Manual de práctica de Bioquímica-2023-2

Manual de Práctica de Bioquímica
Manual de Práctica
CURSO
BIOQUÍMICA
1
Manual de Práctica de Bioquímica
CONTENIDO
Pág.
Introducción
3
Normas generales para el curso
4
Normas para el estudiante del curso de bioquímica en la
Presencialidad
5
Práctica 1. Espectrofotometría
9
Práctica 2. Determinación de proteínas totales y fraccionadas
15
Práctica 3. Técnicas de degradación de proteínas
20
Práctica 4. Factores que afectan la actividad enzimática
24
Práctica 5. Determinación de urea
31
Práctica 6. Técnicas básicas de identificación de biomoléculas
35
Práctica 7. Concentración de glucosa en condiciones de ayuno
y de alimentación por 24 h
43
Práctica 8. Cálculo del balance energético
47
Práctica 9. Digestión enzimática del almidón
57
Práctica 10. Hidrólisis de lípidos
63
Práctica 11. Determinación de triglicéridos y colesterol
en plasma: Perfil lipídico mínimo
67
Práctica 12. Extracción de pigmentos vegetales y aceites esenciales
74
Práctica 13. Método de Extracción del ADN
79
2
Manual de Práctica de Bioquímica
Introducción
La Bioquímica es una ciencia que se caracteriza por estudiar los componentes
(reactantes, enzimas y/ o producto), estructuras y regulaciones de rutas metabólicas
catabólicas, anabólicas y anfibólicas que se desarrollan en los seres vivos a partir de
las biomoléculas como proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos con la
finalidad de entender los mecanismos moleculares que ocurren a nivel celular.
La enseñanza de la bioquímica es teórico-práctica, los conocimientos a nivel práctico
se adquieren a partir de actividades experimentales llevadas a cabo en el laboratorio,
en donde, se desarrollan diferentes procedimientos técnicos, con la finalidad de que el
estudiante complemente conocimientos, genere habilidades y destrezas en la
manipulación de materiales, equipos e instrumental de laboratorio, incentivando la
adquisición de los hábitos del método científico -observando los fenómenos que
ocurren en los ensayos respectivos y tomando datos necesarios para obtener
resultados y conclusiones confiables.
Bioquímica como curso básico que se imparte a los estudiantes de las diferentes
Facultades de la Universidad Científica del Sur ha realizado la “GUIA DE
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA” como herramienta de estudio en donde se
describen las actividades prácticas que se llevan a cabo durante el semestre.
Los Autores
3
Manual de Práctica de Bioquímica
NORMAS GENERALES PARA EL ESTUDIANTE DEL CURSO DE
BIOQUÍMICA
1. Llegar puntual a las prácticas (tolerancia 5 minutos).
2. Leer con anticipación la práctica a realizar.
3. Cada sesión de Laboratorio genera un informe; el que será entregado en
la siguiente práctica en su respectivo horario. Es la única fecha y la
entrega es de carácter obligatorio. El informe se debe desarrollar de
acuerdo con formato que se encuentra al final de cada práctica descrita
en el manual de práctica del curso.
4. La inasistencia injustificada a cualquier práctica impide al alumno la
presentación del informe correspondiente y por lo tanto tendrá la nota
mínima de cero.
5. El alumno con inasistencia justificada deberá recuperar la práctica
durante la misma semana para lo que recabará de su profesor de
prácticas el formato de autorización correspondiente.
4
Manual de Práctica de Bioquímica
NORMAS PARA EL ESTUDIANTE DEL CURSO DE BIOQUÍMICA EN
LA PRESENCIALIDAD
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
a) Higiene personal
1. Queda terminantemente prohibido fumar, comer y/o beber durante las
prácticas en el laboratorio. Así mismo el uso de celulares y otros equipos
electrónicos.
2. Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez
que se sospecha que ha estado en contacto con algún material
contaminado.
3. Al entrar en contacto la piel con ácidos o bases fuertes, lavarse
inmediatamente con abundante agua. Para el caso de ácidos aplicarse
una solución saturada de bicarbonato, para las basesutilice una solución
al 5% de ácido acético (vinagre).
4. Para quemaduras leves el área afectada se debe aplicar inmediatamente
una crema de picrato de Butesín.
5. Mantener limpio el área de trabajo. Al derramar alguna sustancia limpiar
inmediatamente. Al final de la práctica dejar todo el material limpio y
ordenado.
b) Comportamiento de los alumnos durante las prácticas
1. Está terminantemente prohibido ingresar a l Laboratorio mochilas,
carteras o bolsos, teléfono celular, animales domésticos, etc.
2. Una vez que el alumno haya ingresado al laboratorio no puedesalir por
ningún motivo.
3. El trabajo con sustancias volátiles se debe realizar haciendo uso de la
campana extractora.
4. Para diluir ácidos, siempre se debe agregar los ácidos al agua, y no en
sentido contrario.
5. Cuidar como propio todo bien que encuentre o utilice en el laboratorio.
El alumno es responsable de los materiales asignados para el desarrollo
de la práctica, el deterioro implicasu reposición obligatoria.
6. El manejo de materiales, reactivos y el desarrollo de los
5
Manual de Práctica de Bioquímica
experimentos sólo se realizan con autorización del profesor. Los
experimentos no autorizados están prohibidos.
7. Observar cuidadosamente que los frascos con reactivos estén
etiquetados indicando el contenido y la concentración respectiva, antes
de ser usados.
8. Obtener las sustancias químicas de los frascos de reactivos, en un vaso
de precipitados o en un tubo de ensayos
limpio, cuidando de
no usar cantidades mayores que las necesarias, está terminantemente
prohibido regresarsustancia alguna no utilizada al frasco original.
9. Al encender el mechero Bunsen, primero encender el fósforoy luego
abrir la llave de gas.
c) Eliminación de residuos
1. Los desechos sólidos, líquidos y las sales solubles, deben ser
depositados en los recipientes indicados por el profesor para su posterior
tratamiento.
2. Todo desperdicio de papel o residuo sólido debe dirigirse al respectivo
recipiente de basura situados en ambas paredes laterales de cada
Laboratorio
3. No se debe arrojar residuos sólidos al
lavadero.
2. ELEMENTOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y DE LOS EQUIPOS
a) Mandil
1. Para cada sesión de prácticas el estudiante debe llevar un mandil
(guardapolvo), el cual es de carácter obligatorio. Cuando el experimento
lo amerite, los estudiantes usarán lentes de seguridad industrial tipo
MERCK.
2. Los estudiantes vestirán sus mandiles antes de ingresar al Laboratorio y
dejarán de vestirlos a la finalización de las actividades correspondientes.
b) Lentes de seguridad y respiradores
1. Se debe usar lentes de seguridad cuando sea necesario proteger la cara
de salpicaduras y/o sustancias corrosivas. Igualmente se utilizará
respiradores cuando sea necesario. Enambos casos el estudiante tiene
a su disposición estos materiales y los solicitará al responsable del
laboratorio.
6
Manual de Práctica de Bioquímica
2. En la parte lateral central del Laboratorio se encuentra la duchaespañola,
la que será usada para casos de salpicaduras o derrames en el cuerpo
de la víctima con sustancias ácidas, básicas o corrosivas. Así mismo a la
entrada parte izquierda se encuentra un kit lavador de ojos que se
aplicará directamente al ojo de la víctima en caso de salpicadura de
alguna sustanciadañina al ojo.
c) Extinguidores contraincendios
1. El alumno debe conocer el uso y la ubicación de los extintorescontra
incendios que en caso de emergencia se descolgará de la pared con
cuidado. El extintor, en la parte superior tiene una palanca circular que
se saca (se tira) para activar y se presiona la manija con la mano derecha
y con la mano izquierda se coge la manguera la cual se orientará hacia
la fuente de peligro.
2. En el caso de incendiarse la ropa de una persona, se deberá pedir ayuda
inmediatamente, se debe estirar en el piso y rodar sobre sí mismo para
apagar las llamas. No se recomienda utilizar el extintor sobre el cuerpo
o rostro de una persona.
7
Manual de Práctica de Bioquímica
d) Botiquín de primeros auxilios
1. Existe un botiquín perfectamente identificado y de fácil accesocono los
elementos necesarios para prestar primeros auxilios en el laboratorio.
2. Será responsabilidad de todos los usuarios del laboratorio conocer la
ubicación y el uso del botiquín y de los elementos de protección personal.
3. TOMA DE DATOS
1. Manipular con habilidad, criterio y en forma adecuada los diferentes
materiales de laboratorio.
2. Desarrollar los experimentos en forma ordenada y con mucha
responsabilidad.
3. Observar con mucho cuidado los fenómenos que ocurren durante el
desarrollo de los experimentos.
4. Realizar las mediciones con precisión y efectuar las anotaciones
pertinentes, para obtener resultados satisfactorios disminuyendo el
margen de error. “un error mínimo al principio puede ser máximo al
final” (Aristóteles).
5. Todo alumno deberá contar con una calculadora personal que contenga
como mínimo funciones de potencia y logaritmo. No se permitirá usar
celulares como calculadora personal.
8
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°1
ESPECTROFOTOMETRÍA
Logro de
aprendizaje:
-
Manipular el espectrofotómetro
-
Describir las aplicaciones del espectrofotómetro
-
Describir la ley de Lambert-Beer
-
Determina la longitud de onda óptima de la solución de
azul de metileno 1 mg/dL con una curva de espectro de
absorción
Determinar una curva de calibración, factor de calibración usando
solución de azul de metileno 1 mg/dL
-
MATERIALES
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
01 gradilla
06 tubos de ensayo 13x100 mm
01 piseta con agua destilada
02 pipeta graduada 5 mL
•
01 solución de azul de metileno 1mg/dL frasco 100 mL
II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
•
•
•
01 espectrofotómetro
04 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL
Cubetas para espectrofotometría
Puntas descartables respectivas
PROCEDIMIENTO
✓ Solución azul de metileno 1mg/dL
Pesar en la balanza analítica 1mg de azul de metilo. Mezclar 1mg/dL de azul de
metileno previamente pesados en 100 mL de agua destilada. Agitar hasta que se
disuelva completamente.
