UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA FACULTAD DE INGENIERIA EN CIENCIAS PECUARIAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA ZOOTECNISTA CÁTEDRA : MICROBIOLOGÍA - PRÁCTICA DOCENTE : M.Cs.Q.F. ROSALES LOREDO CARLOS MANUEL INFORME “FUNDAMENTOS DE LA COLORACIÓN GRAM” CICLO : IV GRUPO : A1 ESTUDIANTE : BAUTISTA TERRONES, Gilmer. Cajamarca, Perú, marzo de 2021 RESUMEN La coloración Gram, también conocida como tinción de Gram, es una técnica de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las bacterias. Fue diseñado por Christian Gram, un científico danés, en el año 1984. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba resulto todo un éxito y pronto se convirtió en una prueba muy útil no solo para el estudio de las bacterias sino también para identificarlas rápidamente en una infección y entre una de las bacterias más estudiadas de la Escherichia coli. Por su gran importancia en la flora intestinal, esta bacteria de bacilos Gram negativos usa el método de tinción de Gram ya que pertenece al gran grupo de bacterias Gram negativas que puede causar infecciones en humanos. El objetivo del informe es saber el método de la coloración Gram para identificar y estudiar las bacterias. I. INTRODUCCIÓN La coloración Gram el cual debe su nombre al investigar Christian Gram (1884), está técnica de coloración se emplea para la visualización de bacterias, las cuales se diferencian dos grupos la Gram positiva y la Gram negativa; esto se debe a su composición de su pared celular, también es utilizado para poder referirse a la morfología. La coloración Gram se refiere más de un tipo de colorantes, una coloración Gram típicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario el cual se utiliza para teñir a todas las células en la tinción; enseguida un paso de coloración, el cual remueve el colorante sólo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe las células recién decoloradas, pero no tiene efecto sobre las células que aún retienen el colorante primario. En el ultimo cuando se añade la safranina, las células Gram positiva siguen de color azul – violeta mientras que las Gram negativas observen el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas serán del color del cristal de violeta, o colorante primario, y las células Gram negativas serán del color de la safranina que es el colorante de contraste. II. OBJETIVOS 2.1 Objetivos General. Conocer el concepto, fundamentos de la tinción Gram 2.2 Objetivos Específicos. Determinar la tinción de Gram y su procedimiento Identificar la tinción de Gram como estudio para las bacterias Mencionar los diferentes métodos de la coloración Gram. Considerar la importancia de la detección y atención de la bacteria. III. MARCO TEÓRICO PREPARACIÓN DE UN FROTIS Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando son colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el porta objetos, donde puede visualizarse con facilidad. En 1884, un bacteriólogo danés, Christian Gram, desarrolló una técnica de tinción que permite separar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas, basados en si retienen o no, el colorante primario (cristal violeta) luego del proceso de decoloración. Los organismos que retienen el cristal violeta luego de la adición del agente decolorante, el alcohol, aparecen como azul oscuro o violeta, y se designan como Gram positivos; aquellos que pierden el cristal violeta y se tiñen con el colorante secundario, la safranina, aparecen como rojos y se designan como Gram negativos. BACTERIAS GRAM POSITIVAS Poseen una pared celular interna y una pared de peptidoglucano. Peptidoglucano es un exoesqueleto que da consistencia y forma esencial para replicación y supervivencia dela bacteria, no tienen membrana externa, conservan el complejo yodo colorante. La penicilina mata a las Gram positivas, ya que bloquea la formación de enlaces peptídicos entre las diferentes cadenas del peptidoglucano; Son esporulantes y no esporulantes, como Streptococcus, Cisteria, Frankia. Poseen otros componentes: ácidos teicoicos y lipoteicoicos, y polisacáridos complejos. BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Poseen una pared celular más compleja está conformada por pared celular interna, pared de peptidoglucano, bicapa lipídica externa; posee membrana externa. La penicilina no mata a las Gram negativas, a causa de la capa de lipopolisacárido situada en la parte externa de la pared celular este tipo de bacterias quedan decoloradas y pierden el complejo yodo colorante; pueden ser anaerobios o aerobios y poseen proteínas con concentraciones elevadas. LUGOL El Lugol o disolución de Lugol es una disolución de yodo molecular y yoduro potásico en agua destilada. Se preparó por primera vez en 1829 y recibe su nombre en honor al médico francés Jean Guillaume Auguste Lugol. Se emplea en microbiología en la tinción de Gram para retener el colorante cristal violeta, también se utiliza