NEUROGÉNESIS SAMUEL TALEISNIK ERRNVPHGLFRVRUJ Taleisnik, Samuel Neurogénesis. - 1a ed. - Córdoba : Encuentro Grupo Editor, 2012. 184 p. ; 25x17 cm. ISBN 978-987-1432-96-7 1. Neuronas. 2. Genética. I. Título CDD 611.018 8 © 2012 Samuel Taleisnik © 2012 Encuentro Grupo Editor 1° Edición. Impreso en Argentina ISBN: 978-987-1432-96-7 Queda hecho el depósito que marca la ley 11.723. Ninguna parte de esta publicación, incluido el diseño de tapa, puede ser reproducida, almacenada o transmitida por ningún medio, ya sea electrónico, químico, mecánico, óptico, de grabación o por fotocopia sin autorización previa. www.editorialbrujas.com.ar publicaciones@editorialbrujas.com.ar Tel/fax: (0351) 4606044 / 4691616- Pasaje España 1485 Córdoba–Argentina. CONTENIDO A modo de intoducción Neurogénesis Perspectiva histórica Neurogénesis en el cerebro de mamíferos adultos Enseñanzas de la neurogénesis embrionaria Neurogénesis y reparación de lesiones cerebrales 1 1 2 3 4 Neurogénesis en el embrión Neurulación Neurulación secundaria El tubo neural Estructura del tubo neural Auto-renovación de las NSCs Regulación Reguladores epigenéticos División simétrica y asimétrica Pluripotencialidad Ciclo celular Control del ciclo celular Inhibidores de quinasas dependientes de ciclina Migración Neurogénesis Diferenciación en neuronas Genes proneurales Fase de iniciación Regulación de los genes proneurales La vía Delta-Notch de señalización Inhibición lateral Los genes Hes La fase de diferenciación Diferenciación es astrocitos Diferenciación en oligodendrocitos Neurogénesis en la médula espinal Formación de las neuronas ventrales Formación de los dominios progenitores Determinantes intermediarios del tipo celular Determinación de subtipos neuronales Determinantes coordinadores de programas de diferenciación El programa LIM Disposición neuronal en columnas Las agrupaciones de neuronas motoras Organización de las neuronas dorsales Señales de la placa dorsal Las moléculas BMPs Las moléculas Wnt Neurogénesis cortical Organización dorsoventral del telencéfalo Organización del telencéfalo dorsal ERRNVPHGLFRVRUJ 7 8 8 9 12 13 16 17 18 19 19 20 23 23 23 23 25 26 26 28 29 33 35 38 43 43 47 49 50 52 52 54 56 56 59 59 61 64 64 67 Organización de las áreas corticales Corticogénesis Las células progenitoras Formación de las capas neuronales Migración neuronal Neuronas de proyección Las interneuronas Formación del hipocampo 68 71 71 73 74 79 83 86 Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto La zona subventricular (SVZ) La zona subcallosa (SCZ) La zona subgranular del hipocampo (SGZ) Girus dentado Neurogénesis en el hipocampo adulto Neurogénesis en áreas no-neurogénicas Control molecular de la neurogénesis Nichos neurogénicos Componentes de los nichos neurogénicos Auto-renovación y proliferación Control de la auto-renovación y proliferación Control epigenético Migración Supervivencia Diferenciación y maduración Control de la diferenciación celular en el girus dentado Curso de la formación de nuevas neuronas Características de las nuevas neuronas Neurogénesis y aprendizaje Neuronas del sistema SVZ/bulbo olfatorio Influencias ambientales y neurogénesis Actividad física y ambiente enriquecido Aprendizaje Stress Envejecimiento Alteraciones del sueño Alteraciones del CNS y neurogénesis Neuroinflamación Isquemia localizada en el cerebro Lesiones traumáticas del cerebro Epilepsia Depresión Enfermedades neurológicas Neurogenesis y reparación de lesiones del CNS Formación de oligodendrocitos 101 103 104 104 104 107 112 113 113 117 118 126 134 137 138 139 141 142 143 144 146 146 148 148 150 150 151 151 152 154 154 156 156 157 158 Neurogénesis en el epitelio olfatorio La mucosa olfatoria Neurogénesis Regulación de los progenitores olfatorios Regulación de la diferenciación de neuronas receptoras olfatorias ERRNVPHGLFRVRUJ 173 174 177 178 A modo de introducción Neurogénesis El sistema nervioso mantiene la capacidad de modificarse anatómica y funcionalmente a través de la vida del individuo. Esta capacidad de modificación o plasticidad es uno de los principales mecanismos de adaptación del organismo. Los estímulos que inducen la plasticidad neural son activados por los requerimientos ambientales, el aprendizaje, modificaciones fisiológicas o lesiones del sistema nervioso. La plasticidad del cerebro determina cambios estructurales como la formación y reorganización de sinapsis en neuronas preexistentes, la formación de nuevos contactos sinápticos, la formación de colaterales de axones preservados que ocupan vacantes previamente ocupadas por axones, o el crecimiento de nuevos axones. La neuroplasticidad comprende en la actualidad no solo los tradicionales cambios estructurales sino también el agregado de nuevas neuronas al sistema o neurogénesis. La neurogénesis en el adulto representa una forma de plasticidad estructural a través de la generación continua de nuevas neuronas en el cerebro que se integran a los circuitos neuronales. Es un proceso que comprende la proliferación, migración y diferenciación celular. La neurogénesis en el adulto es una forma en la que el cerebro cambia su organización estructural y su capacidad funcional. Perspectiva histórica En la mayor parte del siglo 20 el paradigma de la neurobiología era que la neurogénesis tenía lugar sólo durante el desarrollo embrionario y que el cerebro de mamíferos adultos era un órgano inmutable al que no se agregaban nuevas neuronas. Aunque algunos trabajos ocasionales señalaron la presencia de figuras mitóticas en el cerebro de ratas adultas no se podía determinar con certeza su naturaleza neuronal. Las ideas predominantes de la época relativas a la neurogénesis en el cerebro adulto están sintetizadas en la siguiente sentencia. En el cerebro adulto, las vías nerviosas son algo fijo, terminal, e inmutable. Todo puede morir, nada puede ser regenerado. A la ciencia del futuro le corresponde, si es posible, cambiar este duro juicio. Santiago Ramón y Cajal, 1928 ERRNVPHGLFRVRUJ 2 Neurogénesis A comienzos de 1960 Altman, usando 3H-timidina, como marcador de células en proliferación, seguido por su detección por autorradiografía, presenta evidencias de la formación de nuevas neuronas en varias estructuras del cerebro de rata. La timidina marcada se incorpora a las células que sintetizan DNA en preparación para su división. Sin embargo estos hallazgos fueron ignorados cuanto no objeto de severas oposiciones dado que no era posible determinar fehacientemente el fenotipo neuronal de las células marcadas. Años después, Kaplan con ayuda de la microscopía electrónica demuestra que las células marcadas por timidina tenían las características ultraestructurales de neuronas. En los años 80 Nottebohm demuestra en el cerebro de pájaros adultos neurogénesis asociada al canto estacional, pero las evidencias de neurogénesis en aves fueron consideradas como un fenómeno particular de estas especies. A partir de los años 90 diversos autores demuestran en forma incontrastable neurogénesis en el girus dentado de diversos animales incluso en el hombre. Estos hallazgos fueron favorecidos por la introducción del marcado con bromodesoxiuridina (BrdU), un análogo de la timidina, que es captado por células que sintetizan DNA en preparación para su división. Las neuronas marcadas por BrdU son visualizadas por inmunocitoquímica y en conjunto con otros marcadores permiten la identificación de las nuevas células generadas. Con la ayuda de diversas metodologías un formidable progreso se ha producido en las últimas décadas en el conocimiento de muchos aspectos de la neurogénesis en el sistema nervioso adulto. Neurogénesis en el cerebro de mamíferos adultos En el cerebro de mamíferos adultos la neurogénesis persiste en la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y en la zona subgranular (SGZ) del girus dentado. En ambas estructuras células madre neurales (NSCs, neural stem cells) se dividen dando lugar a la formación de células proliferantes que migran y se diferencian en interneuronas en el bulbo olfatorio y en células granulares del girus dentado. Numerosas neuronas son incorporadas cada día a esas áreas. La capacidad de las NSCs de auto-renovarse y su multipotencialidad les permiten diferenciarse en astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. En otras áreas del cerebro también se encuentran NSCs que permanecen en reposo o reprimidas por lo que la formación de nuevas neuronas es escasa o nula en condiciones normales aunque poseen la capacidad de generar neuronas cuando son transplantadas a regiones neurogénicas. Por su parte, las NSCs de las SVZ o SGZ transplantadas ERRNVPHGLFRVRUJ A modo de introducción 3 fuera de las áreas neurogénicas se diferencian en células gliales pero no en neuronas. Estos experimentos de transplante señalan la importancia del microambiente (nicho neurogénico) en el desarrollo de las NSCs a neuronas maduras. El nicho, compuesto por la matriz extracelular y varios tipos de células, es el destino de muchos estímulos fisiológicos, patológicos y farmacológicos que regulan la neurogénesis. La escasa o nula formación de nuevas neuronas en las áreas no neurogénicas puede deberse a la falta de estímulos adecuados de su medio ambiente o a la acción de inhibidores. Neurogénesis en el adulto también tiene lugar en el sistema nervioso periférico como la generación de neuronas olfatorias en el epitelio olfatorio. La neurogénesis en el adulto fluctúa en respuesta a alteraciones ambientales y puede incrementarse por la actividad física, la exposición a ambientes enriquecidos, el aprendizaje, o por lesiones del sistema nervioso o reprimirse por stress. Además, la expresión de varios factores tróficos y de crecimiento también está implicada en la determinación del tamaño de la población neuronal. El agregado de nuevas neuronas en el cerebro adulto refleja un proceso de recuperación constante de las neuronas que mueren así como de respuesta a las demandas (requerimientos) funcionales a la que el organismo está sometido. En un ambiente normal (condiciones basales) la formación de nuevas neuronas se mantiene en un equilibrio dinámico con la pérdida neuronal, conservando constante el número de neuronas. Con el aumento de los requerimientos funcionales la neurogénesis se incrementa como ocurre en ratas mantenidas en un ambiente enriquecido o durante el aprendizaje. Por el contrario, la disminución de los requerimientos funcionales reduce la neurogénesis. La obstrucción de las fosas nasales se acompaña de una reducción del tamaño de los bulbos olfatorios. En condiciones funcionales basales, la muerte neuronal por apoptosis es un estímulo de la neurogénesis la que aumenta cuando mayor número de neuronas mueren por lesiones del sistema nervioso central (Figura 1). Enseñanzas de la neurogénesis embrionaria La neurogénesis embrionaria es un marco apropiado para entender el papel de los mecanismos moleculares involucrados en la neurogénesis del adulto. La neurogénesis en el adulto recapitula muchos aspectos de la neurogénesis embrionaria. Hay similitudes durante la embriogénesis y la adultez en el sitio de nacimiento neuronal, las características de las SCs, los factores que regulan la proliferación de células precursoras, la migración, y diferenciación de neuronas. Sin embargo, los sustratos para la ERRNVPHGLFRVRUJ 4 Neurogénesis Figura 1. El esquema muestra la inducción de la neurogénesis en las áreas neurogénicas en respuesta a las demandas funcionales o a las variaciones en la población neuronal. neurogénesis embrionaria y del adulto son muy distintos. Durante la vida embrionaria las redes neuronales comienzan a organizarse mientras en el adulto están completamente establecidas y las nuevas neuronas deben integrarse a un ambiente altamente complejo. El estudio de las similitudes y diferencias de la neurogénesis a lo largo de la diferenciación puede proveer evidencias acerca de los mecanismos involucrados en la neurogénesis del adulto. Neurogénesis y reparación de lesiones cerebrales El reconocimiento de la neurogénesis en el cerebro adulto ha creado nuevas esperanzas para la reparación de las lesiones del CNS en el adulto. Sin embargo, aunque lesiones del cerebro, como accidentes cerebrovasculares, lesiones traumáticas o enfermedades neurodegenerativas inducen aumento de la neurogénesis, la recuperación estructural o funcional de las áreas lesionadas a tales respuestas es muy limitada. No obstante, el hecho de que las neuronas neogeneradas después de las lesiones son capaces de integrarse a circuitos funcionales abre la perspectiva del empleo de progenitores endógenos como elemento reparador del daño cerebral. Un mejor conocimiento de los mecanismos que regulan la auto-renovación y proliferación de los precursores neurales endógenos puede proveer procedimientos adecuados para la reparación de lesiones cerebrales. La proliferación y supervivencia neuronal favorecidas por rehabilitación o estimuladas por factores tróficos pueden contribuir a la autoreparación del tejido lesionado. Bibliografía consultada Abrous DJ, Koehl M, Le Moal M. Adult neurogenesis: from precursors to network and physiology. Physiol Rev 85:523-569, 2005. ERRNVPHGLFRVRUJ A modo de introducción 5 Colucci-D´Amato L, Bonavita V, di Porzio U. The end of the central dogma of neurobiology: stem cells and neurogenesis in adult CNS. Neurol Sci 27:266-270, 2006. Emsley JG, Mitchell BD, Kempermann G, Macklis JD. Adult neurogenesis and repair of the adult CNS with neural progenitors, precursors, and stem cells. Prog Neurobiol 75:321-341, 2005. Gross CG. Neurogenesis in the adult brain: death of a dogma. Nat Rev Neurosci 1:67-73, 2000. Kempermann G, van Praag H, Gage FH. Activity-dependent regulation of neuronal plasticity and self repair. Prog Brain Res 127:35-48, 2000. Sohur US, Emsley JG, Mitchell BD, Macklis JD. Adult neurogenesis and cellular brain repair with the neural progenitors, precursors and stem cells. Phil Trans R Soc B 361:1477-1497, 2006. Suh H, Deng W, Gage FH. Signaling in adult neurogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol 25:253–275, 2009. Zhao C, Deng W, Gage FH. