COMO CRECEN LAS CELULAS

COMO CRECEN LAS
CELULAS?
Introducción
Para los microbios, el crecimiento es su respuesta más esencial
a su entorno fisicoquímico. El crecimiento es el resultado tanto
de la replicación como del cambio en el tamaño celular.
Los microorganismos pueden crecer bajo una variedad de
condiciones físicas, químicas y nutricionales.
En un medio nutritivo adecuado, los organismos extraen los
nutrientes del medio y los convierten en compuestos biológicos.
 Parte de estos nutrientes se utilizan para la producción de
energía y otra parte se utilizanpara la biosíntesis y la formación
de productos
Como resultado de la utilización de nutrientes, la masa microbiana aumenta con el tiempo y se
puede describir simplemente por
SUSTRATO + CELULAS = PRODUCTOS EXTRACELULARES + MÁS CELULAS
𝑺 +𝐗=
𝑷 + 𝒏𝑿
Crecimiento microbiano
 El crecimiento microbiano es un buen ejemplo de una reacción
autocatalítica.
 Una reacción química única es autocatalítica si uno de los
productos de reacción es también un catalizador para la misma
reacción o una reacción acoplada. Tal reacción se llama reacción
autocatalítica.
 Se puede decir que un conjunto de reacciones químicas es
"colectivamente autocatalítico" si varias de esas reacciones
producen, como productos de reacción, catalizadores de
suficientes otras reacciones para que todo el conjunto de
reacciones químicas sea autosuficiente dado un aporte de
energía y moléculas alimenticias
Tasa de crecimiento
La tasa de crecimiento está directamente relacionada con la concentración celular, y la
reproducción celular es el resultado normal de esta reacción.
La tasa de crecimiento microbiano se caracteriza por la tasa de crecimiento específica neta,
definida como:
Donde:
𝜇𝑛𝑒𝑡
1 𝑑𝑋
=
𝑋 𝑑𝑡
𝑋= Concentración de masa celular (g/L)
𝑡 = Tiempo (h)
𝜇𝑛𝑒𝑡 = Tasa de crecimiento específica neta (ℎ−1 ).
El crecimiento específico neto es la diferencia entre una tasa de crecimiento
específica y la tasa de pérdida de masa celular por muerte celular o metabolismo
endógeno.
𝜇𝑛𝑒𝑡 = 𝜇𝑔 − 𝑘𝑑
𝜇𝑔 = 𝑇𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 (ℎ−1 )
𝑘𝑑 = Tasa de pérdida de muerte, masa o metabolismo endogeno (ℎ−1 )
El crecimiento microbiano también se puede describir en términos de
concentración de número de células, N, como así como X. En ese caso:
1 𝑑𝑁
𝜇𝑅 =
𝑁 𝑑𝑡
Donde:
𝑁= Concentración de masa celular (g/L)
𝑡 = Tiempo (h)
𝜇𝑅 = Tasa de replicación específica neta (ℎ−1 ).
Crecimiento en Batch
El crecimiento por lotes se refiere al cultivo de células en
un recipiente con una carga inicial de medio que no se
altera por la adición o eliminación de nutrientes
adicionales. Esta forma de cultivo es sencilla y
Ampliamente utilizado tanto en el laboratorio como
industrialmente.
Cuantificación de la concentración
celular
La cuantificación de la concentración celular en un
medio de cultivo es fundamental para la determinación
de la cinética y estequiometría del crecimiento
microbiano.
Los métodos utilizados en la cuantificación de la
concentración celular se pueden clasificar en dos
categorías: directos e indirectos.
En muchos casos, los métodos directos no son viables debido
a la presencia de sólidos en suspensión con otros compuestos
que interfieren en el medio.
Se puede cuantificar el número de celdas o la masa de celdas
según el tipo de información necesaria y las propiedades del
sistema.
La concentración celular de masa a menudo se refiere a la
medición de la densidad del número de células cuando solo se
mide uno, pero la combinación de las dos medidas suele ser
indeseable.
