Subido por Rosales Reséndiz Michelle

PROTOCOLO LIC VII Rosales Resendiz Michelle

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Efecto de la epinefrina en concentraciones fisiológicas sobre los factores de
virulencia de Mannheimia haemolytica.
Rosales Resendiz Michelle
Tutor: Erasmo Negrete Abascal
La familia Pasteurellaceae alberga a un amplio grupo de bacterias relacionadas con
enfermedades económicamente importantes para la industria ganadera, causantes
de infecciones zoonóticas en humanos. Los organismos colonizan principalmente las
membranas mucosas, Mannheimia haemolytica (Mh) ha sido aislada del tejido que
compone el tracto respiratorio superior, orofaringe, tracto reproductivo y, en
ocasiones, de partes del tracto intestinal de un amplio grupo de especies. 6, 13, 29
Mh es una bacteria patógena anteriormente nombrada como Pasteurella haemolytica.
y agrupada en el género Mannheimia; incluye a los serotipos A 1, 2, 5-9, 12-14, 16 y
27, aislados únicamente de rumiantes. Morfológicamente se identifica a Mh como un
cocobacilo Gram negativo, no móvil, encapsulado que forma colonias lisas de color
blanco grisaceo de 1-2 mm de diametro después de incubación en medio TSB. Es
mesófila, de metabolismo aerobio o anaerobio facultativo, oxidasa positiva e indol
negativa, de igual manera es negativa para pruebas de rojo metilo, gelatinasa y
Voges-Proskauer. Crece en agar McConkey y en medios enriquecidos como agar
chocolate o agar sangre, produciendo beta hemólisis (agar sangre de bovino), y es
parcialmente resistente a la fagocitosis debido a las propiedades de su cápsula. 2, 7, 20.
Mh está estrechamente relacionado con las infecciones del tracto respiratorio de
bovinos y ovinos, se considera un habitante común de las criptas amigdalinas de
ganado sano que en situaciones de estrés se multiplica e invade el tejido pulmonar
durante la inhalación, provocando infección activa en el epitelio alveolar. De igual
forma se relaciona con procesos neumónicos, septicémicos y de mastitis. Suele
afectar a animales menores de un año recién transportados y, con mayor incidencia,
a becerros de 1 a 5 meses de edad; aunque también puede ser aislada de organismos
sanos. En la industria ganadera, las enfermedades respiratorias son la causa principal
de morbilidad, mortalidad y de pérdidas de ganado vacuno destinado al consumo. 3, 22,
23, 27, 32.
En Mh se han reportado toxinas relacionadas directamente con la especificidad con
su hospedero así como con sus factores de virulencia sobre el mismo. Las
leucotoxinas (Lkt) son un grupo de exotoxinas cuyo efecto primario se ejerce contra
los leucocitos, específicamente sobre células polimorfonucleares. Estas proteínas
provocan un amplio rango de efectos secundarios sobre los leucocitos, su producción
se ha relacionado directamente con el crecimiento de Mh en infecciones pulmonares,
así mismo, se ha evidenciado que la actividad citotóxica del extracto de Mh fue mayor
en leucocitos y plaquetas de rumiantes que en caballos, cerdos y
humanos.12-14, 27, 35.
La epinefrina, comúnmente conocida como adrenalina, es un neurotransmisor
perteneciente al grupo de las catecolaminas de interés clínico. Estos compuestos
están formados por un grupo catecol (orto-dihidroxibenceno) y una cadena lateral
con un grupo amino, se sintetizan en la médula adrenal de las glándulas suprarrenales
y son liberadas directamente al torrente sanguíneo. Se caracterizan por sus funciones
en la regulación de procesos fisiológicos al estimular los receptores adrenérgicos de
las células receptoras. En el sistema respiratorio, la epinefrina mediante los
receptores β2 adrenérgicos produce efectos broncodilatadores y reduce las
secreciones bronquiales (efecto α-adrenérgico).9, 31.