9
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N°1
EPECTROFOTOMETRÍA
Entre los diversos métodos de análisis de tipo cuantitativo que se utilizan para la
determinación de moléculas o elementos constitutivos de los organismos se encuentra la
espectrofotometría, que utiliza la medición de la intensidad de la luz transmitida y/o
absorbida, a determinada longitud de onda, por compuestos químicos en solución.
Objetivos
✓ Manipular el espectrofotómetro para obtener correctamente absorbancias de la solución
de azul de metileno 1 mg/dL.
✓ Describir las aplicaciones del espectrofotómetro.
✓ Describir la ley de Lambert-Beer.
✓ Determina la longitud de onda óptima de la solución de azul de metileno 1 mg/dL con
una curva de espectro de absorción.
✓ Determinar una curva de calibración, factor de calibración usando solución de azul de
metileno 1 mg/dL.
Fundamento teórico
El paso de un haz de luz de una longitud de onda determinada a travésde una solución es
reflejado en parte, mientras que la mayor fracción de esta es absorbida por la sustancia
disuelta. La absorción esproporcional a la concentración del soluto.
La propiedad de una sustancia para absorber radiación de una determinada longitud de
onda es dependiente de su estructura química. La ley de Lambert y Beer expresa las
relaciones antes mencionadas mediante la siguiente ecuación:
𝐿𝑜𝑔
𝐼𝑜
= 𝜀. 𝐼. 𝑐
𝐼𝑡
Io
Luz incidente
It
Luz transmitida
ɛ
Coeficiente de extensión
10
Manual de Práctica de Bioquímica
Distancia recorrida por la luz a través de
I
c
la solución
Concentración del absorbente
El log Io/It también se conoce como densidad óptica (D.O.) o absorbancia de la solución y
es directamente proporcional a la concentración del soluto.
Para determinar la concentración de una determinada sustancia puede hacerse uso del
factor de calibración o de una curva decalibración.
La preparación de una curva de calibración se realiza utilizando concentraciones conocidas
de la sustancia cuya concentración deseamos conocer. Luego se determina la absorbancia
de cada unade dichas concentraciones y se procede a preparar un gráfico, dondeen el eje
de abscisas se disponen las concentraciones de la sustanciay en el eje de ordenadas la
absorbancia.
Factor de calibración
Se define como la relación que existe entre la concentración del estándar y su respectiva
absorbancia. Este factor puede obtenerse de la siguiente manera:
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
La concentración del estándar puede expresar como: mg/dL, µg/dL, mEq/L, U/L, etc. Para
encontrar la concentración de unasustancia problema se multiplica el factor de calibración
por la absorbancia del problema, operación que se realiza de acuerdo con el siguiente
procedimiento que se aplicará en el desarrollo del experimento.
11
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LA
EXPERIENCIA PRÁCTICA
Procedimiento experimental para determinar la longitud de onda óptima de la solución
Del azul de metileno a través de un gráfico de espectro de absorción.
Para elaborar una curva de espectro de absorción realizar el siguiente procedimiento como
se describe en la tabla:
Adicionar los volúmenes de los reactivos que se describen en un
tubo de ensayo de 13 x 100 mm
1 mL
Solución de azul de metileno 1mg/dL
4 mL
Agua destilada
Para la medición de los volúmenes usar pipetas volumétricas de 5 mL con
propipetas o micropipetas de 100-100 uL
Luego, se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a las siguientes longitudes
de onda: 560, 580, 600, 620, 640, 660,
680 y 700 nm.
Graficar utilizando papel milimetrado las absorbancias en función de las longitudes de onda
y determinar el pico de máxima absorción de azul de metileno, el cual corresponde al mayor
valor de la absorbancia (ver figura 1).
Figura 1. Espectro de absorción de la solución de azul de metileno a 1mg/dL
12
Manual de Práctica de Bioquímica
Procedimiento experimental para determinar la concentración de diferentes patrones de la
solución del azul de metileno a 1 mg/dL a través de curva de calibración.
Preparar el experimento de la siguiente manera:
Preparación de soluciones patrones de diferentes concentraciones:
1. Adicionar en diferentes tubos de ensayos de 13 x 100 mm identificados con números
arábigos (1, 2, 3, 4, 5) los volúmenes de los reactivos que se describen en la tabla que
se muestra a continuación:
Reactivos
Azul de metileno
1 mg/dL (mL)
Agua destilada (mL)
1
0.5
2
1
3
2
4
3
5
4
4.5
4
3
2
1
2. Hallar la concentración de cada estándar preparados con la siguiente fórmula:
C1 x V1 = C2 x V2
C1= Concentración de la sol. de azul de metileno 1 mg/dL
V1= Volumen que se adicionó de la sol. de azul de metileno 1 mg/dL
C2= Concentración que se quiere hallar
V2= Volumen final de reacción (5 mL)
3. Adicionar en cubetas de espectrofotómetro un mL de agua destilada para ajustar el equipo
de lectura a 0 absorbancia y 100% de tramitancia a 660 nm. También, en otras 5 cubetas
agregar un mL de cada una de las soluciones patrones preparadas a la longitud de onda
descrita (660 nm).
4. Graficar en un papel milimetrado o en una hoja de cálculo de Excel los resultados de
absorbancias a 660 nm (eje Y) versus las concentraciones de los estándares (eje X). Luego
trazar una línea recta.
5. Determinar la concentración de una solución de azul de metileno que se debe preparar
2,5 mL de la solución del azul de metileno 1 mg/dL y 2,5 mL de agua destilada.
6. Utilizando la curva de calibración y el factor de calibración determinará la concentración
Absorbancia (660nm)
de la solución preparada en apartado 5.
Curva de calibración de
Azul de metileno
Factor de calibración= Concentración del estándar
Absorbancia a 660 nm
Concentraciones de estándar (mg/dL)
13
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LOS INFORMES DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE ESPECTROFOTOMETRÍA
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
14
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DE LOS INFORMES DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
15
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°2
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES Y FRACCIONADAS
Logro de
aprendizaje:
Determinar la concentración en suero de las proteínas plasmáticas totales
de albúmina y globulinas.
Interpretar los resultados obtenidos en la determinación de proteínas,
albúminas y globulinas.
MATERIALES
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
•
01 gradilla
06 tubos de ensayo 13 x 100mm
01 piseta de agua destilada
02 pipetas de 5mL
03 propipetas
II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
•
•
•
•
•
•
•
01 suero comercial
Estuche comercial para determinar proteínas totales y albúmina (01 estándar de
proteínas frasco 1mL; 01 reactivo BCF frasco 11mL; 01 reactivo EDTA/Cu frasco
11mL
Espectrofotómetro
Baño maría 37°C
04 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL
Puntas descartables para micropipetas
Cubetas para espectrofotometría
Vórtex
PROCEDIMIENTO
El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.
16
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N°2
2
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
Las proteínas plasmáticas cumplen diversas funciones que son muy importantes para un
apropiado funcionamiento de los diversos tejidos del organismo. La medición cuantitativa es
muy útil para el diagnóstico de algunas patologías como: desnutrición, deshidratación,
cirrosis, etc.
Competencias
1. Determinar la concentración de las proteínas plasmáticas total en suero sanguíneo.
2. Determinar la concentración de albúmina y globulinas en el suero sanguíneo.
3. Interpretar los resultados obtenidos en la determinación de proteínas, albúminas y globulinas.
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LAS EXPERIENCIAS
PRÁCTICAS
Determinación de proteínas plasmáticas total por el Método de Biuret
La determinación de las proteínas totales se realiza utilizando ionescúpricos que en medio
alcalino reacciona con las proteínas formando compuestos de coordinación de color violeta,
cuyo pico de máxima absorción es de 540 nm y su intensidad es proporcional a la
concentración de proteínas.
Procedimiento experimental:
1. En tres tubos de ensayo de 13 x 100 identificados B (Blanco), M (muestra), St (Estándar)
2. Adicionar los volúmenes en cada tubo de ensayo de acuerdo con lo descrito en la tabla que se muestra
a continuación:
B
M
St
Agua destilada (µL)
20
-
-
Suero o plasma (µL)
-
20
-
Estándar de proteínas (µL)
-
-
20
Reactivo EDTA/Cu (mL)
1
1
1
Incubar durante 15 minutos a 37°C y leer en el espectrofotómetroa 540 nm.
17
Manual de Práctica de Bioquímica
3. Obtenidas las absorbancias a 540 nm determinar la concentración de proteínas totales por
la fórmula de factor de calibración:
Factor de calibración= Concentración del estándar
Absorbancia a 660 nm
4. Interpretar el valor obtenido de la muestra de acuerdo con los valores de referencia
VALORES DE REFERENCIA:
Determinación de la concentración de albúmina
La albúmina reacciona con el Bromo Cresolfonftaleína a pH 3.8 formando un compuesto
coloreado que absorbe a 625 nm.
Procedimiento experimental:
1. En tres tubos de ensayo de 13 x 100 identificados B (Blanco), M (muestra), St (Estándar)
2. Adicionar los volúmenes en cada tubo de ensayo de acuerdo con lo descrito en la tabla que se
muestra a continuación:
B
M
St
Suero o plasma (µL)
-
10
-
Estándar de albúmina (µL)
-
-
10
Reactivo BCF (mL)
1
1
1
3. Colocar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente durante 10 minutos y leer en el
espectrofotómetro a 625 nm.
