Subido por joana90102010

exp biofis estruct JMM

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CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL
DE BIOMOLÉCULAS
9Interacción radiación-materia:
9Técnicas de dispersión (elástica): difracción de rayos X, electrones, neutrones...
9Técnicas inelásticas (espectroscopias):
9NMR
9EPR
9Espectroscopias ópticas
9Raman
9...
9Microscopias atómicas
¿Caracterización estructural?
¿Cómo es posible?
9Purificación de macromoléculas biológicas: Cromatografías
DIFRACCIÓN DE RAYOS X EN
MACROMOLÉCULAS BIOLÓGICAS
Fundamento teórico:
9Ley de Bragg
9¿Pueden las macromoléculas biológicas organizarse en cristales?
9¿Puede obtenerse la estructura de un cristal de proteína?
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Maurice Wilkins
Rosalind Franklin
William Lawrence Bragg
Max Perutz
John Cowdery Kendrew
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Esquema general:
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
CRECIMIENTO DE CRISTALES DE PROTEÍNAS
Se crecen a partir de disoluciones (acuosas)
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Características de la muestra de proteína para cristalización:
9Alta concentración
9Alta pureza
9Alta homogeneidad
9Alta estabilidad
Métodos para la obtención de la sobresaturación:
9Control de la Evaporación
9Control del pH
9Control de la temperatura
9Control de la concentración salina
9Uso de precipitantes
9Inclusión de sustratos
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Obtención de monocristales:
Cristales inestables (pérdida de agua):
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Fuentes de rayos X y difractómetros
Patrón de difracción obtenido
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
El problema de la fase
Función de Patterson:
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
9Métodos de resolución estructural (solución al problema de la fase):
9Métodos directos
9Método de reemplazamiento múltiple isomorfo (MIR)
9Método de dispersión anómala múltiple (MAD)
9Método de reemplazamiento molecular (MR)
9Refinamiento estructural
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Estructura obtenida: representaciones
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Estructura obtenida: representaciones
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Estructura obtenida: representaciones
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Estructura obtenida: representaciones
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Estructura obtenida: representaciones
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Estructura obtenida: representaciones
“Protein Data Bank”: registro accesible de los varias decenas de miles de estructuras
resueltas de proteínas: www.pdb.org
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
EJEMPLO: EL COMPLEJO FNR-NADP
La enzima “Ferredoxina FADP+ Reductasa”
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Ciclo catalítico de la FNR:
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Estructura obtenida: representaciones
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
USO DE TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS EN BIOFÍSICA
¿Para qué, la espectroscopia?
9Las estructuras mediante difracción de rayos X son muy útiles, pero...
9No siempre se dispone de cristales
9Debate: ¿estructura cristal-estructura disolución?
9Información sobre la proteína activa
9Información no contenida en la estructura molecular
9Las espectroscopias suministran métodos de caracterización inicial básica
9Las espectroscopias segurirán suministrando caracterización avanzada que no
se puede sustituir mediante estructura por difracción.
USO DE TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS EN BIOFÍSICA
Espectroscopia: estudio de la interacción radiación-materia con resolución espectral
En general, son técnicas inelásticas (absorción, emisión, dispersión inelástica)
Se clasifican por:
9Rango de frecuencias
9Grado de libertad energético del material que se excita
9Espectroscopias ópticas
9NMR
9EPR
9Raman
9Mössbauer
9...
RADIACIÓN EM e INTERACIÓN INELÁSTICA
Radiación EM
Materia
Longitud de onda: λ
Frecuencia:
ν = c/λ = ω/(2π)
Niveles discretos de energía
hν
Energía del fotón: E = hν
∆E
Condición de BOHR
∆E = hν
PROCESOS
Absorción
Emisión espontánea
hν
Emisión estimulada
hν
hν
Relaciones de Einstein
P(Emis . espon.)
∝ν 3
P( Abs .)
P(Emis . Est .) ∝ P( Abs .)
hν
INTRODUCIÓN AL FENÓMENO DE LA RESONANCIA (doblete)
Sistema de dos niveles, |+⟩ y | - ⟩, separados en energía ∆E = gµBB0 en presencia de un campo estático B0.
| + ⟩
∆E = gµBB0
Z↑
n+
N = n+ + n -
Z↓
(constante)
| - ⟩
Estado estacionario
Equilibrio a una temperatura T
(Temperatura de espines)
⎛ ∆E
n +ss
⎜⎜ −
exp
=
n −ss
⎝ k BT
⎞
⎟⎟
⎠
n-
Interacciones con “LA RED” y el CAMPO EM
dn+
= − Z ↓ n+ + Z ↑ n−
dt
dn−
= Z ↓ n+ − Z ↑ n−
dt
n ss = n −ss − n +ss =
equilibrio
n = n- - n+
dn
= (Z ↓ − Z ↑ )N − (Z ↓ + Z ↑ ) n
dt
Z↓ − Z↑
N
Z↓ + Z↑
1
τ1
dn
n − n ss
=−
τ1
dt
= Z↓ + Z↑
TIEMPO DE RELAJACIÓN
USO DE TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS EN BIOFÍSICA
¿De qué color son las proteínas?