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell 132:645-660, 2008. . ERRNVPHGLFRVRUJ ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el embrión El huevo fertilizado experimenta en los primeros días una serie de divisiones. Estas células (blastómeros) se transforman en blastocisto, una vesícula rodeada por una capa de células externas (trofoblasto), que dará origen a la placenta, separada de una masa de células internas (ICM) que formará el embión. La ICM se encuentra en el blastocelo o cavidad blastocística y se diferencia en dos tipos de células, epiblastos e hipoblastos, que forman un disco bilaminar. La capa de células epiblásticas consisten en células pluripotentes de las que derivan las tres capas embrionarias: endodermo, mesodermo, y ectodermo (Figura 1). El ectodermo es rico en moléculas BMP-4 y por su influencia dará lugar a la formación de piel. La inactivación de las señales BMP-4 por moléculas secretadas por una discreta banda de mesodermo, situada inmediatamente debajo del ectodermo, estimula al ectodermo a generar una banda de tejido nervioso, la placa neural, en vez de piel. NEURULACIÓN El proceso de formación del sistema nervioso, llamado neurulación, comienza con la formación de la placa neural y la subsecuente formación del tubo neural. La placa neural es un engrosamiento del ectodermo causado por el cambio de la capa unicelular de células epiteliales cuboides a células columnares. Figura 1. Etapas del desarrollo embrionarios desde el ovocito hasta la formación del ectodermo, mesodermo y endodermo. ERRNVPHGLFRVRUJ 8 Neurogénesis Figura 2. Formación de la placa neural y del tubo neural. El cambio de la forma de las células y las adherencias celulares hacen que la placa neural se doble para formar el surco neural que se profundiza, limitado a cada lado por los pliegues neurales que se fusionan para generar el tubo neural (Figura 2). Cuando la placa neural se cierra para formar el tubo neural las células mediales adquieren una posición ventral para desarrollarse en la placa basal y neuronas de tipo ventral mientras que las células más laterales ocupan las estructuras dorsales y se hacen en placa dorsal y neuronas de tipo dorsal Neurulación secundaria En la porción caudal del neuroeje, el tubo neural se desarrolla de manera diferente a las regiones más rostrales. La formación del tubo neural caudal tiene lugar por un proceso conocido como neurulación secundaria que consiste en la formación de una cavidad en un cordón compacto de células epiteliales. Las células externas del cordón se presentan como una capa epitelial seudoestratificada. La cavidad se une a la cavidad ventricular del tubo neural rostral. Ref. 54, 96 EL TUBO NEURAL En humanos, el tubo neural se cierra completamente al comienzo de la 4ª semana después de la fertilización, formando una estructura lineal recta. Luego, aún antes que la porción caudal del tubo neural ha comenzado a desarrollarse, la porción rostral comienza a curvarse y se divide en tres protuberancias, conocidas como las vesículas primitivas, de las que derivan las estructuras cerebrales. Por detrás de estas el tubo neural se continúa para formar la médula espinal. Por debajo del tubo neural, adyacente a su región ventral, se encuentra una barra de células mesodérmicas que se extienden a lo largo del embrión formando el notocordio en su porción caudal ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 9 y el mesodermo precordial rostralmente. En la parte dorsal del tubo neural se encuentra el epitelio ectodérmico. Estructura del tubo neural Las paredes del tubo neural están compuestas por una sola capa de células que ocupa todo su espesor, las células madre neuroepiteliales. Esta capa de células adyacente a la luz ventricular está organizada en un epitelio seudoestratificado que constituye la zona ventricular (VZ). A medida que el desarrollo progresa se generan otros tipos de células. Células neuroepiteliales . Las células neuroepiteliales (NSCs) tienen procesos que contactan el ventrículo y la superficie pial del tubo neural y sus núcleos se mueven a distintos niveles durante el ciclo celular confiriendo el aspecto estratificado del epitelio. Durante la fase G1 del ciclo celular el núcleo se aleja de la superficie ventricular, permanece estacionado en la proximidad de la superficie pial durante la fase S y se mueve hacia la superficie ventricular durante la fase G2. La mitosis tiene lugar en la superficie ventricular (Figura 3). Durante los estadios tempranos del desarrollo, las células neuroepiteliales del tubo neural se dividen simétricamente, dando lugar a dos células hijas que reingresan al ciclo celular con lo que aumentan su número. Las células hijas se disponen a lo largo del eje longitudinal del tubo neural contribuyendo a su extensión rostrocaudal. Con el comienzo de la neurogénesis las células neuroepiteliales cambian hacia un modo de división asimétrica generando otra célula neuroepitelial y una neurona o alternativamente dos otras poblaciones de progenitores: las células glía radiales y los progenitores basales. El cambio de las características de las células neuroepiteliales a células glía radiales es inducido por la acción conjunta de genes como FoxG1 (forkhead box G1), Lhx2 (LIM homeobox 2), Pax6 (paired box 6), y Emx2 (empty spiracles homologue 2). Celulas glía radiales . Con el comienzo de la neurogénesis las células neuroepiteliales comienzan a expresar marcadores gliales y se transforman en células glía radiales. Son células transitorias en la mayoría de las regiones del cerebro. Exhiben una morfología bipolar y ocupan todo el espesor de la pared del tubo neural con un pie terminal en la superficie ventricular y un proceso radial que se extiende a la pía madre mientras que sus cuerpos están retenidos en la VZ. El progresivo engrosamiento del epitelio se acompaña por una extensión de los procesos gliales que se dirigen hacia la superficie pial. Sus núcleos, igual al de las célu- ERRNVPHGLFRVRUJ 10 Neurogénesis Figura 3. Capa de células neuroepiteliales de la pared del tubo neural formando un epitelio pseudoestratificado, en a. Posición del núcleo de las células neuroepiteliales en la pared del tubo neural en las diferentes fases del ciclo celular durante la división simétrica, en b. las neuroepiteliales, se mueven a distintos niveles durante el ciclo celular. Las células glía radiales se diferencian de las células neuroepiteliales por la presencia de microtúbulos, neurofilamentos en las fibras radiales y gránulos de glicógeno en el citoplasma aunque conservan algunas de sus características como nestina y los antígenos reconocidos por los anticuerpos RC1 y RC2. También aparecen marcadores característicos de astrocitos como el transportador de glutamato GLAST, la proteína S100β de unión a Ca 2+, la proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP), las proteínas GFAP, vimentina, y Tenacina-C. La diferenciación astroglial se acompaña de la transformación de los complejos de unión estrecha en uniones de adherencia y el incremento de varias moléculas de adherencia y de la matriz extracelular incluyendo Rcadherina y Tenacina-C. La mayoría de las células glía radiales están restringidas a la generación de un solo tipo celular, astro- Figura 4. Diferentes tipos celulares generadores de neuronas ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 11 cito, oligodendrocito, o neurona. Las células glia radiales, al igual que las células neuroepiteliales, mantienen la polaridad apical-basal y sus núcleos presentan migración intercinética que confiere una estructura pseudoestratificada a la VZ. Los pie terminales apicales de células glía radiales adyacentes están unidos entre sí por uniones de adherencia formadas por interacciones homofílicas de cadherinas lo que es esencial para mantener la integridad de la VZ. Las proteínas Numb y Numbl interactúan con las cadherinas y son requeridas para mantener la estructura de las células glía radiales. Su inactivación altera las uniones de adherencia produciendo el desprendimiento y la dispersión de células glía radiales. Las células glía radiales experimentan dos tipos de división asimétrica. Un tipo es neurogénico por el cual se genera otra célula glía radial y una neurona. Las células hijas neuronales migran a lo largo de las fibras de las células glía radiales paternas para terminar en diferentes capas, las neuronas nacidas más tempranamente en las capas más profundas y las nacidas más tarde en capas más superficiales, para terminar su diferenciación. Otro tipo genera una célula glía radial y una célula progenitora basal (Figura 4). Las células neuroepiteliales y las células glía radiales se consideran células madre neurales (NSCs). Son células que están firmemente unidas entre sí con capacidad de auto-renovación y pluripotencialidad. Progenitores basales . La célula progenitora basal, que aparece al comienzo de la neurogénesis, es el tipo de progenitor neuronal que se origina de células neuroepiteliales y glía radiales. Las células progenitoras basales, también llamadas células progenitoras intermedias (IPCs), son células multipolares que tienen un proceso en contacto con la superficie ventricular y procesos basales cortos que no alcanzan la superficie pial. Las células progenitoras intermedias se dividen simétricamente para generar dos células hijas una de las cuales permanece en la VZ mientras que la otra migra al lado basal del neuroepitelio donde forma la zona subventricular (SVZ) y se divide una vez más para generar dos neuronas. Una parte de las IPCs (10%) también puede producir dos IPCs incrementando su número, son consecuentemente células amplificadoras transitorias (Figuras 4 y 5). Las IPCs difieren de las células glía radiales en la expresión de genes. Las IPCs expresan los factores de transcripción Tbr2, Cux1/2, Lmo2, y Svet1 pero carecen de los factores que funcionan en la auto-renovación de las células glía radiales como Pax6, Emx2, y Sox2. ERRNVPHGLFRVRUJ 12 Neurogénesis Figura 5. Las células glía radial se dividen asimétricamente para dar origen a otra célula glial y a una neurona o a una célula progenitora basal (IPC). Las IPCs se asocian con vasos sanguíneos cuyas células endoteliales pueden liberar factores difusibles que actúan como señales de atracción. La migración hacia los vasos sanguíneos y su contacto con las células endoteliales puede estimular su diferenciación en neuronas. Las células de la SVZ, a diferencia de las células de la VZ, no están unidas entre sí como un epitelio seudoestratificado y los núcleos de las células en proliferación no tiene movimientos intercinéticos durante el ciclo celular. Los cuerpos celulares tienen cortos procesos que permanecen confinados a la zona. La SVZ embrionaria es considerada como el sitio de mayor neurogénesis durante el desarrollo. Las células progenitoras basales que se dividen simétricamente en dos neuronas son Tis21 positivas. Tis21 es un gen antiproliferativo que inhibe la progresión de la transición de la fase G1 a S del ciclo celular. Tis21 está expresado durante la neurogénesis embrionaria en células precursoras pero no en neuronas postmitóticas. Con la generación de neuronas, el neuroepitelio se transforma en un tejido con numerosas capas celulares. La capa de la VZ que limita el ventrículo contiene la mayoría de los cuerpos celulares de las células progenitoras Ref. 46, 55, 126. AUTO-RENOVACIÓN DE LAS NSCs Las células neuroepiteliales y las células glía radiales pueden auto-renovarse y también producir células progenitoras basales, neuronas, y glía. La auto-renovación también se encuentra en células progenitoras aunque en forma más limitada. La auto-renovación es el proceso por el cual las NSCs se diviERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 13 den para auto-perpetuarse. La capacidad de auto-renovación de las NSCs es fundamental para que aumenten su número durante el desarrollo, se mantengan en tejidos adultos, y restablezcan su conjunto después de lesiones. A diferencia de la auto-renovación, la proliferación es un proceso más general que comprende la auto-renovación y otros tipos de división celular. Regulación Las células neuroepiteliales y las células glía radiales tienen sus procesos apicales expuestos al líquido ventricular y sus procesos basales en contacto con la matriz extracelular. Además establecen relaciones entre células por contactos laterales. Señales originadas en estas distintas fuentes pueden modular la autorenovación. La auto-renovación resulta de la acción coordinada de factores celulares intrínsecos y moléculas extracelulares que promueven la proliferación y previenen la diferenciación. Factores celulares intrínsecos. Oct4, Sox2, Nanog Los factores de transcripción Oct4, Sox2, y Nanog forman un complejo regulador de la transcripción, que desempeña un papel fundamental en la auto-renovación de las NSCs. Los tres factores funcionan en colaboración formando un circuito de autoregulación positiva en el cual cada factor regula la expresión de sus propios genes así como la de los otros dos factores. El factor Tcf3 (T cell factor-3) es también un componente de este circuito regulador. Cada uno de estos factores es necesario para mantener la auto-regulación. El complejo Oct4, Sox2, Nanog, Tcf3, a su vez, ocupa varios cientos de genes, un grupo de los cuales es activado y otro reprimido. Entre los activados se encuentran genes que codifican factores de transcripción requeridos para promover la auto-renovación como REST, SKIL, HES, y STAT3 y genes que codifican componentes remodeladores de cromatina y modificadores de histonas. Entre los inactivados se encuentran genes que codifican factores de transcripción asociados a programas de diferenciación y desarrollo como los que inducen las proteínas proneurales Mash1 y Neurogeninas (Figura 6). El complejo Oct4-Sox2-Nanog debe ser adecuadamente regulado por estímulos positivos y negativos dado que ligeras hipo- o hiper-activaciones de algunos de estos factores pueden alterar la proliferación. Caspasa-3 hidroliza y