4. Obtenidas las absorbancias a 540 nm determinar la concentración de proteínas totales por
la fórmula de factor de calibración:
Factor de calibración= Concentración del estándar
Absorbancia a 660 nm
5. Interpretar el valor obtenido de la muestra de acuerdo con los valores de referencia
VALORES DE REFERENCIA:
18
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE LA
EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
19
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
20
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°3
Técnicas de degradación de proteínas
Logro de
aprendizaje:
Describir los factores físicos y químicos que producen degradación de las
proteínas.
MATERIALES (para extracción de ADN)
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
•
•
•
•
•
01 piceta con agua destilada
Tubos de ensayo 13 x 150 mm
Clara de huevo (5 mL por cada mesa de trabajo)
02 pipetas Pasteur
Plancha de calentamiento
Beaker de 150 o 250 mL
Pinza de madera para tubos de ensayos
Solución de alcohol etílico al 96% en frasco ámbar
Solución de ácido clorhídrico al 10% en frasco ámbar
II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
•
Propipetas
Lentes de seguridad
21
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 3
TÉCNICAS DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS
La desnaturalización de proteínas puede ocurrir en condiciones in vitro a través de factores
químicos (sustancias químicas) y/o factores físicos (temperaturas) que alteran la estructura
tridimensional ocasionando la precipitación de polipéptidos. Este proceso puede conllevar a
afectar la función de las proteínas
•
Competencias
Describir los factores físicos y químicos que producen desnaturalización de las proteínas.
Calor:
El calor desnaturaliza las proteínas al romper los enlaces por puente de hidrógeno y
las interacciones hidrofóbicas entre grupos R no polares. Pocas proteínas pueden
permanecer biológicamente activas a más de 50 °C.
Ácidos y bases:
Cuando un ácido o una base se agrega a una proteína, el cambio en el pH rompe los
enlaces por puente de hidrógeno y altera los enlaces iónicos (puentes salinos).
Compuestos orgánicos:
El etanol y el alcohol isopropílico actúan como desinfectantes al formar sus propios
enlaces por puente de hidrógeno con una proteína y alterar el enlace por puente de
hidrógeno intramolecular de la cadena lateral.
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LAS EXPERIENCIAS
PRÁCTICAS
Parte experimental
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Identificar los tubos de ensayos con los números 1, 2, 3 y 4.
Adicionar 1 mL de clara de huevo con la pipeta Pasteur en cada tubo de ensayo.
Adicionar 1 mL de agua destilada a cada tubo de ensayo.
Al tubo de ensayo 1 agregar gotas de alcohol etílico 96 % hasta que aparezca turbidez.
Al tubo de ensayo 2 agregar gotas de ácido clorhídrico hasta que aparezca turbidez.
Al tubo de ensayo 3 colocar dentro de un beaker con agua que se encuentra sobre una
plancha caliente a 100°C
7. Anotar el resultado en su cuaderno de anotaciones, donde la presencia de turbidez
blanquecina indica la desnaturalización de la proteína presente en la clara del huevo.
22
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA TÉCNICAS DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS.
Este informe debe contener las siguientes partes:
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
23
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
24
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°4
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Logros de
aprendizaje:
Determinar el efecto de la concentración del sustrato, la concentración de
la enzima, el efecto del pH sobre la actividad enzimática.
Determinar el Km y Vmáx a través de un gráfico de Michaelis-Mentes y
de doble recíproco.
Interpretar el Km y Vmáx obtenidos en las representaciones gráficas.
MATERIALES
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
•
01 gradilla
17 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
04 pipetas graduadas o volumétricas 5 mL
04 propipeta
II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
01 solución de albúmina 25 mL
01 pepsina 2% frasco 5 mL
01 solución de HCl 1N 5 mL
III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
•
01 baño maría 37°C o plancha de calentamiento
01 termómetro
25
Manual de Práctica de Bioquímica
✓ Pepsina al 2%
Pesar 2 g de pepsina en la balanza analítica, luego agregar agua destilada hasta
completar un volumen de 100mL.
✓ Albúmina [1.3] de Absorbancia a 450 nm
Solución madre: Cocer en un beaker de 1000 ml dos huevos (15 minutos
aproximadamente). Separar la clara y licuar con agua destilada a una capacidad
para 250 ml. Luego filtrar 2 veces con papel toalla.
Realizar una dilución de la solución madre de albumina a 3.7x (5.40 ml para cada
20 ml). Verificar con el espectrofotómetro una absorbancia de 1.3
aproximadamente a una longitud de onda de 450 nm.
26
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 4
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad deacelerar las
reacciones químicas sin modificar la constante de equilibrio del sistema. Su actividad es
afectada por diversos factores: concentración de sustrato, pH, concentración de enzima,
temperatura, inhibidores, fuerza iónica, constante dieléctrica, etc.
Competencias
1. Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para laalbúmina a partir
de la gráfica de Vi contra [S].
2. Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para laalbúmina a partir
de la gráfica de dobles recíprocas 1/Vi contra 1/[S].
3. Explicar la actividad enzimática de la pepsina sobre la actividad dela pepsina.
4. Explicar el efecto de los factores enzimáticos sobre la actividad de lapepsina.
Fundamento teórico
Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados enzimas, son
proteínas que intervienen en las reacciones biológicas, acelerando la velocidad de reacción
hasta alcanzar su punto de equilibrio. Las enzimas son sumamente específicas en las
reacciones que catalizan y en los compuestos (llamados substratos) sobre los que actúan.
La cinética enzimática es el estudio del comportamiento de la velocidad en reacciones
catalizadas por enzimas. Las mediciones de la cinética proporcionan una herramienta
bioquímica muy útil para calcular la concentración de una enzima en una muestra biológica
y comparar su actividad catalítica con la de otras enzimas. Además, lasmediciones cinéticas
permiten describir de manera cuantitativa elefecto de un veneno o medicamento sobre la
actividad de una enzima.
La velocidad a la que procede una reacción enzimática está controlada en parte por las
concentraciones de la enzima y el substrato. A medidaque progresa la reacción, aumenta la
concentración de los productos a expensas de la desaparición de los correspondientes
substratos, entanto que la concentración de la enzima no se altera.
27
Manual de Práctica de Bioquímica
La actividad enzimática puede expresarse:
• Por la desaparición del Substrato (S)
• Por la aparición de Productos (P)
• Por modificación de Cofactores (C)
El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse así:
[E] + [S] → [E] + [P]
C C’
Diversos factores modifican la actividad enzimática, tales como:
1. Concentración de Substrato [S]
2. Concentración de la Enzima [E]
3. pH del medio
4. Influencia de la temperatura
5. Efecto de inhibidores y activadores
En las siguientes prácticas estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad
enzimática de la pepsina en presencia de albúmina.
La pepsina es un enzima proteolítico (proteasa ácida) segregada por las células principales
de las glándulas gástricas, tiene un peso molecular de 34 644 Da. Hidroliza los enlaces
peptídicos, descomponiendo así las proteínas en aminoácidos. La pepsina solo realiza la
proteólisis en medio ácido, actúa a un pH bajo, por lo que esprecisa la presencia de ácido
clorhídrico para la realización de la digestión gástrica de las proteínas. Las células de las
glándulas gástricas no producen directamente pepsina, sino que su producto es el
pepsinógeno, sustancia precursora sin capacidad digestiva que se convierte en pepsina en
la luz de la glándula, al entrar en contacto conel ácido clorhídrico y con la pepsina ya
producida.
28
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LA EXPERIENCIA
PRÁCTICA
La actividad enzimática se medirá por la desaparición del substrato (disminución de la
turbidez en los tubos que contienealbúmina), la cual se determinará en el Espectrofotómetro
a 450nm.
Agua
destilada
(mL)
HCl
1N
(mL)
Albúmina
5% (MmL)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
-
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
-
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
-
-
-
-
-
-
-
-
-
4
Pepsina 2%
P/V(mL)
•
•
•
•
•
Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el espectrofotómetro. Considerar las
Absorbancias como Lectura Inicial.
Luego, incubar los nueve tubos a 37ºC por 5 min.
Añadir 0.5 mL de pepsina a cada tubo (del tubo 9 a los tubos 1, 2,3, 4, 5, 6, 7 y 8). Incubar a
37ºC por 5 min o hasta que el tubo 1 este claro.
Detener la reacción colocando los tubos en un baño de hielo.
Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el espectrofotómetro y considerarlas
como Absorbancias como lectura final.
- Hacer la diferencia:
Actividad Enzimática = Lectura Inicial - Lectura Final
El resultado de esta diferencia se considerará como ActividadEnzimática.
- Graficar en papel milimetrado:
Actividad Enzimática en el eje Y versus [S] en el eje X. 1/Actividad Enzimática en el
eje Y versus 1/[S] en el eje X.
- Calcular el Km y Vmáx de la pepsina en cada una de las gráficas.
29
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE FACTORES QUE AFECTAN LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
30
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
31
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°5
DETERMINACIÓN DE UREA
Logro de
aprendizaje:
Describir la técnica de cuantificación de la concentración de
urea en suero.
Explicar el fundamente de la técnica empleada para medir
urea.
Relacionar el significado clínico de los resultados de esta
prueba.
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
•
•
01 gradilla
05 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
02 pipeta volumétrica o graduada 5 mL
02 pipeta volumétrica o graduada 10 mL
02 propipetas
II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
•
•
•
•
•
•
•
01 suero tubo de tapa rosca 2 mL
Estuche comercial para determinar urea (01 estándar de urea (0.60g/L) frasco 1 mL;
01 ureasa frasco 1 mL; 01 reactivo de trabajo 1 frasco 12 mL; 01 reactivo de
trabajo 2 frasco 12 mL)
Espectrofotómetro
04 micropipetas 10 – 100 µL y/o de 5 – 50 µL
06 puntas descartables de micropipetas
06 cubetas para espectrofotometría
Baño maría 37°C
Vórtex
PROCEDIMIENTO
El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.
