NOM-115-SSA1-1994 Staphylococcus aureus es una bacteria altamente vulnerable a tratamientos térmicos y a varios agentes sanitizantes. La presencia de este microorganismo en los alimentos procesados o en los equipos donde se procesan, es generalmente un indicador de sanitización o manejo inadecuado durante la producción. Esta especie produce enterotoxinas termorresistentes que al ingerirse pueden causar intoxicaciones alimentarias. Entre las razones para su determinación en alimentos están: · Determinar si un alimento o ingrediente es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. · Demostrar la contaminación postproceso la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas. Los alimentos sujetos a contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de este microorganismo representan un riesgo por la ausencia de flora competitiva que normalmente restringe el crecimiento de Staphylococcus aureus y la producción de enterotoxinas. Este tipo de alimentos se vuelven más peligrosos ante un manejo inadecuado o la conservación a temperaturas inapropiadas. Los alimentos perecederos tales como: carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelería y derivados lácteos, son los más comúnmente asociados con intoxicación estafilocóccica. Este método permite hacer una estimación del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación mediante las pruebas de catalasa, coagulasa y termonucleasa. BPA: El medio de cultivo se mantiene fundido a 48-50ºC antes de adicionar los ingredientes de enriquecimiento (telurito de potasio y yema de huevo). Por el color opaco del medio, gracias a la yema de huevo, se pueden observar halos de proteólisis y lipólisis. S. aureus produce lipasa y actúa sobre los lípidos del medio por lo que se observa un halo opaco alrededor de la colonia; esta bacteria también produce proteasas que van a degradar las proteínas del medio, lo que genera un halo claro; las placas preparadas se almacenan a 20-25 ºC hasta 5 días. Emulsión de yema de huevo: Inicialmente se separa la clara de la yema; esta última se disuelve en agua estéril en una proporción 1:4. La mezcla se dispone en un baño de agua, controlando la temperatura a 45 ± 0.5ºC durante 2h; posteriormente, se deja reposar de 18 a 24h a una temperatura de 0-5ºC permitiendo la precipitación. Una vez transcurrido el tiempo de reposo, el sobrenadante se separa asépticamente por decantación. Esta emulsión puede ser almacenada de 2-8ºC por no más de 72h. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ _ _ NOM-210-SSA1-2014 Para la preparación de la muestra, se disuelven 25g de la misma en 225 mℓ de solución reguladora de fosfatos o agua peptonada amortiguada, para una dilución 1:10. La mezcla se homogeniza durante 1-2 min en licuadora u homogeneizador peristáltico. Moluscos bivalvos: Deben tomarse un mínimo de 10-12 moluscos bivalvos (20-30 para especies pequeñas), a fin de obtener una muestra representativa de aproximadamente 200g de licor y carne. Inicialmente, se enjuaga el exceso de suciedad de las conchas y cepillar con un cepillo estéril bajo el chorro de agua potable. Las conchas limpias se colocan en toallas de papel absorbente o gasas limpias. Los moluscos que presenten conchas dañadas o valvas abiertas se desechan. La remoción del contenido se lleva a cabo con un cuchillo desconchador estéril; se pesa el total de la muestra, máximo 200g (carne y licor) se adiciona igual cantidad de agua peptonada amortiguada para obtener una dilución 1:2. La mezcla se homogeniza durante 2min en licuadora. Para los casos en los que se utiliza agua peptonada amortiguada; la dilución inicial homogenizada se incuba a 36ºC ± 1ºC durante 18h ± 2h. Productos de la pesca: Se diluyen 200g de la muestra en en 200mℓ de solución reguladora de fosfatos o agua peptonada amortiguada para una dilución 1:2 y se homogeniza durante 2 min. Las muestras congeladas deben descongelarse en refrigeración un máximo de 18h antes de su análisis. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ _ _ PROCEDIMIENTO ANALÍTICO Se transfiere asépticamente 0.1mℓ de la muestra directa si es líquida, o 0.1mℓ de la dilución inicial (1:10) en el caso de otros productos, por duplicado; el procedimiento se repite para las diluciones 10-2, 10-3 de ser necesario. Cuando se sospeche que el alimento contiene bajas cuentas de S. aureus, el límite de detección se aumentara en un factor de 10; inoculando 1mℓ de la muestra directa si ésta es líquida, o de cada dilución distribuida en 3 placas con 0.4 mℓ, 0.3 mℓ y 0.3mℓ sobre la superficie de las placas de agar, por duplicado. Las placas se mantienen con tapas hacia arriba hasta que el inóculo sea absorbido totalmente por el agar. Posteriormente, se invierten y se incuban durante 24h a 35ºC ± 1ºC. Morfología colonial típica: Colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1-2mm y con una zona opaca, húmedas y con un halo claro (de proteólisis) alrededor de la colonia. Las colonias se ven negras por la reducción del telurito a ión teluro. S. aureus es telurito (+), lipasa (+) y proteasa (+). En algunas ocasiones cepas aisladas de productos congelados o deshidratados que han sido almacenados por periodos largos de tiempo, desarrollan colonias menos negras con apariencia rugosa y textura seca. Las colonias atípicas son similares en apariencia, pero sin halo claro alrededor. Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas y atípicas de S. aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas que tengan más de 150 colonias. Seleccionar por muestra 5 colonias típicas o atípicas para su confirmación. Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas se debe agregar la nota de "valor estimado" al reporte de los resultados. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ _ _ CONFIRMACION Inicialmente, se realiza una tinción de gram a las colonias seleccionadas y se observa al microscopio para confirmar la presencia de cocos Gram positivos, agrupados en racimos. Cada una de las colonias seleccionadas se siembra a la par en TSA y en tubos con 0,5mℓ de caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) e incubada durante 24h a 35ºC. Simultáneamente, se inoculan cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo. Una vez transcurrido el periodo de incubación; se transfieren 0,3mℓ de cada cultivo a otro tubo de 10mm y se conserva para la prueba de termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la prueba de coagulasa. Prueba de catalasa: A partir del cultivo en TSA; en un portaobjetos, se emulsifica una porción del cultivo con una gota de peróxido de hidrógeno al 3%. Observando la producción de burbujas de gas para los casos positivos. Prueba de coagulasa: Agregar a 0.1mℓ del cultivo en BHI a 0.3mℓ de plasma de conejo con EDTA. Incubar a 35 ± 1ºC en baño de agua y observar durante 6h a intervalos de 1h; si no se presenta formación de coagulo, observar a las 24h. La prueba se considera positiva ante la formación de coagulo. Prueba de coagulabilidad del plasma de conejo: Se realiza para cada reactivo nuevo; para ello, se añade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5mℓ del plasma reconstituido a emplear, formándose un coágulo en 10-15 seg. Prueba termonucleasa: El cultivo en BHI aislado anteriormente para esta prueba se calienta en baño de agua hirviendo durante 15 min. Simultáneamente, se prepara un portaobjetos con 3mℓ de agar azul de toluidina-ADN y, se realizan dos orificios equidistantes en el agar con ayuda de una pipeta Pasteur. Finalmente, se transfiere una gota de cada cultivo a uno de estos orificios, incluyendo testigo y se incuba a 35ºC en cámara húmeda de 4h a 24h. La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la perforación se califica como positiva. Pruebas auxiliares: Utilización anaeróbica de manitol y de glucosa. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ _ _ EJEMPLO PARA EL CÁLCULO DE S. AUREUS. La dilución 10-2 con un inoculo de 0,1mℓ de la muestra da como resultado 65 y 85 colonias típicas por placa (no se identificaron colonias atípicas). Las 5 colonias seleccionadas de la primer placa fueron coagulasa y termonucleasa positiva por lo que las 65 colonias fueron consideradas como S. aureus. 3 de las 5 colonias seleccionadas de la segunda placa (que contiene 85 colonias) fueron coagulasa y termonucleasa positiva por lo que el 60%, es decir, 51 colonias son consideradas como S. aureus. La cuenta promedio tomando en cuenta solo las positivas es: ½(65+51) = 58 colonias de S. aureus. El resultado anterior se multiplica por el inverso del factor de dilución (10 2) dando como resultado 5 800 UFC. Finalmente, considerando que el inóculo fue de 0.1mℓ habrá que multiplicar por 10 para obtener 58 000 UFC/g. Los intervalos de confianza de este método varían en un 95% de los casos, desde un ±16% a ±52%.