histo

• 1: Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas
•
• Leslie P. Gartner - Texto de Histologia Atlas a Color (2021) - libgen.li.pdf
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• La histología es el estudio microscópico de los tejidos de organismos vivos, ya sean
animales o plantas, pero en este libro describimos solamente tejidos de mamíferos,
más específicamente, humanos. No obstante, el término ha evolucionado hacia un
concepto más amplio, denominado anatomía microscópica, dado que su objeto de
estudio comprende no solo la estructura microscópica de los tejidos, sino tambien la
de la célula, los órganos y los sistemas que estos forman.
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• El organismo está compuesto por células, matriz extracelular y una sustancia fluida
, el líiquido extracelular (o tisular), que baña estos componentes.
• El líiquido extracelular, que procede del plasma sanguíneo, lleva nutrientes, oxígeno
y moléculas de señalización a las células del organismo. En el sentido contrario, los
productos de desecho, el dióxido de carbono, las moléculas de señalización y otros
productos liberados por las células llegan a la sangre y a los vasos linfáticos a través
del líquido extracelular. Este líquido, así como buena parte de la matriz extracelular,
no es apreciable en las preparaciones histológicas rutinarias, pese a lo cual los
estudiantes de histología deben tener en cuenta su presencia invisible.
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• Además., el objeto de la histología no se centra simplemente en la estructura
microscópica del cuerpo: contempla también sus aspectos funcionales.De hecho, la
histología guarda una relación directa con otras disciplinas y es esencial para
comprenderlas. Así pues, en este libro se entrelazan los campos de la biología
celular, la bioquímica, la fisiología, la embriología, la anatomía macroscópica y,
cuando resulte pertinente, la anatomía patológica. Los estudiantes han de ser
conscientes de la importancia de esta interrelación cuando acudan al presente libro
más adelante en su carrera profesional. Un ejemplo muy claro de este vínculo se
hará evidente cuando el lector estudie la histología del riñión y comprenda que la
compleja y casi insuperable estructura de este órgano (hasta el nivel molecular) es la
responsable de la capacidad que tienen los riñones de llevar a cabo su función. A las
alteraciones de la estructura renal se debe un gran número de enfermedades
potencialmente mortales. Otro ejemplo es la estructura microscópica, e incluso
molecular, de las células musculares. Su capacidad para contraerse depende
intrinsecamente de la organización microscópica, submicroscópica y molecular de
sus diversos componentes.
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• En el resto del presente capítulo se exponen los métodos utilizados por los expertos
en histología para estudiar la anatomía microscópica del cuerpo humano.
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• Microscopia óptica
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• Preparación de los tejidos
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• Entre las etapas necesarias para preparar tejidos de cara a observarlos al
microscopio óptico se encuentran: 1) la fyación; 2) la deshidratación y el aclarado: 3)
la inclusión; 4) el corte, y 5) el montaje y la Tinción de los cortes.
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• Se han desarrollado numerosas técnicas dirigidas a preparar tejidos para su
estudio, de manera que se asemejen al máximo a su estado natural in vivo. Las
etapas que se aplican Reciben los nombres de fijación, deshidratación y aclarado,
inclusión en un medio adecuado, corte en finas secciones que permitan un estudio
por transiluminación, montaje sobre Una superficie que facilite su manejo, y tinción,
de tal forma que sea posible diferenciar los distintos componentes que integran los
tejidos y las células.
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• Fijación
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• La fijación no solo retrasa las alteraciones del tejido después de la extracción del
organismo, sino que además mantiene su arquitectura normal. Los agentes de
fijación más habituales Utilizados en microscopia 6ptica son el formol en tampón
neutro y la solución de Bouin. Estas dos sustancias crean enlaces cruzados en las
proteinas, con lo cual evitan que se Modifique su posición y preservan una imagen
del tejido similar a la viva Deshidratación y aclarado
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• Los baños alcohólicos, primero con alcohol al 50% y después, paso a paso, hasta
legar a alcohol al 100%, se emplean para eliminar el agua del tejido (deshidratación),
el cual se trata a Continuación con xileno, un producto químico miscible con el
alcohol y con la parafina fundida. Este proceso recibe el nombre de aclarado, dado
que el xileno hace que el tejido se Vuelva transparente.
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• Inclusión
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• Los tejidos se incluyen en un medio adecuado y después se seccionan en cortes
finos. En microscopia óptica, el medio de inclusión más habitual es la parafina.Se
coloca el tejido en Parafina fundida hasta que queda totalmente infiltrado y después
se introduce en un pequeño recipiente, recubierto con parafina fundida. Y se deja
que se endurezca hasta formar un Bloque de parafina que contiene dicho tejido.