Patrones de crecimiento y cinética por
cultivo tipo Batch
Cuando se inocula un medio nutritivo líquido con un cultivo de
semillas, los organismos toman selectivamente los nutrientes
disueltos del medio y los convierten en biomasa. Una curva de
crecimiento por lotes típica incluye las siguientes fases:
o Fase de retraso
oFase de crecimiento exponencial
oFase de desaceleración,
oFase estacionaria
oFase de muerte.
Fase de latencia
Los microorganismos reorganizan sus constituyentes moleculares cuando se transfieren a un nuevo medio.
Dependiendo de la composición de nutrientes, nuevos se sintetizan enzimas, se reprime la síntesis de
algunas otras enzimas y la maquinaria interna de las células se adapta a las nuevas condiciones
ambientales.
Estos cambios reflejan los mecanismos intracelulares para la regulación de los procesos metabólicos la
masa celular puede aumentar un poco, sin un aumento en la célula densidad numérica.
Cuando el inóculo es pequeño y tiene una fracción baja de células viables, puede haber una fase de
pseudoretraso, que es el resultado, no de la adaptación, sino del tamaño pequeño del oculo o de las malas
condiciones del inóculo.
Fase de latencia
La baja concentración de algunos nutrientes y factores de crecimiento
también puede causar un retraso prolongado fase.
La edad del cultivo del inóculo tiene un fuerte efecto sobre la duración de la
fase de latencia. La edad se refiere a cuánto tiempo se ha mantenido un
cultivo en un cultivo por lotes.
Para minimizar la duración de la fase de retraso, las células deben adaptarse
al medio de crecimiento y las condiciones antes de la inoculación, y las células
deben ser jóvenes (o células en fase exponencial) y activas, y el tamaño del
inóculo debe ser grande (5% a 10% por volumen)
Fase exponencial o log
La fase de crecimiento exponencial también se conoce como
fase de crecimiento logarítmico.
En esta fase, las células se han ajustado a su nuevo entorno.
Después de este período de adaptación, las células pueden
multiplicarse rápidamente y la masa celular y la densidad del
número de células aumentan exponencialmente. con tiempo.
Este es un período de crecimiento equilibrado, en el que
todos los componentes de una célula crecen al mismo ritmo.
Fase exponencial o log
Durante el crecimiento equilibrado, la tasa de crecimiento
específica neta determinada a partir del número de células o
de la masa celular sería la misma.
Dado que las concentraciones de nutrientes son grandes en
esta fase, la tasa de crecimiento es independiente de la
concentración de nutrientes. La tasa de crecimiento
exponencial es de primer orden.
De manera similar, podemos calcular un tiempo de duplicación basado en el número de celdas y la tasa de
replicación específica neta
𝑡𝑑 =
ln 2
𝜇𝑅
𝑡𝑑 = Tiempo de duplicación basado en la tasa de replicación.
Fase de desacelaración
La fase de crecimiento de desaceleración sigue a la fase
exponencial. En esta fase, el crecimiento se desacelera debido al
agotamiento de uno o más nutrientes esenciales a la acumulación
de subproductos tóxicos del crecimiento.
Para un cultivo bacteriano típico, estos cambios ocurren durante
un periodo de tiempo muy corto. El entorno rápidamente
cambiante da como resultado un crecimiento desequilibrado.
Fase estacionaria
La fase estacionaria comienza al final de la fase de desaceleración,
cuando la red La tasa de crecimiento es cero (sin división celular) o
cuando la tasa de crecimiento es igual a la tasa de mortalidad.
A pesar de que la tasa de crecimiento neta es cero durante la fase
estacionaria, las células siguen siendo metabólicas activas y producen
metabolitos secundarios.
La producción de Ciertos metabolitos se mejora durante la fase
estacionaria (por ejemplo, antibióticos, algunos monos hor) debido a la
desregulación del metabolito
Durante la fase estacionaria
I.