32
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N°5
DETERMINACIÓN DE UREA
La urea es un compuesto nitrogenado que se sintetiza en el hígado a partir del ion amonio,
bicarbonato y ATP. La enzima que cataliza esta primera reacción esel carbamoil fosfato
sintetasa I, cuya actividad es regulada por el N – acetil glutamato. La excreción de urea
por la orina depende fundamentalmente de la ingesta proteica. Un incremento de urea en
sangre puede ocurrir a causa de unaprobable disfunción renal.
Competencia
✓ Describir la técnica de cuantificación de la concentración de urea en suero.
✓ Explicar el fundamente de la técnica empleada para medir urea.
✓ Relacionar el significado clínico de los resultados de esta prueba.
Fundamento teórico
La determinación de urea en orina se fundamenta en la acción que ejerce la enzima ureasa
sobre la urea, descomponiéndola en anhídrido carbónico y amoniaco. Este amoniaco
reacciona con hipoclorito y fenol en medio alcalino, formando un compuesto coloreado
denominada azul de indofenol, cuya intensidad es proporcional a la concentración de urea.
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LA EXPERIENCIA
PRÁCTICA
Preparar el siguiente sistema:
B
X
St
Estándar de urea (µL)
-
-
20
Suero (µL)
-
20
-
Ureasa (gota)
1
1
1
B
X
St
Reactivo 1 (mL)
1
1
1
Reactivo 2 (mL)
1
1
1
Mezclar mediante agitación e incubar a 37°C por 5 minutos.
Mezclar e incubar 37°C por 5 minutos y leer en el espectrofotómetro a 540 nm.
Determinar la concentración de la muestra con la fórmula de factor de calibración e interpretar
33
Manual de Práctica de Bioquímica
el valor obtenido de acuerdo con los intervalos de referencia.
34
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE LA
EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE DETERMINACIÓN DE UREA
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
35
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
36
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°6
TÉCNICAS BÁSICAS DE IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS
Logro de
aprendizaje:
Identificar biomoléculas como proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos
nucleicos
MATERIALES
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
•
•
01 gradilla
05 tubos de ensayo 13x100mm
10 tubos Eppendorf 1.5 mL
01 piseta con agua destilada
07 pipetas graduadas 1mL
01 cronómetro o temporizador
II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
Materiales generales
• 01 espectrofotómetro
• 01 micropipeta 10 µL, 20 µL, 100 µL, 1000 µL
• Puntas descartables respectivas
• 20 cubetas para espectrofotometría
Materiales para la detección de glucosa
• 01 estuche de glucosa oxidasa
• 01 muestra de suero
Materiales para la detección de proteínas
• Muestra de suero o plasma sanguíneo 3 mL
• 01 reactivo EDTA/Cu frasco 11 mL
• 01 espectrofotómetro
• 01 baño maría 37°C
• 01 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL
• 12 puntas descartables respectivas
• 12 cubetas para espectrofotometría
• 01 vórtex
• Materiales para la detección de lípidos
• 01 muestra de aceite
• 01 benceno
37
Manual de Práctica de Bioquímica
PROCEDIMIENTO
✓ Solución de glucosa 150 mg/dL
Pesar en la balanza analítica 15mg de glucosa. Mezclar 15mg de glucosa
previamente pesados en 10mL de agua destilada. Agitar hasta que se disuelva
completamente.
✓ Solución de albúmina sérica bovina (BSA) 10% p/v
Pesar en la balanza analítica 1mg de azul de metilo. Mezclar 1mg de BSA
previamente pesado en 10mL de agua destilada. Agitar hasta que se disuelva
completamente.
38
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 6
TÉCNICAS BÁSICAS DE IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS
Las biomoléculas (carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos) están conformadas por
distintos monómeros con diferentes grupos funcionales (grupos químicos) que le otorgan
propiedades fisicoquímicas particulares a cada biomolécula y participan en diferentes reacciones.
Al evaluar el comportamiento de diferentes biomoléculas frente a determinados reactivos, estímulos
o solventes podremos distinguirlas e identificar qué biomolécula está presente en la muestra.
Objetivos
✓ Identificar biomoléculas como proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos
Identificación de glucosa
Método de la glucosa oxidasa
Fundamento teórico
La glucosa reacciona con el reactivo enzimático que contiene una mezcla de las enzimas Glucosa
Oxidasa (GOD) y Peroxidasa (POD). En la primera etapa la Glucosa es oxidada a Ac. Glucónico
por la acción de la enzima GOD, liberándose como producto H2O2, el cual en una reacción mediada
por la enzima POD, reacciona con el Ac. p-Hidroxibenzoico y 4-Aminoantipirina produciendose un
compuesto coloreado con un máximo de absorción a 505 nm., en cantidad proporcional a la cantidad
de Glucosa presente en la muestra.
Método de Biuret para la detección de proteínas
La determinación de las proteínas totales se realiza utilizando iones cúpricos que en medio alcalino
reacciona con las proteínas formando compuestos de coordinación de color violeta, cuyo pico de
máxima absorción es de 540 nm y su intensidad es proporcional a la concentración de proteínas.
Método de solubilidad para los lípidos
Se basa en la diferente solubilidad de los lípidos en el agua y en solventes orgánicos. Los lípidos
son solubles en solventes orgánicos como el benceno, éter, cloroformo; pero son insolubles en el
agua. Al mezclar aceite con agua se forman dos fases o capas. Al agitar la mezcla, se forma una
emulsión de aspecto lechoso. Al cesar la agitación, luego de unos minutos, el agua y el aceite se
separan nuevamente en dos fases o capas.
39
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LAS EXPERIENCIAS
PRÁCTICAS
Método de la glucosa oxidasa
Preparar el experimento de la siguiente manera
•
B
S
X
Muestra
-
-
0,01
Estándar
-
0,01
-
Reactivo enzimático (mL)
1
1
1
Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C o temperatura ambiente (20° a 25°C). Leer las
absorbancias ajustando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. El
color resultante es estable por a lo menos treinta minutos. (https://www.valtek.cl/wpcontent/uploads/2020/02/Glucosa-GOD-PAP.-Inserto.pdf)
•
Calcular el factor de calibración y la concentración de glucosa en el suero.
40
Manual de Práctica de Bioquímica
Método de Biuret
Preparar experimento de la siguiente manera:
Utilizar el método del Fc para calcular la concentración de proteínas en la muestra (suero).
Método de la solubilidad
Marcar dos tubos de ensayo A y B respectivamente. En el tubo A colocar 1 mL de benceno y en el
tubo B 1 mL de agua. Luego, agregar 1 mL de aceite a cada uno de los tubos, observar la solubilidad
del aceite en benceno y en agua y registrar sus observaciones. Luego, agitar los tubos y observar
la formación de una emulsión en el tubo B. Registrar sus observaciones. Colocar los tubos en la
gradilla (sin agitación) e incubar por unos minutos a temperatura ambiente. Observar la solubilidad
del aceite en ambos tubos y registrar sus observaciones.
41
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN
DE BIOMOLÉCULAS
Este informe debe contener las siguientes partes:
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
42
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DE LOS INFORMES DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
43
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°7
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN CONDICIÓN DE AYUNO Y EN CONDICIÓN DE
ALIMENTACIÓN NORMAL EN UN TIEMPO DE 24 HORAS
Logro de
aprendizaje:
Determinar la concentración de glucosa en condición de ayunas y en
condición de alimentación normal en un tiempo de 24 horas.
MATERIALES
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
•
•
•
01 gradilla
05 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
Propipetas
Pipeta volumétrica de 5 mL
Solución de glucosa de 60 mg/dL
Solución de glucosa de 90 mg/dL
III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
01 estuche comercial de glucosa oxidasa
•
Espectrofotómetro
•
Baño de maría
•
Cubetas
•
Micropipetas de 10-50 µL; 100 – 1000 µL
•
Puntas de micropipetas
•
Vórtex
44
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 7
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN CONDICIÓN DE AYUNO Y EN CONDICIÓN DE
ALIMENTACIÓN NORMAL EN UN TIEMPO DE 24 HORAS
En un individuo en condición de alimentos o de ayuno de 24 horas se ve alteraciones de las
concentraciones de glucosa en circulación se ven afectas debido a que el organismo estimula rutas
metabólicas de los carbohidratos como glicólisis, glucogénesis, glucogenólisis y gluconeogénesis
con la finalidad de preservar las concentraciones de glucosa dentro de los valores de referencia
para mantener las funciones óptimas de cerebro, eritrocito, músculo, entre otros.
Competencia
Determinar la concentración de glucosa en condición de ayunas y en condición de alimentación
normal en un tiempo de 24 horas.
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LA EXPERIENCIA
PRÁCTICA
Método de la glucosa oxidasa
La glucosa reacciona con el reactivo enzimático que contiene una mezcla de las enzimas Glucosa
Oxidasa (GOD) y Peroxidasa (POD). En la primera etapa la Glucosa es oxidada a Ac. Glucónico
por la acción de la enzima GOD, liberándose como producto H2O2, el cual en una reacción mediada
por la enzima POD, reacciona con el Ac. p-Hidroxibenzoico y 4-Aminoantipirina produciendose un
compuesto coloreado con un máximo de absorción a 505 nm., en cantidad proporcional a la cantidad
de Glucosa presente en la muestra.
Determinación de la concentración de glucosa en suero en condición de ayuno y alimentación
en 24 horas
1. Identificar tubos de ensayos de 13 x 100 mm como Blanco (B), Estándar (S) y muestra en ayuno
(X1) y muestra en condiciones de alimentación (X2). Luego, Adicionar los volúmenes que se
describen en la tabla que se muestra a continuación:
Muestras y reactivos
Muestra en condición de
alimentación en 24 h
Muestra en condición de
ayuno
B
S
X1
X2
-
-
0,01
-
-
-
-
0,01
Estándar
-
0,01
-
Reactivo enzimático (mL)
1
1
1
45
1
Manual de Práctica de Bioquímica
2. Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C o temperatura ambiente (20° a 25°C). Leer las absorbancias
ajustando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable
por a lo menos treinta minutos. (https://www.valtek.cl/wp-content/uploads/2020/02/GlucosaGOD-PAP.-Inserto.pdf).
