DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE SACAROSA

DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE
SACAROSA
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Indice
1. Estructura y función
2. Un poco de historia...
3. Análisis de disacáridos
4. Métodos espectrofotométricos
5. Métodos no enzimáticos
6. Métodos enzimáticos
7. Bibliografía
1. Estructura y función
La sacarosa (azúcar de mesa) es un disacárido de glucosa y fructosa. Se sintetiza en plantas
pero no en animales superiores. No contiene ningún átomo de carbono anomérico libre,
puesto que los carbonos anoméricos de sus dos unidades monosacáridos constituyentes se
hallan unidos entre sí covalentemente mediante un enlace O-glucosídico. Por esta razón, la
sacarosa no es un azúcar reductor y tampoco posee un extremo reductor.
Su nombre abreviado puede escribirse como Glc(a -1à 2)Fru o como Fru(b 2à 1)Glc. La
sacarosa es un producto intermedio principal de la fotosíntesis, en muchas plantas
constituye la forma principal de transporte de azúcar desde las hojas a otras partes de la
planta. En las semillas germinadas de plantas, las grasas y proteínas almacenadas se
convierten en sacarosa para su transporte a partir de la planta en desarrollo.
Los disacáridos no pueden entrar directamente en la ruta glucolítica, desde luego no pueden
entrar en las células sin haber sido previamente hidrolizados a monosacáridos
extracelularmente. En los vertebrados, los disacáridos ingeridos se han de hidrolizar
primero por enzimas unidos a la superficie externa de las células epiteliales que cubren el
intestino delgado para dar sus unidades monosacáridas.
Los monosacáridos así formados se transportan al interior de las células que tapizan el
intestino, desde las que pasan a la sangre siendo transportados a hígado. Allí son
fosforilados y canalizados hacia la secuencia glucolítica.
La mayor parte de las triosas fosfato generadas por fijación del CO2 en las plantas se
convierte en sacarosa o almidón. La sacarosa puede haber sido seleccionada durante la
evolución como forma de transporte del carbono debido a que su unión poco usual, que une
el C-1 anomérico de la glucosa al C-2 anomérico de la fructosa, no es hidrolizada por
amilasas u otras enzimas que escinden glúcidos comunes. La sacarosa se sintetiza en el
citosol, empezando con la dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehído - 3 - fosfato exportadas
del cloroplasto. Después de la condensación a fructosa-1,6-bisfosfato (por la aldolasa), la
hidrólisis por la fructosa-1,6-bisfosfatasa forma fructosa-6-fosfato. La sacarosa-6-fosfato
sintasa cataliza la reacción de la fructosa-6-fosfato con UDP-glucosa (glucosa activada)
para formar sacarosa-6-fosfato. Finalmente, la sacarosa-6-fosfato fosfatasa elimina el grupo
fosfato haciendo que la sacarosa esté disponible para su exportación desde la célula a otros
tejidos.
La comunicación y coordinación entre síntesis de sacarosa en el citosol y fijación de
carbono y síntesis de almidón en el cloroplasto están mediadas por el sistema de
cotransporte antiparalelo Pi-triosas fosfato. Si la síntesis de sacarosa es demasiado rápida,
el transporte del exceso de Pi al cloroplasto dará lugar a la eliminación de demasiada triosa
fosfato, esto tiene un efecto deletéreo sobre la velocidad de fijación de carbono porque se
sintetizan cinco de cada seis moléculas de triosa fosfato producidas en el ciclo de Calvin
para regenerar la ribulosa-1,5-bisfosfato y completar el ciclo. Si la síntesis de sacarosa es
demasiado lenta, habrá una insuficiencia de Pi en el cloroplasto para la síntesis de triosa
fosfato.
La síntesis de sacarosa está regulada principalmente en tres pasos, los catalizados por la
fructosa-1,6-bisfosfatasa, sacarosa-6-fosfato sintasa y sacarosa fosfato fosfatasa. Cuando la
luz incide por primera vez sobre la hoja por la mañana, aumentan los niveles de triosa
fosfato en el citosol (provenientes de la fijación de carbono en el cloroplasto). Las triosas
fosfato inhiben la actividad de la fosfofructoquinasa-2 disminuyendo los niveles de
fructosa-2,6-bisfosfato. Esto libera la inhibición de la fructosa-1,6-bisfosfatasa, lo que
permite la síntesis de fructosa-6-fosfato y así de otras hexosas fosfato, incluida la glucosa6-fosfato. La glucosa-6-fosfato es un activador alostérico de la sacarosa-6-fosfato sintasa.
