Analisis de la via de desarrollo ojo de drosofila utilizando microarreglos ADN

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Análisis de la vía de desarrollo del ojo en drosófila
utilizando microarreglos de ADN
Lydia Michaut*, Susanne Flister*, Martin Neeb†, Kevin P. White‡, Ulrich Certa§y Walter J. Gehring*¶
* Biozentrum, Universidad de Basilea, CH-4056 Basilea, Suiza;†Roche Bioinformática y§Centro Roche de Genómica Médica, F. Hoffmann–La Roche, CH-4070
Basilea, Suiza; y‡Facultad de Medicina de la Universidad de Yale, New Haven, CT 06520
Contribución de Walter J. Gehring, 29 de enero de 2003
Paz-6Los genes codifican factores de transcripción conservados evolutivamente
genes que ya se sabe que actúan aguas abajo deoyedurante el desarrollo del ojo
ojo. Cuando se expresa ectópicamente endrosófiladiscos imaginales, Paz-6genes
se encontraron junto con un grupo de genes previamente no caracterizados que
inducen la formación de ojos en los apéndices correspondientes de la mosca
aún no estaban asociados con la formación del ojo.
adulta. Usamos dos diferentesdrosófilamicromatrices de ADN de genoma
completo para comparar la expresión génica en discos de pierna de tipo salvaje
versus discos de pierna dondesin ojos, uno de los dosDrosófila Pax-6 genes, se
expresó ectópicamente. Validamos estos datos mediante el análisis de la expresión
endógena de genes seleccionados en los discos oculares e identificamos 371 genes
que se expresan en los discos imaginales del ojo y se regulan al alza cuando se
induce ectópicamente un campo morfogenético ocular en los discos de las piernas.
Estos genes codifican principalmente factores de transcripción implicados en la
especificación de fotorreceptores, transductores de señales, moléculas de
adhesión celular y proteínas implicadas en la división celular. Como era de esperar,
los genes que ya se sabe que actúan aguas abajo desin ojosdurante el desarrollo
del ojo fueron identificados, junto con un grupo de genes que aún no estaban
asociados con la formación del ojo.
PAGS
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Inducido poroyedurante la formación del ojo ectópico. Como era de esperar, los
capaces de activar el programa de expresión génica necesario para construir un
hacha-6Los genes codifican factores de transcripción conservados
evolutivamente con dos dominios de unión al ADN que actúan aguas
arriba en la vía de desarrollo del ojo tanto en vertebrados como en
invertebrados (1, 2). Son capaces de inducir la expresión de todos los genes
necesarios para construir un ojo tipo cámara de vertebrado o un ojo
compuesto de insecto. En drosófila, la diferenciación retiniana comienza
durante el tercer estadio larvario, cuando una onda de diferenciación
marcada por una hendidura del epitelio del disco, el surco morfogenético,
atraviesa el disco ocular de atrás hacia adelante (3, 4). Aunque las células
anteriores al surco no están diferenciadas y se dividen de forma
asincrónica, las que están dentro del surco se detienen en G1fase y
empezar a diferenciar. A medida que emergen del surco, las células se
agrupan en grupos previos de cinco fotorreceptores (R8, R2-R5 y R3-R4),
mientras que las otras células indiferenciadas experimentan una ronda
adicional de mitosis (la segunda onda mitótica) antes de diferenciarse en
los fotorreceptores R1. -R6 y R7, células cónicas y células pigmentarias (5).
lossin ojos(oye) el gen codifica uno de los dosDrosófila Pax-6genes, los
cuales se expresan en los precursores del ojo tan pronto como aparecen
estas estructuras (6, 7). Cuando se expresa ectópicamente en otros discos
imaginales, Paz-6los genes son capaces de inducir la expresión de todos los
genes necesarios para la formación de los ojos, lo que lleva a la formación
de ojos ectópicos en los apéndices adultos (8).