9 Espectrofotometría de absorción
* IR
* Visible
* UV
9 Espectrofotometría de emisión
9 Dicroísmo Circular
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
Esquema de un espectrofotómetro
de un solo haz y de doble haz
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
Isomería óptica de aminoácidos
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
El enlace peptídico
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
Estructura de hélice α
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
Estructura
de lámina β
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
Absorbancia visible-UV:
Caracterización de aminoácidos
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
Fluorescencia de aminoácidos aromáticos
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
Estructura secundaria revelada
mediante dicroísmo circular en el UV
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
Estructura secundaria revelada
mediante absorción de infrarrojos
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
Espectro diferencial UV
Detección de la compacidad de plegamiento
Espectro de fluorescencia
FUNDAMENTOS DE LA RESONANCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR
Modelo “naïve”
Momento magnético
FUNDAMENTOS DE LA RESONANCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR
Ondas de radio
Acoplo de la oscilación
B
Detección de la frecuencia de giro
FUNDAMENTOS DE LA RESONANCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR
B
FUNDAMENTOS DE LA RESONANCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR
La interacción entre núcleos
modifica la frecuencia de giro
INFORMACIÓN
ESTRUCTURAL
FUNDAMENTOS DE LA RESONANCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR
9Los núcleos de algunos isótopos
presentan degeneración de espín
9Al aplicar un campo magnético, la
degeneración se resuelve, efecto Zeeman
(nuclear)
r r
H = µ N g N B0 ⋅ I = µ N g N B0 I z
E (M ) = E0 − µ N g N B0 M
|M⟩
2I+1
Transiciones dipolares
magnéticas
hν
-|M⟩
Resonancia
| ∆M | = ±1
hν = µN gN Bo
De acuerdo con hν = µN gN Bo la resonancia se puede obtener
experimentalmente variando la frecuencia, ν, o el campo
estático, Bo.
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Evolución de la magnetización bajo campo estático
r
B0 = B0 k̂
r
B0
ZL
r
M (t)
YL
M⊥ (t)
γ = µN gN
r
r
M= I
r
r r
dM
= −γ M ∧ Bo
dt
ωL = γ Bo
XL
M x (t ) = M ⊥ (0 ) cos (ω L t )
dM x
= ω L BM y
dt
dM y
= −ω L BM x
dt
dM z
=0
dt
Frecuencia de Larmor
(propia de cada núcleo)
La magnetización realiza
M y (t ) = M ⊥ (0 ) sin (ω L t )
una precesión en torno al
M z (t ) = M z (0 )
campo magnético estático
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
M x (t ) = e
− t / T2
La precesión de la magnetización
M ⊥ (0 ) cos(ω L t )
relaja al estado de equilibrio a
M y (t ) = e
M ⊥ (0 ) sin (ω L t )
eq
eq
M z (t ) = M z − e −t / T1 M z − M z (0 )
− t / T2
[
]
través de la interacción con los
modos de energía de la red
Microondas: introducen un campo transversal, débil y variable
[
r
r
r
B1 (t ) = B1 cos(ϖ t ) i + sen(ϖ t ) j
r
B0
ZL
r
B1 (t)
r
M (t)
YL
]
Cuando ω = ωL, el campo de microondas se
acopla a la magnetización, y se produce
absorción de energía (resonancia)
Eabs
M⊥ (t)
XL
ωL
ω
DESCRIPCIÓN EN COORDENADAS ROTATORIAS
(ejes rotando en torno a Z con una frecuencia ω)
r
El comportamiento de M se describe con rlas mismas
r
r
−1
ecuaciones, considerando un campo efectivo
r
B0
XL
ωt
r
ω $
k
γ
r
b
.
resonancia
ZL=Z
−
Bef =B−ωγ k
Z
r
Bef
Y
r
B1
YL
X
r ⎛
ω⎞ r
b = ⎜ Bo − ⎟ k
γ⎠
⎝
r
B1
9 Para ω = ω L , b = 0 : la magnetización
precede en el plano Z-Y, pasando
a estados de energía más alta
v
M
Y
X
-Y
Z
ω´
r
B1
Y
X
Descripción cuántica de la magnetización
Mi = Ii = tr(Ii ρ ) = ∑ mi Ii ρ mi = ∑∑ mi Ii m'i ρm'i mi
mi
mi m'i
Caso puro: el sistema contiene un conjunto de espines nucleares iguales
MATRIZ DENSIDAD:
sistema I = 1/2 (base de
estados de Iz)
Elementos diagonales
(POBLACIONES)
Elementos no diagonales
(COHERENCIAS)
α
β
+1 / 2 −1 / 2
ρ=
α +1 / 2
a
c*
β −1 / 2
c
b
• En el equilibrio
a o = −b0 ≠ 0
• Evolución temporal
a ( t ) = a o − (a o − a (0)) e − t / T1
• En el equilibrio
• Evolución temporal
b ( t ) = bo − (bo − b (0)) e − t / T1
c=0
c( t ) = c( 0) e
−i
E j − Ei
2 πh
t
e − t / T2
Descripción cuántica de la magnetización
Muestra inhomogénea: existen N distintos subsistemas (de espines) independientes
N
N
n
n
ρ = ∑ ρn ⇒ Mi = ∑tr[(Ii )n ρn ]
Si los sistemas no son independientes, se describen en el espacio ⊗(Iz)n
Mi = tr(Ii ρ ) =
∑
m1 ,m2 ,...,mN
∑
m'1 ,m'2 ,...,m' N
m1, m2 ,...,mN ⊗ Ii m'1 , m'2 ,...,m'N ρ(m'1,m'2 ,...,m'N ) (m1 ,m2 ,...,mN )
(Iz )1
Caso I = 1/2:
+1/2 -1/2 +1/2 -1/2
(Iz )1
ρ =
(Iz )2
(Iz )2
+1/2
-1/2
+1/2
-1/2
...