La concentración total de masa celular puede permanecer constante, pero
el número de células viables puede disminuir.
II.
La lisis celular puede ocurrir y la masa celular viable puede caer. Una
segunda fase de crecimiento puede ocurrir y las células pueden crecer en
productos de lisis de células lisadas (crecimiento críptico).
III.
Las células pueden no estar creciendo, pero pueden tener un
metabolismo activo para producir secundaria metabolitos.
Fase estacionaria
Durante la fase estacionaria, la celda cataboliza las reservas celulares
para nuevos bloques de construcción y para monómeros productores de
energía.
Esto se llama metabolismo endógeno. La célula siempre debe gastar
energía para mantener una membrana energizada (es decir, protonesmotivo fuerza) y transporte de nutrientes y para funciones metabólicas
esenciales como la motilidad y Reparación de daños a estructuras
celulares.
La ecuación apropiada para describir la conversión de la masa celular en mantenimiento
La energía o la pérdida de masa celular debido a la lisis celular durante la fase
estacionaria es:
𝑋 = 𝑋𝑆𝑂 𝑒
−𝑘𝑑𝑡
𝑘𝑑 = Velocidad de primer orden constante para el metabolismo endogéneo.
𝑋𝑠𝑜 = Concentración de masa al comienzo de la fase estacionaria.
Debido a que S es cero, 𝜇𝑔 es cero en la fase estacionaria.
Fase estacionaria
El motivo de la interrupción del crecimiento puede ser
el agotamiento de un nutriente esencial o la acumulación
de productos tóxicos.
Si se produce un producto inhibidor y se acumula en el
medio, la tasa de crecimiento disminuirá, dependiendo
de la producción del inhibidor ya un cierto nivel de
concentración de inhibidor, el crecimiento se detendrá.
Ejemplo
La producción de etanol por la levadura es
un ejemplo de fermentación en la que el
producto inhibe el crecimiento.
La dilución de medio toxico, por la adición
de un compuesto químico no metabolizable
con la toxina, o la eliminación simultánea de
la toxina aliviaría los efectos adversos de la
toxina y así mismo producir un mayor
crecimiento.
Fase de muerte
La muerte celular puede comenzar durante la fase
estacionaria, y una clara demarcación entre estos dos fases
no siempre es posible.
A menudo, las células muertas se lisan y los nutrientes
intracelulares liberados en el medio son utilizados por los
organismos vivos durante la fase estacionaria.
Al final de la fase estacionaria, debido al agotamiento de
los nutrientes o a la acumulación de productos tóxicos,
comienza la fase de muerte.
La tasa de muerte suele seguir una cinética de primer orden:
N = 𝑁𝑆 𝑒
−𝑘′𝑑𝑡
Ns= Concentración de células al final de la fase estacionaria.
k’d= Tasa de mortalidad de primer orden.
Fase de muerte
En la fase de muerte, las células pueden lisarse o
no, y el restablecimiento del cultivo puede ser
posible en la fase de muerte temprana si las células
se transfieren a un medio rico en nutrientes.
Tanto en la fase de muerte como en la
estacionaria, es importante reconocer que existe
una distribución de propiedades entre los
individuos de una población. Con una distribución
estrecha, la muerte celular ocurrirá casi
simultáneamente.
La cinética de crecimiento, definimos algunos parámetros relacionados estequiométricamente. Los
coeficientes de rendimiento se definen en función de la cantidad de consumo de otro material. Por
ejemplo, el rendimiento de crecimiento en una fermentación es:
∆𝑋
𝑌𝑥/𝑠 =
∆𝑆
En el apartado de cultivo continuo diferenciaremos entre el rendimiento de crecimiento real (que es
constante) y el rendimiento aparente. Pueden definirse coeficientes de rendimiento basados en otros
sustratos o en la formación de productos; por ejemplo:
∆𝑃
𝑌𝑃/𝑠 =
∆𝑆
∆𝑋
𝑌𝑋/𝑂2 =
∆ 𝑂2
Para los organismos que crecen aeróbicamente con glucosa, el Y x/s suele ser de 0,4 a 0,6 g/g para la mayoría de
las levaduras y bacterias, mientras que el Y X/O2 es de 0,9 a 1,4 g/g. El crecimiento anaeróbico es menos eficiente
y el coeficiente de rendimiento se reduce sustancialmente.