El objetivo de nuestro estudio es obtener una visión general de toda la
cascada genética que controla la morfogénesis del ojo. Aquí nos enfocamos
en la etapa de desarrollo cuando las células comienzan a diferenciarse en
fotorreceptores. Para identificar los genes que se regulan al alza cuando se
induce un campo morfogenético ocular, utilizamos micromatrices de ADN
para comparar los discos de las patas de tipo salvaje con otros en los que
oyese expresa ectópicamente. Para validar estos datos, analizamos la
expresión endógena de genes seleccionados en los discos oculares.
La elección de las secuencias de sonda de oligonucleótidos presentes en la
matriz es fundamental para el análisis de la transcripción basado en matrices.
Por lo tanto, comparamos el rendimiento de dos diferentesdrosófilamatrices de
oligonucleótidos de alta densidad de genoma completo, roDROMEGa y
DrosGenome1, que se diseñaron de forma independiente (verMateriales y
métodos). Este enfoque aseguró la validación cruzada de nuestros datos y
aumentó significativamente la importancia de nuestros resultados. Identificamos
un conjunto de 371 genes transcritos en los discos imaginales del ojo y
4024–4029-PNAS -1 de abril de 2003-vol. 100 - no. 7
Materiales y métodos
drosófilaCepo.losdrosófilapresioniso4licenciatura, con un cuarto
cromosoma isogenizado, se utilizó como cepa de tipo salvaje. Para
potenciar la expresión ectópica deoyeen los discos imaginales larvales,
dppparpadear-GAL4 (9) se recombinó con UAS-GAL4 (obsequio de B.
Hassan, Flanders Interuniversity, Institute for Biotechnology, Leuven,
Bélgica, y H. Bellen, Baylor College of Medicine, Houston) y se cruzó a
UAS-oye(8).
Micromatrices de ADN.Dos matrices de oligonucleótidos de alta densidad
diferentes (Affymetrix, Santa Clara, CA) que cubren eldrosófilagenoma (10)
se utilizaron en este estudio: roDROMEGa y DrosGenome1. roDROMEGa es
una matriz personalizada de Hoffmann–LaRoche diseñada según el
drosófilasecuencias depositadas por Celera en las bases de datos
SwissProt-TrEMBL en agosto de 2000 (11). La matriz Dros-Genome1 se basa
en una publicación posterior de la anotación del genoma y contiene
diferentes sondas de oligonucleótidos (www.affymetrix.com-analysisindex.affx).
En ambas matrices, algunos genes están representados por más de un
conjunto de sondas para incluir diferentes variantes de corte y empalme. Por
ejemplo, en roDROMEGa, elfalta longitudinal(lola) (12) está representado por
cinco conjuntos de sondas (CG12052-CDS 1–5), que reflejan las cinco
transcripciones empalmadas alternativamente descritas en la primera versión de
la base de datos de anotación del genoma dedrosófila, mientras que en la matriz
DrosGenome1, ellolaEl gen está representado por tres conjuntos de sondas
derivados de las secuencias de CG12052, CG18376 y de EST ld17006. También
nos dimos cuenta de que algunos genes están representados en solo una de las
dos matrices. Por ejemplo, ningún conjunto de sonda correspondiente a la
camisetael gen (13) se pudo encontrar en la matriz DrosGenome1, y elaplicación
El gen no está representado en la matriz roDROMEGa.
Los datos sin procesar informados en este documento se enviaron a
NCBI Gene Expression Omnibus, www.ncbi.nlm.nih.gov-geo- (número
de acceso GSE271).
Preparación de objetivos.Para cada experimento, se diseccionaron 100–
200 discos imaginales, se transfirieron inmediatamente a 800-l de
Trizol (GIBCO-Life Technologies, Basilea, Suiza), y almacenado en
- 70°C. La extracción de ARN se realizó de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. La cantidad y la calidad del ARN total se
determinaron mediante electroforesis capilar en un bioanalizador
RNA6000 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania).