...
...
...
(Iz )N
+1/2
-1/2
(Iz )N
+1/2 -1/2
...
...
...
...
...
Descripción cuántica de la magnetización
9Efecto de las microondas: en la resonancia, se reducen los elementos diagonales y se
aumentan los no diagonales (transferencia de poblaciones a coherencias) con absorción
de energía
RESONANCIA
Descripción cuántica
a0
0
0
b0
MW
a
c*
c
b
Magnetización
v
M
-Y
Z
ω´
r
B1
Y
X
La magnetización transversal depende de los elementos no diagonales de ρ
M y = I y = tr(I y ρ ) = ∑∑ mi I y m'i ρm'i mi
mi I y m'i ≠ 0 ⇔ mi ≠ m'i
mi m'i
Aparece magnetización transversal con absorción de energía (equilibrio absorción-relajación)
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
NMR pulsado
9 Pulsos “duros”: modifican la magnetización (matriz densidad) en tiempos mucho más
rápidos que la relajación, y con anchura de banda capaz de excitar todo el sistema de espines
Z
B1
θ
r
B0
tp
X(π/2)
Z
X
Y
• θ = γB1tp
pulso π/2: transfiere poblaciones a
coherencias y coherencias a
poblaciones
a
c*
c
b
X
Y
M
• tp << T1, T2
X(π/2)
M
Z
X(π)
X
Y
M
pulso π: intercambia coherencias y
poblaciones
d
f*
a
c*
f
e
c
b
X(π)
b
-c
-c*
a
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
NMR pulsado: experimento general
Medida de la MAGNETIZACIÓN TRANSVERSAL tras la aplicación de una
secuencia de pulsos a un sistema que parte del equilibrio
P1
θ1
P2
τ1
θ2
Pn-1
θn-1
Pn
τn-1
θn
DETECCIÓN
9Se detecta la magnetización transversal
M y = I y = tr(I y ρ ) = ∑∑ mi I y m'i ρm'i mi
mi m'i
detección de coherencias entre estados de (Iz)n
9Las coherencias oscilan a frecuencias dadas por la diferencia de energía
entre los estados: necesitamos conocer las energía (Hamiltoniano)
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Jean Jeener
Richard Ernst
Kurt Wüthrich
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Hamiltoniano (de espín) nuclear:
Zemann nuclear
Chemical Shift
Acoplamiento escalar
Interacción dipolar
r r
r r r r
r
r
r
r
r r
(I ) (I ) (I ) r (I ) r
H = µN gN B ⋅ ∑(I )n − µN gN B ⋅ ∑σ n ⋅ (I )n + ∑ Jn,n' (I )n (I )n' + (µN gN )2 ∑ n 3 n' − n 5 n'
r
r
n
n
n, n'
n, n'
[
Interacciones a través de orbitales
(conectividad a uno dos o tres enlaces)
Interacciones entre espines distintos (los
espines que interaccionan dejan de ser
independientes y pueden presentar
coherencias no nulas fuera del equilibrio
Da lugar al efecto Overhauser nuclear
(NOE), dependiente de r-6, sin conectividad
][
]
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Experimento “Decaimiento libre de la inducción”
9Se pueblan las coherencias entre estados del mismo núcleo
9Oscilan con una frecuencia que es la diferencia entre las energías de los dos estados
9El espectro (transformada de Fourier del FID) muestra picos que asignan las
energías del Zeeman nuclear y Chemical Shift
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
9Espectros multidimensionales: una correcta elección de las secuencias de pulsos
permite detectar coherencias relacionadas con el acoplamiento escalar o con el NOE
Ejemplos:
9En la diagonal, picos del experimento FID (asignación del núcleo concreto)
9Fuera de la diagonal, correlaciones entre núcleos con interacción escalar exclusivamente
9La intensidad de los picos no diagonales depende de la conectividad
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Ejemplos:
9En la diagonal, picos del experimento FID (asignación del núcleo concreto)
9Fuera de la diagonal, correlaciones entre núcleos con NOE exclusivamente
9La intensidad de los picos no diagonales depende de la distancia
9Se pueden ajustar los tiempos para excitar distintas coherencias NOE
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Ejemplos:
9Experimentos heteronucleares: se detectan coherencias entre núcleos de
naturaleza distinta
9Se hace uso de las abundancias (relativas o enriquecidas) de 13C, 17O...