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• Corte
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• Los bloques de tejido endurecidos se recortan para retirar el exceso de material de
inclusión y después se montan para proceder a su corte en un micrótomo, con el cual
se obtienen Cortes finos del bloque. En microscopia óptica, el grosor de corte es de
aproximadamente 5-10 um, y cada corte, o serie de cortes, se monta (o coloca)
sobre un portaobjetos de vidrio.
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• El corte puede realizarse asimismo en muestras . que han sido congeladas en
nitrógeno líquido o en la barra de congelación rápida de un criostato, Los cortes se
montan con ayuda de Un medio de congelación rápida y se seccionan a
temperaturas bajo cero con una cuchilla de acero previamente enfriada.Se colocan
los cortes en portaobjetos previamente enfriados, se deja que se atemperen a
temperatura ambiente y se tiñen con colorantes especificos (o bien se tratan para
realizar estudios de histoquímica o inmunocitoquímica).
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• Montaje y tinción
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• Los cortes de parafina se montan (o se colocan) en portaobjetos de vidrio y
después se tiñen con colorantes hidrosolubles que permiten la diferenciacion de los
diversos componentes celulares.
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• Los cortes empleados en microscopia óptica convencional se montan en
portaobjetos de vidrio recubiertos con material adhesivo. Dado que muchos
constituyentes tisulares poseen Aproximadamente las mismas densidades ópticas,
es preciso teñirlos para facilitar su estudio por microscopia Óptica, principalmente
con colorantes hidrosolubles.En consecuencia.
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• Primero es necesario retirar la parafina de los cortes montados, después de lo cual
se rehidrata y se tiñe el tejido. Una vez realizada la tinción, se vuelve a deshidratar el
corte de manera que el cubreobjetos pueda fijarse de forma permanente mediante el
empleo de un medio de montaje adecuado. EI cubreobjetos no solo protege el tejido
de posibles dañios y del Secado, sino que es necesario para ver el corte al
microscopio.
• Los colorantes pueden agruparse en las tres clases siguientes:
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• Los que diferencian entre componentes ácidos y básicos de la célula.
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• Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz
extracelular.
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• Sales metálicas que forman un depósito metálico en los tejidos.
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• Los colorantes utilizados habitualmente en histología son la hematoxilina y la
eosina (H&E). La primera es una base que se une preferentemente a los
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componentes ácidos de la Célula, como el ácido desoxiribonucleico (ADN) y el ácido
ribonucleico (ARN), tiñéndolos de azul; se dice que estos componentes de la célula
son basófilos. La eosina es un ácido que se une a componentes del citoplasma
tienen un pH básico, tiñéndolos de color rosa:; se dice que estos elementos de la
célula son acidófilos. Se han desarrollado muchos otros Colorantes para el estudio
histológico (tabla 1.1).
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• Tabla 1.1
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• Colorantes histológicos comunes y sus reacciones
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• Reactivo
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• Resultado
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• Hematoxilina
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• Azul: núcleo, regiones ácidas del citoplasma, matriz de cartlago
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• Rosa: regiones básicas del citoplasma, fibras de colágeno
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• Azul oscuro: núcleos
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• Rojo: músculo, queratina, citoplasma
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• Azul claro: mucinógeno, colágeno
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• Azul: fibras elásticas
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• Negro: fibras reticulares
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• Eosina
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• Tricrómico de Masson
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• Tinción elástica de Weigert
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• Tinción argéntica
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• Hematoxilina férrica
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• Negro: estriaciones de músculos, núcleos, eritrocitos
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• Ácido peryódico de Schiff
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• Tinciones de Wright y Giemsa
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• Magenta: moléculas ricas en glucógeno e hidratos de carbono
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• Usadas para tinción diferencial de glóbulos sanguíneos
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• Rosa: eritrocitos, gránulos de eosinófilos
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• Morado: núcleos de leucocitos, gránulos de basófilos
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• Azul: citoplasma de monocitos y linfocitos
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• Las moléculas de algunos de ellos, como el azul de toluidina, polimerizan entre sí
cuando se exponen a concentraciones elevadas de polianiones en los tejidos. Este
colorante tiñe Los tejidos de azul, excepto aquellos que son ricos en polianiones (p.
ej., matriz de cartlago y gránulos de mastocitos), que se tiñen de color morado.De un
componente tisular o celular Que se tiñe de morado con este colorante se dice que
es metacromático, y se considera que el azul de toluidina muestra metacromasia. Al
final del capítulo se ofrecen algunos Ejemplos de tejidos teñidos con colorantes
histológicos comunes (v. figs. 1.11 a 1.17).
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• Microscopio óptico
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• Los microscopios compuestos están formados por una configuracion especifica de
lentes que permiten alcanzar un gran aumento y una buena resolución de los tejidos
visualizados.