Comparar la expresión génica en discos imaginales de piernas de
control versus discos de piernas en los que se indujo un campo ocular
[dppparpadear- GAL4, UAS-GAL4-UAS-oye], se prepararon dianas
biotiniladas de 15 a 20-g de ARN total (500–700 discos de patas) según
el procedimiento estándar de Affymetrix. Para analizar la expresión
génica en primordios oculares normales, la parte del ojo se separó de
la parte antenal del disco antenalar. Para reducir el número de discos
requeridos, usamos un protocolo que involucra dos sucesivas
Abreviatura: AD, diferencia media.
¶A
quién debe dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: Walter.Gehring@unibas.ch.
www.pnas.org-cgi-doi-10.1073-pnas.0630561100
Figura 1.(A) Reparto de los 371oye-genes inducidos según la matriz de sondas por la que se detectan; se dan ejemplos de algunos genes detectados por sólo uno de
los dos microarrays de ADN. (B) Clasificación funcional de 254 de los 371oyegenes inducidos a los que se podría asignar una función molecular.
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MAS 4.0software,
y los datos fueron procesados utilizando elCARRERA-A
software (Hoffman-LaRoche) como se describe en la ref. 14. Los valores de
diferencia promedio (AD) se usaron para estimar la abundancia de
transcritos. En este estudio, se consideró que los genes con AD - 100 se
expresaban y, para calcular los pliegues de inducción, el valor mínimo de
AD se estableció en 20 para todos los conjuntos de sondas con AD - 20.
Debido a que la información sobre la expresión génica diferencial no es
confiable sin una medida del nivel de confianza con el que se rechaza o
acepta la hipótesis nula, utilizamos de tres a cinco réplicas biológicas para
realizar una prueba no pareada.tprueba [tprueba para muestras
independientes con estimaciones de varianza separadasPAGS)]. losPAGS
valor de los desparejadostprueba (PAGS) por lo tanto, refleja la
probabilidad de que se rechace la hipótesis nula (ninguna diferencia en la
expresión de un gen dado entre muestras experimentales).
Resultados y discusión
Diseño de pantalla y estrategia de identificación de genes expresados
aguas abajo deoyeDurantedrosófilaDesarrollo de ojos.para obtener un
visión global del programa genético desencadenado porPaz-6, nosotros
usamos drosófilamatrices de genoma completo para comparar muestras
de ARN de discos de piernas normales con discos de piernas en los que se
había inducido un campo morfogenético ocular mediante la expresión
ectópica deoye. Para mejorar oyeexpresión, recombinamos el controlador
dpp-GAL4 con UAS-GAL4. Los ojos ectópicos generados en [dppparpadear
-GAL4, UAS-GAL4-UAS-oye] las moscas son considerablemente más grandes
que las obtenidas con el controlador dpp-GAL4 solo (D. Felix, comunicación
personal).
Debido a que Ey es un factor de transcripción que juega un papel en
varios tejidos a lo largodrosófiladesarrollo, su expresión ectópica también
puede inducir la expresión de genes que no están específicamente
involucrados en la formación del ojo. Para identificar genes específicos del
ojo, utilizamos micromatrices de ADN para analizar la expresión génica
endógena en los discos imaginales del ojo y combinamos estos dos
criterios (inducción ectópica poroyey la expresión en el disco imaginal del
ojo de la larva) para discriminar entre la transcripción de genes específicos
del ojo y no específicos.
Los mismos objetivos biotinilados se hibridaron sucesivamente con los
dos microarreglos de ADN, primero con roDROMEGa y luego con
DrosGenome1, y se procesaron usando el mismo procedimiento estándar.
Se usó un exceso de ARN marcado para evitar la titulación del
Michautet al.
de las piernas), la actividad de cada gen se midió de forma independiente de 6 a
10 veces, porque se hibridaron de tres a cinco réplicas biológicas con las dos
matrices. Los datos completos de todos los conjuntos de sondas de ambos
microarrays de ADN se proporcionan en las tablas 4 (roDROMEGa) y 5 (DrosGenome1), que se publican como información de apoyo en el sitio web de PNAS
(consulte también www.biozentrum.unibas.ch-gehring -).