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Estrategias para la resolución de estructuras:
Desplazamientos químicos
en los 20 aminoácidos
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Estrategias para la resolución de estructuras:
Espectro COSY de la alanina
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Hζ3
Estrategias para la resolución de estructuras:
NOE4
Interacciones en el anillo aromático
del residuo de triptófano
H
Cβ
1
Hε3
Cζ3
2
Hη2
Cε3
Cη2
Cδ2
Cζ2
Cγ
Cε2
3
Hζ2
δ1 Nε1
C
NOE1
H
Hε1
NOE3 Hδ1 4
NOE2
1
2
3
COSY
TOCSY
ASIGNACIÓN SECUENCIAL DE PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS
Para la asignación secuencial se hace uso del efecto NOE entre diferentes
núcleos cercanos en el espacio: Espectro 2D-NOESY.
A principio de los 80, analizando las estructuras de un conjunto de proteínas,
Kurt Wüthrich y cols. observaron que para la mayoría de los residuos las
distacias entre protones de residuos adyacentes es en muchos casos menor
de 5 Å.
Por tanto, debe poder observarse casi siempre un NOE (NOE secuencial)
entre dichos núcleos.
El método de asignación secuencial propuesto por Wüthrich se basa en
relacionar los sistemas de spin previamente identificados mediante los NOEs
secuenciales en el espectro NOESY.
Una alternativa a este protocolo, propuesta por el grupo de Walter Englander,
se llama asignación dirigida por la cadena principal, que relaciona
segmentos de la cadena principal mediante el uso combinado de NOEs
secuenciales y de NOEs característicos de las diferentes estructuras
secundarias.
Generalmente se utiliza una combinación de ambos métodos.
DISTANCIAS CORTAS CARACTERÍSTICAS DE LAS
DIFERENTES ESTRUCTURAS SECUNDARIAS
Lámina β paralela
Lámina β antiparalela
Hélice α
Giro β tipo I
Giro β tipo II
DISTANCIAS CORTAS CARACTERÍSTICAS DE LAS
DIFERENTES ESTRUCTURAS SECUNDARIAS
Distancias cortas (< ≈2.5 Å) generalmente darán lugar a un NOE fuerte (pico
de cruce intenso en el NOESY).
Distancias intermedias (≈2.5-3.5 Å) dan un NOE intermedio.
Distancias largas (≈ 3.5-5.0 Å) darán un NOE débil.
ESQUEMAS DE NOEs SECUENCIALES Y
CARACTERÍSTICOS DE ESTRUCTURAS SECUNDARIAS
Se suelen realizar representaciones esquemáticas de los NOEs
indicando su intensidad mediante el grosor de las líneas.
IDENTIFICACIÓN DE LOS TIPOS DE NOEs
Antes de proceder a la asignación secuencial, es necesario discernir entre
NOEs intrarresiduo y NOEs interresiduo.
Para ello se superponen los espectros NOESY y TOCSY y se marcan los
NOEs intrarresiduo. Los NOEs restantes son interresiduo (secuenciales ó a
larga distancia)
J1
L5
E1
G18
V17
U1 E2
L1
A2
T1
W13
U3
A3
L4 A1
T1
L2
L3
U2
N11
T2
NOEs αN(i - i+1)
Generalmente se comienza relacionando pares de sistema de spin que
correspondan a pares de residuos únicos en la secuencia
Ej. N11-A12 ó L19-K20(tipo U).
Esto nos permite identificar A12, L19 y K20.
J1
L5
E1
G18
V17
U1 E2
L1
A2
T1
W13
U3
A3
L4 A1
T1
L2
L3
U2
N11
T2
NOEs βN(i - i+1)
Generalmente los NOEs αN(i-i+1) se acompañan de NOEs βN(i-i+1) entre
los mismos residuos.
N11 Hβ
A12 HN
NOEs NN(i - i+1)
Se pueden observar también NOEs NN(i - i+1)
L19
K20
N11
A12
A partir de los pares de residuos identificados podemos ir extendiendo la
asignación a lo largo de la secuencia.
Sistemas de spin: N11 A3 J1 L5 U2 E2 V17 G18 L2 U3
Secuencia:
N11 A12 W13 L14 R15 E16 V17 G18 L19 K20
W13
L5
E1
G18
V17
U1 E2
L1
A2
T1
W13
U3
A3
L4 A1
T1
L2
L3
U2
N11
T2
Resto de la asignación secuencial:
Sistemas de spin: U4 T1 L3 T2 L4 E1 A2 A1 L1 U1
Secuencia:
K1 T2 L3 T4 L5 E6 A7 A8 L9 R10
Sistemas de spin: J2 A3 J1 L5 U2 E2 V17 G18 L2 U3
Secuencia:
N11 A12 W13 L14 R15 E16 V17 G18 L19 K20
W13
L14
L9
E6
G18
R10 E16V17
A7
T2
W13
R15
L5 A8A12
L19
T2
L3
N11
T4
K20
NOEs NN(i - i+1)
L19
G18 K20
E16
V17 R15
N11
A8
E6
A12
A7
W13
L9
A8 R10
R15T4
L5
L3
W13 Hε3
W13 HN
W13 Hη3
ESQUEMA DE NOEs
K1 T2 L3 T4 L5 E6 A7 A8 L9 R10 N11 A12 W13 L14 R15 E16 V17 G18 L19 K20
dαN(i,i+1)
dβN(i,i+1)
dNN(i,i+1)
dαN(i,i+2)
dαN(i,i+3)
dNN(i,i+2)
dαβ(i,i+3)
A esta información se suelen añadir las constantes de acoplamiento JHN-Hα
e información sobre la protección de cada HN frente al intercambio con
deuterio.