3. Calcular el factor de calibración y la concentración de glucosa en el suero.
4. Interpretar los resultados de acuerdo con los valores de referencia y posteriormente identificar
que rutas metabólicas de han activado bajo las condiciones de ayuno y de alimentación de 24
horas.
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE CONCENTRACIÓN DE
GLUCOSA EN CONDICIÓN DE AYUNO Y EN CONDICIÓN DE
ALIMENTACIÓN NORMAL EN UN TIEMPO DE 24 HORAS
Este informe debe contener las siguientes partes:
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
46
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
47
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N° 8
CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO
Logro de
aprendizaje:
Calcular de las propias necesidades energéticas (gasto energético) del
alumno
Calcular de la ingesta energética del alumno
Determinar el balance energético del alumno
Determinar el % de adecuación de la dieta del alumno
Interpretar el balance energético y el % de adecuación de la
dieta del alumno
Esta práctica no requerirá de materiales ni reactivos de Laboratorio. Únicamente
del Manual de práctica de Bioquímica.
El docente podrá solicitar materiales adicionales, previo requerimiento anticipado.
48
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N°8
CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO
Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasapancreática. En
este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares, compuestos que tienen la
propiedad de emulsionar los lípidos para una eficienteacción de la lipasa pancreática.
El Balance Energético es el equilibrio que debe existir entre el gasto energético y diario de un
individuo, de acuerdo con su metabolismo basal, edad, sexo, actividad física y la ingesta
energética diaria a través de los macronutrientes de los alimentos consumidos.
Si predomina el gasto energético sobre la ingesta energética, en un tiempo prolongado, el
individuo tiende a perder sus reservas, y como consecuencia se adelgaza. Por otro lado, si
predomina la ingesta, el exceso de energía seacumulará en el cuerpo, en forma de triglicéridos,
en el tejido adiposo, observándose un aumento de peso.
Para realizar este balance, es necesario, calcular, en forma independiente, el gasto energético
en las 24 horas de cualquier día rutinario, de acuerdo con la tasametabólica basal (TMB) y la
actividad física realizada, luego compararlo con la ingesta energética que proporcionaron los
alimentos consumidos el mismo día, utilizando la Tabla de composición química de los
alimentos peruanos y Tabla auxiliar de alimentos peruanos.
Competencias
1. Calcular las propias necesidades energéticas (gasto energético)del alumno
2. Calcular la ingesta energética del alumno
1. Determinar el balance energético y el % de adecuación de la dieta del alumno
2. Interpretar el balance energético y el % de adecuación de la dieta del alumno
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LA
EXPERIENCIA PRÁCTICA
Parte experimental
1. Calcular la ingesta energética, utilizando:
2. Tabla de trabajo
3. Listado de alimentos consumidos en 24 horas
4. Tabla de composición química de alimentos peruana
49
Manual de Práctica de Bioquímica
5. Tabla auxiliar de alimentos peruana
DISPONIBLE EN:
-Tablas Auxiliares para la Formulación y Evaluación de Regímenes Alimentarios (CENAN)
http://www.ins.gob.pe/repositorioaps/0/5/jer/doc_tec_norm/TAFERA_1_compressed.
pdf
- Tablas Peruanas de Composición de Alimentos (CENAN)
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Tabla%20de%20Alimentos.pdf
CÁLCULO DE LA INGESTA ENERGÉTICA”
a. En la lista de consumo de alimentos, desglosar las preparaciones detodo el día en cada
uno de sus constituyentes. En columnas ordenadas calcular mediante regla de tres el
contenido de proteínas, grasas y carbohidratos de cada alimento respectivamente, según
la cantidad quese haya consumido.
Ejemplo 1:
•
Ingesta de leche fluida de vaca = 250 mL
•
Leche fluida de vaca en 100 mL contiene 3.1gr de proteínas Para
calcular la cantidad de proteína que existe en 250 mL de lechefluida de
vaca:
Leche fluida de vaca en 250 mL
“x”
Leche fluida de vaca en 100 mL
3.1gr de proteínas
X = 7.75gr de proteínas
Ejemplo 2:
•
Ingesta de pulpa de carne vacuno = 90gr
•
Pulpa de carne vacuno en 100gr contiene 21.3gr de proteínas
•
Para calcular la cantidad de proteína que existe en 90gr de pulpa de carne de vacuno:
Pulpa de carne de vacuno en 90gr
Pulpa de carne de vacuno en 100gr
50
“x”
21.3gr de proteínas
Manual de Práctica de Bioquímica
X = 19.17gr de proteínas
La tabla de Composición química de los alimentos indica
los
valores en 100 g de porción comestible
cruda (a menos que indique los valores en cocido).
a)
Totalizar luego de cada una de las tres columnas, y el valor obtenidoen gramos de
cada macronutriente se multiplica por el factor respectivo.
Proteína x 4.0 Kcal
Grasa x 9.0 Kcal
Carbohidratos x 4.0 Kcal
b)
Sumar los totales, y el resultado obtenido corresponde a la cantidad deenergía
(Kilocalorías) que aportan los alimentos consumidos ese día.
TABLA DE TRABAJO
Cantidad
ALIMENTO
en medida
Cantidad
Energía
(gr)
(Kcal)
Proteína
Grasa
CHO
(gr)
(gr)
(gr)
x4
x9
x4
casera
Desayuno
SUB – TOTAL
ALMUERZO
SUB – TOTAL
CENA
SUB – TOTAL
MERIENDAS
SUB – TOTAL
FACTOR
TOTAL (Kcal)
Ingesta Energética = Ʃ (kcal)/d
✓ Calcular el gasto energético, utilizando:
51
Manual de Práctica de Bioquímica
- Ecuaciones para calcular la tasa metabólica basal (TMB)
- Tabla de categorías y factores de la actividad física
“CÁLCULO DEL GASTO ENERGÉTICO”
G.E. = TMB x FACTOR DE ACTIVIDAD
a)
Se calcula la tasa metabólica basal (TMB) o gasto en reposo, aplicandola fórmula
de la siguiente tabla:
Ecuaciones para calcular la tasa metabólica basal (TMB) a partir delpeso corporal (P).
RANGO DE EDAD (años)
Kcal/día
HOMBRES
0–3
60.9 (P) – 54
3 – 10
22.7 (P) + 495
10 – 18
17.5 (P) + 651
18 – 30
15.3 (P) + 679
30 – 60
11.6 (P) + 879
> 60
13.5 (P) + 487
MUJERES
0–3
61.0 (P) – 51
3 – 10
22.5 (P) + 499
10 – 18
12.2 (P) + 746
18 – 30
14.7 (P) + 496
30 – 60
8.7 (P) + 829
> 60
10.5 (P) + 596
Fuente: Organización Mundial de la Salud (OMS). 1985.
52
Manual de Práctica de Bioquímica
Ejemplo 1:
La TMB para una estudiante de 19 años, con 55 kg. de peso,será:
TMB = 14.7 (P) + 496
TMB = 14.7 (55) + 496
TMB = 1305 Kcal/d
b)
Con la lista de actividades, se agrupan éstas por categorías, tomandoen cuenta el tiempo
empleado (en minutos) y multiplicándolas por el múltiplo de la TMB o factor de actividad (o gasto de
energía promedio por actividad). Las categorías de actividad física son las siguientes:
ACTIVIDAD FÍSICA
CATEGORÍA
Dormir, descansar
Manejando automóvil,
escribiendo a máquina,
atendiendo a clase, trabajando
en laboratorio, viendo TV,
cocinando, planchando, jugando
cartas, tocando un instrumento
musical
Caminando a 4 – 5km/h,
atendiendo al público, limpieza
de la casa, cuidando niños,
trabajo de carpintería y
electricidad, jugar tenis de mesa
Caminando a 5.5 – 6.5km/h,
manejando bicicleta, bailando,
trabajando en jardinería,
cargando bultos pesados
Jugando fútbol, vóley, básquet,
caminando con carga pesada
cuesta arriba, cortando árboles,
trabajo de excavación manual
Reposo
MÚLTIPLO DE LA TMB o
FACTOR DE ACTIVIDAD
1.0
Muy ligera
1.5
Ligera
2.5
Moderada
5.0
Pesada
7.0
* Asignar 1/3 de hora para el mantenimiento cardiovascular y
muscular. Recomendación FAO/OMS 1985.
1) Ordenar las actividades de acuerdo al tiempo empleado:
HORA
6:00 – 6:15 a.m.
6:15 – 6:45 a.m.
6:45 – 7:00 a.m.
7:00 – 8:00 a.m.
8:00 – 10:00 a.m.
ACTIVIDAD
Aseo personal
Tomar desayuno
Caminar para tomar el
bus
Viajar en bus
Asistir a clase
etc. (Debe completar 1440 minutos).