agota la proteína Nanog impulsando a las células madre embrionarias (ES) a salir de su fase de auto-renovación induciendo su diferenciación. REST (repressor element 1 silencing transcription factor) o ERRNVPHGLFRVRUJ 14 Neurogénesis Figura 6. El complejo Oct4-Sox2-Nanog se auto-regula activando la expresión de sus propios genes y activa genes involucrados en la proliferación celular y silencia otros asociados a la diferenciación. NRSF (neuron-restrictive silencing factor) es un represor de latranscripción que se une a una secuencia de 21-23 pb del DNA llamada NRSE (neuron-restrictive silencer element) reprimiendo la transcripción de genes neuronales. REST previene la diferenciación y mantiene la auto-renovación de las NSCs en asociación con los co-represores mSin3 y CoREST (ver página 128). SKIL es un inductor de la proliferación celular. Actúa como represor de la actividad antiproliferativa de las señales TGFβ impidiendo la formación del complejo heterodimérico Smads o reclutando co-represores. Otros factores además del complejo Oct4-Sox2-Nanog son también necesarios para mantener la auto-renovación de las NSCs. Ronin es un factor, que se expresa en los periodos tempranos del desarrollo embrionario, que contiene un motivo dedozinc de unión a DNA (dominio THAP). Anula la diferenciación de células ES suprimiendo la transcripción de genes inductores de la diferenciación incluyendo GATA4 y GATA6. Foxd3 es un factor de transcripción que se une al DNA por el motivo caja forehead y mantiene la auto-renovación de las células ES en cultivos reprimiendo su diferenciación. Moléculas extracelulares Las NSCs pueden mantenerse en un estado indiferenciado en cultivos pero están prontas a diferenciarse. Señales extracelulares contribuyen a mantener su pluripotencia o estimulan su diferenciación. LIF (leukemia inhibitory factor) también conocido como Dia (differentiation inhibitory activity) es un factor que bloquea la ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 15 diferenciación de células ES y mantiene la proliferación. LIF se une a su receptor LIFRβ para luego formar un heterodímero con gp130. Después de esta unión, las tirosina quinasas JAK, asociadas constitutivamente a pg130, son fosforiladas en residuos tirosina. También se fosforila la parte citoplasmática de gp130 y LIFRβ creando sitios de anclaje a proteínas adaptadoras con dominios SH2, entre ellas las proteínas STAT1 y STAT3, que son fosforiladas. STAT3 fosforilada se desprende del receptor, dimeriza en el citoplasma, y transloca al núcleo donde activa la transcripción de genes (Figura 7). Aunque LIF se necesita para mantener la pluripotencia de las células ES in vitro, embriones de ratones carentes de LIF pueden mantener in vivo la pluripotencia por vías alternativas. LIF es incapaz de mantener la autorenovación de células ES en cultivo en ausencia de suero, indicando que su actividad depende de otra señal la que ha sido identificada como la proteína BMP. BMP4 (bone morphogenetic proteín-4) contribuye a mantener las células ES de ratones en cultivos en un estado indiferenciado induciendo proteínas que inhiben la diferenciación neuronal. El efecto de BMP se ejerce vía las proteínas SMAD que promueve la expresión del inhibidor de genes de diferenciación Id (Figura 8). El factor Id previene la actividad transcripcional de factores bHLH. FGF2 mantiene la auto-renovación de células ES a través de la activación de la vía PI3K/Akt. La vía PI3K/Akt puede mantener la auto-renovación de las células ES en ausencia de LIF. Las señales de Akt regulan la pluripotencia y la proliferación de cé- Figura 7. La vía Jak/STAT activada por la citpquina LIF estimula la expresión de genes implicados en la auto-renovación de las NSCs. ERRNVPHGLFRVRUJ 16 Neurogénesis Figura 8. BMP induce la expresión del inhibidor de genes Id vía las proteínas Smad. lulas ES y la inhibición de las señales PI3K/Akt induce diferenciación de células ES. Akt/PKB activada por fosforilación controla varios procesos celulares a través de la fosforilación de numerosas proteínas. Akt/PKB suprime la actividad del inhibidor del ciclo celular p27 con lo cual acelera la progresión a través de la fase G1 y la entrada en la fase S. Notch mantiene la auto-renovación de NSCs por su capacidad de inhibir la diferenciación. Notch actúa a través de las proteínas Hes caracterizadas por mantener indiferenciados a las células glía radiales. La unión de Wnt a sus receptores promueve una cadena de señales que dan lugar a la acumulación de β-catenina en el citoplasma. β-catenina transloca al núcleo activando la expresión de genes que mantienen la auto-renovación de las NSCs (Figura 40). Reguladores epigenéticos Los reguladores epigenéticos son configuraciones heredadas de la expresión de genes por modificaciones de la cromatina que no implican cambios en la secuencia del DNA. Estos reguladores también contribuyen a mantener la auto-renovación. Las proteínas del grupo Policomb (PcG) son reguladores epigenéticos que mantienen el estado celular silenciando genes. Las proteínas PcG forman grandes complejos multiméricos que catalizan la trimetilación de histona H3 en la lisina 27 (H3K27me3). H3K27me3 puede reclutar al complejo PRC1, que tiene una proERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 17 teína que se une a H3K27me3, facilitando la condensación de la cromatina para mantener la represión de la transcripción de genes. Por el contrario, la proteína Trithorax (TrxG), una metiltransferasa que trimetila la H3 en la lisina 4 (H3K4), contrarresta la represión de las proteínas PcG promoviendo la transcripción. Las proteínas PcG y TrxG están implicadas en la proliferación celular y en mantener el balance entre la represión y la transcripción de las SCs (ver página 129). Las NSCs requieren el represor de la transcripción Bmi-1 de la familia policomb para la auto-renovación. Las NSCs deficientes en el gen Bmi-1 se forman normalmente pero se extinguen después del nacimiento. Un mecanismo por el que Bmi-1 promueve la auto-renovación es a través de la represión de la expresión del inhibidor p16 ink4a de la Cdk. Las microRNAs (miRNA) son una familia de pequeñas RNA de 20-22 nucleótidos que tienen importantes papeles en la autorenovación de SCs (ver página 131). División simétrica y asimétrica Durante los estadios tempranos del desarrollo del tubo neural las células neuroepiteliales se dividen mayormente simétricamente dando lugar a dos células hijas, con iguales potencialidades a las de la célula madre, que reingresan en el ciclo celular con lo que aumentan su número. Las células hijas se disponen a lo largo del eje longitudinal del tubo neural contribuyendo a su extensión rostrocaudal. A medida que el desarrollo progresa las células experimentan cambios como la inducción de nestina y la disminución de las uniones intercelulares por reducción de ocludina, un componente de la unión estrecha, con lo que da lugar a cambios en la permeabilidad de la membrana. Pero un número cada vez mayor de células comienzan a dividirse asimétricamente dando lugar a dos células hijas diferentes, otra célula neuroepitelial y a una neurona. La división asimétrica es un mecanismo fundamental para la generación de la diversidad celular. La diferencia entre división simétrica y asimétrica está determinada por una igual o desigual distribución de constituyentes celulares en las células hijas. Esto permite que determinantes del destino celular sean heredados en forma diferente por las dos células hijas las que adoptan distintos destinos. El cambio de la división simétrica a la asimétrica se inicia con el comienzo de la neurogénesis. Mecanismos Los mecanismos moleculares que controlan el cambio de la diERRNVPHGLFRVRUJ 18 Neurogénesis visión simétrica a la asimétrica en SCs de mamíferos se basan en la división de neuroblastos en Drosophila. Se ha propuesto que cuando el plano de fractura está orientado paralelo al eje apicalbasal da lugar a la división simétrica debido a la igual distribución de constituyentes entre las células hijas. Por el contrario, si el plano de fractura es perpendicular al eje apical-basal resulta en división asimétrica como resultado de una distribución diferencial de determinantes del destino celular entre las células hijas. En mamíferos, sin embargo, el plano de fractura horizontal es raro y la gran mayoría de SCs presentan un plano de fractura vertical durante la neurogénesis al igual que las divisiones durante la proliferación. El cambio de la división de las SCs de un estado de proliferación a neurogénico estaría asociado más bien a un cambio en la distribución de la membrana apical en las células hijas que a la rotación del plano de fractura de vertical a horizontal. Una distribución de la membrana apical por igual en las células hijas se asocia a la división simétrica mientras que la distribución desigual da lugar a una división asimétrica en la que la célula hija que hereda la membrana apical conserva la potencialidad similar a la de la célula madre y la que no la hereda se volverá neurona (Figura 9). La membrana apical, que constituye sólo el 1-2% de toda la membrana plasmática, incluiría moléculas cuyas señales mantienen a las células hijas en el estado de SCs y su falta contribuye a su diferenciación. Entre los determinantes de la división asimétrica de las células se han identificado genes específicos tales como los que codifican las proteínas Notch y Numb. Pluripotencialidad Las células madre embrionarias son pluripotentes o sea que tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares del embrión y del adulto aunque sólo se diferencian en células del ectoder- Figura 9. Esquema de división simétrica y asimétrica de NSCs. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 19 mo, mesodermo y endodermo. La pluripotencialidad de las células ES se mantiene durante su auto-renovación previniendo la diferenciación. Consecuentemente los mecanismos que mantienen la autorenovación celular preservan la pluripotencialidad. En el tubo neural las células glía radiales tiene la potencialidad de generar neuronas astrocitos y oligodendrocitos . Ref. 16, 17, 22, 41, 47, 62, 65, 81, 91, 92, 108, 123, 132, 136, 137, 148, 174, 180, 181, 189, 192, 231, 238 CICLO CELULAR Las NSCs que se auto-renuevan y las células progenitoras que proliferan entran en el periodo G 1 del ciclo celular. Este periodo se extiende hasta la iniciación de la síntesis de DNA, durante el cual tienen su principal actividad factores de crecimiento y se sintetizan muchos elementos citoplasmáticos. El periodo de la síntesis de DNA es la fase S para entrar luego en la fase G 2 durante la cual las células contienen el doble de la cantidad de cromosomas. Al final de esta fase comienza la mitosis (M) durante la cual se produce la división celular. Las células que no proliferan abandonan el ciclo celular en G 1 y entran en el estado latente G 0 para diferenciarse. Para las neuronas diferenciadas el estado G 0 es permanente y no retornan al ciclo para replicarse. La progresión de una fase del ciclo celular a la siguiente es controlada por una serie de complejos proteicos formados por una ciclina y una proteína quinasa dependiente de ciclina (CDK). Diferentes ciclinas están presentes en diferentes fases del ciclo celular. En la fase G 1 las ciclinas D y E se asocian respectivamente a CDK4/CDK6 y CDK2. La ciclina A asociada a CDK2 actúa durante la fase S y la ciclina B asociada a CDK1 determina el comienzo de la mitosis (Figura 10). Control del ciclo celular Al comienzo del ciclo celular se encuentra la proteína Rb (retinoblastoma) no fosforilada cuyos efectos se extienden durante los primeros dos tercios de la fase G 1 cuando la célula toma la decisión entre crecimiento y reposo. Rb no fosforilada se une a E2F reprimiendo su actividad de transcripción (Figura 11). Las proteínas inhibidoras Cip/Kip también están elevadas. Consecuentemente, no se sintetizan los factores requeridos para la división celular permaneciendo la célula en reposo y previniendo su entrada en la fase S. Con la progresión de la fase G 1 y en respuesta a factores de crecimiento se promueve la transcripción de ERRNVPHGLFRVRUJ 20 Neurogénesis Figura 10. Representación esquemática de las diferentes fases del ciclo celular. genes de las ciclinas D, vía activación de la cascada de quinasas Ras-MAPK. Las ciclinas D neosintetizadas forman complejos con Cdk4 y Cdk6 haciendo que Cdk se haga accesible a la acción de CAK (Cdk-activating kinase) que fosforila a las quinasas activándolas. Cdk4 y Cdk6 dependientes de ciclina activadas inician la fosforilación de la proteína Rb con lo que E2F es liberada. E2F libre forma complejos heterodiméricos con el factor de transcripción DP1 y DP2 que se unen a DNA para activar genes que expresan las proteínas Cdk2 y las ciclinas E y A, y genes cuyos productos son necesarios para la replicación de DNA. Los complejos ciclina D-Cdk también secuestran las proteínas Cip/Kip suprimiendo su efecto represor y facilitando la activación posterior de ciclina E-Cdk2. Las ciclinas E y A, cuya concentración incrementa al final de la fase G 1, son ambas necesarias para catalizar la transición de G 1 a S. El complejo Cdk2-ciclina E estimula aún más la fosforilación de la proteína Rb. También fosforila a p27 favoreciendo su proteólisis (Figura 11). Las Cdks dependientes de ciclinas A y B, activadas después, mantienen a Rb hiperfosforilada hasta la salida de la mitosis cuando Rb es defosforilada y cada célula hija entra en la fase de reposo de un nuevo ciclo celular. Para salir de la mitosis la ciclina B es proteolíticamente degradada por ubicuitinas controladas por el complejo APC/Cdk. Inhibidores de quinasas dependientes de ciclina La actividad de las Cdks es restringida por proteínas inhibidoras (CKIs) que se agrupan en dos familias: una comprende las proteínas INK4 inhibidoras de las subunidades Cdk4 y Cdk6, que incluye las proteínas p15INK4, p16INK4, p18INK4, y p19INK4. Otra comprende a las proteínas Cip/Kip, cuya acción afecta la actividad de todas las Cdks, incluye a p21Cip1, p27Kip1, y p57Kip2. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 21 Figura 11. Cascada de eventos en la síntesis de ciclinas durante la fase G1 del ciclo celular. La familia Cip/Kip La familia de inhibidores Cip/Kip inhibe la actividad de todas la Cdks. Su acción inhibidora se hace por intermedio de un dominio N-terminal, relativamente conservado en las tres proteínas, que se une a los complejos ciclinaD/Cdk4 y ciclina E/Cdk2 de la fase G 1. p21 Cip es un inhibidor de Cdk dependiente de ciclina que inhibe principalmente la actividad del complejo ciclinaE-Cdk2 y modula negativamente la progresión del ciclo celular. p21 Cip se une a los complejos ciclinaD-Cdk4 y ciclinaE-Cdk2 durante la fase G1 del ciclo celular. Mientras los complejos contengan una única molécula p21 Cip son catalíticamente activos y permiten la progresión del ciclo celular. El incremento de la concentración de p21 Cip inhibe la actividad de Cdk. Como consecuencia se impide la fosforilación de Rb y los factores E2F son secuestrados. p21 Cip es codificada por un gen activado por el factor de transcripción p53 en respuesta a lesiones del DNA. p53 se mantiene inactivo en células normales en ausencia de estímulos estresantes pero se activa en respuesta estímulos genotóxicos y oncogénicos. La vía p53 es regulada por la interacción de p53 con numerosas proteínas entre las cuales se encuentran MDM2 y MDM4 que actúan como inhibidores específicos de p53 durante el desarrollo embrionario. A su vez p53 activa MDM cuando su concentración es elevada (Figura 12). p27 Kip es una proteína que se une a los complejos ciclinaDCdk4 y ciclinaE-Cdk2. En las células en reposo la tasa de p27 Kip ERRNVPHGLFRVRUJ 22 Neurogénesis Figura 12. Moléculas involucradas en la inhibición de Cdks es elevada. Cuando la célula entra en el ciclo, p27Kip es captada por los complejos ciclinaD-Cdk liberando la represión de los complejos ciclinaE-Cdk2 por las moléculas Cip/Kip y facilitando su activación. El complejo ciclinaE-Cdk2 activado fosforila las moléculas p21 Cip y p27 Kip que permanecen libres facilitando así su degradación. Cuando la concentración de p27 Kip incrementa superando la capacidad de captación por el complejo ciclinaDCdk4/6 se fija a los complejos ciclinaE-Cdk2 inhibiendo su actividad y dando lugar a la detención del ciclo en G1 (Figura 11). FGF2 vía Akt suprime la actividad de p27. La familia INK4 Las proteínas de la familia de inhibidores INK4 son polipéptidos que poseen un motivo que interacciona con Cdk4 y Cdk6 inhibiendo su actividad. p15INK4 es inducida por TGF-β, p16INK4 se acumula progresivamente a medida que la célula envejece mientras que p18 INK4 y p19 ARF se expresan durante el desarrollo fetal. El aumento de las proteínas INK4 compite con las ciclinas por la asociación con Cdk4/6 con las que forma complejos estables inhibiendo su actividad de quinasa. Las ciclinas D son liberadas y rápidamente degradadas. La pérdida de la actividad de quinasa de las Cdk4/6 da lugar a la hipofosforilación de Rb. El incremento de p16Ink4a directamente previene la unión de Cdk4/6 a la ciclina D mientras que el aumento de la concentración de p19 ARF lo hace a través de una cascada de eventos que involucra la activación de p53 mediada por la degradación las proteínas MDM2/4 (Figura 12). ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 23 La expresión de los genes p16Ink4a, y p19 Arf en NSCs es reprimida por Bmi1, un miembro de la familia policomb. La deficiencia en Bmi1 reduce la capacidad de auto-renovación de NSCs. Otro inhibidor de las Cdks es el factor TGF que a través de miembros de la familia Smad activa la transcripción de diversos genes, entre ellos el gen p15. Ref. 53, 95, 135, 154, 160, 166, 178, 188, 193, 209, 216, 217, 221 MIGRACIÓN La migración es un proceso fundamental en el desarrollo del sistema nervioso central. Las neuronas se originan generalmente en sitios diferentes a su residencia final donde migran. En el telencéfalo se reconocen dos formas de migración esenciales para la morfogénesis de la corteza cerebral: la migración radial y la migración tangencial (ver páginas 74) NEUROGÉNESIS Las células neuroepiteliales del tubo neural que se autorenuevan producen progenitores intermedios de los que subsecuentemente derivan diferentes tipos de neuronas y células gliales. La mayoría de las células progenitoras proliferan suficientemente antes que comienza la diferenciación neuronal a fin de proveer un adecuado número de células indiferenciadas. La diferenciación de los progenitores neuronales da origen a diferentes tipos de células neurales, produciendo primero neuronas y después células gliales. La diferenciación en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos tiene lugar en ondas temporalmente distintas que se superponen dando lugar secuencialmente a las fases neurogénica, astroglial, y oligodendroglial. En el ratón, la neurogénesis alcanza su pico aproximadamente en el segundo tercio de la gestación, los astrocitos lo alcanzan al nacer, y los oligodendrocitos al mes postnatal. DIFERENCIACIÓN EN NEURONAS La diferenciación de las células del neuroepitelio a neuronas está regulada por genes proneurales activadores y represores. Genes proneurales Los genes proneurales, que codifican los factores de transcripción hélice-lazo-hélice básico (bHLH) (Apartado 1), se expreERRNVPHGLFRVRUJ 24 Neurogénesis san en células precursoras y son necesarios para la selección de los precursores neurales y su compromiso para diferenciarse. La transición de la proliferación a la neurogénesis implica un coordinado aumento de la actividad de genes proneurales. El incremento de la actividad de los genes proneurales al comienzo de la neurogénesis pone en marcha un conjunto de eventos que resultan en la diferenciación neuronal terminal. La activación de esta cascada de eventos moviliza dos categorías de genes, los iniciadores de la neurogéneis (Mash1, ngn y Math) y los de diferenciación neuronal miembros de la familia NeuroD (NeuroD, NeuroD2 y Math2) que terminan la diferenciación dando lugar a las fases de iniciación y de diferenciación neuronal. La fase de iniciación es plástica y facilmente reversible mientras que la fase de diferenciación es menos reversible y lleva a la formación de neuronas maduras. Cuando los genes proneurales de iniciación son suficientemente activados en las NSCs las proteínas bHLH activan la expresión de genes de diferenciación que Apartado 1 Los genes proneurales son reguladores de varias etapas del desarrollo del linaje neuronal. Los genes proneurales de vertebrados comprenden dos familias una, relacionada a los genes Achete-Scute de Drosophila, contiene a Mash1 y Mash2, y otra, relacionada a los genes atonal de Drosophila, comprende a Math1 y Math5, y a las familias neurogenina (Ngn), NeuroD, y Olig. En mamíferos, los genes proneurales Mash1, ngn/Math4, y Math1 son expresados por células precursoras neuronales y NeuroD y Math2/NEX-1 por células postmitóticas. Los genes proneurales codifican factores de transcripción con motivos hélice-lazo-hélice básico (bHLH). HLH es un motivo estructural, compartido por esas proteínas, caracterizado por dos α-hélices separadas por una región de unión o lazo de longitud variable. Las regiones de las hélices de 15-16 aminoácidos de largo participan en la dimerización. Adyacente al motivo HLH hay una región rica en aminoácidos básicos necesaria para la unión al DNA. Las proteínas bHLH se clasifican en clase A (clase I) y clase B (clases II-VII). La clase A, también llamada proteínas E, comprende a HEB, E2-2, E2a, E12, y E47. La clase B se dividen en seis subclases (clases II-VII). Los miembros de estas subclases promueven o inhiben la diferenciación neuronal. Los factores bHLH subclase II, implicados en la diferenciación neural y en determinar el tipo celular, comprenden a Mash1, Math1, Math5, Ngn1, 2, 3, y NeuroD1. Los factores de la subclase VI comprenden a las proteínas Hes codificadas por los genes bHLH antineurales (Hes1-5). ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 25 promueven la salida del ciclo celular y la diferenciación neuronal. Por el contrario cuando la actividad de los genes proneurales de iniciación es inhibida las NSCs vuelven a estado indiferenciado. El mantenimiento del balance entre células indiferenciadas y las que se diferencian en neuronas es un mecanismo importante a fin de evitar el agotamiento del conjunto de las células indiferenciadas. La fase de iniciación Los genes bHLH iniciadores Mash1, Math y Ngn son expresados en los estadios tempranos de la embriogénesis en diferentes regiones del sistema nervioso. Las proteínas proneurales bHLH, que forman heterodímeros con las proteínas E para unirse a la caja E del DNA, que tiene la secuencia CANNTG, compromoten a las células progenitoras a un destino neuronal activando la expresión de genes que promueven el cambio de la fase de proliferación a la de diferenciación neuronal e inhibiendo la expresión de genes que determinan el destino de células gliales. El mecanismo por el cual Ngn1 induce estas dos acciones implica la unión de Ngn1 con CBP/p300 y Smad reclutándolos al promotor de NeuroD para activar la transcripción e inducir la neurogénesis. El secuestro de CBP impide su unión a Stat1/3 inhibiendo la diferenciación a astrocitos (Figura 13). Mutaciones de los genes Mash1, Ngn1, Ngn2 y Math1 suprimen la diferenciación neuronal y por el contrario, su incremento promueve neurogénesis ectópica. En ausencia de las funciones de Ngn2 y Mash1 los progenitores dejan de diferenciarse en neuronas y generan astrocitos. Mash1, Ngn1/2 y Math1 están implicados en generar diferentes subgrupos de neuronas. Así, en el prosencéfalo Mash1, expresado en la región ventral del telencéfalo, da lugar a neuronas GABAérgicas, mientras que Ngn2, expresado en la región dorsal, da lugar a neuronas glutamatérgicas. En el CNS Mash1 influencia las decisiones del destino neuronal en neuronas olfatorias, de la retina, y autonómicas (nor-adrenérgicas), y en interneuronas de la médula espinal, mientras que Ngns están implicados en la diferenciación de motoneuronas de la médula espinal. En el sistema nervioso periférico Ngns promueven la identidad de neuronas sensoriales. Por su parte, Math1 ha sido implicado en generar las células granulares del cerebelo y poblaciones dorsales de interneuronas de la médula espinal. La activiadad de los genes Ngn2 es inducida por el factor de transcripción Olig2 en la generación de neuronas motoras en la médula espinal. BMP2 y eritropoyetina inducen la expresión de ERRNVPHGLFRVRUJ 26 Neurogénesis Figura 13. Mecanismos por los cuales Ngn1 induce la expresión de genes que determinan la diferenciación neuronal e inhibe la expresión de genes que determinan la diferenciación glial Mash1 y BMP6 y BMP7 inducen la expresión de Math1. Ref. 13, 56, 60, 79, 109, 112, 113, 122, 131, 147, 161, 162, 182, 202, 211 Regulación de los genes proneurales La actividad o la expresión de los genes proneurales implicados en el desarrollo de los linajes neurales está sujetada a distitos reguladores positivos y negativos. La proliferación de las células progenitoras durante el desarrollo es regulada por señales de las proteínas Notch controlando su número hasta que se disponga de las señales correctas de diferenciación. La vía Delta–Notch de señalización El circuito de las señales Notch (Apartado 2) comprende el dominio extracelular de los ligandos delta y jagged, expresado en la superficie de una célula, que interactúa con el dominio extracelular del receptor Notch en la membrana celular de la célula adyacente. Esta interacción promueve dos fracturas proteolíticas en el receptor Notch, una primera, catalizada por la familia de metaloproteasas. ADAM o TACE fractura la proteína Notch en ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 27 próximidad a la cara externa de la membrana liberando su dominio extracelular que continúa interactuando con el ligando. El ligando y el dominio extracelular de Notch son entonces endocitados por la célula que expresa el ligando. Una segunda fractura, catalizada por la enzima γ-secretasa cerca de la cara interna de la membrana celular, libera el dominio intracelular de Notch (NICD). γ-secretasa puede ser codificada por el gen presenilina1. NICD liberado transloca al núcleo donde forma un complejo de transcripción con la proteína RBP-J de unión a DNA (también conocida como CSL o CBP1/ Su(H)/LAG1) y la proteína coactivadora MAM/LAG-3 de la familia Martermind. NICD se une con gran afinidad a RBP-J a través de su dominio N-terminal RAM, pero la formación de un complejo de transcripción fun cionalmente activo requiere la interacción del dominio ANK con el coactivador MAM, una proteína rica en glutamina localizada en el núcleo. MAM contribuye a activar la transcripción a través de su asociación con coactivadores (Figura 15). Apartado 2 La familia de proteínas Notch (Notch 1-4) son receptores de superficie. El gen notch codifica un receptor que atraviesa la membrana una sola vez. El largo dominio extracelular contiene un número variable de repeticiones en tándem similares a EGF (epidermal growth factor) de las cuales las repeticiones 11 y 12 están implicadas en la interacción con el ligando. A continuación de este dominio se encuentran tres repeticiones ricas en cisteína conocidas como repeticiones LIN (NLR). Entre las repeticiones LIN y el dominio de transmembrana se encuentra un sitio de procesamiento proteolítico. El dominio intracelular (NICD) contiene un dominio RAM (regulation of aminoacid metabolism), siete repticiones ankirina en tándem (ANK), implicadas en interacciones proteínaproteína, y una secuencia PEST rica en prolina (P), glutamina (E), serina (S), y treonina (T). Notch1 y Notch2 tienen además un dominio TAD (terminal transactivation domain) antes de PEST. Los ligandos Notch consisten en una familia de proteínas Delta simil o Serrate/Jagged simil (familia DSL). En mamíferos hay dos subtipos Serrate simil: Serrate1/Jagged1 y Serrate2/Jagged2 y tres subtipos Delta simil (Dll), Dll-1, Dll-3, y Dll-4. Los ligandos Notch son