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• Dado que los microscopios ópticos actuales emplean configuraciones especficas de
lentes para aumentar una imagen (fig. 1.1) se conocen como microscopios
compuestos. La fuente luminosa es una bombilla eléctrica con un filamento de
tungsteno cuya luz es recogida en un haz enfocado por la lente condensadora.
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• Imagen en el ocular
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• Cátodo
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• Ándo
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• Ocular
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• Lente•
• Condensadora
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• Anodo
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• Lente
•
• Condensadora
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• Bobina,
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• de barrido
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• Haz
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• De barrido
•
• Muestra•
• Lente
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• Del objetivo
•
• Muestra
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• Detector de
•
• Electrones
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• Amplificador
•
• Electronico
•
• Lente
•
• Condensadora
•
• Ventana
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• De visualización
•
• Lente de
•
• Proyeccion
•
• Espejo Imagen
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• En la pantalla
•
• De visualización
•
• Microscopio electrónico
•
• De transmisión
•
• Lámpara
•
• Muestra
•
• Imagen en
•
• La pantalla
•
• De visualización
•
• Microscopio electrónico
•
• De` barrido
•
• Pantalla
•
• De televisión
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• FIG. 1.1 Comparación de los microscopios óptico, y electrónicos de transmisión y
de barrido.
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• La luz que pasa a través de la muestra teñida desde abajo entra en una de las
cuatro lentes habituales unidas a un revólver móvil localizado justo por encima de la
muestra. En general, en la mayorfa de los microscopios, las tres primeras lentes
procuran un aumento de 4. 10 y 40 veces, respectivamente , y se utilizan sin aceite;
la lente de inmersión en aceite Aumenta la imagen 100 veces.
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• La imagen del objetivo es recogida y aumentada aún más por el ocular. Esta lente
suele aumentar la imagen en un factor de 10, para lograr magnificaciones totales de
40, 100, 400 y 1000 y enfoca la imagen resultante en la retina del ojo (o en la
película de una cámara tradicional o el sensor de una cámara digital).
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• La imagen se enfoca moviendo los objetivos arriba y abajo por encima de la
muestra.Es interesante observar que la imagen proyectada en la retina (o la película
o sensor) esta Invertida de derecha a izquierda y de arriba abajo.
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• La calidad de una imagen depende del poder de aumento de una lente y de su
resolución, entendida como la capacidad para mostrar que dos objetos diferentes
están separados por una cierta distancia. Debido a la longitud de onda de la luz
visible, el límite teórico de la resolución es de 0,25 hm y la calidad de una lente se
juzga por la proximidad con la que la Lente puede acercarse a dicho límite.
•
• Existen varios tipos de microscopios ópticos, que se diferencian por el tipo de luz
utilizado como fuente luminosa y por el modo en que hacen uso de dicha fuente. No
obstante, a los Estudiantes de histología se les pide que reconozcan solamente
imágenes obtenidas con microscopia óptica ompuesta, microscopia electrónica de
transmisión Electrónica de barrido. Por tanto, no se analizarán los restantes tipos de
microscopia.
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• Técnicas de imagen digital
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• Las técnicas de imagen digital utilizan tecnologia informática para capturar y
manipular las imógenes histológicas.
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• La tecnología informática permite capturar imágenes digitalmente, sustituyendo el
uso de películas y proporcionar resultados tan buenos, si no mejores, que los
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aportados por la Tecnología con pelicula.
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• Además. Como estas imágenes se almacenan en un formato digital, es posible
archivar miles de ellas en discos extrafbles, desde los cuales su recuperación es casi
instantánea. Por Último, este formato digital permite la transmisión electrónica de las
imágenes para su distribución a través de Internet, sin riesgo de que se pierdan los
archivos originales.
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• Interpretación de los cortes microscópicos
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• Aprender a interpretar el significado de un corte bidimensional como una estructura
en tres dimensiones es una de las habilidades más dificiles y frustrantes que se
necesitan en Histología. Si imaginamos una manguera de jardín enrollada, como la
de la figura 1.2, y se realizan en ella los cortes finos señalados, está claro que
normalmente no se puede discernir Un objeto tridimensional a partir de cualquiera de
sus representaciones en dos dimensiones. Sin embargo, si se contemplan de forma
global muchos de los cortes obtenidos de la Manguera enrollada, es posible
reconstruir mentalmente una imagen tridimensional correcta.
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• Sección
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• transversal
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• Sección
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• longitudinal
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• Sección
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• oblicua
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• Diagrama que muestra los distintos aspectos de las secciones cortadas en un tubo
curvo a diferentes alturas
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• FIG. 1.2 La histologia exige una reconstrucción mental de imágenes en dos
dimensiones para formar un solido tridimensional a partir del cual se obtuvieron los
cortes. En este diagrama se ha seccionado un tubo curvo en varios planos para
ilustrar la relación entre una serie de secciones en dos dimensiones y la estructura
• tridimensional.