La sacarosa fosfato fosfatasa cataliza el paso final en la síntesis de sacarosa a medida que
dispone de sustrato.
2. Un poco de historia...
La historia de la investigación de disacáridos está íntimamente ligada al desarrollo de la
bioquímica.
El esfuerzo por entender la estructura de los azúcares, el proceso de fermentación, la
naturaleza de los enzimas, la catálisis biológica, y la ruta del carbono asimilado durante la
fotosíntesis y el seguimiento del curso de las rutas metabólicas, a menudo involucran el
estudio de disacáridos, especialmente la sacarosa.
La forma de preparar azúcar de caña cristalina pura (sacarosa) se conocía desde los tiempos
antiguos, pero su naturaleza química era un misterio hasta mediados del siglo XIX. Este fue
el caso también del disacárido lactosa, el cual fue aislado por primera vez por Bartoletti en
1619. Fue Sigismud Andreas Marggraf quien entre 1747 y 1762 logró aislar azúcar
cristalina a partir de remolacha y otras plantas por extracción en una solución etanólica
caliente en presencia de cal. Él afirmó, basándose en el sabor, forma de los cristales y
"estabilidad" en soluciones alcalinas que el material obtenido de esas fuentes era el mismo
que el obtenido de la caña de azúcar. Se necesitó un período adicional de doscientos años
de investigación para finalmente establecer la naturaleza química de este compuesto y para
entender como es sintetizado en la naturaleza. Dos de las técnicas que empleó Marggraf,
extracción con alcohol caliente y el uso de una solución alcalina en la cual la sacarosa es
estable, siguen siendo métodos prácticos fundamentales usados para la extracción,
purificación y análisis de sacarosa.
Entre 1810 y 1830, se estableció la composición química del azúcar, por GayLussac,
Berzelius y Dumas. Dumas en 1828, Presoz en 1833, Peligot en 1838 y Biot en 1842,
concluyeron que la sacarosa puede ser dividida por ácido o por un "fermento" derivado de
la levadura u otras fuentes biológicas, produciendo un azúcar "reductor". Fue Dubrunfaut
quien en 1847 finalmente estableció que esta reacción provee glucosa y una cetosa, la cual
mostraba ser fructosa. La invertasa de levadura fue identificada como una entidad catalítica
individual por Berthelot en 1860. Estudios posteriores de O´Sullivan, E. Fisher y
Armstrong hacia finales del siglo XIX, y por C.S. Hudson entre 1908 y 1915,
transformaron a la invertasa en un agente comúnmente usado en el análisis de sacarosa y
azúcares en general.
En la segunda mitad del siglo XIX se aislaron y caracterizaron otros disacáridos, y junto
con la identificación química de estos compuestos, se obtuvieron los enzimas que causan su
hidrólisis.
Aunque los científicos de esa época percibieron el potencial que tenían estos enzimas para
el análisis específico de disacáridos, sus esfuerzos en esta dirección se vieron frustrados
porque las preparaciones de enzimas usadas en esa época eran impuras, conteniendo más de
una actividad hidrolasa.
A principios del siglo XIX, el análisis de soluciones de sacarosa se basaba en la
determinación de la gravedad específica, una técnica que está todavía en uso en la industria
azucarera, la cual es útil para la determinación de soluciones de azúcar en el rango 0.199%.
En 1842, Biot y Ventzke descubrieron las propiedades ópticas de los azúcares, y la
"inversión" de la rotación óptica que ocurre cuando la sacarosa es hidrolizada por ácidos.
Esto inmediatamente llevó al desarrollo de métodos polarimétricos para la determinación
de azúcares en solución, usando polarímetros.
En 1831, Becquerel se encontró con que unos azúcares pueden reducir cobre alcalino, y
Barreswill (1846) usó esta reacción para la cuantificación de azúcares en solución. H.
Fehiling en 1849 mejoró el procedimiento y estableció la permanencia de uno de los
reactivos más importantes disponibles para el análisis de azúcares. El método de Fehiling
permite la determinación de azúcares en solución del orden de 2-300mg.
Hacia finales del siglo XIX, se desarrollaron reacciones adicionales para el análisis de
azúcares basadas principalmente en la reactividad del carbono carbonílico, como por
ejemplo, oxidaciones, aminaciones, formación de hidrazonas, entre otros.
Se desarrollaron tests colorimétricos cualitativos específicos para azúcares, tales como
reacciones con variados compuestos fenólicos en medio ácido.