proteínas de transmembrana cuya porción extracelular consiste en un péptido señal seguido por el dominio N-terminal (NT) de 100-165 aminoácidos. Adyacente a esta región N-terminal se encuentra el motivo DSL de unos 45 aminoácidos seguido por 2 -16 repeticiones EGF simil. Jagged1 y Jagged2 contienen además una región rica en cisteína (CR) entre la región de repeticiones EGF y el dominio de transmembrana que falta en Dll. El dominio NT junto con el segmento adyacente DSL forman el dominio de unión al motivo EGF de Notch. (Figura 14). ERRNVPHGLFRVRUJ 28 Neurogénesis Figura 14. Representación esquemática del receptor Notch y los ligandos Jagged y Delta. En ausencia de NICD, RBP-J recluta los co-represores SMRT/Ncor/ HDAC1 y CIR/HDAC2/SAP30 y reprime la transcripción. En presencia de NICD los co-represores son desplazados de RBP-J y el complejo formado por RBP-J─NICD─MAM recluta la histona acetiltansferasa PCAF y activa la transcripción de los genes Hes (Figura 15). Numb inhibe las señales Notch en células progenitoras. Otra molécula que antagoniza a Notch es EGFL7 (epidermal growth factor-like domain 7) secretada por células endoteliales de los vasos sanguíneos. EGFL7 actúa como un inhibidor de las señales Notch uniéndose a su porción extracelular y antagonizando la unión de ligandos Notch. El bloqueo de las señales Notch reprime la expresión de Hes1 e incrementa la regulación de la expresión de Ngn2 y Dll1. En neuronas postmitóticas que no expresan Hes1 la expresión de Ngn2 y Dll1 es constante. Inhibición lateral Las señales Notch son un mecanismo de control del destino celular a través de interacciones entre células vecinas por un mecanismo llamado inhibición lateral. La inhibición lateral asegura la producción de dos células distintas de una población inicialmente homogénea. A medida que el desarrollo progresa las diferencias entre células vecinas, causada por eventos accidentales o por factores intrínsecos o extrínsecos, se estabilizan o amplifican a través de las señales Notch y Delta. En un comienzo las células expresan niveles equivalentes de receptores y ligandos. Con los cambios iniciales, una célula expresa altos niveles de ligando y bajos niveles de receptores mientras que las células vecinas adoptan una disposición inversa. De esta forma las señales Notch se transmiten de la célula que expresa altos niveles de ligando a la célula que expresa altos niveles de receptor inhibiERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 29 Figura 15. Cascada de eventos inducida por activación del receptor Notch. endo su diferenciación. Este proceso, llamado inhibición lateral, previene la diferenciación simultánea de todas las NSCs, permitiendo que un grupo de células se diferencie mientras que otras se mantengan indifenciadas para diferenciarse posteriormente en diferentes tipos celulares (Figura 16). Ref. 6, 19, 48, 50, 89, 93, 97, 110, 145, 183, 203, 229 Los genes Hes En las células neuroepiteliales, los genes Hes1 y Hes3 son expresados antes que Notch y sus ligandos, indicando que su expresión es independiente de señales Notch. Cuando las células neuroepiteliales comienzan generar células glía radiales la expresión de Hes3 disminuye y aparece la expresión de Hes5 así como la de los genes proneurales Mash1 y Ngn2 y la de los genes Notch1 y del ligando Dll1. La expresión de Dll1 es inducida por las proteínas Mash y Ngn2 (Figura 17) a partir de la cual la expresión de Hes1 se vuelve dependiente de Notch. La activación de Notch por sus ligandos Dll1 induce la expresión de los genes Hes1 y Hes5. A medida que el desarrollo progresa la expresión de Hes1 y Hes5 disminuye aunque se mantiene en las NSCs y en los progenitores de la zona subventricular. Aunque la expresión de los genes Hes1 y Hes5 es inducida por Notch, Hes1 es también controlado por otros factores como Wnt, SHH y BMP. Cada uno de los siete miembros que integran la familia de factores Hes tiene tres dominios conservados, el dominio bHLH N-terminal, por el cual forma dímeros y se une a DNA, el dominio Orange, que confiere especificidad para la selección del heterodímero asociado, y el dominio WRPW C-terminal, una secuencia Trp-Arg-Pro-Trp que interactúa con co-represores (Figura 18). ERRNVPHGLFRVRUJ 30 Neurogénesis Figura 16. Los genes proneurales Mash1 y Ngn2, activados en la célula progenitora que se diferencia, inducen la expresión del ligando Delta que activa las señales Notch en la célula vecina inhibiendo su diferenciación (inhibición lateral). Actividad de los factores Hes Los genes Hes son reguladores negativos de la neurogénesis antagonizando a los genes proneurales. El factor Hes1 reprime la expresión de los genes proneurales Ngn2 y Mash1 con lo que inhibe la diferenciación y mantiene a los progenitores neurales indiferenciados. La inactivación del gen Hes1 incrementa la expresión de genes proneurales produciendo diferenciación prematura de las células progenitoras las que se agotan antes que hayan proliferado suficientemente mientras que la sobreexpresión del gen Hes1 inhibe la diferenciación neuronal. Los factores Hes reprimen la transcripción de los genes proneurales por dos mecanismos. En uno, inhibición activa, los factores Hes forman homo- y hétero-dímeros con miembros relacionados de la familia para unirse, con gran afinidad, a la caja N (CACNAG) y a los sitios CACG(C/A)G de DNA, a través de la región básica. La interacción molecular entre el motivo WRPW de Hes y el co-represor TLE/Grg forma un complejo represor. La actividad de histona deacetilasa asociada al complejo represor modifica la estructura de la cromatina haciendo que DNA sea inaccesible a activadores de la transcripción. En otro, Hes forma Figura 17. Los genes proneurales Mash1 y Ngn2 activan una casacada de eventos que inducen la expresión del gen Hes. La proteína Hes, a su vez, reprime la expresión de los genes Ngn2 y Dll1. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 31 Figura 18. Estructura de los factores Hes. En la parte inferior funciones de los distintos dominios. heterodímeros con activadores bHLH como Mash1 y E47 secuestrándolos. Estos heterodímeros no pueden unirse al DNA inhibiendo así la actividad de transcripción de los activadores bHLH (represión pasiva) (Figura 19). Un papel similar a Hes para inhibir la diferenciación precoz lo desempeña el factor Id (inhibitor of DNA binding). Las proteínas Id comprenden 4 miembros (Id1-Id4) que pertenecen a la familia de factores de transcripción bHLH. Las proteínas Id pueden asociarse a otros miembros de la familia bHLH formando heterodímeros pero como carecen del dominio básico no pueden unirse a DNA. Las proteínas mejor caracterizadas que interaccionan con Id son miembros de la familia de proteínas E. Como estas proteínas son asociados obligatorios de las proteínas bHLH su secuestro en los heterdímeros Id-bHLH permite a las proteínas Id producir una rápida inhibición de la actividad del factor de transcripción bHLH (Figura 19). Los genes Id son inducidos por la vía BMP/ Smad en células neuroepiteliales (Figura 8). Actividad oscilante de los factores Hes Los factores Hes1 y Hes5 reprimen no sólo la expresión de los genes proneurales sino que también inhiben los genes Dll1 (Figura 17). Hes1 también se autorregula, cuando adquiere una alta concentración inhibe su propia expresión uniéndose a la caja N del promotor Hes1 y consecuentemente la proteína Hes1 desaparece (Figura 20). Esta represión es de corta duración, debido a la corta vida media tanto del mRNA de Hes1 como de la proteína Hes1, volviendo Hes1 nuevamente a su actividad represora. De esta forma Hes1 inicia expresiones oscilantes con una pe riodicidad de 2-3 horas. Las oscilaciones de Hes1 reprimen la expresión de Ngn2 en progenitores neurales de manera oscilante en relación inversa a Hes1 de forma tal que los niveles altos de Hes1 reprimen la expresión de Ngn2 y la disminución de Hes1 permite nuevamente su expresión (Figura 21). La expresión de Dll1 es también oscilante en las células progenitoras neurales, controlada por la activación periódica de Ngn2 y por la represión ERRNVPHGLFRVRUJ 32 Neurogénesis Figura 19. Inhibición de la transcripción de los genes proneurales por factores Hes e Id. periódica de Hes1. Las oscilaciones de Dll1 activan, a su vez, las señales Notch manteniendo a grupos celulares como células progenitoras. Las oscilaciones de Hes1 son transitorias y se detienen después de algunos ciclos. La pérdida de la expresión de Hes1 incrementa la expresión de Ngn2 en forma sostenida induciendo la diferenciación neuronal. La oscilación de Hes 1 se requiere para una eficiente proliferación celular. El mecanismo por el que se regula la expresión oscilante de Hes1 implica la inducción de la expresión de genes Socs3 por la vía Jak-Stat3. En respuesta a citoquinas, Jak2 activa a Stat3 por fosforilación la que transloca al núcleo activando la expresión de genes, uno de los cuales es Socs3. La proteína Socs3 (suppressor of cytokine signaling 3) inhibe la activación de Stat3 por Jak2 y por este feedback negativo los niveles de pStat3 y Socs3 oscilan. El bloqueo de estas oscilaciones a su vez inhibe las oscilaciones de Hes1 haciendo que los niveles de Hes1 sean constantes. Por su parte, Hes1 promueve la activación de Stat3 dependiente de Jak2. De modo que es probable que las oscilaciones de Hes1 y las oscilaciones de pStat3-Socs3 dependan una de la otra. Hes1 no sólo controla la diferenciación neural sino que también puede estar implicada en mantener la proliferación de progenitores. Hes1 promueve la proliferación celular reprimien- Figura 20. Activación de la expresión de Hes1 por señales Notch. Hes1 se autoregula.reprimiendo la expresión de sus propios genes. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 33 Figura 21. Represión oscilante inversa de los niveles de Hes1 y Ngn2 en células progenitoras neurales. do la expresión de p27Kip1 , lo que permite a las células progresar a través de la fase G1 de su ciclo celular. El miembro Hes6 de la familia Hes forma heterodímeros con Hes1 inhibiendo su actividad y promoviendo la diferenciación neuronal induciendo la actividad de Mash1. Una subclase de genes relacionada a los genes Hes, Hesr1-Hesr3, también se expresan en SC neuronales en el cerebro de embriones. La expresión de Hesr también es controlada por señales Notch. Las proteínas Hesr y Hes forman heterodímeros que actúan como represores de la diferenciación manteniendo a las SC neuronales en estado indiferenciado. Ref. 9, 26, 72, 85, 86, 87, 88, 94, 140, 149, 177, 183, 189, 232, 233 La fase de diferenciación En una segunda etapa Ngn2 activa los genes bHLH de diferenciación miembros de la familia NeuroD (NeuroD1, NeuroD2, y Math2). La supresión de Ngn1 y Ngn2 en ratones se traduce en pérdida de la expresión de NeuroD. NeuroD se expresa en neuronas inmaduras y NeuroD2 y Math2 dirigen la diferenciación terminal de las neuronas. El factor de transcripción NeuroD y sus similares NeuroD2, Math2, y Math3, comparten secuencias similares de aminoácidos en toda su extensión pero particularmente en su dominio básico y en la secuencia de 40 aminoácidos que siguen a la hélice 2. NeuroD se expresa en el dasarrollo de neuronas periféricas y del CNS. La expresión del mRNA de NeuroD está en su máximo nivel durante la diferenciación de la corteza cerebral y la médula espinal y disminuye a medida que las neuronas maduran aunque se mantiene en el cerebelo e hipocampo en ratones y humanos adultos. NeuroD es un factor de diferenciación de neuronas capaz de convertir a células embrionarias en células diferenciadas de tejidos. El incremento de la actividad de NeuroD promueve la ERRNVPHGLFRVRUJ 34 Neurogénesis salida prematura del ciclo celular y la diferenciación ectópica de neuronas. NeuroD es capaz de transactivar su propio promotor, un efecto que puede incrementarse por ácido retinoico. Además la histona deacetiltransferasa HDAC3 tiene efectos sinérgicos con la auto-activación de NeuroD. Por el contrario, la supresión de NeuroD en ratones se traduce en falta de neuronas granulares del cerebelo y en pérdida del girus dentado del hipocampo. En el hipocampo la formación y organización de las células glía radiales es normal pero una vez que las células granulares llegan al girus dentado su proliferación y diferenciación están alteradas. NeuroD activa la expresión de los genes NeuroD2 y Math2 (Figura 22). Los factores de transcripción de estos genes se caracterizan como agentes de diferenciación neuronal que inducen la detención del ciclo celular en progenitores neuronales, vía el incremento de la expresión de p21 Cip, y la transcripción de genes que contribuyen a la maduración de neuronas. Sus patrones de expresión se superponen durante el desarrollo embrionario dando lugar a compensaciones funcionales cuando uno de ellos es suprimido. Aparte de sus funciones inductoras de la diferenciación promueve la supervivencia de linajes neuronales específicos. NeuroD2 se necesita para el desarrollo y la supervivencia de las neuronas granulares del hipocampo y el cerebelo, las neuronas del núcleo basolateral de la amígdala y el desarrollo de las conexiones corticotalámicas. Ratones deficientes en NeuroD2 tienen cerebros pequeños y poseen un exceso de apoptosis en el CNS junto a otras alteraciones neurológicas. NeuroD2 inhibe la expresión de REST, un represor de muchos genes. Math2, por su parte, estimula la diferenciación neuronal y desempeña un importante papel en el crecimiento de neuritas. La estimulación del crecimiento neurítico es mediada por el aumento de la expresión de GAP-43 y la expresión de Prg1, un gen Figura 22. Cascada de eventos involucrada en la diferenciación neuronal ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 35 que codifica la proteína Prg1 importante para el crecimiento neurítico Ref. 77, 104, 124, 155, 171, 186, 213, 214, 222, 230 DIFERENCIACIÓN EN ASTROCITOS Una vez que la mayoría de las neuronas se han diferenciado se inicia la fase de diferenciación astroglial. El cambio de la fase neurogénica a la fase gliogénica depende del cambio de programas de la