055 g
Hepes
Sigma
0,238 g
1,19 g
MgCl2.6H2O
Sigma
0,031 g
0,155 g
Rojo fenol
Sigma
0,0001 g
0,001 g
Solución
Penicilina
Sigma
10 µL
50 µL
Streptomicina
pH
7.2-7.4
49
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Solución TALP-sp ESTOQUE
REACTIVO
MARCA
CANTIDAD
H2O
Ultra pura
50 ml
100 ml
NaCl
Gibco
0,292 g
0,584 g
NaH2PO4
Sigma
0,00175 g
0,0035 g
KCL
Sigma
0,0115 g
0,023 g
Ácido Láctico 98%
Sigma
95 µL
190 µL
Hepes
Gibco
0,119 g
0,238 g
NaHCO3
Sigma
0,105 g
0,210 g
Rojo fenol
Sigma
0,0005 g
0,001 g
CaCl2.2H2O
Sigma
0,0155 g
0,031 g
MgCl2.6H2O
Sigma
0,031 g
0,155 g
Piruvato de sodio
Sigma
0,0055 g
0,011 g
Solución
Penicilina
Streptomicina
Sigma
50 µL
100 µL
pH
7.2-7.4
50
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Solución TALP-sp Uso
REACTIVO
CANTIDAD
MARCA
TALP-sp ESTOQUE
4,985 µL
9,970 µL
BSA fracción V
Sigma
0,03 g
0,06 g
Piruvato de sodio estoque 100 mM
Sigma
10 µL
20 µL
Penicilina
Streptomicina
Sigma
5,0 µL
10 µL
Gradientes de Percoll 90 - 60 - 30%
Percoll 90%
REACTIVO
Percoll 100%
CANTIDAD
MARCA
GH
Talp 10x
1500 µL
3000 µL
1350 µL
2700 µL
150 µL
300 µL
Percoll 90%
REACTIVO
CANTIDAD
300 µL
600 µL
Percoll 90%
200 µL
400 µL
TALP sp USO
100 µL
200 µL
51
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
Percoll 30%
CANTIDAD
REACTIVO
300 µL
600 µL
Percoll 90%
100 µL
200 µL
TALP sp USO
200 µL
400 µL
Cultivo In vitro
REACTIVO
CONCENTRACIÓN
TCM 199 S/H
MARCA
Sigma
REFERENCIA
M5017
VOLUMEN
5 ml
10 ml
4386 µL
8840 µL
500 µL
1000 µL
5 µL
10 µL
SFB
10%
Solución
100 UI/ml
Sigma
P3032
Penicilina
100 µL/ml
Sigma
S1277
Piruvato de sodio
100 mM
Sigma
P4562
75 µL
150 µL
Cysteamina
100µM
Sigma
M9768
34 µL
68 µL
Estreptomicina
Cultivar por 7 días, hacer cambio de medio (feeding) en el día 4 de cultivo, evaluar clivaje.
Medio recomendado para cultivo de embriones en ambiente de solo CO2 regulado.
52
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
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53
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
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