 Durante la fase estacionaria, en la que hay poco
sustrato externo disponible, el metabolismo
endógeno de los componentes de la biomasa se
utiliza como energía de mantenimiento.
 El mantenimiento celular representa los gastos de
energía para reparar los componentes celulares
dañados, para transferir algunos nutrientes y
productos dentro y fuera de las células, para la
motilidad y para ajustar la osmolaridad del
volumen interior de las células.
 Las tasas específicas se utilizan para comparar la
eficacia de varios esquemas de fermentación y
biocatalizadores.
Los productos microbianos se pueden
clasificar en 3 categorías:
1. Los productos asociados al crecimiento se producen simultáneamente con el
crecimiento microbiano. La tasa específica de formación del producto es
proporcional a la tasa específica de crecimiento µg. Tenga en cuenta que µ g difiere
de µ net, la tasa de crecimiento específica neta, cuando es endógena a el
metabolismo es distinto de cero.
𝑞𝑝 = 𝑌𝑝/𝑠 𝜇𝑔
2. La formación de productos no asociados al crecimiento tiene lugar durante la fase
estacionaria cuando la tasa de crecimiento es cero. La tasa específica de formación del producto
es constante.
𝑞𝑝 = 𝛽 = 𝐶𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒
Algunos metabolitos secundarios (antibióticos).
3. La formación de productos asociados al crecimiento mixto tiene lugar durante las fases
estacionaria y de crecimiento lento. En este caso, la tasa específica de formación del producto
viene dada por la siguiente ecuación:
𝑞𝑝 = α 𝜇𝑔 + 𝛽
Un ejemplo de la ecuación anterior:
La fermentación del ácido láctico, la goma
xantana y algunos metabolitos secundarios
del cultivo celular son ejemplos de productos
asociados al crecimiento mixto.
Ecuación de Luedeking-Piret. Si a = 0, el
producto solo no está asociado al crecimiento,
y si b = 0, el producto estaría solo asociado al
crecimiento y, en consecuencia, a sería
entonces igual a Y P/X
a) Formación de productos asociados al crecimiento.
b) Formación de productos asociados al crecimiento mixto.
c) Formación de productos no asociados al crecimiento
Ejercicio
Se cultivó una cepa de moho en un cultivo discontinuo en glucosa y se obtuvieron los
siguientes datos:
Tiempo
(h)
Concentració
n cellar (g/L)
Concentración
de glucosa
(g/L)
0
1.25
100
9
2.45
97
16
5.1
90.4
23
10.5
76.9
30
22
48.1
34
33
20.6
36
37.5
9.38
40
41
0.63
a) Calcule la tasa de crecimiento específica neta
máxima.
b) Calcular el rendimiento de crecimiento
aparente.
c) ¿Qué concentración celular máxima se podría
esperar si se usaran 150 g de glucosa con el
mismo tamaño de inóculo?