como contraste visual en parasitología; se utiliza esta disolución como indicador en la prueba del yodo, que sirve para identificar polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por presentar distintos colores según las ramificaciones que presente la molécula de polisacárido. CRISTAL VIOLETA (violeta genciana) Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-Penta y N-hexametil p-rosanilinas. Por la mezcla de diferentes versiones, el fabricante puede crear diferentes tonos de violeta en el colorante final. Cuanto más metilado esté el colorante, su color será de un violeta más oscuro. En la forma pura, el cristal violeta se presenta como cristales de color azul verdoso brillante. Su punto de fusión está entre 194°-189°C. Los violetas de metilo son solubles en agua, etanol, di etilenglicol, y dipropil englicol. El violeta de metilo 10B es conocido como violeta de genciana y es el ingrediente activo en el colorante de Gram, usado para clasificar bacterias. El violeta de genciana destruye células, y es usado en desinfectante de intensidad moderada externo. El violeta de genciana es muy venenoso para la mayoría de los animales, cachorros y gatos incluidos; no debe ser usado para desinfección de la piel de estos animales. SAFRANINA La safranina O es un colorante biológico también conocido como dimetil safranina y rojo básico 2, se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G-. ¿QUÉ ES LA COLORACIÓN GRAM? La coloración Gran es una tinción diferencial muy utilizada en Bacteriología para observar bacterias en muestras clínicas. Debe su nombre a Christian Gram (1984). FUNDAMENTOS El fundamento de la coloración Gram se basa en las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano (retiene el complejo colorante – mordiente) y dos clases de ácido teicoico. La pared celular de las bacterias Gram negativas tiene una capa de peptidoglucano más fina (facilita la salida del complejo colorante – mordiente) Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como mureína). Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero, por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicano, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros, cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violeta La tinción de Gram es utilizada comúnmente como estudio para la bacteria Escherichia coli. Ella está integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, móviles conflagelos peritricos o inmóviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar Mac Conkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores, esto quiere decir que pertenece a ese gran grupo de bacterias Gram negativas. IV. CONCLUSIONES Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se presentan morfológicamente como cocos o bacilos, sin embargo, al ejecutar tinción de Gram en estas para identificar su grupo taxonómico, las Gram positivas se tiñen de color violeta mientras que las Gram negativas se tiñen de color rosado. Mediante la tinción de Gram se identifican bacterias Gram positivas y Gram negativas gracias al color que tornan después de ser teñidas; en el caso de las bacterias Gram positivas se tiñen de violeta, esto se debe a que gracias a que contienen una pared gruesa de peptidoglicano y gran cantidad de ácidos teicoicos que permiten fijar y retener rápidamente el colorante inicial el cual es, el cristal violeta de Hucker, y además son resistentes a la decoloración. Lo contrario ocurre con el caso de las Gram negativas, las cuales poseen una pared delgada con menos cantidad de peptidoglicano y lípidos, la cual requiere de un colorante de contra tinción como la safranina o la fucsina en este caso, ya que el colorante inicial es fácilmente retirado en la decoloración con alcohol, debido a que por su delgada pared celular no lo retienen. La tinción de Gram permite conocer la morfología celular, el tamaño, la forma y su clasificación taxonómica (Gram positivos o Gramnegativos) de acuerdo al color que tornan las bacterias después de la tinción, sin embargo, no permite conocer la especie o género de la bacteria al cual pertenece. Las colonias de bacterias a las que se les realizó tinción de Gram se tomaron de una muestra de suelo, lo cual explica la presencia de estas bacterias, debido a que en el suelo predominan las bacterias Gram negativas. Sin embargo, en el suelo también se encuentran bacterias Gram positivas, pero en menor proporción que las Gram negativas, lo cual también explica la presencia de estas bacterias en el suelo. De acuerdo a esto Fue posible observar bacterias Gram negativas con forma de bacilo (con forma de barra o vara) y Gram positivas como Staphylococcus sp. V. BIBLIOGRAFÍA Díaz Camilo (2011). Definición de tinción. Santambrosio Eduardo. (2009). tinción de Gram. [En línea]. Disponible:/biotecnología/practico4.pdf. González Juan. Definición de peptidoglicano, lipopolisacárido. Martínez Roberto. (2009). Bacteria Gram positiva ácido teicoico y