• Técnicas de visualización avanzadas
• Histoquimica.
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• La histoquimica es un método de tinción de tejidos que aporta información relativa a
la presencia y la localización de las macromoléculas intracelulares y extracelulares.
• Es posible localizar los constituyentes químicos concretos de los tejidos y las
células mediante los métodos de la histoquímica y la citoquímica. Estos
procedimientos se basan en la actividad enzimática. Ia reactividad química u otros
fenómenos fisicoquímicos relacionados con la sustancia de interés. Las reacciones
químicas particulares se supervisan mediante la formación de precipitados insolubles
que adoptan un determinado color. A menudo, Ia histoquimica se aplica en tejidos
congelados y puede utilizarse tanto en la microscopia óptica como en la electrónica.
• Una de las reacciones histoquímicas más comunes utiliza el reactivo ácido
peryódico de Schiff (PAS., periodic acid-Schiff, que forma un precipitado de color
morado con moléculas ricas en glucógeno e hidratos de carbono. Los cortes
consecutivos se tratan con amilasa antes de aplicar el reactivo de PAS para
asegurarse de que la reacción sea específica del glucógeno. De este modo, en los
cortes no tratados con amilasa aparece un depósito morado, mientras que aquellos
tratados muestran, en Ia misma zona, ausencia de tinción.
• Aunque tambiến es posible localizar las enzimas mediante técnicas histoquímicas,
lo que suele visualizarse es el producto de la reacción enzimática, y no la enzima en
sÍ. El reactivo se elige de manera que el producto precipite en el lugar de la reacción
y sea visible como un depósito metálico o coloreado.
• Inmunocitoquimica
• La inmunocitoquimica utiliza anticuerpos y antianticuerpos marcados con
fluorocromos para proporcionar una localización intracelular y extracelular de las
macromoléculas mós precisa que con la
• histoquimica.
• Aunque las técnicas histoquímicas permiten una localización relativamente
adecuada de algunas enzimas y macromoléculas en las células y los tejidos, es
posible lograr una ubicación más exacta mediante el empleo de la
inmunocitoquímica. Esta tếcnica necesita el desarrollo de un anticuerpo contra la
macromolécula en concreto que se dete desea locdlizar localizar y el marcado del
anticuerpo con un colorante fluorescente, como, por ejemplo, fluoresceína o
rodamina. oddimina.
• marcaje con anticuerpos direet Se conocen dos métodos comunes de marcaje con
anticuerpos: directo e indirecto. En el método directo (fig. 1.3). el anticuerpo que
reconoce la macromolécula se marca con un colorante fluorescente.Se deja,
entonces, que reaccione con la macromolécula y se visualiza el complejo resultante
con un microscopio de fluorescencia (fig. 1.4).
• Añadir antianticuerpo
• fluoresceinado
• Anticuerpo
• fIluoresceinado
• Anticuerpo
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• Antigeno
• Antigeno
• Directo
• Indirecto
• FIG. 1.3 Métodos de inmunocitoquímica directa e indirecta. /zquierda: se marcó un
anticuerpo contra el antigeno con un colorante fluorescente y se observó con un
microscopio de fluorescencia. La fluorescencia tiene lugar únicamente en la posición
del anticuerpo. Derecha.: se preparan anticuerpos con marca fluorescente contra un
anticuerpo que reacciona con un determinado antigeno. Cuando se observa con
microscopia por fluorescencia, la región de fluorescencia representa la posición del
anticuerpo.
• FIG. 1.4 Ejemplo de inmunocitoquimica directa. Inmunotinción de neuronas
cultivadas a partir de un ganglio cervical superior de rata mediante un anticuerpo con
marca fluorescente contra el receptor de la insulina. Las zonas brillantes
corresponden a puntos en los que el anticuerpo se ha unido a los receptores de
insulina. El patrón de tinción indica que los receptores están distribuidos por todo el
citoplasma del soma y las proyecciones, pero están ausentes del núcleo. (Tomado de
James S. Patel N, Thomas P, Burnstock G. Immunocytochemical localisation of
insulin receptors on rat superior cervical ganglion neurons in dissociated cell culture.
J Anat. 1993:182:95-100.)
• En el procedimiento indirecto (v. fig. 1.3) se prepara un segundo anticuerpo con
marca fluorescente contra el anticuerpo primario específico de la macromolécula de
interés. Una vez que el anticuerpo primario ha reaccionado con el antígeno, se lava
la preparación para eliminar el anticuerpo primario no unido. Seguidamente se añade
el anticuerpo marcado y se hace reaccionar con el complejo original antígenoanticuerpo, para formar un complejo secundario visible por microscopia por
fluorescencia (fig. 1.5). El método indirecto es más sensible que el directo, dado que
numerosos antianticuerpos marcados se unen al anticuerpo primario, con lo cual se
visualizan con más facilidad. Por otra parte, el método indirecto no obliga a marcar el
anticuerpo primario, del que con frecuencia solamente se dispone de cantidades
limitadas.