LISTA DE ASIGNACIÓN COMPLETA.
Uniendo la información de la asignación secuencial con la identificación de las
señales de cada sistema de spin, se obtiene la asignación completa que se suele
expresar en forma de lista.
Sec.
K1
T2
L3
T4
L5
E6
A7
A8
L9
R10
N11
A12
W13
NH
8.67
8.57
7.78
8.43
8.38
7.92
8.27
8.56
8.16
8.26
8.14
8.54
αH
4.17
4.43
4.49
4.38
4.20
3.94
4.10
4.17
4.15
4.10
4.52
4.16
4.33
L14
R15
8.55
7.84
3.83
4.22
E16
V17
G18
L19
K20
8.11
7.89
7.69
7.89
7.62
4.12
4.02
3.86,4.00
4.40
4.23
βH
1.97,1.97
4.20
1.71,1.71
4.52
1.74,1.74
2.15,2.04
1.54
1.57
1.87,1.48
2.01,1.96
2.83,2.96
1.61
3.37,3.54
Otros
γCH2 1.54,1.54 δCH2 1.77,1.77 εCH2 3.07,3.07 ζNH3 7.70
γCH3 1.28
γOH γCH 1.73
δCH3 0.96, 0.91
γCH3 1.33
γOH γCH 1.64
δCH3 0.97, 0.93
γCH2 2.46
γCH 1.80
δCH3 0.87, 0.87
γCH2 1,83,1.67 δCH2 3.23,3.23 εNH 7.24
δNH2 6.98, 7,72
ε1NH 9.83 δ1CH 7.15 ε3CH 7.41
η1CH 7.15 ζ2CH 7.03 ζ3CH 7.52
2.00,1.40 γCH 2.07
δCH3 0.98, 0.94
1.96,1.82 γCH2 1.65,1,65 δCH2 3.25,3.25 εNH 7.40
2.19,2.19 γCH2 2.46,2.52
1.89
γCH3 0.56,0.47
1.61,1.61 γCH 1.61
δCH3 0.89, 0.89
1.83,1.67 γCH2 1.42,1.42 δCH21.72,1.72 εCH2 3.02,3.02 ζNH3 7.65
El banco de datos de desplazamientos químicos de RMN
BioMagResBank ( BMRB)
http://www.bmrb.wisc.edu/index.html
Contiene los desplazamientos químicos de unos 2900 péptidos, proteínas,
DNA y RNA, además de parámetros relacionados con RMN, condiciones de
estudio, datos de secuencias, datos cinéticos y termodinámicos obtenidos o
relacionados con la RMN.
ESTRUCTURAS DE PROTEÍNAS
RMN
Difracción de rayos X
La estructura por RMN no requiere obtención de monocristales
FENÓMENO DE LA RESONANCIA MAGNÉTICA
(caso espín electrónico)
Sistema asilado con momento angular J (degenración 2J+1)
Razón giromagnética
γ
Campo magnético estático
Momento magnético
r
B0 = B0 k̂
(Descenso de simetría O(3) → C∞)
r r
r r
H = − B0 ⋅ µ = − γ B0 ⋅ J = −γ B0 J z
-|M⟩
2J+1
r
µ =γ J
r
E (M ) = E0 − γ B0 M
Transiciones dipolares magnéticas | ∆M | = ±1
hν = γBo
Resonancia
hν
|M⟩
eh
Electrones
µB =
Núcleos
µn = µ B ⎜
2mc
= 13.996 GHz/T
⎛ m
⎜ mp
⎝
⎞
1
⎟=
µ
⎟ 1836.11 B
⎠
γ = -g µ B
γ = -g N µ N
De acuerdo con hν = γBo la resonancia se puede obtener experimentalmente variando la
frecuencia, ν, o el campo estático, Bo.
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
Evolución de la magnetización bajo campo estático
r
B0 = B0 k̂
r
B0
ZL
r
M (t)
YL
M⊥ (t)
γ = µN gN
r
r
M= I
r
r r
dM
= −γ M ∧ Bo
dt
ωL = γ Bo
XL
M x (t ) = M ⊥ (0 ) cos (ω L t )
dM x
= ω L BM y
dt
dM y
= −ω L BM x
dt
dM z
=0
dt
Frecuencia de Larmor
(propia de cada núcleo)
La magnetización realiza
M y (t ) = M ⊥ (0 ) sin (ω L t )
una precesión en torno al
M z (t ) = M z (0 )
campo magnético estático
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
M x (t ) = e
− t / T2
La precesión de la magnetización
M ⊥ (0 ) cos(ω L t )
relaja al estado de equilibrio a
M y (t ) = e
M ⊥ (0 ) sin (ω L t )
eq
eq
M z (t ) = M z − e −t / T1 M z − M z (0 )
− t / T2
[
]
través de la interacción con los
modos de energía de la red
Microondas: introducen un campo transversal, débil y variable
[
r
r
r
B1 (t ) = B1 cos(ϖ t ) i + sen(ϖ t ) j
r
B0
ZL
r
M (t)
]
Cuando ω = ωL, el campo de microondas se
acopla a la magnetización, y se produce
absorción de energía (resonancia)
YL
M⊥ (t)
Eabs
XL
ωL
ω
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
DESCRIPCIÓN EN COORDENADAS ROTATORIAS
(ejes rotando en torno a Z con una frecuencia ω)
El comportamiento de
r
M se describe con rlas mismas
r
r
−1
ecuaciones, considerando un campo efectivo
r
B0
XL
ωt
r
ω $
k
γ
r
b
.