Al comienzo del siglo XIX, estas reacciones colorimétricas, como también los clásicos
métodos redox, se convirtieron en ensayos espectrofotométricos cuantitativos, y la
sensibilidad de la determinación de azúcares aumentó a un nivel de 0.1-1m mol por
muestra.
Entre 1928 y 1938, reactivos bioquímicos clave como ATP, NAD+ y NADP+,
hexoquinasa, fosfoglucoisomerasa y mutasa, y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa fueron
descubiertos por Meyerhof, Lohman, Von Euler, Warbug y Cori entre otros. El uso de estos
enzimas en un procedimiento espectrofotométrico para el análisis de glucosa al nivel de
mmol surgió como un bonus de estos estudios bioquímicos.
La introducción de la cromatografía, el uso de radioisótopos, y el desarrollo de las técnicas
espectroscópicas en el período 1940-1950 abrieron puertas para la determinación de
azúcares en estudios biológicos. El desarrollo y la sofisticación de técnicas e
instrumentación nos traen donde nos encontramos ahora, que podemos estudiar y analizar
azúcares de forma rápida, precisa y en los niveles de sensibilidad del orden de pmol.
Con respecto a la estructura de la sacarosa, el análisis de metilación de Irvine y Haworth,
entre 1903 y 1927, y los estudios polarimétricos de Hudson en el mismo período,
proporcionaron el modelo estructural del disacárido tal como lo conocemos hoy. La
espectroscopia NMR en 1960 determinó la conformación espacial exacta de la molécula.
En 1953, Lemieux y Huber sintetizaron químicamente la sacarosa por primera vez. La
síntesis enzimática de sacarosa utilizando sacarosa fosforilasa bacteriana fue lograda por
Hassid, Doudoroff y Barker en 1944, y la síntesis por sacarosa sintasa de plantas fue
lograda por Leloir y Cardini en 1955.
3. Análisis de disacáridos
Estrategia
Antes de aplicar un procedimiento analítico específico es necesario tener una buena idea de
cuales carbohidratos están presentes y los rangos de concentración de las soluciones
estudiadas.
Si el sistema es completamente desconocido, una evaluación cualitativa por TLC y un
análisis de los azúcares totales presentes deben ser obtenidos primero.
La elección de la metodología cuantitativa específica va a depender de muchos factores:
a. El objetivo del análisis.
b. El rango de concentración del disacárido.
c. La presencia de otros carbohidratos u otros compuestos que puedan interferir con el
método particular para el disacárido de interés.
d. El grado de precisión requerido.
e. El disacárido no debe ser degradado antes ni durante el análisis dado que se podrían
obtener datos erróneos.
f. La disponibilidad del reactivo analítico específico, su costo y eficacia.
g. La accesibilidad a la instrumentación específica necesaria.
Cabe notar que para muchos fines, una técnica simple y barata para el análisis de
carbohidratos puede lograr excelentes resultados- casi tan buenos como los obtenidos con
técnicas e instrumentos sofisticados y caros.
Recordar que la caracterización de un disacárido por una técnica dada, debe ser siempre
verificada por un segundo método independiente.
4. Métodos espectrofotométricos
El término espectrofotometría se refiere al uso de la luz para medir las concentraciones de
sustancias químicas.
Cuando una molécula absorbe un fotón, su energía se incrementa. Se dice que pasa a un
estado excitado. Si por el contrario emite un fotón, su energía disminuye. El estado de
menor energía de una molécula se denomina estado basal o fundamental.
En la siguiente figura se describe un esquema básico de un espectrofotómetro:
Monocromador - Celda con el analito - Detector de luz Fuente de luz - (Selección de
longitud de onda)
Una fuente de luz se hace pasar por un monocromador. Éste permite seleccionar un haz de
luz con una única longitud de onda. Este haz de luz monocromática incide sobre una celda
de ancho b que contiene la solución con el analito. Si la solución absorbe la luz, la potencia
radiante incidente (Po) (1) del haz de luz disminuye al emerger de la celda. Los valores de
la potencia radiante emergente (P) tienen que cumplir necesariamente la siguiente relación:
P £ Po
(1) La potencia radiante se define como energía por unidad de tiempo y por unidad de área
o sección.
- Magnitudes en Espectrofotometría
La transmitancia se define de la siguiente forma:
En tanto, la absorbancia se define como:
Cuando no se absorbe luz, P = Po y por lo tanto A = 0. Cuando se absorbe 90 % del haz de
luz, 10 % de éste se transmite, por lo que P = Po / 10 y A = 1.