• FIG.1.5 lnmunocitoquímica indirecta.Se prepararon anticuerpos fluorescentes
contra anticuerpos primarios frente al colágeno de tipo IV para demostrar la
Presencia de una lámina basal continua en la interfase entre los grupos celulares
malignos y el tejido conjuntivo circundante. (omado de Kopf Maier P, SchroterKermani Distribution of type Vll collagen in xenografted human carcinomas. Cel
Tissue Res. 1993: 272:395-405)
•
• C.
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• La inmunocitoquímica puede utilizarse con muestras para microscopia electrónica
mediante el marcaje del anticuerpo con ferritina, una molécula de alta densidad de
electrones,en Lugar de con un colorante fluorescente. El marcado con ferritina puede
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aplicarse a los dos métodos, el directo y el indirecto.
•
• Autorradiografia
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• La autorradiografia es un método que utiliza la incorporación de isótopos radiactivos
en macromoléculas, que después se visualizan con el revelado de una lómina
emulsionada.
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• La autorradiografía (o radioautografía) es un procedimiento muy útil para buscar e
investigar una secuencia de acontecimientos temporales. Este método exige la
inclusión de un isótopo radiactivo, con frecuencia tritio (H), en el compuesto a
analizar (fig. 1.6). A modo de ejemplo puede citarse el empleo de aminoácidos
tritiados para el seguimiento de la síntesis Y el empaquetado de proteínas. Después
de inyectar el compuesto radiomarcado en un animal, se toman muestras del tejido
en intervalos de tiempo seleccionados. EI tejido se procesa Del modo habitual y se
coloca en un portaobjetos de vidrio. Sin embargo, en lugar de sellar el tejido con un
cubreobjetos, se aplica sobre este una capa fina de emulsión fotografica. El Tejido se
aloja en una caja oscura varios días o semanas, durante los cuales las partículas
emitidas desde el isótopo radiactivo exponen la emulsión en los puntos de las células
en los Que se encuentra el isótopo, Se revela la emulsión y se fija mediante técnicas
fotográficas, y se dejan pequeños granos de plata sobre las partes expuestas de
dicha emulsión. A Continuación se tapa la muestra con un cubreobjetos y se observa
al microscopio óptico. Los granos de plata se distribuyen sobre las regiones de la
muestra que contienen el Compuesto radiactivo.
•
• FIG.1.6 Autorradiografia. Exploración en el microscopio óptico de la incorporación a
lo largo del tiempo de prolina tritiada tras su inyección inicial. En las Micrografias (A)
a (C), los granos de plata (puntos negros) se encuentran principalmente en las
células endodérmicas. Sin embargo, después de 8 h (D), los granos De plata están
situados también en la membrana basal. La presencia de estos granos señala la
localización de la prolina tritiada. (Tomado de Mazariegos MR, Leblond CP, van der
Rest M. Radioautographic tracing of sH-proline in endodermal cells of the parietal
yolk sac as an indicator of the biogenesis of basement membrane components. Am J
Anat. 1987:179:79•
• 93-)
•
• La autorradiografia se ha utilizado para seguir a lo largo del tiempo la incorporación
de prolina tritiada en la membrana basal situada bajo las células endodérmicas del
saco vitelino (v. fig. 1.6). Se ha recurrido a una adaptación del método de la
autorradiograffa para microscopia electrónica con el propósito de mostrar que la
prolina tritiada aparece primero en el Citosol de las células endodérmicas y, después,
recorre el retíiculo endoplasmático rugoso, el aparato de Golgi, las vesículas y, por
- 12 -
último, aparece en la matriz extracelular (fig. 1.7). De Esta forma se demostró
visualmente la secuencia de acontecimientos que conducen a la síntesis del
colágeno de tipo IlV, la principal proteína de la lámina densa en lIa lámina basal.
•
• FIG. 1.7 Autorradiografa. En esta micrograffa electrónica de una célula
endodérmica del saco vitelino, los granos de plata (similares a los de la fig. 1.6), que
Representan la presencia de prolina tritiada se observan por encima del reticulo
endoplasmático rugoso (RER), el aparato de Golgi (G) y los gránulos secretores
(GS). El colageno de tipo lV, que es rico en prolina, se sintetiza en las células
endodérmicas y se libera en la membrana basal. La prolina tritiada alcanza su
máxima Concentración en los orgánulos relacionados con la síntesis de proteínas. M,
mitocondria; N, núcleo. (Tomado de Mazariegos MR, Leblond CP, van der Rest M R
adioautographic tracing of sH-proline in endodermal cells of the parietal yolk sac as
an indicator of the biogenesis of basement membrane components. Am J Anat.