En 2018, Pillai et al. desarrollaron un modelo in-vitro de la biopelícula formada por Mh
bajo el efecto de compuestos estresantes: epinefrina (E), norepinefrina (NE) y
sustancia P (SP), donde E tuvo la mayor efecto en la dispersión de la biopelícula,
seguido de NE y SP. Ellos concluyen que este modelo, aplicado in-vivo, implicaría a
estos agentes como coadyuvantes en las primeras etapas de la neumonía causada
por Mh.
Betancourt (2020) determinó el impacto de E y NE en el crecimiento poblacional, la
expresión de proteínas, la actividad proteolítica y la formación de biopelículas de
Actinobacillus seminis. En su trabajo se reporta que, aunque las catecolaminas
utilizadas no indujeron cambios significativos en el crecimiento de A. seminis, existen
cambios en los patrones de proteínas, zimogramas e inmuno reconocimientos, así
como un aumento en la dispersión de biopelículas.
Se ha estudiado ampliamente el efecto de las hormonas en miembros de la familia
Pasteurellaceae. Al estar relacionado con enfermedades económicamente
importantes para la industria ganadera, es importante estudiar los factores que
afectan la virulencia de Mh, como lo es la epinefrina.
OBJETIVO GENERAL
● Determinar el efecto de la Epinefrina sobre el crecimiento y la expresión
proteíca de Mannheimia haemolytica.
OBJETIVOS PARTICULARES
● Determinar el efecto de la epinefrina sobre el crecimiento de M. haemolytica.
● Determinar los patrones de proteínas totales y secretadas por Mannheimia
haemolytica en presencia de epinefrina a diferentes concentraciones.
● Observar el efecto de los diferentes tratamientos de epinefrina sobre la
actividad proteolítica de Mannheimia haemolytica.
MATERIALES Y MÉTODOS.
CRECIMIENTO BACTERIANO.
La obtención de la cepa y el mantenimiento del cultivo se llevó a cabo de acuerdo a
lo reportado por Mortes-García (2015) y Betancourt (2020), así como todas las
técnicas reportadas.
Para el crecimiento bacteriano se utilizó medio Infusión de Cerebro y Corazón (BHI),
donde se realizó un pre-cultivo de la cepa de Mh (ATCC 31612) donada por el Dr.
Edgar Zenteno (Facultad de Medicina, UNAM) en un tubo de ensayo con 3 ml de
BHI y se dejó creciendo en agitación (150 rpm) a 37° C durante 24 horas.
Posteriormente se sembró en agar sangre para su mantenimiento.
CINÉTICA DE CRECIMIENTO.
La determinación del efecto de los diferentes tratamientos de epinefrina en el
crecimiento de Mh se realizó una cinética de crecimiento; se cultivó la cepa de Mh en
3 mL de caldo BHI, una alícuota de este cultivo se diluyó en 3 mL de caldo para
llevarlo a una concentración del 10% y se incubó a 37 y 39 °C en agitación hasta
alcanzar una densidad óptica de 0.1. En ese momento se añadirán 10, 20, 30,
40 y 50 ng/ml de E y como control se uso medio sin epinefrina. Se realizaron
mediciones cada hora durante 6 h a 600 nm, la última medición fue leída a las 24 h.
Se realizó prueba de pureza sobre placas de agar BHI y estas fueron incubadas a
37ºC durante 24 h.34
OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS.
Las proteínas totales y secretadas se obtuvieron mediante cultivos en 100 mL de
medio con la cepa ATCC 31612. Una vez alcanzada la densidad óptica de 0.1 a 600
nm se agregaron 10, 20, 30, 40 y 50 ng/ml de E, estos cultivos se incubaron a 37 y
39 °C. Los cultivos se centrifugaron a 10500 rpm durante 25 minutos a 8°C, el
sobrenadante de cultivo fue precipitado con 100 ml de etanol para recuperar las
proteínas secretadas. La pastilla celular fue resuspendida con una solución de
HEPES 10 mM pH 7.8 con lisozima (1 mg/mL) y se incubaron en agitación a 150
rpm a 37°C durante 1 hora, posteriormente las células se sonicaron 10 ciclos
(15 segundos de sonicación por 10 segundos de descanso) en baño frío. Las
muestras se centrifugaron a 13400 rpm durante 3 minutos para separar las células
enteras, se recuperará el sobrenadante (proteínas totales).