Discrepancias entre los dos microarreglos.Los siguientes criterios
se utilizaron para filtrar los datos: un nivel de expresión en los discos
imaginales del ojo (reflejado por el AD) -100 y una inducción por ectópico
oyede al menos 1,5 veces con un nivel de confianza del 95%. Sólo el 40% de
los genes inducidos ectópicamente poroyeen los discos de las piernas
también se transcribió en los discos de los ojos. Esto enfatiza la importancia
de analizar también la transcripción de genes endógenos que proporciona,
junto con el uso de réplicas biológicas, una fuerte validación de los datos.
Como se esquematiza en la Fig. 1A, 228 y 198 genes inducidos por ectópico
oyey expresados en los discos oculares son detectados por las matrices
roDROMEGa y DrosGenome1, respectivamente. Esto corresponde a 371
genes únicos (enumerados en la Tabla 6, que se publica como información
de respaldo en el sitio web de PNAS), entre los cuales 55 son detectados
por ambos microarrays de acuerdo con nuestros tres criterios de selección
(Tabla 1). Si noPAGSse considera el valor, el 61% deloyeLos genes inducidos
por roDROMEGa también son detectados por Dros-Genome1 y, a la inversa,
el 65,5% de losoyeLos genes inducidos por DrosGenome1 también son
detectados por roDROMEGa (Tabla 7, que se publica como información de
apoyo en el sitio web de PNAS). Debido a que los objetivos hibridados con
las dos matrices de sondas eran idénticos, estas discrepancias
probablemente reflejen diferencias entre las dos micromatrices de ADN.
Además de las razones estadísticas, las diferentes versiones de la anotación
del genoma y los parámetros de selección de la sonda que se usaron para
diseñar las dos matrices, así como el ruido en elMAS 4.0algoritmo utilizado
aquí son posibles fuentes de discrepancias (G. de Feo, Affymetrix,
comunicación personal).
losseno ocular(asi que) se requiere el gen aguas abajo deoyedurante el
desarrollo del ojo (15, 16). Sin embargo, no hay transcripciones correspondientes
aasi que son detectados por roDROMEGa en los discos oculares (Tabla 2; AD - -8).
Un análisis más detallado de las métricasMAS 4.0Los archivos revelaron que para
las cinco réplicas independientes del disco ocular analizadas, el número de pares
de sondas negativas es mayor o igual al número de pares de sondas positivas
que representan elasi quegene. Por el contrario, el número de pares de sondas
positivas después de la hibridación de los mismos objetivos con DrosGenome1 es
PNAS -1 de abril de 2003-vol. 100 - no. 7 -4025
BIOLOGÍA
Análisis de los datos.Las señales de expresión se analizaron con Affymetrix
dianas durante la hibridación con la segunda micromatriz de ADN. En
nuestras condiciones experimentales, los mismos objetivos podrían
hibridarse sucesivamente tres veces con micromatrices de ADN sin ninguna
pérdida significativa de señal (Tabla 3, que se publica como información de
apoyo en el sitio web de PNAS).
Bajo cada condición analizada en este estudio (iso4licenciaturadiscos oculares,
iso4licenciaturadiscos de las piernas, y [dppparpadear-GAL4, UAS-GAL4-UAS-oye] discos
DE DESARROLLO
rondas de síntesis de ADNc, lo que nos permitió comenzar con
cantidades más pequeñas de ARN total (1–2-gramo). Este
procedimiento se detalla en Texto de apoyo, que se publica en el sitio
web de PNAS, www.pnas.org. En ambos casos, 20-g de cRNA
antisentido biotinilado finalmente se fragmentaron y se hibridaron
con las matrices de acuerdo con el protocolo estándar.