•
• Microscopia confocal y endomicroscopia láser confocal
•
• La microscopia confocal se basa en el empleo de un haz de láser como fuente
luminosa y de una pantalla con un orificio para eliminar la observación de luz
reflejada no deseada.De este modo, la Única luz que puede observarse es la situada
en el punto focal del objetivo, con lo cual se obtiene el conjugado del punto focal. La
endomicroscopia láser confocal recopila representaciones en tiempo Real de la
mucosa a nivel microscópico durante una endoscopia.
•
• En la microscopia confocal se hace pasar un haz de láser a través de un espejo
dicroico y se enfoca sobre la muestra con ayuda de dos espejos motorizados cuyos
movimientos están Controlados por ordenador, con el fin de barrer toda la muestra
con el haz. Dado que la muestra se trata con colorantes fluorescentes, el haz de
láser incidente induce la emisión de luz Desde dichos colorantes. La luz emitida
sigue la trayectoria adoptada por el haz de láser, aunque en sentido contrario, y el
espejo dicroico enfoca esta luz emitida a un orificio en una Placa. Un tubo
fotomultiplicador recoge la luz emitida que atraviesa el orificio, mientras que la placa
que lo contiene bloquea el resto de luz incidente, que podría crear una imagen
Difusa. Conviene recordar que la luz que emerge del orificio en un instante dado
representa un punto concreto de la muestra, y, a medida que el haz de láser barre
dicha muestra.se Recogen puntos concretos adicionales en el tubo fotomultiplicador.
Todos estos puntos reunidos por el tubo son analizados posteriormente por un
ordenador, para formar una imagen Compuesta píxel a pixel. Dado que la
profundidad de campo es muy reducida (en cada barrido se observa únicamente una
fina capa de la muestra), el barrido puede irse repitiendo a Profundidades cada vez
mayores en la muestra, con lo que se puede compilar una imagen tridimensional muy
completa (fig. 1.8).
•
- 13 -
• FIG. 1.8 lmagen de microscopia confocal de una célula de rata canguro en
metafase (PtK2) tenida con faloidina ligada a FITC para mostrar los flamentos de
actina (actina F) (verde) y con yoduro de propidio para mostrar los cromosomas
(rojo). (Por cortesia del Dr. Matthew Schibler, UCLA Brain Research Institute.)
•
• Una variante de la microscopia confocal, conocida como endomicroscopia láser
confocal (ELC), está diseñada para recopilar representaciones en tiempo real de la
mucosa a nivel Microscópico durante la endoscopia. Básicamente, la ELC es capaz
de proporcionar al médico una biopsia virtual de la estructura que se está
examinando. Para poder usar la capacidad De esta técnica, se administra un
colorante fluorescente por vía intravenosa o tópica. La luz fluorescente que se
produce en respuesta al haz del láser que incide es capturada por un Fotodetector, el
cual convierte las señales luminosas en señales eléctricas que pueden
informatizarse. Este mismo proceso está disponible para examinar tejidos que se
congelaron Rápidamente después de su extracción del organismo mediante una ELC
con sondas (ELCs). Mediante estas técnicas se descubrieron espacios tisulares
microscópicos hasta entonces Desconocidos dentro del tejido conjuntivo denso
irregular (fig. 1.9). Estos espacios intersticiales llenos de líquido, apuntalados por
haces de fibras de colágeno, parecen estar revestidos por células muy aisladas que
expresan moléculas CD34 en sus membranas celulares. El líiquido contenido en
estos espacios parece ser líquido prelinfático que probablemente Esté fluyendo hacia
los ganglios linfáticos. Se ha postulado que este compartimento tisular no se ha
observado porque el líquido es drenado de los tejidos durante la resección y el Tejido
se hunde sobre sí mismo durante la preparación histológica rutinaria. En el
organismo vivo, los espacios intersticiales llenos de líquido prelinfático actúan como
<amortiguadores De choque> que contrarrestan las fuerzas de compresión. Mucosa
•
• Haces
•
• De colágeno
•
• Células de
•
• Revestimiento
•
• Que expresan
•
• CD34
•
• Espacio lleno
•
• De líquido
•
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• TGregory
•
• FIG. 1. Ilustración de los espacios llenos de líiquido en el tejido conjuntivo del
conducto biliar visualizados mediante endomicroscopia con láser confocal basada en
Una sonda (ELCs). Usando una preparación histológica normal de tejido conjuntivo
propiamente dicho, se comprimen entre sí los haces de fibras de colágeno
•
• Oscureciendo los espacios lenos de liquido puestos de relieve por la ELCs. Estos
espacios están delimitados por células de revestimiento que expresan CD34
(Ilustración de JillK. Gregory, CMI. Reproducido con autorización de Mount Sinai
Health System.) Microscopia electrónica.