53
TIEMPO
15´
30´
15´
60´
120´
Manual de Práctica de Bioquímica
2)
Agrupar por categoría de actividad:
CATEGORÍA
DE ACTIVIDAD
TIEMPO
EMPLEADO
(HORA)
MÚLTIPLO DE
LA TMB O
FACTOR DE
ACTIVIDAD
FACTOR DE
TMB
PONDERADO
8
14
2
1.0
1.5
2.5
8.0
21.0
5.0
En reposo
Muy ligera
Ligera
TOTAL
34.0
Promedio / hora
(Factor TMB/24h)
1.417
Gasto energético
(1.417 x TMB)
1850.0
Gasto Energético = 1850 Kcal/d
✓ Calcular el balance energético:
Balance Energético = Ingesta Energética – Gasto Energético
Obtener la respuesta respetando el signo (+) (exceso) o (-)(déficit)
EQUILIBRIO
BALANCE (+)
BALANCE (-)
Ingesta energética = Gasto energético
Ingesta energética > Gasto energético
Ingesta energética < Gasto energético
✓ Calcular el porcentaje de adecuación de la dieta
% 𝑑𝑒 𝑎𝑑𝑒𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑖𝑛𝑔𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎
𝑥 100
𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑟𝑒𝑞𝑢𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎
Energía ingerida = Ingesta de alimentosEnergía
requerida = Gasto energético
Analizar el % de adecuación de la dieta obtenido, según lossiguientes parámetros:
VALORES NORMALES
90 – 110%
DÉFICIT
< 90%
EXCESO
> 110%
54
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORMES DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO
Este informe debe contener las siguientes partes:
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
55
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
56
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°9
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN
Logro de
aprendizaje:
Describir la digestión enzimática del almidón mediante la hidrólisis por
efecto de la amilasa salival
MATERIALES
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
•
•
01 gradilla
12 tubos de ensayo 13x100 mm
01 piseta con agua destilada
04 pipetas graduadas 5 mL
01 pipetas graduadas de 1 mL
01 propipeta
II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
Tampón fosfato 0.1M pH 6.5, 5 mL
Solución de almidón 1%, 10 mL
Solución de cloruro de sodio 0.5N gotero 25mL
01 gotero con solución de Lugol
III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
•
01 baño maría 37°C
Tiras indicador de pH
PROCEDIMIENTO
✓ Tampón Fosfato 0.1M pH 6.5
Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 6.5, se mezcla 68.5mL de
Solución 1 y 31.5mL de la Solución 2. Luego se completa a un volumen total de
200mL con agua destilada. (Para otro pH y concentración ver el Anexo 1).
Solución 1: 0.2M de NaH2PO4
Disuelva 24g de NaH2PO4 y lleve a un volumen de 1Litro con agua destilada.
Solución 2: 0.2M de Na2HPO4
Disuelva 53.6g de Na2HPO4*7H2O y lleve a un volumen de 1Litro con agua
destilada.
57
Manual de Práctica de Bioquímica
✓ Almidón 1%
Colocar 1L de agua en una plancha de calentamiento hasta llegar a ebullición.
Luego, añadir 10 gr de almidón hasta su disolución.
Conservación: Con el objetivo de que el almidón dure más tiempo, luego de la
ebullición se puede agregar 3gr de NaCl, disolver y añadir 10gr de almidón.
Verificación: Colocar en un tubo de ensayo 10 mL de la solución de almidón y
agregar 2-3 gotas de Lugol. La reacción positiva dará una coloración azul-violeta.
✓ Cloruro de sodio NaCl 0.5N
Medir un volumen de 29.25 gr en una probeta, luego llevar a un recipiente y
agregar agua destilada hasta completar un volumen de 1L.
58
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA 9
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN
El almidón constituye un importante componente de la dieta de los seres humanos. El
proceso de digestión de este nutriente se inicia en la cavidad oral, lugar en que actúa la α
– amilasa salivar, enzima que tiene la propiedad de hidrolizar los enlaces α 1.4 del almidón
y forma polisacáridos de menor peso molecular.
Competencia
1. Hidrolizar el almidón por efecto de la amilasa salival
2. Interpretar hidrólisis del almidón por efecto de la amilasa salival
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LAS EXPERIENCIAS
PRÁCTICAS
Parte experimental
Hidrólisis del almidón por efecto de la amilasa salival
Para realizar el experimento se prepararán los siguientes mediosde reacción:
1
2
3
Tampón fosfato 0.1M pH 6.5 (mL)
0.5
0.5
0.5
Almidón 1% (mL)
1.0
1.0
1.0
-
-
1.0
2.0
1.5
-
Cloruro de sodio 0.5N (mL)
Agua destilada (mL)
Colocar los tubos de ensayo en el baño maría a 37°C durante 2 minutos, luego adicionar:
Solución de saliva (mL)
1
2
3
-
0.2
0.2
Colocar nuevamente los tubos en baño maría y sacar alícuotas de 0.5 mL de cada uno de los
tubos a los 3, 6, 9 minutos, y adicionarlos a los tubos previamente preparados que contienen
1.0 mL de cloruro de sodio 0.5 N, de acuerdo con el siguiente esquema:
59
Manual de Práctica de Bioquímica
Cloruro de sodio 0.5N (mL)
1
2
3
1.0
1.0
1.0
Luego, adicionar a cada tubo:
Solución de Lugol (gota)
1
2
3
1
1
1
Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado, Durante el desarrollo del experimento
se observaránmodificaciones del color inicial de los tubos como consecuenciasde la acción de la
α – amilasa salival. El experimento concluye cuando uno de los tubos muestre un color pardo claro.
60
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL
ALMIDÓN
Este informe debe contener las siguientes partes:
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
61
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
62
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°10
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LÍPIDOS
Logro de
aprendizaje:
Explicar el mecanismo de hidrólisis de lipasa sobre lípidos.
MATERIALES
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
01 gradilla
05 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
01 fenolftaleína gotero 25 mL
01 hidróxido de sodio ̴ NaOH 0.05N gotero 25 mL
III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
•
•
•
01 solución de pancreatina 1% frasco 100 mL
01 sales biliares 1% frasco 100 mL
01 aceite vegetal 30 mL
01 tampón fosfato 0.1M pH 7.8 frasco 5.0 mL
PROCEDIMIENTO
✓ Fenolftaleína
Pesar 1.25gr de fenolftaleína y diluir con etanol al 95% hasta un volumende
250mL.
✓ Hidróxido de sodio NaOH 0.05N
Pesar 1.9g de NaOH en la balanza analítica, luego agregar agua destiladahasta
completar un volumen de 1L. (¡PRECAUCION!, la reacción es exotérmica, es decir,
que desprende calor).
Es recomendable almacenar en envases de plástico para mayor duracióndel
reactivo.
✓ Pancreatina al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Pancreatina y luego agregar aguadestilada
hasta llenar 1L. Agitar hasta lograr una mezcla completa.
✓ Sales biliares al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Sales Biliares y luego agregar aguadestilada
hasta llenar 1L. Agitar hasta lograr una mezcla completa.
Tampón fosfato 0.1M pH 7.8
Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 7.8, se mezcla 8.7 mL de
63
Manual de Práctica de Bioquímica
Solución 1 y 91.3mL de la Solución 2. Luego se completa a un volumen total de
200mL con agua destilada.
Solución 1: 0.2M de NaH2PO4
Disuelva 24g de NaH2PO4 y lleve a un volumen de 1Litro con agua destilada.
Solución 2: 0.2M de Na2HPO4
Disuelva 53.6g de Na2HPO4*7H2O y lleve a un volumen de 1Litro con agua
destilada.
64
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA 10
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LÍPIDOS
Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasapancreática. En este
proceso juegan un papel muy importante las sales biliares,compuestos que tienen la propiedad de
emulsionar los lípidos para una eficienteacción de la lipasa pancreática.
Competencia
1. Describir el proceso de hidrólisis de lípidos por acción de lipasa pancreática comercial.
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LA EXPERIENCIA
PRÁCTICA
Parte experimental
Para la demostración experimental de la acción hidrolítica de esta enzima, se prepararán
los siguientes medios de reacción;
B
1
2
3
Tampón fosfato 0.1M (mL)
2.0
2.0
2.0
-
Aceite (mL)
1.0
1.0
1.0
1.0
Sales biliares 1% (mL)
2.0
2.0
-
2.0
Agua destilada (mL)
5.0
-
2.0
2.0
Añadir 2 gotas de fenolftaleína a cada uno de los tubos, luego adicionar gota a gota una solución de
NaOH 0.05N hasta que aparezcauna coloración débilmente grosella estable, luego adicionar:
Pancreatina 1% (mL)
B
1
2
3
-
5.0
5.0
5.0
Volver a incubar los tubos a la misma temperatura durante 1 hora, agitándolos cada 5 minutos.
Al finalizar el tiempo de incubación, adicionar nuevamente a cada tubo 2 gotas de fenolftaleína y
proceder a titular, utilizando una bureta, con una solución de NaOH 0.05N hasta que aparezca
nuevamente la coloración ligeramente grosella.
Los resultados se expresarán como miliequivalentes de ácido esteárico liberado por acción de la
lipasa pancreática.
65
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE
LOS LÍPIDOS
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
66
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
67
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°11
Determinación de triglicéridos y colesterol en plasma: Perfil lipídico mínimo
Logro de
aprendizaje:
Determinar los parámetros que conforman parte del perfil lipídico
Interpretar los valores de los parámetros del perfil lipídico de acuerdo con
valores de referencia.
MATERIALES
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
•
01 gradilla
10 tubos de ensayo 13x100 mm
01 piseta con agua destilada
03 pipetas graduadas o volumétricas de 5mL
03 propipetas
II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
01 suero comercial 2mL
01 estuche comercial para determinar la concentración de colesterol total
01 estuche comercial para determinar la concentración de triglicéridos
01 estuche comercial para determinar HDL-colesterol
01 espectrofotómetro
04 micropipeta 10 – 100 µL y/o de 5 – 50 µL
Puntas descartables para micropipetas
Cubetas para espectrofotometría
Baño maría 37°C
Vórtex
PROCEDIMIENTO
El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.
68
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 11
DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN PLASMA.
PERFIL LIPÍDICO MÍNIMO
La determinación de los parámetros de perfil lipídico tiene una importancia en las carreras del
área de la salud, ya que alteración de estos biomarcadores puede conllevar al desarrollo de
dislipidemias que favorecen que un individuo presente una mayor probabilidad de presentar
riesgo de enfermedad cardiovascular.
