Secuenciación Sanger Diapositiva 2. • A finales de la década de 1970, los investigadores desarrollaron varias estrategias para determinar, de forma sencilla y rápida, la secuencia de nucleótidos de cualquier fragmento de ADN purificado. Diapositiva 3. • • La que se convirtió en la más utilizada se denomina secuenciación dideoxídica o secuenciación de Sanger. Se trata de una técnica desarrollada por el bioquímico británico Frederick Sanger. Diapositiva 4. • El método es una forma de secuenciar una secuencia de ADN. • Este método se utilizó para determinar la secuencia de nucleótidos de muchos genomas, incluidos los de E. coli, moscas de la fruta, gusanos nematodos, ratones y seres humanos. Diapositiva 5. • El método se basa en la acción de las ADN polimerasas. • Capaces de unirse a una cadena de ADN a la que se le haya unido un fragmento corto de ADN complementario (cebador) previamente e ir añadiendo nucleótidos. Diapositiva 6. • De este modo, a partir de una cadena simple, podemos obtener una doble cadena. Este proceso que ocurre de forma natural en nuestras células es el que ocurre también en la secuenciación de Sanger, Diapositiva 7. • salvo por un ingenioso detalle: la presencia de didesoxinucleótidos. Cuando una polimerasa inserta un didesoxinucleótido, la síntesis de la nueva cadena se detiene. Diapositiva 8. ¿Qué se necesita para el método de Sanger? • Para secuenciar una molécula de ADN mediante el método de Sanger clásico, es necesario disponer de los siguientes elementos: Diapositiva 9. ADN a secuenciar Diapositiva 10. ADN polimerasa Diapositiva 11. • Primer o cebador (una secuencia de ADN que servirá como base para comenzar la síntesis de ADN) Diapositiva 12. • Nucleótidos (A, T, C y G). Uno de ellos, marcado radiactivamente. Diapositiva 13. • Didesoxinucleótidos (ddA, ddT, ddG y ddC), desoxirribonucleótidos con una pequeña modificación en el grupo unido al carbono 3 de la ribosa. Diapositiva 14. • utiliza ADN polimerasa, junto con nucleótidos especiales de terminación de cadena llamados dideoxirribonucleósido trifosfatos (izquierda), para hacer copias parciales del fragmento de ADN que se va a secuenciar. Diapositiva 15. • Estos ddNTP son derivados de los desoxirribonucleósidos trifosfatos normales que carecen del grupo hidroxilo 3′. Cuando se incorporan a una cadena de ADN en crecimiento, bloquean su elongación. Diapositiva 16. El método de Sanger original paso a paso Diapositiva 17. • 1. Amplificación del ADN • Lo primero que hay que hacer para secuenciar una molécula por el método de Sanger es amplificar el ADN que queremos estudiar. Esto servirá para obtener muchas copias del fragmento que queremos analizar. • Actualmente lo que se hace es amplificar el ADN mediante una PCR. Diapositiva 18. • 2. Preparación de la muestra • El segundo paso es añadir el ADN amplificado a las 4 reacciones independientes que se han de preparar, cada una de ellas con: • Una ADN polimerasa • Un primer específico • Uno de los cuatro tipos de nucleótidos (A, C, T y G) marcado radiactivamente • El resto de nucleótidos no marcados • En cada una de las disoluciones añadiremos una pequeña cantidad de un solo tipo de didesoxinucleótido. Diapositiva 19. • 3. Acción de la ADN polimerasa • El siguiente paso será propiciar la síntesis de nuevas cadenas de ADN a partir de las dobles cadenas problema, amplificadas en pasos anteriores. Para ello, se aumenta la temperatura de las reacciones, lo que provoca la separación de las dos cadenas del ADN del que queremos conocer la secuencia. Luego dejaremos enfriar para favorecer la unión de los primers o cebadores. Diapositiva 20. • Una vez unido el cebador, comenzará la reacción de la ADN polimerasa, que irá añadiendo nucleótidos marcados, hasta que inserte un didesoxinucleótido, se detenga la síntesis y la nueva cadena se suelte. Entonces, la ADN polimerasa empieza de nuevo. De este modo, en cada una de las reacciones obtendremos fragmentos de diferentes tamaños, acabados en el didesoxinucleótido que hayamos empleado en ellas. Diapositiva 21. • 4. Electroforesis • Tras la actuación de la ADN polimerasa, el resultado de cada una de las cuatro reacciones se somete a una electroforesis. • Una electroforesis consiste en colocar una mezcla de moléculas con diferente tamaño y/o carga eléctrica en un “filtro” o soporte poroso, que puede ser en un gel. Este filtro se introduce en una solución y se somete a un campo eléctrico. De este modo, las moléculas se moverán por bandas más o menos rápido por el filtro según su carga y tamaño. Por ejemplo, el ADN, que tiene carga negativa, migrará hacia el polo