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y ELECTROFORESIS.
Para identificar los cambios en los patrones de proteínas inducidos por los diferentes
tratamientos y su peso molecular relativo, se realizó una separación electroforética en
geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) al 10%. Previo a
ello se determinó la concentración de proteína por muestra por método de Bradford y
se cargaron 10 μg de proteína por carril. Se corrieron a 90V durante 120 min y
posterior a ello se tiñeron los geles con una solución de Azul de Coomassie (R-250
0.1%, metanol 40% y ácido acético 10%), se utilizó una solución de ácido acético
al 10% para retirar el exceso de colorante.8, 16.
ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA.
La actividad proteolítica se identificó mediante zimogramas en geles SDS-PAGE al
10% con 0.1% de gelatina porcina. Posterior a la separación electroforética, los geles
de sustrato se incubaron en agitación durante 1 h en una solución de tritón X-100 al
2.5%. Enseguida, los geles fueron incubados en Tris 20 mM CaCl 210 mM toda la
noche a 37 °C para activar las posibles proteasas que degradan el sustrato. Los geles
fueron teñidos con azul de Coomassie y las actividades proteolíticas fueron
observadas como zonas blancas contra un fondo azul.15, 28.
WESTERN BLOT
Cuando obtenemos la separación electroforética, se realizó una electrotransferencia
a una membrana de nitrocelulosa. Ésta se bloqueó con leche al 5% en PBS-Tween20 al 0.5% y tras lavar la membrana con Buffer PBS-Tween-20, se adicionó como
anticuerpo primario suero bovino agudo y agitó a 80 rpm durante dos horas a
temperatura ambiente. Después, se recuperó el suero y se lavó la membrana, se
adicionó suero α (anti) bovino como anticuerpo secundario y se dejó en agitación
durante dos horas. Finalmente, se realizó un revelado químico de la membrana para
su posterior análisis.25
CRECIMI
M. haemolytica ATCC
CINÉTIC
BHI 3ml, alícuota de
10%. 37 y 39 °C
OBTENC
BHI 100 ml, 37 y 39 °C
Control, 10, 20, 30, 40 y
PROTEÍN
EXTRAC
Método
Gel SDS-
ELECTR
Gel SDS-
ZIMOGR
WESTER
Figura 1. Diagrama de metodología utilizada para la evaluación de los factores de
virulencia de Mannheimia haemolytica.
RESULTADOS
Se evaluó el crecimiento y el patrón proteico de de Mh. incubada a 37°C bajo
concentraciones fisiológicas de epinefrina (100, 200 y 500 pg) y en concentraciones
mil (10, 20 y 50 ng) y un millón veces mayor (1, 10 y 20 μg) encontrando mayores una
respuesta más significativa en concentraciones mil veces mayores a las fisiológicas
(datos no mostrados). 10, 33, En la evaluación del crecimiento de Mh a 37 °C se observó
que las concentraciones de 10, 20, 30, 40 y 50 ng/ml epinefrina no favorecen el
crecimiento respecto al control (Gráfico 1); esto ocurre también en el crecimiento a 39
°C, únicamente en la concentración de 50 ng/ml de epinefrina el crecimiento se ve
desfavorecido respecto al control (Gráfico 2).
Gráfico 1. Cinética de crecimiento de Mannheimia haemolytica a 37°C en presencia
de epinefrina (Control, 10, 20, 30, 40 y 50 ng/ml).