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Tabla
Los nombres de los genes se resaltan cuando se detectan etiquetas de análisis en serie de expresión génica (SAGE) correspondientes en bibliotecas de discos oculares (35). IF, inducción de
pliegue; sombreado amarillo, IF - 1.5; sombreado naranja, 1.5 - IF - 5; sombreado rojo, SI - 5.
significativamente mayor (8-10; Tabla 3), lo que se correlaciona con el
AD positivo para elasi quegen en esta matriz. Por el contrario, la
matriz Dros-Genome1 no detectaSur-8,pique, o SP1173 transcritos en
el ojo (Tabla 2), aunque confirmamos la expresión de estos genes en
los discos oculares poren el lugarhibridación (Fig. 2).
el caso de laciclina E(ciclo) también ilustra las diferencias entre los
dos microarrays de ADN.ciclose expresa en todas las células que se
dividen asincrónicamente en la fase S anterior al surco morfogenético,
así como en el subconjunto de células que sufrirán la segunda onda
mitótica, posterior al surco morfogenético (17, 18). El microarreglo de
ADN DrosGenome1 no detecta ningún aumento enciclotranscripción
después de ectópicooye expresión en los discos de las piernas,
mientras que detecta la presencia de las transcripciones en los discos
de los ojos. Por el contrario, en la micromatriz de ADN roDROMEGa,
ciclola transcripción en los discos de las piernas se regula 16,4 veces
después de un ectópicooyeexpresión, perociclono se detecta
expresión endógena en los discos oculares (Tabla 2).
Por lo tanto, es difícil concluir que una micromatriz es más sensible que
la otra porque su precisión depende en gran medida de la selección de las
secuencias de oligonucleótidos elegidas para representar un gen, que a su
vez depende de la secuencia o anotación del genoma.
Es el uso combinado de dos micromatrices de ADN diferentes que
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permite la validación de la expresión génica, por lo que reduce
considerablemente el número de falsos positivos y valores atípicos.
losoye-Función de genes inducidos en lo alto de la diferenciación retinal
Ruta.Sobre la base de un AD - 100, se detectan transcripciones correspondientes
a 5600–6100 genes en los discos oculares. Estos genes pueden actuar en el
desarrollo del ojo aguas arriba o en paralelo aoye, comojuguetey Optix(7, 19), o
también puede ser necesario para el desarrollo del disco de la pierna (Muesca,
Egfr, yDPP). Por lo tanto, a pesar de su importante papel en el desarrollo del ojo,
su transcripción no se regula significativamente por ectópicos.oye. Es más
probable que los genes que identificamos aquí participen preferentemente en la
diferenciación de la retina en lugar de ser necesarios para la morfogénesis
general de los discos imaginales. De acuerdo con hallazgos previos, los
microarrays de ADN detectan una regulación positiva deojos ausentes,asi que, y
perro tejonero(dac), que codifican proteínas conservadas evolutivamente que
funcionan junto conPaz-6 en la parte superior de la cascada de desarrollo del ojo
(20). Sin embargo,dac la regulación al alza ocurre con solo un 74% de confianza
(Tabla 2) porque ya está altamente expresada en los discos imaginales de las
piernas en ausencia de oye, consistente con su papel en el desarrollo de las
piernas (21). Debido a que los discos imaginales de las piernas se utilizaron como
base para la actividad genética en nuestra pantalla, los genes más
específicamente requeridos para el desarrollo de los ojos en lugar de las piernas
se detectan con un nivel de confianza más alto.
Michautet al.
Los nombres de los genes se resaltan cuando se detectan etiquetas de análisis en serie de expresión génica (SAGE) correspondientes en bibliotecas de discos oculares (35). LDC,iso4licenciaturadiscos imaginales de las
piernas; LDey, discos imaginales de piernas [dppparpadear-GAL4, UAS-GAL4-UAS-oye]; AD-ED, diferencia promedio en los discos imaginales del ojo; IF, inducción de pliegue; sombreado amarillo, IF - 1.5; sombreado
Entre los 38 factores de transcripción que se encontraron tanto
inducidos durante la formación ectópica del ojo como expresados en
los discos imaginales del ojo (Tabla 6), 18 ya estaban asociados con el
desarrollo del ojo. Se expresan endógenamente en la vecindad del
surco morfogenético y se sabe que son necesarios durante los
primeros pasos de la diferenciación de los fotorreceptores. Entre esos,
elmi(spl) transcripciones m deltaygama mse expresan en el surco
morfogenético (22).atonalprimero se expresa ampliamente en las
células por delante del surco que avanza y luego sufre refinamientos
sucesivos hasta que se expresa solo en una sola célula en cada
omatidio, la célula R8, que es el primer fotorreceptor en diferenciarse
(23, 24).brutocontrola la diferenciación de las células R2 y R5, que
posteriormente se están diferenciando (25, 26), y elagrupadoEl gen se
expresa en una franja dependiente de hedgehog en las células
indiferenciadas justo antes del surco morfogenético (27). los genes
guijarrosyvidrio comienzan a expresarse en el surco morfogenético y
su expresión se extiende posteriormente en los fotorreceptores
diferenciados (28, 29).oyetambién induce la expresión ectópica de
pastilla, que se expresa en todas las células indiferenciadas que
surgen de la segunda ola de morfogénesis que da lugar a las células
R1-R6, R7, cono y pigmento (30).