resonancia
ZL=Z
−
Bef =B−ωγ k
Z
r
Bef
Y
r
B1
r
B1
YL
X
r ⎛
ω⎞ r
b = ⎜ Bo − ⎟ k
γ⎠
⎝
9 Para ω = ω L , b = 0 : la magnetización
precede en el plano Z-Y, pasando
a estados de energía más alta
v
M
Z
ω´
Y
Y
X
-Y
r
B1
X
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
DESCRIPCIÓN CUÁNTICA
r
r
La magnetización M ∝ tr ( ρ S ) es el la magnitud macroscópica asociada al observable espín
α
β
+1 / 2 −1 / 2
MATRIZ DENSIDAD:
sistema S = 1/2
Elementos diagonales
(POBLACIONES)
Elementos no diagonales
(COHERENCIAS)
ρ=
α +1 / 2
a
c*
β −1 / 2
c
b
1
I
2
+
• En el equilibrio
a o = −b0 ≠ 0
• Evolución temporal
a ( t ) = a o − (a o − a (0)) e − t / T1
• En el equilibrio
• Evolución temporal
b ( t ) = bo − (bo − b (0)) e − t / T1
c=0
c( t ) = c( 0) e
−i
E j − Ei
2 πh
t
e − t / T2
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
Hamiltoniano de espín:
r ~ r
r ~ r r ~ r r ~ r
r r
H = S ⋅ D ⋅ S + µB B ⋅ g ⋅ S + S ⋅ A ⋅ I + I ⋅ Q ⋅ I − µ N g N B ⋅ I
ZFS
Ze
HF
9Interacción en general anisótropa
9Fuertemente influido por la
configuración electrónica y el entorno
(no caracteriza directamente en centro)
9D, tensor de traza nula
9Sólo se da para S > ½
(algunos metales, birradicales...)
cuadrupolar
Zn
9Interacción con el propio
núcleo del átomo
9Interacción con núcleos
próximos, por conectividad o
dipolar
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
INFORMACIÓN OBTENIBLE DE UN ESPECTRO DE EPR
IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
Espín electrónico (Valencia)
Espín nuclear
(Elemento)
PARÁMETROS ESPECTROSCÓPICOS
Tensor g
Mapa
Tensor hiperfino
distribución
ZFS
electrónica
shf
.....
DETERMINACIÓN ENTORNOS LOCALES
Simetría local (anisotropías)
INTERACCIONES SISTEMA - BAÑO
Tiempos de relajación
Procesos
ƒ Reorientación
dinámicos
ƒ Difusión
INTERACCIONES MAGNÉTICAS
Interacciones entre especies
magnéticas
(pares, oligómeros)
Sistemas concentrados
(dipolar, canje)
SONDAS PARAMAGNÉTICAS PARA
Transiciones de fase estructurales
Orden en CL
Atrapamiento de productos metaestables
....
⇒
⇒
……
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
Caso S = 1/2, I = 1/2, g isótropo en interacción hiperfina:
H = µ B g BS Z + a I z S z +
1
2
H0
M ,m
(M
= −S , S
m = −I ,I )
a (S + I − + S − I + ) − g N µ N BI z
H1
E (1) (M , m ) = gµ B BM + aMm − g N µ N Bm
EPR regla de selección
|∆M| = ±1, |∆m| = 0
B0 =
hν
gµ B
a=0
B0 =
hν = gµBB + am
hν
a
Bm =
−
m
gµ B gµ B
1
2I + 1
∑
Bm =
m
a
gµ B
Espectro de EPR 2I+1 líneas
B
∆B = Bm +1 − Bm =
hν
gµ B
a
gµ B
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
Caso S = 1/2, I = 1/2, g isótropo en interacción hiperfina:
Iz
+1/2 -1/2 -1/2 +1/2
α
-1/2
+1/2
α
-1/2
-1/2
β
+1/2
-1/2
β
+1/2
α
: Sz = + 1/2
β
: Sz = - 1/2
+1/2
En el experimento contínuo se detectan las transiciones permitidas (coherencias dentro de
La misma variedad de espín electrónico)
EPR regla de selección
|∆M| = ±1, |∆m| = 0
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
Interacción hiperfina con varios núcleos:
Anión benceno
H
Anión butadieno
H
H
H H
CH2 C C CH2
H
H
-
H
6
4
4
1
1
0.5 mT
1 mT
RESONANCIA PARAMAGNÉTICA ELECTRÓNICA
Ensanchamiento
Inhomogéneo (interacción
hiperfina, distintos centros,
relajación inhomogénea...)