Gráfico 2. Cinética de crecimiento de Mannheimia haemolytica a 39°C en presencia
de epinefrina (Control, 10, 20, 30, 40 y 50 ng/ml).
En el patrón de proteínas de extractos totales se pudieron observar cambios en la
expresión de proteínas, principalmente en todas las muestras a las que se les
añadieron diferentes volúmenes de epinefrina y que se incubaron a 39°C. En el gel
se presentan cambios en las bandas en pesos aproximados de 24, 27, 60 y 75 kDa
que no se aprecian visiblemente en el control. Así mismo, las bandas con tratamiento
de epinefrina con peso molecular de 100 kDa se muestran con mayor intensidad
respecto al control (Figura 2). No se apreciaron cambios trascendentes en los
tratamientos incubados a 37°C.
25
15
0k
0k
D
10
D
75
0k
kD
D
3
7°
C
3
9°
C
50
kD
37
kD
25
kD
20
kD
con
trol
10
20
ng/
ng/
ml
ml
SDS-Page
30
40
50
ng/ ng/
ng/
ml
ml
al 10%. Patrónmlde
con
trol
10
20
ng/ ng/
mltotales
ml
proteínas
30
40
50
ng/
ng/
ng/
ml
ml
ml
de Mannheimia
Figura 2. Gel
haemolytica en presencia de epinefrina (10 - 50 ng/ml)
De la igual forma, en el patrón de proteínas secretadas se presentaron cambios en la
expresión de proteínas de ambos ensayos (37 y 39°C). En ambas temperaturas se
pueden observar cambios en las bandas a un peso de 21 y 25 kDa en los volúmenes
de 30 y 50 ng/ml de los ensayos a 37°C y en los volúmenes de 30, 40 y 50 ng/ml de
epinefrina de los ensayos a 39°C; también a 39°C se puede observar que se
presentan cambios en las bandas a un peso de 35 y 100 kDa en las muestras con
epinefrina (Figura 3).
37
°C
39
°C
25
0
15
k
0
D
k
10
D
0
75
k
k
D
D
50
k
D
37
k
D
25
k
D
20
k
D
Figura
co
10
20
30
40
50
co
10
20
30
40
50
nt
3. Gel
de proteínas
secretadas
por Mannheimia
nt SDS-Page
ng/ ng/al 10%.
ng/ Patrón
ng/
ng/
ng/ ng/
ng/
ng/
ng/
ro
ml ng/ml)
presencia
de
(10
ro haemolytica
ml ml en ml
ml
mlepinefrina
ml - 50
ml
ml
ml
l
l
Se realizó un zimograma con sustrato de gelatina porcina para identificar la actividad
proteolítica de las proteínas secretadas por Mh incubada a 37 y 39°C en presencia
de epinefrina. En él se pudo observar alta actividad en el tratamiento de 10 ng/mL a
39°C distribuida en pesos moleculares de 50 a 80 kDa aproximadamente. De igual
forma se presenta ligera actividad en los tratamientos de 30 y 40 kDa a 37°C en los
pesos moleculares de 45 y >250 kDa (Figura 4).
25
15
0k
0k
D
10
D
75
0k
k
D
D
3
7
°
C
3
9
°
C
50
k
D
37
k
D
25
k
D
20
k
con 10
20
30
40
50
con 10
20
30
40
50
D
Figura 4. Zimograma
(Gel SDS-Page
al 8%)ng/
de lasng/muestras
trol ng/ con
ng/ gelatina
ng/ porcina
ng/
ng/
trol ng/
ng/
ng/
de proteínas secretadas
haemolyticamlen presencia
epinefrina.
ml
mlpor Mannheimia
ml
ml
ml
ml
ml de ml
ml
Por último, se realizó un western blot para confirmar la presencia de proteínas tipo
proteasas dentro de las muestras, la inmunogenicidad se determinó usando suero de
bovino agudo. Con ello se observó reconocimiento a 10, 55 (más intensa), 45, 40, 35,
27, 25, 23 (más débil) kDa en los tratamientos con epinefrina a 37 y 39°C (Figura 5).