Genes conocidos que aún no están asociados con la formación del ojo.Entre la
otros 20 factores de transcripción regulados positivamente durante la
formación del ojo ectópico, se ha descrito que ocho están involucrados en
otros procesos de desarrollo. Por ejemplo, los roles delola(12), secoya(
secuencia) (31), ystich1(32, 33) en el desarrollo del sistema nervioso
embrionario se investigaron sobre la base de sus fenotipos de pérdida de
función. De manera similar, las mutaciones de pérdida de función en elred
gen que codifica eldrosófilahomólogo de MATH6, han sido
Michautet al.
se ha descrito que afecta el patrón de las venas del ala (34). La transcripción
endógena de estos cuatro genes en los discos imaginales del ojo y su regulación
positiva durante el desarrollo del ojo ectópico (Tablas 1 y 2) sugieren un posible
papel durante el desarrollo del ojo. Además, la transcripción de estos genes en el
ojo en desarrollo se confirmó de forma independiente mediante análisis en serie
de imágenes de transcripción de expresión génica (SAGE) de poblaciones de
células purificadas de discos imaginales del ojo (35); Etiquetas SAGE
correspondientes alola,secuencia,stich1, yred de hecho se detectaron en
bibliotecas de ADNc derivadas de poblaciones clasificadas de células del disco
ocular.
losinfructuoso(fru) yken y barbie(conocidoLos genes ) también codifican
factores de transcripción (36, 37) que se expresan en los discos oculares y
son inducidos poroyedurante el desarrollo del ojo ectópico (Tabla 1). A
pesar de queconocidolas transcripciones están presentes en el disco ocular
en varias filas de células posteriores al surco morfogenético (Fig. 2), no se
describen defectos en el desarrollo o la morfología del ojo para alelos
mutantes viables (http:--flybase.org-). Una posibilidad es que estos alelos
mutantes no afectenconocidofunción en el ojo, similar al caso delfrualelos;
fruLas mutaciones viables causan anomalías en el comportamiento de
cortejo masculino y afectan las transcripciones específicas del sexo
producidas bajo el control de un promotor distal del gen (38).frues un gen
multifuncional que codifica proteínas no específicas del sexo además de la
proteína involucrada en el comportamiento masculino (39). Una o más de
estas proteínas podrían ser responsables defrufunción en el ojo.
Además de los factores de transcripción, los transductores de señales
representan una categoría importante de genes expresados en los discos
oculares y regulados al alza durante la formación del ojo ectópico (Fig. 1B).
Confirmamos la expresión de los interactores RasSur-8(40) ypique(41), así como
elAPLICAR-proteína interactuante 1(42) en los discos oculares. Lo especifico
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BIOLOGÍA
naranja, 1.5 - IF - 5; sombreado rojo, SI - 5.