expresión de genes específicos de la neurogénesis a la expresión de genes específicos de la gliogénesis. Este cambio depende de señales ambientales así como de propiedades intrínsecas de las células. La diferenciación de astrocitos se caracteriza por la expresión de dos marcadores, la proteína GFAP (glial fibric acidic protein) de los filamentos intermedios y la proteína S100β de unión a calcio. Propiedades celulares intrínsecas Un factor intrínseco importante es el tiempo, que determina el cambio de competencia de las células progenitoras por la que se hacen más propensas a formar neuronas primero y glía después. Los progenitores también cambian la respuesta a citoquinas durante el desarrollo siendo los más jóvenes menos reactivos. El mecanismo de represión de la formación de astrocitos en los periodos tempranos del desarrollo implica la metilación del DNA de los genes específicos de astrocitos. Otro mecanismo involucra a las proteínas proneurales que promueven neurogénesis e inhiben la gliogénesis. Altos niveles de las proteínas bHLH proneurales impiden que se formen astrocitos en respuesta a citoquinas. Señales ambientales El ambiente donde los progenitores se encuentran es un importante determinante de su diferenciación. Las señales extrínsecas incluyen los factores de crecimiento FGF y EGF, las proteínas BMPs, y las citoquinas LIF, CNTF y CT-1, todas las cuales influencian la decisión de células progenitoras a adquirir un destino neuronal o glial . La producción de astrocitos es inducida por los factores LIF y CNTF. La unión de LIF y CNTF a sus receptores activa la vía Jak-STAT. Los receptores de citoquinas son expresados por células de la VZ y la SVZ. Las moléculas STAT activadas dimerizan y translocan al núcleo donde forman complejo con los co-activaERRNVPHGLFRVRUJ 36 Neurogénesis dores CBP/p300 uniéndose a secuencias específicas de promotores gliales que promueven la diferenciación de astrocitos así como del promotor GFAP (Figura 7). Además las citoquinas activan la vía PI3K-Akt que fosforila el co-represor N-CoR. N-CoR fosforilado transloca del núcleo al citoplasma suprimiendo su actividad inhibidora. Cuando N-CoR no está fosforilado transloca al núcleo reprimiendo la diferenciación de astrocitos. La falta de los receptores LIFRβ o gp130 produce déficit en la formación de astrocitos mientras que el aumento de CNTF y LIF son capaces de inducir formación prematura de astrocitos. Sin embargo, ratones que carecen los genes de las citoquinas CNTF o LIF presentan modestos déficit en el número de astrocitos y por el contrario, la falta de la citoquina CT-1 da lugar a un marcado déficit de astrocitos. CT-1 es un ligando importante en la transición de la neurogénesis a la gliogénesis en células progenitoras de la corteza cerebral. Un mecanismo extrínseco que regula el comienzo la gliogérnesis implicaría a la producción de CT-1 por las neuronas recién formadas que induciría a las células progenitoras a producir astrocitos. BMPs activan una vía de señales que implican a las proteínas Smad que forman complejos que translocan al núcleo para activar la transcripción de genes específicos (Figura 8). BMP promueve la astrorogénesis colaborando al menos en parte con la vía gliogénica Jak-STAT. Para una efectiva inducción de las células progenitoras a diferenciarse en astrocitos es indispensable una cooperación entre BMP y citoquinas. En cultivos de células corticales, BMPs estimulan inicialmente la neurogénesis pero la suprimen en estadios posteriores. Estos efectos biológicos opuestos dependen, al menos en parte, de la participación de moléculas concurrentes. Durante el periodo neurogénico cuando los niveles Ngn1 son altos, la exposición a BMP2 produce el complejo Smad-CBP/p300-Ngn1 que secuestra CBP/p300 de STATs inhibiendo la gliogénesis (Figura 13). Ngn1 también inhibe la diferenciación glial inhibiendo la activación de STAT1/STAT3. Por el contrario, durante el periodo gliogénico, cuando los niveles de Ngn1 son bajos, la exposición a BMP2 en cooperación con LIF produce la formación del complejo de transcripción Smad1-CBP/p300-STAT3 que activa los genes gliogénicos. En esas condiciones BMP2 también induce la expresión de proteínas Ids (Figura 8) con lo que interfiere la expresión de bHLH neurogénicas en los mismos progenitores asegurando que formen glía y no neuronas. Las señales Notch no sólo inhiben la diferenciación neuronal sino que también incrementan la proliferación de progenitores y su diferenciación en astrocitos en el sistema nervioso central y periférico. Notch induce astrogliogénesis directamente a través ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 37 de la activación del promotor GFAP por un complejo de transcripción que implica al dominio intracelular NICD de Notch y al factor de transcripción RBP-Jκ de unión al promotor gfap promoviendo la transcripción pero solo cuando la vía JAK-STAT está activada. Cuando la vía JAK-STAT no está activada RBP-Jκ se une al co-represor N-CoR reprimiendo los genes gliogénicos. Notch también actúa vía Hes para promover la diferenciación de astrocitos a través de la represión de los genes proneurales. Las proteínas Hes activan el factor de transcripción STAT3 un inductor de la génesis de astrocitos. Un paso importante en el cambio de los progenitores neurales a gliogénesis es la inducción de las proteínas Sox9 y NF1A que promueven los destinos a astrocitos y oligodendrocitos e inhiben la neurogénesis. Ratones con supresión de Sox9 producen menos progenitores de oligodendrocitos y astrocitos y aumentan el número de neuronas en la médula espinal ventral. La supresión de los genes Nfia en la médula espinal del pollo previene la generación de progenitores de astocitos y oligodendrocitos y produce la diferenciación neuronal prematura. En presencia de factores de crecimiento se incrementa la generación de neuronas a través de la activación de la vía MEKERK-Rsk. Esta cascada de señales fosforila a C/EBP que promueve la transición de progenitores a neuronas, por la transcripción de genes específicos de neuronas, e inhibe la gliogénesis. En ausencia de activación de C/EBP los progenitores permanecen en la VZ/SVZ donde proliferan pero después tienen tendencia a generar astrocitos. El programa de diferenciación de astrocitos esta suprimido durante el periodo neurogénico y no puede ser activado por LIF ni por Notch. La supresión de la diferenciación de astrocitos durante el periodo neurogénico depende por una parte por la expresión de los factores Ngn1/2 y Mash1 y por otra por la metilación del DNA de genes glía específicos. Ambos mecanismos suprimen la activación de la vía JAK-STAT. La supresión de los factores proneurales Ngn1/2 y Mash1 disminuye la neurogénesis e incrementa la astrogénesis prematura y por el contrario su aumento promueve neurogéneis a expensas de gliogénesis. Uno de los mecanismos por los que Ngn1 ejerce su acción represiva es secuestrando CBP/p300 previniendo su unión a STAT. La metilación del DNA es un mecanismo necesario para silenciar la formación de astrocitos. La metilación del promotor gfap en el sitio de unión a STAT impide la unión de STAT a gfap y la activación de la vía JAK-STAT reprimiendo los genes específicos de astrocitos. Ref. 38, 44, 52, 57, 64, 129, 197, 202, 219 ERRNVPHGLFRVRUJ 38 Neurogénesis DIFERENCIACIÓN EN OLIGODENDROCITOS La generación de oligodendrocitos comprende varias etapas. Primero, se originan oligodendrocitos progenitores (OPCs) a partir de las células neuroepiteliales. Los oligodendrocitos progenitores, proliferan activamente y migran poblando el cerebro en desarrollo. Después de la migración los oligodendrocitos progenitores se asientan a lo largo de tractos fibrosos de la futura sustancia blanca, se hacen no migratorios y se diferencian en oligodendrocitos inmaduros para finalmente generar oligodendrocitos formadores de mielina (Figura 23). En ratones las OPCs comienzan a diferenciarse en los últimos periodos del desarrollo embrionario, hacen su pico 10-12 días después del nacimiento y continuan unas 6 semanas más. En humanos, la mielinización de los tractos corticoespinales se continúa por varios años después del nacimiento. Origen de oligodendrocitos En la médula espinal los oligodendrocitos se originan de células neuroepiteliales. Las células progenitores del dominio pMN generan neuronas motoras seguidas por oligodendrocitos progenitores. Alrededor del 80% de los oligodendrocitos de la médula espinal tienen ese origen y el 20% restante se origina de los dominios dP3-5 de la médula espinal dorsal (Figura 24). La configuración de neuronas motoras como de OPCs en la médula espinal ventral depende de señales del factor sonic hedgehog (SHH). SHH compromete inicialmente a las células del neuroepitelio a un linaje de neuronas motoras y en una segunda fase a oligodendrocitos. Las moléculas BMP2 y BMP4, expresadas en la médula espinal dorsal, limitan, por su parte, la extensión espacial de la generación de OPCs en la médula espinal ventral. Figura 23. Etapas de diferenciación de oligodendrocitos durante el desarrollo y sus marcadores antigénicos. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 39 La supresión de las señales BMP produce la expansión dorsal de las OPCs a expensas de astrocitos producidos en dominios de progenitores p2. En la médula espinal dorsal los oligodendrocitos progenitores se desarrollan más tardíamente que los que se originan en el dominio pMN y son SHH y Nkx independientes. Oligodendrocitos precursores también pueden originarse en células inmaduras limitadas a dar sólo progenies gliales llamadas precursores restringidos a glía (GRPs, glia restricted precursors). Estas células, a diferencia de los oligodendrocitos precursores limitados a la médula espinal ventral, pueden aislarse de la médula espinal tanto dorsal como ventral durante el desarrollo embrionario temprano. En áreas más rostrales del CNS oligodendrocitos progenitores se originan de un grupo de células del diencéfalo ventral que luego migran al tálamo, hipotálamo, y cerebelo. Las OPCs del telencéfalo derivan del neuroepitelio de la eminencia ganglionar media y lateral y dependen de señales SHH para su generación. Estas OPCs migran a la corteza cerebral donde se unen a OPCs que se originan luego en la corteza. Los oligodendrocitos progenitores son células bipolares migratorias que expresan el proteoglicano condroitin-sulfato NG2, y el receptor α del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-Rα) (Figura 23). Control del desarrollo de OPCs En la médula espinal en desarrollo SHH activa al factor de transcripción Nkx6 que a su vez induce la expresión del factor de transcripción Olig2. Olig2 se requiere para la configuración de MNs y OPCs ya que ambos tipos celulares se pierden en médula espinal con mutantes de Olig2. Por el contrario, Olig1 estaría implicado en estadios posteriores de diferenciación y mielinización de oligodendrocitos. Olig2 en combinación con Neurogenina1 y -2 (Ngn-1, -2) genera neuronas motoras. Durante ese periodo Olig2 y el factor de transcripción Nkx2.2 se reprimen mutuamente limitando la expresión de sus respectivos dominios. La expresión de Ngn decrece al final de la inducción de las neuronas permitiendo la expresión del factor de transcripción Nkx2.2. Las células que expresan Olig2 y Nkx2.2 se desarrollan como oligodendrocitos (Figura 25). Las señales Notch están implicadas en la selección de los destinos de MN y OPC durante el desarrollo. La supresión de las señales Notch da lugar a un exceso de producción de MNs a ex pensas de OPCs y por el contrario la activación de Notch produce un exceso de OPCs a expensas de MNs. ERRNVPHGLFRVRUJ 40 Neurogénesis Figura 24. Origen de OPCs en los distintos dominios progenitores de la médula espinal. La inducción de las proteínas Olig1/2, requeridas para la generación de todos los oligodendrocitos, puede resultar en las células progenitoras dorsales de una combinación de señales FGF y la inhibición de la actividad de BMP (Figura 25). Control de la proliferación de OPCs Una vez comprometido el linaje celular en la zona ventricular, los oligodendrocitos progenitores proliferan. Las fases iniciales de la proliferación tienen lugar en la VZ y la SVZ mientras que la mayoría de los oligodendrocitos proliferan después que han migrado a la sustancia blanca en desarrollo. Las OPCs requieren para su auto-renovación de la acción de moléculas como PDGF-A (platelet-derived growth factor A). La sobreexpresión de PDGF-A aumenta el número de OPCs en la médula espinal y su supresión lo reduce. La respuesta a PDGF-A se incrementa en presencia de NT-3 (neurotrofina-3), FGF-2 (fibroblast growth factor-2), y citoquinas. Control de la migración de OPCs Los oligodendrocitos precursores tienen la capacidad de migrar, para adquirir su destino final, que se pierde con la maduración. La movilidad de oligodendrocitos precursores es promovida por PDGF que tiene propiedades quimioatrayentes. PDGF, producido por astrocitos y neuronas, está ampliamente distribuído en el sistema nervioso. La migración a lo largo de las células nerviosas es guiada por señales específicas del medio ambiente. En el nervio óptico, la mayoría de las neuronas migran del ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 41 Figura 25. Vías moleculares en el desarrollo de oligodendrocitos de la médula espinal ventral (a) y dorsal (b). quiasma a la retina por señales repelentes producidas por el quiasma óptico. Netrina-1 y semaforina-3A han sido señaladas como los factores quimio-repelentes. También en la médula espinal la dispersión de oligodendrocitos precursores de la zona ventricular ventral es mediada por Netrina-1. Otros factores que controlan la migración son componentes de la superficie celular como moléculas de adherencia y receptores de la matriz extracelular. Receptores integrina regulan la migración interactuando con componentes de la matriz extracelular y con receptores de superficie de otras células. Antes de contactar con los axones los oligodendrocitos progenitores extienden múltiples procesos radiales. Una vez que