Resolución
A) 𝜇𝑛𝑒𝑡 =
𝜇𝑛𝑒𝑡 =
120
ln 𝑥2 − 𝑙𝑛𝑥1
𝑡2
𝑡1
ln 37.5 −ln 5.1
36−16
FERMENTACIÓN BATCH
= 0.1 h -1
No se toma en
cuenta la fase de
adaptación, ni la
fase de muerte
Tiempo
(h)
Concentració
n cellar (g/L)
Concentración
de glucosa
(g/L)
0
1.25
100
9
2.45
97
16
5.1
90.4
23
10.5
76.9
30
22
48.1
34
33
20.6
36
37.5
9.38
40
41
0.63
100
80
60
40
20
0
0
9
16
23
30
Concentración de
glucosa
34
36
Para el rendimiento de
masa y sustrato se
toman todas las fases
B) 𝑌𝑥/𝑠 =
𝑌𝑥/𝑠 =
∆𝑋
∆𝑆
41 −1.25
0.625 −100
=
0.4 g células/ g de sustrato
C) 𝑥𝑚𝑎𝑥 = 𝑋𝑜 𝑌𝑆0
𝑥𝑚𝑎𝑥 = 1.25 + 0.4(150) =
60.25 g de células/ L
Tiempo
(h)
Concentració
n cellar (g/L)
Concentración
de glucosa
(g/L)
0
1.25
100
9
2.45
97
16
5.1
90.4
23
10.5
76.9
30
22
48.1
34
33
20.6
36
37.5
9.38
40
41
0.63
FERMENTACIÓN BATCH
120
100
80
60
40
20
0
0
9
16 23 30
Concentración de
glucosa
34
36
Ejercicio en clase:
Se cultivó una cepa de S. cervessace en un cultivo discontinuo utilizando fructosa para la
producción de etanol y se obtuvieron los siguientes datos:
a) Grafica la curva de X/S
b) Calcule la tasa de crecimiento específica neta
máxima.
c) Calcular el rendimiento de crecimiento aparente.
d) ¿Qué concentración celular máxima se podría
esperar si se usaran 300 g de fructosa con el mismo
tamaño de inóculo?
e) Calcula la formación P/S y graficalos.
Tiempo
(h)
Concentración
cellar (g/L)
Concentració
n de fructosa
(g/L)
Formación
de etanol
(g/L)
0
0.25
200
0.3
5
0.75
193
4.5
15
6
150
10.5
25
8.56
115
47
30
13.4
107
69
35
25
99
100
40
27
60
130
45
30
35
146
50
25.4
13.2
167
CUANTIFICACIÓN Y
CRECIMIENTO CINÉTICO
Crecimiento limitado por el sustrato en
BATCH
Una sola especie química, S, limita la tasa de
crecimiento.
Estas cinéticas son similares a las de LangmuirHinshelwood (o Hougen-Watson) cinética en
cinética química tradicional o cinética de
Michaelis-Menten para reacciones enzimáticas.
Cuando se aplica a los sistemas celulares, esta
cinética puede ser descrita por la ecuación de
Monod:
𝜇𝑔 =
𝜇𝑚 𝑆
𝐾𝑠 +𝑆
𝜇𝑔 = Tasa máxima de crecimiento específico cuando S >> Ks.
Ks= Constante de saturación o constante de velocidad media.
La ecuación de Monod se ajusta empíricamente a
una amplia gama de datos satisfactoriamente y es el
modelo de crecimiento microbiano no estructurado y
no segregado más comúnmente aplicado.
La ecuación de Monod describe el crecimiento
limitado por sustrato solo cuando el crecimiento es
lento y la densidad de población es baja.
Modelos con inhibidores de crecimiento en BATCH
El patrón de inhibición del
crecimiento
microbiano
es
análogo a la inhibición enzimática.
Si una reacción catalizada por
una enzima de un solo sustrato es
el paso limitante de la velocidad
en el crecimiento microbiano,
entonces las constantes cinéticas
en la expresión de la velocidad
son biológicamente significativas.
1. Inhibición por sustrato
A altas concentraciones de sustrato, el sustrato
inhibe la tasa de crecimiento microbiano.
Al igual que en la cinética enzimática, la inhibición
del crecimiento por sustrato puede ser competitiva o
no competitiva.
Si una reacción catalizada por una enzima de un solo
sustrato es el paso limitante de la velocidad en el
crecimiento microbiano, entonces la inhibición de la
actividad enzimática da como resultado la inhibición
de crecimiento microbiano por el mismo patrón.
2. Inhibición por el producto
Las altas concentraciones de producto pueden inhibir el
crecimiento microbiano.