DE DESARROLLO
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Tabla 2. ADN m
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Figura 2.Expresión endógena de laoyegenes inducidos en discos oculares de tipo salvaje. (A) La proteína de codorniz se detectó utilizando el mAb 6B9 desarrollado por L. Cooley
(Escuela de Medicina de Yale, New Haven, CT) y proporcionado por el Banco de Hibridomas de Estudios de Desarrollo (Iowa City, IA). (B–norte)En el lugarhibridación utilizando sondas
de ARN antisentido marcadas con digoxigenina derivadas de EST correspondientes a los genes mencionados en cada panel. La especificidad de la señal se controló utilizando sondas
de ARN sentido (no mostradas).
la expresión de estos tres genes en el área del surco morfogenético (Fig. 2)
y su inducción significativa durante el desarrollo del ojo ectópico (Tablas 1 y
2) argumenta a favor de una función previamente no caracterizada durante
el desarrollo del ojo. entre los tresrazagenes presentes endrosófila(43), sólo
rac2aumenta durante la formación del ojo ectópico (Tabla 1). Las Rac
GTPasas actúan en varios pasos del desarrollo controlando los cambios en
la forma celular (44). Estas modificaciones del citoesqueleto de actina están
mediadas por proteínas de unión a actina (Fig. 1B). Nuestros datos
muestran que la proteína QUAIL, que está involucrada en el ensamblaje del
haz de actina durante la ovogénesis (45, 46), también está presente en los
discos oculares posteriores al surco morfogenético (Fig. 2) y se regula
durante el desarrollo ectópico del ojo (Tabla 1).
La transcripción de una serie de genes necesarios en varios pasos de la
división celular se regula durante la formación del ojo ectópico;mellizos
codifica la subunidad reguladora de la proteína fosfatasa tipo 2A
involucrada en la regulación de la mitosis y expresada en discos imaginales
(47).gran Murallacodifica una supuesta proteína quinasa requerida para la
condensación cromosómica y la progresión mitótica (http:-- flybase.org-), y
esqueletocodifica una proteína cromosómica que se relocaliza durante la
mitosis (48), que se postuló para constituir una matriz para el ensamblaje
del huso basado en microtúbulos durante la profase (49). esqueletose
expresa en el disco ocular en una fila discreta
4028-www.pnas.org-cgi-doi-10.1073-pnas.0630561100
de células posteriores al surco morfogenético (Fig. 2), lo que
podría corresponder a las células en la segunda ola de mitosis.
losvaleEl gen codifica un factor de crecimiento del disco imaginal relacionado
con la quitinasa, sintetizado por el cuerpo graso e implicado en el control del
crecimiento del disco imaginal (50). Aquí mostramos quevaletambién se
transcribe en los discos imaginales de las piernas y los ojos y que su transcripción
aumenta durante la formación del ojo ectópico (Tabla 1), lo que indica un papel
autónomo devaleen el desarrollo del disco imaginal y más específicamente en la
diferenciación del ojo. Este hallazgo está en perfecto acuerdo con los resultados
del análisis de micromatrices de genes expresados diferencialmente en los
diversos discos imaginales realizado por Klebes.et al.(51), donde los autores
encontraronvalela expresión es 2 veces mayor en los discos antenales del ojo que
en los discos de las alas.
Genes previamente no caracterizados expresados durante el desarrollo del ojo
mentoMás de la mitad de los 371oyeLos genes inducidos identificados en este
estudio no están caracterizados. No se pudo asignar ninguna función molecular a
117 de ellos, como SP1173 (FBgn0035710), para el cual no se pudo identificar
claramente ningún homólogo ni ningún dominio funcional. Curiosamente, las
transcripciones de SP1173 están presentes en dos regiones distintas de los
discos oculares: en una banda de células ubicadas en el área del surco
morfogenético y en el borde posterior del disco (Fig. 2). La transcripción de tres
genes previamente no caracterizados potencialmente
Michautet al.
Conclusiones
Utilizamos micromatrices de ADN para obtener una visión general de la cascada
genética que controladrosófilamorfogénesis del ojo al final del tercer estadio
larvario. Al comparar la expresión génica en discos de pierna de tipo salvaje con
discos de pierna dondeoyese expresa ectópicamente, identificamos 371 genes
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que se expresan endógenamente en los discos oculares y
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Michautet al.