Anchura de línea
homogénea
ωL
ω0
f(ωL - ω0)
2T2−1
ω
ω
Solución: técnicas de pulsos permiten inducir coherencias entre transiciones ocultas
en el ensanchamiento (en especial hiperfinas) y detectarlas
P1
θ1
P2
τ1
θ2
Pn-1
θn-1
Pn
τn-1
θn
t
DETECCIÓN
Producción Fotosintética de
NADPH
NADP+
PSI
FLD
FNR
NADPH
PSI
FLDrd + FNRox
FLDsq + FNRsq
FLDrd + FNRsq
FLDsq + FNRrd
FNRrd + NADP+
FNRox + NADPH + H+
Estados Redox del Anillo de
Isoaloxazina en Flavoproteínas
2e- + 2H+
R
CH3
8
1e- + 1H+
7
9
10
-1
6
.5
4
CH3
N
N
O
2
3
N
N
H
+
R
1e- + 1H+
O
R
H
N
N
H
CH3
8
9
7 6
CH3
N
10
5
N
N
1
4
Semiquinona neutra
O
2
CH3
8
3N
7 6
1H+
H
9
CH3
10
5
4
N
O
O
1e-
CH3
8
9
7 6
CH3
10
-1
.5
4
N
Reducido
N
N
1e-
O
2
3
N
H
O
Semiquinona aniónica
+
2H+
O
2
3
N
H
H
R
Oxidado
1
EPR DE FLAVOPROTEÍNAS
¿Por qué?
9Estado semiquinona, paramagnético (S = 1/2)
9Radical molecular: ¿distribución electrónica?
9Estructura hiperfina: Interacción entre el espín del
núcleo y el del electrón
Presencia del electrón en las
Desdoblamiento hiperfino
proximidades del núcleo
“A knowledge of sites of high spin-density is of mechanistic
importance in that it suggests potential sites where one-electron
transfer could occur in flavoenzyme-catalysed reactions
involving the semiquinone intermediate.”
D. E. Edmondson, “Electron-spin resonance studies on
flavoenzymes”, Biochem. Soc. Trans. 13, 593 (1985).
CW-EPR de flavoproteínas
•Semiquinona neutra
•Semiquinona aniónica
1 mT
g = 2.005
pequeñas diferencias en anchura:
identificación de la forma de flavina
9Diferencias de anchura por intercambios:
1H
14N
2H
(D)
15N
9Anchuras debidas a desdoblamiento hiperfino no resuelto
9Desdoblamientos resueltos el flavinas modelo
Técnicas avanzadas
Permiten la detección de desdoblamientos hiperfinos no resueltos
ENDOR (doble resonancia electrón-núcleo)
Metilo en C(8)
R
H en C(6)
CH3
8
7
9
N
10
6
5
N
CH3
H
N
1
2
3
+
4
O
H
O
N
H
Acoplamientos Hiperfinos de
Algunos Protones de la Flavina
Obtenidos Mediante ENDOR
Flavoproteina
semiquinona
CH3(8)
(+ 0.1 MHz)
A⊥
A//
Flavodoxina
7.91
Ferredoxina-NADP+
reductasa
Colesterol oxidasa
CH(6)
a
a
9.46
8.42
5.53
7.47
9.41
8.12
5.11
10.30
12.11
10.90
9.0
TÉCNICA DE EPR PULSADO ESEEM
ESEEM bidimensional: HYSCORE
F1:[MHz]
30
H en C(5)
25
20
15
N(10)
10
5
N(1), N(3)
0
-30
-20
-10
0
F2:[MHz]
10
20
30
R
CH3
8
7
CH3
9
N
10
6
5
N
+
H
N
1
4
O
O
2
3
N
H
Parámetros de Interacción de los Núcleos 1H y
de la Isoaloxazina Obtenidos por HYSCORE
Flavoproteina
semiquinona
Posición
atómica
Colesterol Oxidasa
H(5)
N(A)a
N(B)a
N(10)
FNR
H(5)
N(A)a
N(B)a
N(10)
Flavodoxina
H(5)
N(A)a
N(B)a
N(10)
a (MHz)
1.9 ± 0.2b
0.7 ± 0.2b
11.7 ± 1.0
T (MHz)
K2(3+
η)
(MHz2)
14N
η
< 0.3
2.3 ± 0.2
< 0.3
2.1 ± 0.1
9.0 ± 1.1
n.d.
0.5 ± 0.1
n.d.
n.d.
-18.7
1.2
0.7
11.7
±
±
±
±
0.8
0.2b
0.3b
1.0
8.2
<
<
9.0
± 0.4
0.3
0.3
± 1.1
2.2 ± 0.1
2.4 ± 0.2
n.d.
0.5 + 0.1c
n.d.
n.d.
-18.8
1.3
0.8
11.7
±
±
±
±
0.6
0.3b
0.2b
1.0
8.7
<
<
9.0
± 0.3
0.3
0.3
± 1.1
2.2 ± 0.1
2.1 ± 0.1
n.d.