Competencia
1. Determinar los parámetros que conforman parte del perfil lipídico.
2. Interpretar los valores de los parámetros del perfil lipídico de acuerdo con valores de
referencia.
Determinación de Triglicéridos
La determinación de triglicéridos en plasma constituye un dato muy importante en el manejo de
ciertas dislipidemias. Su incremento en el plasma constituye unfactor de riesgo positivo para
aterosclerosis.
Fundamento teórico
Los triglicéridos del plasma son hidrolizados por una lipoproteína lipasa (LPL) que forma como
productos glicerol y ácidos grasos. El glicerol en presencia de ATP por acción del glicerol
quinasa es convertido en glicerol – 1 – fosfato, compuesto que es convertido porel glicerol fosfato
oxidasa (GPO) en dihidroxiacetona fosfato y peróxidode hidrógeno, este compuesto en presencia
de 4 – aminofenazona (4 – AF), clorofenol y peroxidasa (POD) es transformado en una
quinonimina de color rojo.
LPL
Triglicérido
Ácido graso + Glicerol
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP
GPO
Dihidroxiacetona fosfato + H2O2
POD
Quinonimia roja
69
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL EXPERIENCIA
PRÁCTICA
Parte experimental
B
X
St
Suero o plasma (µL)
-
20
-
Estándar de TGC (µL)
-
-
20
Reactivo de trabajo (mL)
1
1
1
Mezclar e incubar durante 5 minutos en baño maría a 37°C, luego leeren el espectrofotómetro a
505 nm.
VALORES DE REFERENCIA:
< 150 mg/dL
2. Determinar el nivel de colesterol en suero sanguíneo.
El colesterol es una sustancia cuyos niveles en la sangre mantienen una estrecha relación con
diversas patologías, por cuyo motivo su determinación puede contribuir al diagnóstico de:
aterosclerosis, mixedema, diabetes mellitus, nefrosis, hipertiroidismo, etc.
Fundamento teórico
La técnica utilizada para la determinación se fundamenta en la hidrólisis previa de los ésteres de
colesterol por el colesterol esterasa,la posterior acción de la enzima colesterol oxidasa que formará
peróxido de hidrógeno en cantidades estequiométricas y finalmente laparticipación de la peroxidasa
que en presencia de reactivos químicosformará un compuesto coloreado proporcional a la cantidad
de colesterol existente en la muestra de sangre.
Esteres de colesterol + H2O
Colesterol esterasa
Colesterol + AGNE
Colesterol oxidasa
Colesterol + O2
Peroxidasa
70
Quinonimia coloreada + 4 H2O
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL EXPERIENCIA
PRÁCTICA
Parte experimental
B
x
St
Suero o plasma (µL)
-
10
-
Estándar de colesterol (µL)
-
-
10
Reactivo de trabajo (mL)
1
1
1
Incubar durante 5 minutos en baño maría a 37°C y leer en elespectrofotómetro a
540 nm.
VALORES DE REFERENCIA:
200 mg/dL
Determinación de HDL-colesterol
El colesterol de origen endógeno es transportado por tres lipoproteínas: alta densidad (HDL), baja
densidad (LDL), y muy baja densidad (VLDL). El HDL-c, es responsable de realizar el transporte reverso
de colesterol y su determinación se realiza a través de la precipitación de lipoproteínas de baja y muy
bajas densidad.
Fundamento
•
•
•
El HDL-Colesterol es obtenido precipitando selectivamente las lipoproteínas LDL y VLDL,
quedando el primero en solución.
El HDL-Colesterol en solución se determina por acción de las enzimas Colesterol Ester hidrolasa
y Colesterol oxidasa.
La primera libera el colesterol de los ésteres de colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre
produciéndose peróxido de hidrógeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona
con el sistema cromo génico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe a 505 nm
(https://grupomexlab.com/wp-content/uploads/2020/08/Colesterol-HDL-Precipitante.pdf).
Técnica
1. Precipitación: Agregar en un tubo de centrífuga 0.5 mL de reactivo precipitante y 0.2 mL de muestra,
mezclar y esperar 15 minutos a temperatura entre 20º y 30ºC. Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m.o
3 minutos a 10.000 r.p.m.
B
x
St
Sobrenadante (mL)
-
100
-
Estándar (µL)
-
-
100
Reactivo de trabajo (mL)
1
1
1
71
Manual de Práctica de Bioquímica
Mezclar e incubar 10 minutos a 37°C o 20 minutos a temperatura ambiente (20 a 25°C.). Leer las
absorbancias llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. El color resultante es
estable por a lo menos treinta minutos
Obtener la concentración a través del factor de calibración
Intervalos de referencias para interpretar el valor obtenido de HDL-c
Determinación de VLDL-c y LDL-colesterol
La determinación de la concentración de LDL-Colesterol a través de la siguiente fórmula
Fórmula para
determinar VLDL-c
https://grupomexlab.com/wp-content/uploads/2020/08/Colesterol-HDL-Precipitante.pdf
72
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA DETERMINACIÓN DE
CONCENTRACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROLPERFIL LIPÍDICON MÍNIMO
Este informe debe contener las siguientes partes:
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
73
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
74
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°12
EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES Y ACEITES ESENCIALES
Logro de
aprendizaje:
Reconocer los principales pigmentos vegetales.
Reconocer los métodos para la extracción de aceites esenciales.
Extraer pigmentos vegetales y aceites esenciales.
MATERIALES
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
•
•
•
01 piceta con agua destilada
01 barra de manteca vegetal natural
02 frascos de vidrio con tapa
01 con mortero con pilón
01 recipiente de vidrio con tapa
II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
•
•
•
•
01 muestra de beterraga* en trozos, 1kg
01 muestra de clavo de olor, 200g **
01 muestra de pétalos de rosas***
02 frascos de alcohol 96o 1L
02 frascos de aceite vegetal, 1L
PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra de beterraga:
Pesar aproximadamente 1kg de beterraga, pelarla y cortarla en trozos.
El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.
*Alternativamente, se puede utilizar zanahoria, cúrcuma, espinaca, arándanos, etc.
**Alternativamente, se puede utilizar canela, romero, albahaca, orégano, etc.
*** Alternativamente, se puede utilizar pétalos de jazmín, lavanda, etc.
75
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 12
EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES Y ACEITES ESENCIALES
Los pigmentos vegetales son compuestos químicos producidos por diferentes órganos de las
plantas que dan una coloración característica al órgano donde son sintetizados. Los pigmentos
vegetales se clasifican en tres grandes grupos: la clorofila (color verde), los carotenoides y
flavonoides (color amarillo), los carotenoides (color naranja), y las antocianinas y carotenoides (color
rojo). La clorofila y los carotenoides son liposolubles mientras que los flavonoides y las antocianinas
son hidrosolubles. Los pigmentos cumplen diferentes funciones: producción de energía (vía la
fotosíntesis), protección contra los rayos UV, atracción de los polinizadores, entre otras. Asimismo,
tienen aplicación en industria textil, industria alimentaria, cosmética, y tienen propiedades curativas.
Uno de los métodos más utilizados para extraer pigmentos vegetales es la maceración.
Los aceites esenciales son, por lo general, mezcla de 1 – 4 compuestos químicos producidos por
ciertos órganos de la planta y se caracterizan por aportar un aroma característico al órgano que lo
produce. Su naturaleza química es muy variable, siendo las moléculas más abundantes los
terpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos. Los aceites esenciales tienen aplicación en perfumería y
cosmética, en la industria de la alimentación, licorería y confitería. Por sus propiedades antisépticas,
son utilizados en industrias alimentarias. También son utilizados en medicina tradicional y en
aromaterapia por sus propiedades antibacterianas, antifúngicas, antiinflamatorias, digestivas,
analgésicas, depurativas, relajantes, tonificantes, equilibrantes, entre otras. Entre los métodos para
extraer los aceites esenciales se encuentran la destilación por arrastre con vapor, el prensado, la
maceración, el rozamiento o enfleurage, la extracción con solventes, entre otros.
1. Competencias
1. Extraer pigmentos vegetales y aceites esenciales.
Fundamento teórico
1. La maceración es una técnica basada en la transferencia del aceite esencial desde el órgano
vegetal hasta un medio líquido en el cual se encuentra sumergido. Para facilitar la transferencia,
previamente se debe machacar el órgano vegetal para romper las estructuras en las cuales puede
estar almacenado el aceite y facilitar su liberación.
2. La técnica de enfleurage consiste en la transferencia del aceite esencial a la grasa purificada (por
ejemplo, manteca vegetal).
76
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LOS INFORMES DE
EXPERIENCIAS PRÁCTICAS
Parte experimental
a. Extracción de pigmento vegetal de beterraga
Pesar 200g de trozos de betarraga en un beaker de 200 mL y cubrir con alcohol 96°. Tapar con
papel Parafilm y dejar macerar.
b. Extracción de aceite esencial de clavo de olor
Pesar 50g de clavo de olor y triturarlos / machacarlos con el mortero con pilón. Colocar la
muestra en un beaker de 50 mL. Cubrir con aceite vegetal, idealmente precalentado a 37oC.
Tapar con papel Parafilm y dejar macerar, idealmente a 37oC.
c. Extracción de aceite esencial de pétalos de rosas o de jazmín
Colocar la manteca vegetal en una placa de Petri y esparcir hasta formar una capa de
espesor intermedio con una espátula lo más uniforme posible. Triturar ligeramente los
pétalos de rosas y colocarlos sobre la manteca. Tapar y dejar que el aceite se difunda en
la manteca.