25
15
0k
0k
10
D
D
75
0k
kD
D
37
°C
39
°C
50
kD
37
kD
25
kD
20
kD
Figura 5.
con
trol
10
20
30
40
50 con
10
20
30
40
ng/
ng/
ng/ ng/
ng/ trol
ng/
ng/ ng/
ng/
Inmuno ml
reconocimiento
de ml
proteínas
ml
ml de
mllas muestras
ml
ml secretadas
ml
ml
Mannheimia haemolytica en presencia de epinefrina.
50
ng/
por
ml
DISCUSIÓN
Aunque actualmente se conoce mucho acerca de los factores de virulencia de Mh y
cómo estos le ayudan a causar infecciones en rumiantes al pasar de hospedero de
su microbiota a un importante patógeno, aún es poco explorado el comportamiento
de estos factores frente a agentes estresantes, como lo es el aumento de la
epinefrina.19 Mh es ampliamente estudiada por ser un organismo de alta importancia
en la industria ganadera, pues se ha aíslado de ganado joven con cuadros de
neumonía aguda; así mismo, en esta industria el ganado se somete a muchos
procedimientos que alteran las concentraciones de hormonas relacionadas al estrés
debido al impacto que la manufactura tiene sobre los animales, por ello es importante
evaluar el comportamiento de Mh frente a estas variaciones. 11, 18, 26.
Anteriormente se ha reportado un efecto positivo en el crecimiento de bacterias
patógenas gram negativas inducida por las catecolaminas relacionadas al estrés que
son secretadas por el sistema nervioso entérico, sin embargo, en este trabajo el
crecimiento de Mh en presencia de epinefrina no se ve favorecido. Esto concuerda
con lo reportado por Betancourt (2020), que tampoco observó efectos significativos
en el crecimiento de Actinobacillus seminis en presencia de epinefrina y
norepinefrina.
Por otro lado, los factores de virulencia de Mh son otro aspecto importante a evaluar
debido a su intervención en el proceso de infección. Las proteasas son productos
secretados por las bacterias que pueden tener un papel importante en el proceso de
patogénesis, su alcance como factor de virulencia reside en su capacidad para actuar
como un factor tóxico que promueve la colonización en el hospedero.1, 30. La actividad
proteolítica obtenida presentó pesos moleculares de 50 a 80 kDa a 39°C y 45 y >250
kDa a 37°C en presencia de epinefrina; las proteasas reportadas previamente para
Mh se señalaron a pesos moleculares de 35.2 kDa y 64 kDa. 4,36 Esto podría
indicar que se trata de proteasas similares, sin embargo, se recomienda identificar
el tipo de proteasas a partir de inhibidores.
Finalmente, la leucotoxina es el factor de virulencia más estudiado en Mh debido a su
papel principal en la lisis de leucocitos y por tanto en la disminución de la capacidad
inmunológica del animal. En la prueba de inmuno reconocimiento se pudo observar
una intensa banda alrededor de 100 kDa, similar a la reportada por Morales-Álvarez
(2004), esto sugiere que la leucotoxina se hace presente aun en presencia de
epinefrina.
CONCLUSIONES
➔ La epinefrina a en volúmenes de ng/mL no favorece el crecimiento de
Mannheimia haemolytica.
➔ A una temperatura de 39°C se ve favorecida la expresión de proteínas en
presencia de volúmenes de epinefrina de 10 a 50 ng/mL.
➔ Un volumen de epinefrina a 10 ng/mL favorece la producción de probables
proteasas.
➔ A concentraciones de 10 a 50 ng/ml de epinefrina a 90 ng/mL se favorece la
expresión de leucotoxina.
➔ La leucotoxina sigue presente aun en presencia de volúmenes de epinefrina
en ng/mL a 37 y 39°C
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