- Ley de Beer
Donde:




A es la absorbancia (magnitud adimensional)
e es un coeficiente de proporcionalidad denominado absortividad molar. Indica la
absorbancia de una determinada sustancia a una longitud de onda dada y se expresa
en M-1. cm-1.
b es el ancho o espesor de la celda donde se deposita la muestra y se expresa en cm.
c es la concentración expresada en moles / Litro (M)
La ley de Beer establece que la absorbancia es proporcional a la concentración de las
especies absorbentes. Dicha ley se verifica muy bien en un rango definido de
concentraciones (£ 0.01 M). Las fallas aparentes de la ley de Beer en soluciones más
concentradas pueden atribuirse a cambios en las propiedades de las especies absorbentes de
la solución. Conforme una solución se vuelve más concentrada, las moléculas de soluto
interactúan entre sí debido a su proximidad, modificando sus propiedades de absorber la
luz. De ello resulta que la gráfica de Absorbancia en función de la concentración pierde su
linealidad.
5. Métodos no enzimáticos
1. Este es probablemente el procedimiento más común para la estimación del
contenido total de azúcares reductores y glucósidos. Una muestra de 0.01 – 0.25 m
mol de azúcar en 0.3 mL se mezcla con 0.01mL de fenol 10%. Se agrega 1.0mL de
H2SO4 concentrado de grado analítico a la mezcla azúcar – fenol. Después de
mezclar, se incuba por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se mide la
absorbancia a 490nm.
Algunas sustancias tales como cationes de metales pesados, compuestos azo- y tiopodrían interferir.
2. Fenol – H2SO4
3. Antrona - H2SO4
El medio ácido hidroliza el enlace glicosídico de la sacarosa y los monosacáridos
resultantes reaccionan con la antrona produciendo un color verde – azulado.
Para el análisis de sacarosa, una muestra de 100m L (0.05-0.4m mol de sacarosa) se mezcla
con 100m L de NaOH 30%, y se calienta por 10 minutos a 100°C. Se deja enfriar a
temperatura ambiente y se agregan 3.0mL del reactivo de antrona (0.15% en 80% H2SO4).
Después de 15 minutos a 40°C, se mide la absorbancia a 620nm.
Antrona
6. Métodos enzimáticos
1. Introducción
Desde un punto de vista analítico, la capacidad de los enzimas para catalizar reacciones
específicas con un alto grado de eficacia, ha dado lugar a diferentes aplicaciones en
diversos campos del análisis como análisis clínicos, análisis de productos alimentarios,
análisis de preparados farmacéuticos etc.
El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en:
1. La determinación de los sustratos de la reacción enzimática, siendo posible determinar
específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de separar. Para la
cuantificación de sustratos se pueden utilizar dos métodos generales:
a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo de métodos (los más
utilizados en la práctica) se permite que la reacción enzimática se complete o llegue al
equilibrio y se mide la variación producida en la concentración de un producto de reacción
o de un reactivo presente inicialmente en exceso.
b. Métodos cinéticos, en los que se utilizan medidas de la velocidad inicial de la reacción
enzimática para deducir la concentración inicial de sustrato. Los procedimientos de medida
son idénticos a los utilizados para reacciones catalíticas en general.
2. Determinación de los mismos enzimas mediante el empleo de métodos cinéticos en los
que se mide la velocidad de desaparición del sustrato o de generación del producto,
relacionada con la concentración de enzima en disolución.
1. Determinación de otras sustancias mediante el empleo de reactivos marcados con
enzimas: enzimoinmunoanálisis.
El objetivo de esta práctica es determinar el contenido de sacarosa en un preparado
empleando para ello un método enzimático espectrofotométrico de tiempo fijo.
2. Fundamentos
Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su mayoría carecen
de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacáridos. Tanto en
análisis clínicos como en la industria alimentaria y farmacéutica se utilizan métodos
enzimáticos para la determinación de glucosa.
La glucosa oxidasa es una flavoproteína altamente específica que cataliza la oxidación de la
glucosa a b -D-gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión
apreciable.
C6H12O6 + O2 C6H10O6 + H2O2
Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente o mediante
un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reacción
espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacción enzimática
indicadora adecuada. Así, para la determinación colorimétrica de glucosa por el método de
la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP), que elimina el peróxido
de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado según el
siguiente esquema de reacción:
H2O2 + Aceptor de oxígeno Producto coloreado + H2O
(DH2) (D)
Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin
embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de
aceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina, que reacciona con el
p-hidroxibencensulfonato y el peróxido de hidrógeno en presencia de HRP para formar un
colorante quinonaimina con un máximo de absorción a 505 nm, de acuerdo al siguiente
esquema de reacción.