77
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS
VEGETALES Y ACEITES ESENCIALES
Este informe debe contener las siguientes partes:
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
78
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
79
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
PRÁCTICA N°13
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DEL ADN
Describir los método para la extracción del ADN
Logro de
aprendizaje:
Identificar los componentes y procesos de Reacción de Cadena de la
Polimerasa y electroforesis en gel de agarosa a través de videos
explicativos por parte del docente.
MATERIALES (para extracción de ADN)
I.
MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
Muestra: hígado de pollo. Los estudiantes por grupo deben traer a la práctica 100 g
de hígado de pollo.
Papel toalla
Marcadores indelebles para vidrio
01 piceta con agua destilada
03 beacker de 250 mL
04 probetas de 100ml
1 mortero (grande) con pilón
Agitador de vidrio
Balanza de precisión
1 embudo grande
1 luna de reloj
Gasa (20x 20)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
•
•
100 mL de NaCl al 2M
100 mL de alcohol al 96° (refrigerado a 4°)
IV. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
•
1g de Lauril sulfato de sodio
80
Manual de Práctica de Bioquímica
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 13
Métodos de extracción del ADN
El descubrimiento del ADN y la elaboración y refinamiento de técnicas para el estudio del ADN
han permitido grandes avances en el conocimiento del ADN y el análisis de su secuencia con
fines de investigación y de conocer, entre otros, las causas genéticas y moleculares de ciertas
patologías. Dichas técnicas han mostrado ser bastante versátiles, teniendo aplicación en
investigación, diagnóstico, ingeniería genética, análisis forense, entre otros.
Competencias
1. Extraer ADN del hígado de pollo a través de un método casero.
2. Reconocer los componentes y procesos involucrados en la Reacción de Cadena de
la Polimerasa y el gel de agarosa a través de videos y explicaciones dadas por el docente.
Fundamento teórico
✓
Extracción de ADN
Se basa en la separación del ADN de los demás componentes de la célula. Existen una gran
variedad de métodos de extracción, entre los que se encuentran métodos comerciales y caseros.
Los kits de extracción comerciales utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas
positivamente capaces de retener varios microgramos de ADN y separarlos del resto de las
biomoléculas, permiten obtener un extracto libre de inhibidores. Las membranas de sílice o perlas
magnéticas, las primeras están formadas por una resina y las segundas consisten en un centro
de hierro recubierto por resina. La membrana está insertada dentro de un microtubo de
polipropileno y las microesferas se encuentran suspendidas en una solución amortiguadora.
Durante la extracción, el ADN cargado negativamente se adsorbe o une a la matriz selectiva de
manera reversible y se mantiene unido a ésta durante la remoción de lípidos, proteínas y
metabolitos secundarios, posteriormente la molécula se libera de la matriz.
La cantidad de ADN que se extrae es un volumen en unidades de microlitros y con estos métodos
se obtienen un ADN de muy buena calidad de ADN en cuanto a pureza y este se puede emplear
de una vez para realizar pruebas de biología molecular.
En los métodos de extracción caseros, la cantidad de volumen es mayor y solo se puede
visualizar, la pureza del ADN es pobre en comparación a los métodos comerciales.
✓
Electroforesis en gel de agarosa (video)
Se basa en la separación de moléculas (ADN) por acción de un campo eléctrico en un gel según
su tamaño, su peso y su carga. Las moléculas de ADN tienen carga negativa, por lo tanto, se
desplazarán hacia el polo positivo. En su estructura, el gel de agarosa tiene poros. Las moléculas
más grandes tendrán mayor dificultad para pasar por los poros, por lo tanto, van a migrar más
lento y no avanzarán una gran distancia. Por otro lado, las moléculas más pequeñas pasarán a
través de los poros con mayor facilidad y migrarán más rápido, por lo tanto, recorrerán una
distancia mayor.
81
Manual de Práctica de Bioquímica
✓
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (video)
Consiste en la producción de un gran número de copias (amplificación) de un determinado
fragmento de ADN (ADN molde). Dicho fragmento es delimitado por los primers o cebadores
y es copiado por la polimerasa. Este proceso se da en tres etapas:
1. La desnaturalización (95oC), durante la cual se separan las cadenas de ADN
2. Hibridación, anillamiento o annealing (55 – 65oC), durante la cual los primers se unen al ADN
molde
3. Elongación (72oC), durante la cual la ADN polimerasa extiende los primers agregando uno a
uno los nucleótidos. Así se sintetiza la nueva cadena de ADN.
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LAS
EXPERIENCIAS PRÁCTICAS
Extracción de ADN
Parte experimental
1. Pesar en una balanza de precisión, 60 g de hígado de pollo. Apoyándose en una luna de
reloj.
2. Triturar el hígado pollo en un mortero, hasta obtener fragmentos pequeños y con apariencia
de un puré. Al triturar se pueden romper las membranas y se liberan los núcleos sueltos.
3. Añadir al triturado 30 mL de agua destilada. Remover hasta homogenizar.
4. A la mezcla obtenida, añadirle 30mL de cloruro sódico al 2M. Con esto conseguimos producir
el estallido de los núcleos para que queden libres de las fibras de cromatina.
5. A continuación, añadir 1 g de Lauril sulfato de sodio, mezclar por inversión, así nos quedará
el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas.
6. Filtraren un beacker, utilizando una gasa, medir el volumen obtenido en una probeta.
7. Medir el volumen del filtrado en una probeta.
8. Añadir por las paredes, el alcohol (previamente refrigerado a 4°C), hasta lograr un volumen
de 60 mL, para obtener dos fases claramente identificables. En la interfase precipita el ADN
9. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección. <sobre la varilla se van
adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la agrupación
de muchas fibras de ADN.
82
Manual de Práctica de Bioquímica
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE
EXPERIENCIA PRÁCTICA MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DEL
ADN.
Este informe debe contener las siguientes partes:
Apellidos
Nombres
N° Mesa
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO (S)
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
83
Fecha
Manual de Práctica de Bioquímica
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA
EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
ASPECTO /
CRITERIO A
EVALUAR
Introducción y objetivo (s)
de la práctica
Materiales y métodos
Procedimiento
experimental
Análisis de resultados
Conclusiones,
recomendaciones y
referencias
Niveles de desempeño
EN PROCESO
LOGRADO
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera correcta
Elabora una introducción y objetivo (s)
de la práctica de manera parcial
2 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera correcta
3.5 puntos
Desarrolla materiales y métodos de
manera parcial
4 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera correcta
2.5 puntos
Explica el procedimiento experimental
de manera parcial
5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis
de manera correcta
2.5 puntos
Describe los resultados y discusión de
los hallazgos evidenciando el análisis de
manera parcial
6 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera correcta
2.5 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones y referencias de
manera parcial
3 puntos
1 puntos
84
NO LOGRADO
Elabora una introducción y
objetivo (s) de la práctica de
manera incorrecta
0 puntos
Desarrolla materiales y
métodos
de
manera
incorrecta
0 puntos
Explica el procedimiento
experimental de manera
incorrecta
0 puntos
Describe los resultados y
discusión de los hallazgos
evidenciando el análisis de
manera incorrecta
0 puntos
Elabora
conclusiones,
recomendaciones
y
referencias de manera
incorrecta
0 puntos
Manual de Práctica de Bioquímica
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
OBLIGATORIAS
Bittencourt, J. (2018). The Power of Carbohydrates, Proteins, and Lipids. Disponible en:
https://www.researchgate.net/publication/322473648
Macías Alvia, A., Hurtado Astudillo, J. R., Cedeño Holguín, D. M., Cedeño Holguín, F. A., Scott
ÁLava, M., Vallejo Valdivieso, P. A., Macías Alvia, M. J., Santana Sornoza, J. W., Espinoza
Macías, M. J., Ubillús Saltos, S. P., Arteaga Espinoza, S. X., Torres Macías, O. E., Pigüave
Reyes, J. M., Pigüave Reyes, Chavarría Cedeño, D. I., & Intriago Sánchez, K. J. (2018).
Introducción al estudio de la bioquímica. https://doi.org/10.17993/CcyLl.2018.28
Nelson, D. L., y Cox, M. M. (2017). Lehninger Pinciples of Biochemistry (7.a Edición). W.H Freeman
Macmillan Learning.
Salazar, J., Salazar, Y. y Sotelo, J. (2021). Manual de prácticas de Bioquímica. Universidad
Científica del Sur.
DE CONSULTA
Alejos Velázquez, LP., Aragón Martínez, M., Romero, A. Extracción y purificación de ADN.
Herramientas
moleculares
aplicadas
en
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
ecología.
Guinn G. 1966. Extraction of nucleic acids from lyophilized plant material. Plant Physiology 41:
689-695.
Cuadros
Trillos,
G.
(2019).
Mapas
conceptuales
http://elibro.net.cientifica.remotexs.co/en/lc/ucsur/titulos/128368
Melo,
V. y Cuamatzi, O. (2019). Bioquímica
https://elibro.net/es/ereader/ucsur/127790
de
los
en
procesos
bioquímica.
metabólicos.
Müller-Esterl, W. (2020). Bioquímica: fundamentos para medicina y ciencias de la vida.
http://elibro.net.cientifica.remotexs.co/en/lc/ucsur/titulos/129564
Piña Garza, E., Martínez Montes, F., Riveros Rosas, H., Laguna, J. y Pardo Vázquez, J.P. (2018).
Bioquímica de Laguna y Piña (7.a ed.). Editorial El Manual Moderno.
Pulido Villamil, X. C. (2019). Prácticas de bioquímica y estudios de casos en ciencias de la salud.
http://elibro.net.cientifica.remotexs.co/en/lc/ucsur/titulos/142510
Simes, L. E. (2020). Introducción a la bioquímica: interpretación de análisis clínicos.
http://elibro.net.cientifica.remotexs.co/en/lc/ucsur/titulos/172171
Timberlake, K. (2013). Química general, orgánica y biológica: estructuras de la vida. México:
Pearson Educación
85