Además de los genes que ya se sabe que actúan aguas abajo deoyedurante el
desarrollo del ojo, identificamos una serie de genes descritos previamente que
aún no se sabía que se expresaran durante la formación del ojo y sugieren un
posible papel en el desarrollo del ojo para genes previamente no caracterizados.
En este sentido, el perfil de transcripción global en microarreglos es una
herramienta útil que complementa las pantallas genéticas realizadas para
identificar genes que funcionan en vías de desarrollo específicas. Sin embargo,
los resultados obtenidos mediante el uso de dos microarreglos diferentes indican
que la anotación del genoma y el diseño de GeneChip influyen fuertemente en
los resultados.
oyeinduce principalmente la expresión de genes que actúan temprano en la
diferenciación retiniana, como factores de transcripción involucrados en la
especificación de fotorreceptores, transductores de señales, proteínas de unión a
actina, moléculas de adhesión celular y proteínas involucradas en la división
celular. Este estudio proporciona una imagen de cómooyesuperpone su acción
en las células activando específicamente la expresión de miembros particulares
de las vías de señalización generales, generando así una combinación única de
productos génicos que confieren una identidad ocular a las células del disco
imaginal donde se expresa. Este enfoque se puede utilizar para comprender
mejor el programa genético dedrosófilamorfogénesis del ojo, desde el
establecimiento inicial de un campo morfogenético del ojo hasta la diferenciación
final y el mantenimiento del ojo compuesto. En última instancia, esto nos
permitirá comparar la morfogénesis del ojo de insecto con la morfogénesis del
ojo tipo cámara de los mamíferos y varios otros tipos de ojos que se encuentran
en otros filos.
Agradecemos a R. Hoffmann por la comunicación del procedimiento de
amplificación de destino y M. Wilhelm-Seiler y M. Tessier por el apoyo
técnico. Agradecemos a C. Punzo por la lectura crítica del manuscrito y a T.
Loop y L. Hermida por su ayuda con el depósito de datos. Este trabajo fue
apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza, la Universidad de
Basilea, la Fundación Novartis y la Fundación Steinbach.
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PNAS -1 de abril de 2003-vol. 100 - no. 7 -4029
BIOLOGÍA
ADNbc:gh11415codifica el homólogo de la proteína determinante
del destino celular conservada evolutivamente mab-21 identificada en
el nematodo (53), el ratón pez cebra y el ser humano. El homólogo
mab-21 de ratón participa en el desarrollo del cerebelo, el
mesencéfalo y los ojos. En la embriogénesis de la mitad de la
gestación, se expresa en sus niveles más altos en el rombencéfalo, el
cerebelo, el mesencéfalo y la futura retina neural. El homólogo de
mab-21 humano, CAGR1, se detectó originalmente en una biblioteca
de cDNA retinal. Se expresa en varios tejidos, sobre todo en el
cerebelo (54, 55).ADNbc:gh11415expresión anterior al surco
morfogenético endrosófiladiscos imaginales del ojo (Fig. 2) y su
inducción ectópica poroyeson consistentes con un papel
evolutivamente conservado de mab-21 en el desarrollo del ojo.
se regula cuando se induce ectópicamente un campo morfogenético ocular.
DE DESARROLLO
La codificación de moléculas de adhesión celular también se regula durante
la formación del ojo ectópico: CG13532, BcDNA:gh11973 y CG9134 se
expresan en el área del surco morfogenético (Fig. 2). CG12605 codifica un
supuesto factor de transcripción similar al gen panneuralrascary se expresa
posterior al surco morfogenético, donde se produce la diferenciación
neuronal (fig. 2). CG11849 y CG13651 codifican proteínas homólogas que
contienen un dominio de unión a ADN pipsqueak N-terminal (52). Ambos
son inducidos ectópicamente poroyeen los discos imaginales de las piernas
y muestran patrones de expresión casi idénticos en los discos oculares, en
células no diferenciadas anteriores al surco morfogenético (Fig. 2). Estos
genes codifican factores de transcripción putativos que pueden representar
importantes reguladores del desarrollo ocular no caracterizados
previamente.