• El empleo de electrones como fuente luminosa en microscopia electrónica permite
lograr un aumento y una resolución muy superiores a los de la microscopia óptica.
• En los microscopios ópticos, las lentes ópticas enfocan luz visible (un haz de
fotones). En los electrónicos, unos electroimanes se encargan de enfocar un haz de
electrones. Dado que la longitud de onda de un haz de electrones es mucho más
corta que en la luz visible, en teoría los microscopios electrónicos pueden resolver
dos objetos separados o,005 nm. Sin embargo, en la práctica, la resolución del
microscopio electrónico de transmisión (MET) es de 0,2 nm aproximadamente, pero
aún asf es más de 1.000 veces mayor que la del modernos microscopio óptico
microscopios compuesto. electrónicos Por su pueden parte, la aumentar resolución
un del objeto hasta microscopio 150.000 veces; electrónico esta de barrido
magnificación magnificación (MEB) es es es de suficientemente suficientemento
unos 10 nm, na d poderosa notablemente " para ti"t ver inferior ""efor
macromoléculas a a la la de de los los MET. MET. individuales, A su como vez, los el
ADN y la miosina.
•
• Microscopia electrónica de transmisión
• La microscopia electrónica de transmisión utiliza cortes mucho más finos que la
microscopia óptica y necesita técnicas de precipitación de metales pesados, en vez
de colorantes hidrosolubles, para visualizar los tejidos.
• La preparación de muestras tisulares para microscopia electrónica de transmisión
comprende las mismas etapas básicas iniciales que en microscopia óptica. En Ia
microscopia electrónica de transmisión se emplean fijadores especiales, ya que, al
aumentar su poder de resolución, precisa productos finales más pequeños y un nivel
de entrecruzamiento de las proteínas mucho más específico que el requerido para la
microscopia óptica. Estos fijadores, entre los cuales se encuentran soluciones
tamponadas de glutaraldehído paraformaldehído, tetróxido de osmio y permanganato
de potasio, preservan los detalles estructurales más pequeños y actúan además
como sustancias de contraste de alta densidad electrónica, permitiendo la
observación del tejido con el haz de electrones.
• ◦Dado que la capacidad de estos fijadores de penetrar en los tejidos frescos es
mucho menor que la de los empleados en microscopia óptica, deben utilizarse
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fragmentos de tejido de un tamañio reducido sumergidos en grandes volúmenes de
fijadores. Los bloques de tejido en microscopia electrónica de transmisión no suelen
ser de más de 1 mm.Se han desarrollado medios de inclusión adecuados, como la
resina epoxi, que permiten seccionar tejidos incluidos en plásticos en cortes
extremadamente finos (ultrafinos: de 25-100 nm), los cuales absorben tan solo una
pequeña fracción del haz de electrones incidente.
• Los haces de electrones se producen en una cámara al vacío mediante el
calentamiento de un filamento de tungsteno, el cátodo. A continuación los electrones
son atraídos hacia el electrodo de carga positiva, el ánodo, una placa metálica en
forma de rosquilla con un agujero en su centro. Con un diferencial de carga de unos
60.000 voltios entre el cátodo y el ánodo, los electrones que atraviesan el orificio en
el ánodo poseen una elevada energía cinética.
• El haz de electrones se enfoca en la muestra mediante electroimanes, que cumplen
una función semejante a la lente condensadora de un microscopio optico (v. fig. 1.1).
Dado que el tejido se ha teñido con metales pesados que precipitan preferiblemente
en membranas lipídicas, los electrones pierden parte de su energía cinética al
interaccionar con el tejido, Cuanto mayor es la concentración del metal con que se
encuentra un electrón, menor será la energía que este conserve.
• Los electrones que salen de la muestra se ven sometidos a campos
electromagnéticos asociados a varios electroimanes adicionales, que enfocan el haz
en una placa fluorescente.
• Cuando los electrones inciden sobre dicha placa, su energía cinética se convierte
en puntos de luz cuya intensidad es una función directa de la energía cinética del
electrón. Si se sustituye la placa fluorescente por una película sensible a los
electrones, puede realizarse un registro permanente de la imagen resultante y se
produce un negativo a partir del cual es posible mprimir una micrograffa en blanco y
negro. Recientemente se ha introducido la denominada microscopia electrónica
digital., en la que la película fotográfica ha sido reemplazada por una tecnología de
dispositivos de acoplamiento de carga para capturar la imagen producida por los
electrones.