positivo. Diapositiva 22. • Combinando la información de las cuatro electroforesis, podemos establecer el orden de la cadena complementaria a la que estamos estudiando. Luego, solo hay que cambiar las bases por sus complementarias y ya tendríamos las dos. Diapositiva 23. Secuenciación Sanger por electroforesis capilar Diapositiva 24. • Sanger elaboró un buen método para secuenciar el ADN de un organismo. Sin embargo, todavía tenía muchas cosas por pulir. Afortunadamente, las técnicas de electroforesis capilar y su automatización favorecieron modificaciones en el método de Sanger que perduran hasta el día de hoy: Diapositiva 25. • se dejó de utilizar nucleótidos radiactivos y se añadieron marcadores fluorescentes a los didesoxinucleótidos (cada uno de ellos de un color diferente). Desde luego, una técnica más visual y muchísimo más práctico, porque podemos visualizar los resultados en un único gel y con una sola reacción. De este modo, lo que antes veíamos como en la figura anterior, se puede ver como en esta figura. ¡Mucho más ordenado y vistoso! Diapositiva 26. SECUENCIACIÓN DIDEOXI MANUAL Diapositiva 27. • Para determinar la secuencia completa de un fragmento de ADN monocatenario (gris), primero se hibrida el ADN con un cebador de ADN corto (naranja) marcado con un colorante fluorescente o un radioisótopo. Diapositiva 28. • La ADN polimerasa y un exceso de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos normales (azul A, C, G o T) se añaden al ADN cebado, que a continuación se divide en cuatro tubos de reacción. Diapositiva 29. • Cada uno de estos tubos recibe una pequeña cantidad de un único dideoxirribonucleósido trifosfato terminador de cadena (rojo A, C, G o T). Diapositiva 30. • Dado que éstos se incorporarán sólo ocasionalmente, cada reacción produce un conjunto de copias de ADN que terminan en diferentes puntos de la secuencia. Diapositiva 31. • Los productos de estas cuatro reacciones se separan por electroforesis en cuatro carriles paralelos de un gel de poliacrilamida (etiquetados aquí A, T, C y G). Diapositiva 32. • En cada carril, las bandas representan fragmentos que han terminado en un nucleótido dado pero en diferentes posiciones en el ADN. Diapositiva 33. • Leyendo las bandas en orden, empezando por la parte inferior del gel y leyendo a lo largo de todos los carriles, se puede determinar la secuencia de ADN de la cadena recién sintetizada • * Aquí se muestran los resultados de una reacción de secuenciación dideoxi. De izquierda a derecha, las bandas en los cuatro carriles se produjeron añadiendo nucleótidos G, A, T y C encadenados. Las moléculas de ADN se marcaron con 32P, y la imagen que se muestra se produjo colocando una película fotográfica sobre el gel y dejando que el 32P expusiera la película, produciendo las bandas oscuras que se observan al revelar la película.* Diapositiva 34. • La secuencia, que aparece en la flecha verde a la derecha del gel, es complementaria a la secuencia del ADN monocatenario gris original. Diapositiva 35. SECUENCIACIÓN DIDEOXI AUTOMATIZADA Diapositiva 36. • Las máquinas totalmente automatizadas pueden realizar reacciones de secuenciación dideoxídica. (A) El método automatizado utiliza una cantidad excesiva de dNTPs normales más una mezcla de cuatro ddNTPs de terminación de cadena diferentes, cada uno de los cuales está marcado con una etiqueta fluorescente de un color diferente. Diapositiva 37. • Los productos de la reacción se cargan en un gel capilar largo y fino y se separan por electroforesis. Diapositiva 38. • Una cámara (no mostrada) lee el color de cada banda a medida que se desplaza por el gel y transmite los datos a un ordenador que ensambla la secuencia. Diapositiva 39. • (B) Una pequeña parte de los datos de este tipo de secuenciación automatizada. Cada pico de color representa un nucleótido de la secuencia de ADN. Diapositiva 40. Aplicaciones de la secuenciación de Sanger Diapositiva 41. • La secuenciación de didesoxinucleótidos fue un bombazo científico en la década de los 70, que impulsó la creación de proyectos tan importantes como el Proyecto Genoma Humano, que empezaba a “cocinarse” como una posibilidad entre los científicos de todo el mundo. Después de unos años, en los años 90, comenzó formalmente este proyecto, gracias al avance en este tipo de técnicas de secuenciación y a la aparición de la PCR. Diapositiva 42. • Actualmente la secuenciación de Sanger sigue utilizándose en los laboratorios, pero tiene sus limitaciones. Por ello, se han desarrollado diferentes técnicas de secuenciación de nueva generación, mucho más rápidas y económicas.