La inhibición del producto puede ser competitiva o no
competitiva y, en algunos casos, cuando se desconoce el
mecanismo subyacente, la tasa de crecimiento inhibida
se aproxima expresiones de decaimiento exponencial o
lineal.
3. Inhibición por
compuestos tóxicos
Las siguientes expresiones de velocidad se
utilizan para la inhibición competitiva, no
competitiva y no competitiva del
crecimiento en analogía con la inhibición
enzimática.
Inhibición no competitiva
Inhibición competitiva
COMO CRECEN LAS CELULAS
EN CULTIVO CONTINUO
Cultivo continuo
En un cultivo continuo, se suministra continuamente
medio nutritivo fresco a un cultivo bien agitado y los
productos y las células se retiran simultáneamente.
El crecimiento y la formación de productos se pueden
mantener durante períodos prolongados en cultivo
continuo. Después de un cierto período de tiempo, el
sistema generalmente alcanza un estado estable donde las
concentraciones de células, productos y sustratos
permanecer constante.
El cultivo continuo proporciona condiciones ambientales
constantes para el crecimiento y la formación de productos
y suministra un producto de calidad uniforme.
Algunos dispositivos específicos de cultivo continuo
Los principales tipos de dispositivos de cultivo continuo son el quimiostato y el turbidostato,
aunque se utilizan reactores de flujo pistón (PFR).
Quimiostato = Químico constante
Tubidiostato= Densidad constante
QUIMIOSTATO
TURBIDIOSTATO
QUIMIOSTATO
oEl nombre quimiostato se refiere a un
entorno químico constante.
oSon los mas utilizados porque son
dinámicos.
TURBIDIOSTATO
oEL turbidostato mantiene la concentración de
células en el recipiente de cultivo se mantiene
constante al monitorear la D.O del cultivo y
controlar la tasa de flujo de alimentación.
oEs mas elaborado que el quimiostato.
oCasi no se utilizan
oLos turbidostatos pueden ser muy útiles para
seleccionar subpoblaciones capaces de
soportar un estrés ambiental deseado.
El quimiostato ideal
Es lo mismo que un reactor de tanque
agitado de flujo continuo perfectamente
mezclado (CFSTR).
 La mayoría de los quimiostatos requieren
algunos elementos de control, como
unidades de control de oxígeno disuelto y pH,
para ser útiles.
Se alimenta medio estéril fresco a la mezcla
completamentey reactor aireado (si es
necesario), y la suspensión de células se
elimina a la misma velocidad.
Quimiostato
Un balance de materia sobre la concentración
celular alrededor del quimiostato produce:
F= Caudal de solución nutritiva (L/h)
VR= Volumen de cultivo (L)
X= Concentración celular (g/L)
𝜇g y kd = Tasa de crecimiento y endógenas
constantes (h-1).
Es un sistema en el que se alimenta en forma continua
el reactor con medio fresco y del cuál se retira en forma
continua un volumen igual de medio de cultivo agotado,
junto con el (o los) productos de reacción.
Es un sistema en el que se alimenta en forma continua
el reactor con medio fresco y del cuál se retira en forma
continua un volumen igual de medio de cultivo agotado,
junto con el (o los) productos de reacción
El cultivo continuo opera con bajas concentraciones
de nutriente limitante, es decir en la zona de cultivos
restrictos (recordar Monod).
Las células adaptan su velocidad de crecimiento a la
concentración del sustrato limitante (s).
Antes de iniciar un cultivo continuo, se debe realizar previamente un
cultivo batch para tener una cierta concentración de microorganismos.
Luego se comienza a alimentarcon medio fresco a un caudal Fy por un
rebalse se mantiene V constante.
Los microorganismos dentrodel biorreactor se están multiplicando, esto
compensa las “pérdidas” debida a los microorganismos que son
arrastradosfuera del biorreactor por el caudal de salida.
REFERENCIAS
https://studylib.es/doc/8870920/clase-7---cultivo-continuo