• Microscopia electrónica de barrido
• La microscopia electrónica de barrido proporciona una imagen en tres dimensiones
de la muestra.
• A diferencia de la de transmisión, la microscopia electrónica de barrido sirve para
visualizar la superficie de una muestra sólida. Con esta técnica pueden verse
imágenes tridimensionales del objeto. Por lo general., la muestra que se desea
analizar se prepara de un modo especial, de manera que permite el depósito de una
fina capa de un metal pesado, por ejemplo, oro o paladio, en su superficie.
• A medida que el haz de electrones barre la superficie del objeto, en parte estas
partículas se reflejan (electrones de retrodispersión) y en otra parte (electrones
secundarios) son eyectadas del recubrimiento de metales pesados. Los electrones
de retrodispersión y secundarios son capturados por detectores específicos que se
interpretan. procesan y presentan para su visualización en un monitor en forma de
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una imagen tridimensional (v. fig. 1.1). La imagen puede conservarse mediante
fotografia o digitalización para su almacenamiento informático.
• Técnica de criofractura
• La estructura macromolecular de las caras internas e las membranas se puede
observar mediante el método de la criofractura (fig. 1.10). Las muestras sometidas a
congelació ultrarrápida tratadas con crioconservantes no desarrollan cristales de
hielo durante el proceso criógeno; por tanto, el tejido no sufre daños mecánicos.
Cuando la muestra congela es golpeada por una cuchilla superenfriada.se rompe a
lo largo de planos de fractura, que son regiones de mínima unión molecular. En las
células, la rotura Se produce frecuentementos entre las hemimembranas Interna y
externa de las membranas.
• FIG. 1.10 Citoquimica y criofractura. Réplica por fractura y marcaje de una célula
acinar de páncreas de rata. Mediante el empleo de un complejo de oro coloidallectina Helix pomatia se pone de manifiesto la N-acetil-d-galactosamina, en la
imagen en forma de puntos negros. El núcleo (Nu) se muestra como una oquedad, el
reticulo endoplasmático rugoso (RER) aparece en forma de lineas paralelas y los
gránulos secretores (G) se ven como pequenas elevaciones o depresiones. Las
elevaciones (los granulos) representan la cara E y las depresiones (asteriscos), la
cara P de la membrana del gránulo secretor. m, mitocondria. (Tomado de Kan FWK.
• Bendayan M. Topographical and planar distribution of Helix pomatia lectin-binding
glycoconjugates in secretory granules and plasma membrane of pancreatic acinar
cells of the rat.
• Demonstration of membrane heterogeneity. Am J Anat. 1989:185:165-176.)
• La cara de fractura se recubre con platino y carbono evaporado en distintos
ángulos, con lo que en una cara de la proyección se acumula platino, mientras que
en la cara opuesta contigua a dicha proyección no tiene lugar tal acumulación,
generando asf una réplica de la superficie. A continuación se elimina el tejido y se
examina la réplica mediante microscopia electrónica de transmisión. Este método
permite visualizar las proteínas transmembrana de las membranas celulares, Las
figuras 1.11 a 1.17 ilustran ejemplos de tejidos teñidos con colorantes histológicos
comunes.
• FIG. 1.11 La hematoxilina y la eosina son los colorantes más utilizados. La
hematoxilina tiñe de azul los ácidos. Los núcleos son ricos en ácidos
desoxiribonucleicos y, por tanto, se tiñen de azul. Las regiones básicas del
citoplasma adquieren con la eosina un color rojo rosáceo.
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• 1.12 Philadelphia: EI tricrómico de masson tiñe de azul oscuro Ios núcleos, de azul
claro el colágeno y de rosa o rojo el citoplasma. (Tomado de Standring S. Gray's
Anatomy 40th
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• FIG. 1.13 La tinción elástica de Weigert tife las fibras elásticas de color.
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• FIG. 1.14 La tinción argéntica tiñe de negro las fibras reticulares (filbras de
colágeno de tipo 1.
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• FIG. 1.15 La hematoxilina férrica tiñe de negro las estriaciones cruzadas y los
núcleos de las células musculares estriadas, y también los eritrocitos.
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• FIG. 1.16 El reactivo del ácido peryódico de Schiff(tinción PAS) tie las moléculas
ricas en glucógeno y los hidratos de carbono de un color magenta. (Tomado de
Standring S. Gray's Anatomy: 4oth ed. Philadelphia: Elsevier; 2008.)
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• FIG. 1.17 Las tinciones de Wright y Giemsa se utilizan para la tinción diferencial de
las células sanguineas. Los eritrocitos y los gránulos eosinófilos se tifen de rosa los
núcleos de los leucocitos (flecha) y los gránulos basófilos lo hacen de morado, y el
citoplasma de los monocitos y los linfocitos se tifie de azul.
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