Este método, propuesto por Trinder (1) en 1972, será el empleado en esta práctica para la
determinación de glucosa en un preparado. A continuación se resumen las distintas
reacciones acopladas que se utilizarán para la determinación de la glucosa. La cantidad de
colorante generada, y por tanto la absorbancia medida a 505 nm, será directamente
proporcional a la cantidad de glucosa.
El disacárido sacarosa puede también determinarse específicamente basándose en el
esquema de reacciones anterior, previa hidrólisis enzimática del mismo con el enzima
fructofuranosidasa o invertasa. Este enzima cataliza la transformación de la sacarosa en una
molécula de fructosa y una molécula de glucosa (azúcar invertido).
3. Material, reactivos, instrumentación
a. Instrumentación
- Espectrofotómetro con cubetas de 1 cm de paso de luz.
b. Material




4 matraces de 100 ml
8 matraces de 25 ml
1 vaso de 250 ml, 2 vasos de 100 ml
1 embudo, papel de filtro, vidrio de reloj.
c. Reactivos

Reactivo Trinder: Disolución que contiene todos los reactivos necesarios para la
determinación de la glucosa por el método propuesto en las concentraciones que se
indican a continuación:

o
o
o
o
4-aminoantipirina 0,5 mmol/L
p-hidroxibencensulfonato 20 mmol/L
Glucosa oxidasa (GOD) obtenida de Aspergillus Niger 15 U/mL
Peroxidasa de rábano silvestre (Horseradish peroxidase, HRP) 10 U/mL
Pesar las cantidades adecuadas de los reactivos indicados y disolver en una disolución
reguladora de Tris 0,02 M de pH 7,0. Llevar a volumen en un matraz de 100 mL. Esta
disolución debe almacenarse en botellas color topacio y en el refrigerador.


Disolución de invertasa 72 U/ml en tampón de citrato 0,1 M de pH 4,6. Preparar 25
mL
Disolución patrón de glucosa 0,01 M
Procedimiento
Se empleará un método de tiempo fijo para la cuantificación de sacarosa en una muestra de
un preparado.
Para la construcción de la línea de calibrado deben prepararse cinco disoluciones de
glucosa de concentraciones comprendidas entre 5´ 10-5 M y 5´ 10-4 M por dilución del
patrón de glucosa. Añadir a la cubeta del espectrofotómetro 1 mL de reactivo Trinder y 250
µL de patrón, mezclar e incubar exactamente 18 minutos a temperatura ambiente.
Medir a continuación la absorbancia de la mezcla de reacción a 505 nm frente a un blanco
de reactivos.
Para la determinación de glucosa y sacarosa en la muestra, esta se disolverá y/o diluirá con
agua en la proporción adecuada según el contenido de glucosa y sacarosa esperado.
Para determinar el contenido de sacarosa se llevará a cabo en primer lugar su hidrólisis
enzimática a glucosa y fructosa (inversión) con invertasa. Para ello se toman 2 mL de la
disolución de muestra y se mezclan con 8 mL de la disolución de invertasa. Se incuban 15
minutos a 55 ºC. La suspensión fría se filtra, se lava el filtro y se recoge cuantitativamente
en un matraz aforado enrasando con agua hasta la marca.realizando a continuación la
determinación del contenido total de glucosa según el procedimiento anteriormente
descrito. El contenido de sacarosa se obtiene por diferencia entre las concentraciones de
glucosa obtenidas antes y después de la inversión enzimática. Expresar el contenido de
glucosa y sacarosa en la muestra en g/g de muestra.
7. Bibliografía
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
D. Barham, P. Trinder; Analyst,1972, 97, 142-145
P.M. Dey, J.B. Harborne; Methods In Plant Biochemistry. Vol. 2.
L. Stryer; Bioquímica. 4ta. Edición.
A. Lehninger; Principios de bioquímica. 2da. Edición.
L.G. Wade, Jr.; Química Orgánica. 2da. Edición.
F.A. Carey; Química Orgánica. 3ra. Edición.
Tinoco, Jr.; Physical Chemistry. 3ra. Edición.
Internet: www.chemfinder.com
www.chemweb.com
www.spectragalactic.com
www.probes.com/handbook
www.netbiochem.com
Autor:
Marcie Jiménez Riani
mjr510[arroba]hotmail.com
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