0.5 ± 0.1c
n.d.
n.d.
a Estos nitrógenos corresponden a N(1) o N(3) del anillo de flavina.
b Sólo se ha determinado el valor absoluto.
c Estimado de los datos obtenidos para colesterol oxidasa.
R
CH3
Posiciones del
Anillo de
Isoaloxazina
en
Flavoproteínas
Caracterizadas
Mediante ESEEM
e HYSCORE
8
7
9
N
10
6
.
CH3
5
N
1
O
2
3
4
N
N
+
H
O
H
Semiquinona Neutra
R
CH3
9
N
10
6
.
8
7
CH3
5
N
1
O
2
3
4
N
N
H
O
Semiquinona Aniónica
R
CH3
Posiciones del
Anillo de
Isoaloxazina
en
Flavoproteínas
Caracterizadas
Mediante
ENDOR, ESEEM e
HYSCORE
8
7
9
N
10
6
.+
5
N
CH3
H
N
1
O
2
3
4
N
H
O
H
Semiquinona Neutra
R
CH3
9
N
10
6
.
8
7
CH3
5
N
1
O
2
3
4
N
N
H
H
O
Semiquinona Aniónica
9Mediante el uso combinado de las técnicas avanzadas de EPR
ESEEM y ENDOR disponemos de un mapa del espín a través de
las interacciones hiperfinas
9Rasgos del mapa:
9Elevada presencia del espín en
el anillo central (“pirazinoide”),
sobre todo en el N(5)
9Moderada presencia en el anillo
de la izquierda (“bencenoide”), y
muy baja en el de la derecha
(“pirimidinoide”)
R
H3C
H3C
N
N
O
N
H
N
H
O
Adaptado de D. E. Edmondson, “Electron-spin resonance studies
on flavoenzymes”, Biochem. Soc. Trans. 13, 593 (1985).
9Uso del mapa: Elucidación del mecanismo
de reacción (¿por dónde salta el electrón?)
9Sensibilidad al entorno en la proteína
9Efecto de la entrada del sustrato
CÁLCULOS CUÁNTICOS DE LA FLAVINA
9Programa Gaussian
9Cálculo de la distribución de espín en el estado
semiquinona (capa abierta)
9Elección del funcional y de las bases de cálculo
9Elección del sistema a calcular
Lumiflavina, neutra y aniónica
CH3
CH3
8
7
9
6
CH3
H
N
10
5
N
CH3
N
1
O
H
2
3
4
CH3
O
8
7
N
H
9
N
10
N
1
6
5
N
4
CH3
H
O
2
3
O
N
H
Resultados de los cálculos para el orbital
ocupado por el electrón desapareado
Comparación cálculos-experimentos
Calculated Data
ATOM
a (MHz)
T (MHz)
H(5)
-21.4
H(6)
Experimental Data
η
a (MHz)
T (MHz)
11.0
-18.8
9.0
-6.4
2.1
-5.7
n.d.
H(met8)
9.1
0.6
8.4
0.5
H(met10)
9.8
1.0
12.5
N(1)
0.1
0.3
0.7
0.8
0.8
e
n.d.
b
N(3)
-1.0
0.3
0.8
0.2
1.3
e
n.d.
b
N(5)
13.6
14.6
0.7
0.3
22.1
N(10)
7.6
7.6
0.8
0.2
11.7
K (MHz)
d
g
K (MHz)
η
b, c
1.15
d
0.8
e, f
0.5
0.7-0.9
-
-
9.0
1.3
e
e, f
n.d.
b
h
-
Neutra
Calculated Data
Experimental Data
η
ATOM
a (MHz)
T (MHz)
H(6)
-11.3
2.7
-9.0
n.d.
H(met8)
13.9
0.6
10.9
0.6
N(1)
0.7
1.1
0.7
0.8
0.7
d
n.d.
b
0.7-0.9
N(3)
-1.3
0.1
0.8
0.2
1.9
d
n.d.
b
0.8
N(5)
16.0
17.4
0.7
0.3
20.4
N(10)
8.2
5.2
0.8
0.2
11.7
K (MHz)
Aniónica
a (MHz)
e
T (MHz)
K (MHz)
η
b, c
d
-
-
9.0
1.3
d
n.d.
0.5
b
d
f
n.d.
b
RESULTADOS DE LA COMPARACIÓN
9Los cálculos reflejan bastante bien (desviación < 20%) los
valores de desdoblamiento hiperfino, tanto la parte isótropa como
la anisótropa
9Los cálculos predicen correctamente las diferencias entre
flavina neutra y aniónica
RESULTADOS ADICIONALES DEL CÁLCULO
9El orbital ocupado por el electrón desapareado tiene un
marcado carácter π.
9Además de en los átomos con densidad detectada (a través de
la interacción hiperfina), hay una elevada densidad de espín en
O(2), O(4) y C(4a)
POSIBILIDADES DE LOS CÁLCULOS
9Disponer del mapa completo de densidades de espín
9Calcular el efecto del entorno del anillo dentro de la proteína
Resultados de los cálculos para el orbital ocupado por el
electrón desapareado considerando el entorno (R-X)
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