los procesos hacen contacto con los axones se extienden a lo largo de sus superficies para después extender láminas que los envuelven. Control de la diferenciación de OPCs Después que los oligodendrocitos progenitores llegan a su destino final, detienen su división, se vuelven no migratorios, y se diferencian en oligodendrocitos formadores de mielina. La diferenciación depende tanto de señales intrínsecas como de señales extrínsecas derivadas de las neuronas. Las señales intrínsecas determinan cuando el proceso proliferativo es suficiente y cuando es adecuado detener el ciclo celular. Las señales extrínsecas controlan el tiempo adecuado de la diferenciación, para asegurar que la mielinización tenga lugar en el momento y sitio precisos, y que el número de oligodendrocitos se adecue a la superficie neuronal que requiere ser mielinizada. Entre las señales externas se encuentra PDGF. En ausencia de PDGF la proliferaERRNVPHGLFRVRUJ 42 Neurogénesis ción se detiene prematuramente mientras que un exceso la prolonga. En condiciones normales, la concentración de PDGF disminuye progresivamente con el progreso de la proliferación haciendo que esta se detenga. Otro factor externo que promueve la diferenciación es la hormona tiroidea (TH). TH actuaría activando genes dependientes del factor de transcripción p53 cuyo producto p27 detiene el ciclo celular inhibiendo la actividad de CDK2. Las señales Notch también están implicadas en el control de la diferenciación de oligodendrocitos. OPCs expresan receptores Notch1 que interactúan con el ligando Jagged1 de la superficie del axón. La activación de la vía Notch inhibe la diferenciación de oligodendrocitos. La supresión de Notch da lugar a la expresión prematura de marcadores de diferenciación de oligodendrocitos. La diferenciación puede también inducirse por la unión de laminina al receptor integrina mediada por la activación de una cascada de señales intracelulares. En condiciones normales de desarrollo los oligodendrocitos se producen en exceso y su número se ajusta al número y largo de los axones que requieren ser mielinizados. Sólo los oligodendrocitos que hacen contacto con axones sobreviven mientras que los demás mueren por apoptosis. El contacto con los axones previene la apoptosis de oligodendrocitos los que prosiguen la maduración en oligodendrocitos formadores de mielina. Factores como PDGF, factor de crecimiento insulina simil, factor neurotrópico de crecimiento ciliar, y neurotrofina-3, segregados principalmente por astrocitos pueden promover la supervivencia de oligodendrocitos inmaduros pero a medida que estos progresan en la diferenciación requieren de nuevos factores de supervivencia como neuregulinas provistas por los axones. Los oligodendrocitos diferenciados comienzan a extender membranas envolventes de axones antes de diferenciarse en oligodendrocitos formadores de mielina. La formación de procesos membranosos en los oligodendrocitos se asociaría a laminina de la matriz extracelular. Laminina incrementa la formación de membranas una vez que la diferenciación ha ocurrido y se ha producido un contacto axoglial. La formación de membranas se incrementa por la interacción de laminina con oligodendrocitos, un efecto mediado por el receptor integrina α6β1. Una de las vías activadas por la interacción laminina-integrina en la formación de procesos membranosos implica a la quinasa Fyn. La activación de integrinas inducida por la unión de laminina lleva a la interacción de la cola citoplasmática de la subunidad β de integrina con Fyn, directamente o a través de FAK. Fyn fosforila la tirosina 1105 de p190 RhoGAP aumentando su actividad GAP y ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 43 facilitando la hidrólisis de RhoAGTP a RhoAGDP. La inactivación de RhoA es un requisito para la diferenciación de oligodendrocitos en múltiples procesos. Además, las proteínas que se unen a la cola de la subunidad β de integrina pueden activar Rac1 induciendo el crecimiento de procesos en oligodendrocitos vía activación de WAVE1. Mielinización Los oligodendrocitos extienden varios procesos cada uno de los cuales hace contacto y envuelve segmentos de axones formando multiespiras que mielinizan. Cada oligodendrocito puede envolver hasta 40 segmentos en diferentes axones. La mielinización es fuertemente influenciada por señales provenientes de los axones. Ref. 11, 18, 23, 82, 111, 130, 139, 140 NEUROGÉNESIS EN LA MÉDULA ESPINAL La configuración del tubo neural en los periodos tempranos del desarrollo de la médula espinal comprende compartimientos de células neurales progenitoras que darán origen a distintas clases de neuronas. La determinación de las características neuronales se inicia por factores de inducción, que restringen el desarrollo de las células progenitoras hacia la producción de determinadas clases de neuronas. La organización neuronal a lo largo del eje dorsoventral implica a grupos celulares específicos que generan señales que darán lugar a la formación de neuronas ventrales, controladas por señales derivadas del notocordio y la placa ventral, o de neuronas dorsales, dependientes de señales de la placa dorsal. Las señales que inducen la formación de estas neuronas producen alteraciones en la expresión de factores de transcripción, como los factores homeodominio (HD) y hélice-lazo-hélice básico (bHLH), que actúan en el control entre la proliferación y diferenciación neuronal. Formación de las neuronas ventrales La diferenciación de los tipos de neuronas ventrales en la médula espinal en los periodos tempranos del desarrollo del embrión es activada por señales derivadas de células del notocordio ERRNVPHGLFRVRUJ 44 Neurogénesis y de la placa ventral. Las principales señales originadas en estas estructuras son mediadas por la proteína Sonic hedgehog (SHH). Otras señales, derivadas del mesodermo paraaxial, son mediadas por retinoides. Sonic hedgehog (SHH) SHH es una molécula que provee señales para controlar la generación y organización de distintas poblaciones neuronales del tubo neural (Apartado 3). Secretada por el notocordio, produce cambios en el tubo neural en inmediato contacto induciendo la formación de la placa ventral que a su vez también comienza a expresar SHH. SHH presenta un gradiente de concentración ven- Apartado 3 Hedgehog (Hh) es un morfogen que activa varios eventos durante el desarrollo de sistema nervioso central. Tres genes Hh de similar homología codifican las proteínas Hh en mamíferos. De la familia de glicoproteínas Hh, Sonic hedgehog (SHH) es el único miembro expresado en el sistema nervioso central. SHH actúa a través del complejo receptor Patched1 (Ptc1)Smoothened (Smo) para activar una vía de transducción de señales. Ptc es una proteína que atraviesa la membrana 12 veces. En ausencia de SHH, Ptc inhibe catalíticamente la actividad de Smo, una proteína receptora 7TM. La unión de SHH a Ptc produce la pérdida de la actividad inhibidora de Ptc con lo que Smo se activa transduciendo las señales de SHH al citoplasma para finalmente activar la familia Gli de factores de transcripción. Hay tres proteínas Gli de las que Gli1 y Gli2 tienen funciones activadoras mientras que Gli3 antagoniza la función de SHH-Gli1. Las proteínas Gli controlan la expresión de genes Gli. En ausencia de SHH las proteínas Gli están unidas al citoesqueleto en un complejo multimolecular formado por Su(fu) (supressor-of-fused), Fu (Fused), PKA, proteínas Gli, y otros posibles componentes. La proteína Sufu secuestra a las proteínas Gli en el citoplasma las que son fosforiladas por PKA dando lugar a la degradación de Gli2 y a la fractura de Gli3 con la formación de moléculas Gli3 truncadas. Estas moléculas se mueven al núcleo donde reprimen la transcripción de genes Gli dependientes. La unión de SHH al receptor Ptc1-Smo genera una señal que actúa sobre el complejo multimolecular para inhibir la proteólisis de Gli3 y producir Glis activadas que translocan al núcleo activando genes específicos incluyendo ciclina D1, ciclina E, y factores de crecimiento y sus receptores (PDGF-α, EGF) (Figura 26). ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 45 SHH Smo Ptc1 Microtúbulos Sufu Microtúbulos Fu PKA Smo Ptc1 Sufu Fu Glis Glis PKA Otros Otros Proteasoma Represor Glis NÚCLEO Represor Glis Activador Glis Transcripción NÚCLEO Activador Glis Transcripción Figura 26. Eventos intracelulares inducidos por señales Hedgehog. En ausencia de SHH (panel izquierdo) se originan represores que inhiben la transcripción de genes Gli dependientes. La unión de SHH al receptor (panel izquierdo) da lugar a la activación de Gli que estimula la transcripción de genes. tro-dorsal con concentraciones altas en la proximidad de la placa ventral que disminuyen gradualmente al alejarse de la fuente. Las células progenitoras expuestas a diferentes concentraciones de SHH, mediadas por diferentes niveles de actividad Gli, experimentan dos o más divisiones celulares antes de adquirir propiedades de neuronas motoras y activar diferentes programas de diferenciación en neuronas motoras e interneuronas ventrales. SHH aumenta la proliferación de células progenitoras neurales afectando varios parámetros del ciclo celular. Las señales SHH incrementan la expresión de las ciclinas D y E. También inhiben a la proteína p21, inhibidor de la actividad Cdk, potenciando la fosforilación de Rb. Puede también estimular la progresión de G2 a la fase M. Las señales SHH controlan la organización del tubo neural a través de la regulación de los factores de transcripción Gli. Los factores Gli son expresados en el tubo neural y regulan la actividad de los genes Gli. En ratones, la falta de Gli2 se traduce en falta de generación de la placa ventral y del dominio p3 y en la expansión ventral del dominio pMN. La falta del factor inhibidor Gli3 resulta en la expansión dorsal de la región intermedia (p2). Por el contrario, la supresión de la expresión de Gli1 no afecta la organización dorsoventral de tubo neural. Un grupo de factores de transcripción se une a SHH para inERRNVPHGLFRVRUJ 46 Neurogénesis fluenciar la respuesta de las células. Estos factores, que pueden aumentar o inhibir las señales de transducción, pueden dividirse en dos grupos: uno, formado por Cdo, Boc, y Gas1, aumenta las señales SHH pero es reprimido por estas, y otro, que incluye el receptor Ptc1 y la proteína Hhip1 asociados a membrana. Las proteínas Cdo, Boc, y Gas1 son expresadas en el tubo neural ventral contribuyendo a la descarga inicial de SHH. Se unen a SHH aumentando las señales intracelulares. Su inhibición por SHH asegura que la inducción inicial de señales sea sólo temporaria. Las proteínas Hhip1 y Ptc1, por el contrario, contribuyen a generar restricciones temporales y espaciales de las células a las señales de SHH que son esenciales para la adecuada respuesta de la expresión de genes. Los papeles opuestos de estos dos grupos de proteínas pueden actuar como sistema protector que incrementa las señales cuando los niveles de SHH son bajos o las reduce en células expuestas a altos niveles del ligando. Ref . 39, 78, 120, 173, 176, 195 Ácido retinoico (RA) y otras señales RA (Apartado 4) se sintetiza en las somitas y participa en la organización dorsoventral de la médula espinal siendo responsable de generar poblaciones de algunas interneuronas y neuronas ventrales. RA actuaría como un activador adicional de Pax6 y Nkx6.1 para inducir Olig2 y estimular a los progenitores de la médula espinal a adquirir el destino de neuronas motoras ven- Apartado 4 El ácido retinoico (RA) es una molécula derivada de la vitamina A o retinol. RA se une a las proteínas CRABP-I y –II (celular retinoico acid-binding protein) siendo transportado a varios compartimentos subcelulares y al núcleo. En el núcleo RA se une a receptores ácido retinoico (RAR-α, −β, −γ) y a receptores X retinoides (RXR-α, −β, −γ). Estos receptores son miembros de la familia de receptores esteroideos que presentan muchas isoformas generadas por empalmes alternativos. Los receptores están compuesto por cuatro módulos que a partir del extremo N-terminal comprenden el dominio modulador, el dominio de unión a DNA, la región bisagra, y el dominio de unión al ligando. RA unido a sus receptores regula la expresión de genes uniéndose a una secuencia de DNA denominada RARE reclutando co-activadores HAT con actividad histona acetiltransferasa (Figura 27). ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 47 Figura 27. El RA unido a los receptores RAR y RXR regula la expresión de genes uniéndose a la secuencia RARE de DNA y reclutando coactivadores HAT. trales. La falta de RA en embriones de ratones produce pérdida de la expresión de Pax6 y Olig2 en la médula espinal. Las señales de los factores de crecimiento de fibroblastos actúan como inhibidoras de la diferenciación neuronal asegurando que las células permanezcan como progenitores. También inhiben muchos factores de transcripción de las células progenitoras. Varios miembros de la familia de proteínas BMP, que se expresan en la porción dorsal del tubo neural, se opones a las señales SHH limitando la extensión dorsal de neuronas ventrales. Ref. 42, 114, 224 Formación de dominios progenitores Las vías por las que SHH dirige la determinación de neuronas motoras e interneuronas implican una cascada de transcripciones que operan en fases sucesivas. En una primera fase las señales SHH activan, en células progenitoras, la expresión de un grupo de proteínas homeodominio (HD). Estas proteínas, que son factores de transcripción, pueden dividirse en dos grupos: clase I, comprende a los factores Pax, Dbx, e Irx constitutivamante expresados por células progenitoras en ausencia de SHH y cuyos genes son reprimidos por SHH, y clase II, que comprende a los factores Nkx y Olig que dependen de las señales SHH para su expresión (Figura 28). Los genes de clase I y clase II se agrupan de a pares de modo tal que la expresión de las proteínas clase I tiene lugar dorsalmente respecto a las proteínas de clase II. La expresión de ambas clases de proteínas es regulada por las señales SHH cuya concentración en un determinado umbral induce la expresión de las proteínas clase II y reprime al mismo tiempo la expresión de la proteína clase I del correspondiente par estableciendo el límite ERRNVPHGLFRVRUJ 48 Neurogénesis Figura 28. Organización espacial de los dominios de células progenitoras, establecida por el gradiente de concentración de SHH, y la determinación de subtipos neuronales. A izquierda, dominios de las proteínas clase I (Pax, Dbx, e Irx) y clase II (Nkx) expresadas por células progenitoras en respuesta a gradientes de SHH. Figura de la derecha modificada de Ribes, Briscoe. entre ambas. Como resultado, las señales SHH desplazan el límite del dominio de expresión de las proteínas clase II dorsalmente mientras que la falta de señales SHH promueve la expresión de las proteínas clase I desplazando el límite de su dominio de expresión ventralmente. Además, los pares de proteínas clase I y clase II establecen interacciones que se reprimen mutuamente generando límites precisos entre dominios progenitores. Así el par Pax6 y Nkx2.2 tiene un patrón de expresión que se autoexcluye, siendo Nkx2.2 expresada en progenitores situados más ventralmente mientras que Pax6 se expresa en progenitores situados dorsalmente a los límites de Nkx2.2. De igual manera se comportan los pares Nkx6.1-Dbx2, Nkx6.2-Dbx1, y Olig2-Irx3. Las interacciones entre las proteínas generan cinco distintos dominios progenitores de los cuales los dominios p0-p3 darán origen a interneuronas y el dominio pMN a neuronas motoras. La proteína HD Nkx6.1 en ausencia de Irx3 induce la generación de motoneuronas (MNs) y la pérdida de su actividad disminuye la producción de MNs. Aunque Nkx6.1 también es expresada por progenitores que generan las neuronas V2 y V3 la generación de MNs en esos dominios está restringida por la actividad de Irx3 y Nkx2.2 respectivamente. Nkx6.1 en presencia de Irx3 genera neuronas V2 y la expresión de Nkx2.2 en el dominio p3 supera la actividad de Nkx6.1 generando neuronas V3 (Figura 29). Muchas proteínas de clase I y clase II, que funcionan como ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 49 represores de la transcripción, poseen un dominio al que se une el represor groucho/TLE. Groucho/TLE a su vez recluta al DNA la histona acetilasa HDAC1 creando un complejo que inhibe la expresión de genes. Esto asegura que las células progenitoras de los distintos dominios expresen distintas combinaciones de proteínas homeodominio. Determinantes intermediarios del tipo celular En la segunda fase, las proteínas homeodominio de cada dominio progenitor inducen la activación de genes determinantes específicos que expresan factores de transcripción. Estos factores sirven de intermediarios en la determinación de la identidad neuronal. Se proproducen así células hijas progenitoras que están limitadas a producir sólo un tipo de célula neural, neuronas, oligodendrocitos, o astrocitos. Por su parte las neuronas también resultan determinadas a producir un determinado tipo de neurona o interneurona en un proceso denominado subtipo determinante. En el dominio pMN las proteínas homeodominio, presentes en los potenciales progenitores que darán origen a las neuronas MN, están implicadas en la expresión de la proteína bHLH Olig2 aunque su función principal en los progenitores pMN es prevenir la expresión de factores de transcripción capaces de reprimir la expresión de Olig2 (Figura 30). Olig2 tiene un rol fundamental en coordinar diversos aspectos de la diferenciación de neuronas motoras. Olig2 es expresada selectivamente por progenitores en el dominio pMN durante gran parte de la generación de neuronas motoras. Ratones con mutaciones de Olig2 carecen de neuronas y oligodendrocitos en la Figura 29. La interacción entre las proteínas HD clase I y clase II genera distintos dominios progenitores. En la parte inferior derecha represión de genes por Nkx2.2 en el par complementario Pax6. ERRNVPHGLFRVRUJ 50 Neurogénesis médula espinal debido a la conversión de las células pMN en progenitores de interneuronas V2. En el dominio p2, Nkx6.1 activa la expresión de Lim3 en progenitores que darán origen a interneuronas. Nkx2.2 induce neuronas V3 en dominios p3 aunque no se conocen los genes determinantes mientras que las neuronas V1 y V0 son inducidas por la actividad de Dbx2 y Dbx1 respectivamente (Figura 30). Determinación de subtipos neuronales En la tercera fase, antes que se originen neuronas postmitóticas, aparecen determinantes de subtipos neuronales para coordinar programas de diferenciación. Olig2 promueve la expresión de factores homeodominio (MNR2, Lhx2, Isl1), para imponer en células características específicas de neuronas motoras y la expresión de Neurogenina2 (Ngn2), para inducir a los progenitores de neuronas motoras a salir del ciclo celular y adquirir características de neuronas postmitóticas. Olig2 contribuye a la determinación de subtipos neuronales a través de factores homeodominio MNR2 y su homólogo Hb9. MNR2 es un miembro de la clase de proteínas HD Mnx codificado por el gen homeobox MNR2. En embriones de pollo, MNR2 comienza su expresión en progenitores MN durante la división del último ciclo celular antes de la generación de neuronas postmitóticas pero es reemplazado por Hb9 y el factor Isl1 cuando las células se vuelven postmitóticas. El comienzo de la expresión de MNR2 por progenitores de neuronas motoras coincide con el tiempo en que se independizan de las señales SHH. MNR2 induce la expresión de un grupo de factores de transcripción LIM (Lim3, Isl1), que cooperan en la determinación de características de neuronas motoras somáticas, así como regula su propia expresión. Estos factores a su vez pueden inducir los factores de transcripción Isl2 y Hb9 específicos de neuronas motoras postmitóticas. Hb9 posee actividad similar a la de MNR2 pero aparece sólo en neuronas postmitóticas y su función sería mantener las propiedades de las neuronas motoras somáticas después que la expresión de MNR2 se ha extinguido (Figura 31). En ratones falta el gen MNR2 pero Hb9 se manifiesta tanto en células progenitoras como en MNs postmitóticas cumpliendo funciones similares a MNR2 en embriones de pollo. En ratones carentes de función del gen Hb9, la generación de neuronas motoras es normal pero después que han salido del ciclo celular generan factores de transcripción característicos de interneuronas V2. Esto se acompaña de desorganización de las columnas motoras. Así, aunque Hb9 no es necesario para la generación de neuERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 51 Figura 30. Formación de distintos dominios progenitores por la interacción de proteínas HD. En una fase posterior, las proteínas HD activan genes que expresan factores de transcripción que actúan como determinantes intermediarios en la generación de neuronas. ronas motoras se requiere para facilitar un programa normal de diferenciación de neuronas motoras y para suprimir la expresión inadecuada de genes de interneuronas. La actividad de Olig2 dirige la expresión de MNR2 y Lim3 en células neurales progenitoras pero el patrón de expresión de estas dos moléculas depende de la eficacia con que Olig2 reprime la expresión del gen Irx3. Cuando Irx3 es eficientemente reprimido por Olig2, MNR2 es expresado y puede dar lugar a la formación de neuronas motoras. Pero en presencia de altos niveles de expresión de Irx3 la expresión de MNR2 es inhibida pero aún permite la expresión de Lim3 en células que generan neuronas V2. Figura 31. Cadena de eventos que inician la generación de neuronas motoras en el dominio pMN. En gris el homólogo en embrión de ratón a la proteína HD del embrión de pollo. ERRNVPHGLFRVRUJ 52 Neurogénesis Lim3 puede funcionar en un programa de generación de neuronas V2 pero en una vía independiente de MNR2 (Figura 32). Determinantes coordinadores de programas de diferenciación La expresión de Ngn2, activada por Olig2 en un grupo de células, comienza a acumularse a medida que el desarrollo progresa. Olig 2 y Ngn2 son co-expresadas en el núcleo de progenitores MN durante el periodo de formación de neuronas. La actividad de Olig2 interfiere con la capacidad de Ngn2 para iniciar la diferenciación neuronal compitiendo por la unión a la caja E de DNA a fin de expandir la población de precursores pMN antes que se diferencien en neuronas motoras. El bloqueo de la diferenciación postmitótica de neuronas motoras también puede preservar células pMN para la formación de oligodendrocitos en estadios posteriores del desarrollo. La decisión de las células pMN de determinar si forman neuronas motoras o permanecen como progenitores en reserva depende de los niveles relativos de Olig2 y Ngn2 Progenitores con niveles altos de Olig2 y bajos de Ngn2 tienen más tendencia a permanecen como tales mientras que en condiciones inversas la tendencia es a diferenciarse en neuronas motoras. Ratones con mutantes de Olig1/2 carecen de neuronas motoras y oligodendrocitos debido a la conversión de las células pMN en progenitores de interneuronas V2 y astrocitos. Ngn2 inicia la diferenciación activando genes de la familia NeuroD (ver La fase de diferencición). Ref. 20,21, 39, 58, 81, 150, 151, 163, 173, 190, 204, 225 El programa LIM En la médula espinal muchos tipos neuronales expresan los factores de transcripción LIM-HD (Apartado 5). Complejos formados por diferentes mezclas de proteínas LIM-HD, que se conocen como programa LIM (LIM code), se asocian con subtipos neuronales. Figura 32. La formación de motoneuronas o de interneuronas V2 por Olig2 depende de la baja, a, o alta, b, expresión de Irx3 respectivamente. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 53 Figura 33. Estructura de la molécula LIM. Un programa LIM inicial diferencia una clase de motoneuronas de la población vecina de interneuronas en la médula espinal. Un complejo tetramérico formado por las moléculas 2Lhx3:2-NLI se une a DNA y regula la expresión de genes y la configuración característica de interneuronas V2. En las células que se transformarán en motoneuronas, Isl1 desplaza a Lhx3 de NLI evitando que se forme el complejo tetramérico. Lhx3, a su vez, se une al C-terminal de Isl1 formando un complejo hexamérico compuesto por 2-Lhx3:2-Isl1:2-NLI (Figura 34). Este complejo sinergiza con factores proneurales como Ngn2, NeuroD, y NeuroM para incrementar la actividad de genes que activan la diferenciación de motoneuronas vMN. La presencia de Isl1 en la división final del ciclo celular de células progenitoras, antes de volverse postmitóticas, determinaría su predestinación a motoneuronas. Ratones Isl1 knockout no tienen motoneuronas mien- Apartado 5 Proteínas LIM-HD. Las proteínas homeodominio LIM (LIMHD) son una familia de proteínas codificada por la subfamilia de 12 genes LIM. Las proteínas LIM-HD son factores de transcripción que se caracterizan por poseer dos motivos dedos zinc repetidos en tándem en el N-terminal, llamado dominio LIM, y un homeodominio de unión a DNA situado centralmente. El dominio LIM es una secuencia de 50-60 aminoácidos, rica en cisteína e histidina, que une dos iones zinc para formar motivos dedos zinc (Figura 33). Las proteínas LIM-HD comprenden a Lhx1-Lhx9, Isl1 e Isl2, y Lmx1a y Lmx1b. La proteína LIM-HD, a través del dominio LIM, interactúa con las proteínas nucleares NLI (nuclear LIM interactor). NLI es una proteína que contiene un dominio de autodimerización y un dominio de interacción con LIM para la formación de complejos homo- y heteroméricos con moléculas LIM-HD que regulan la transcripción. La unión de las proteínas LIM-HD a DNA es modulada por la interacción con distintos reguladores de la transcripción. ERRNVPHGLFRVRUJ 54 Neurogénesis Figura 34. Lhx3 dimeriza con NLI para formar un complejo tetramérico en interneuronas V2. En motoneuronas MN se forma un complejo hexamérico compuesto por 2Lhx3:2-Isl1:2-NLI. tras que la doble falta de Lhx3 y Lhx4 produce una completa pérdida de interneuronas V2 además de defectos en las vMNs. Ref. 8, 73, 76, 84, 101, 164, 172, 187, 194, 199, 205, 206 Disposición neuronal en columnas En un estadio siguiente ocurren cambios adicionales en el perfil de expresión de factores de transcripción en las células MNs. Estos cambios llevan a la formación de subtipos neuronales que inervan los músculos del cuerpo. Los subtipos neuronales migran a sitios específicos del tubo neural adquiriendo una disposición en columnas, conteniendo cada columna neuronas motoras que proyectan sus axones a objetivos periféricos comunes. Los subtipos neuronales se disponen en cinco columnas. La columna motora medial (MMC) comprende un grupo medial a nivel de la médula espinal, que proyecta axones a los músculos mediales, y un grupo lateral a nivel torácico, que proyecta axones a los músculos intercostales y de la pared abdominal. La columna motora preganglionar (PMC) se genera a nivel torácico y sus neuronas proyectan axones a ganglios simpáticos. La columna motora lateral (LMC), generadas a niveles braquiales y lumbares de las médula espinal, está formada por neuronas cuyos axones proyectan a los miembros. Comprende un grupo medial y ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 55 Figura 35. Disposición en colunas de los subtipos de neuronas motoras en la médula espinal y su control por expresión de genes Hox. un grupo lateral que proyectan axones a músculos ventrales y dorsales de los miembros respectivamente. Dentro de las columnas motoras, en particular en la LMC, las neuronas motoras pueden subdividirse en agrupaciones que forman conexiones especializadas con músculos individuales (Figura 35). Las neuronas motoras adquieren su posición en las columnas en respuesta a gradientes de señales que inician, en células progenitoras, programas de transcripción de los cuales los codificados por los genes Hox son fundamentales. La acción de los factores de transcripción codificados por los genes Hox son mediadores fundamentales de los programas que determinan las características de los subtipos neuronales y las conexiones en la médula espinal en desarrollo. Los miembros de la familia de genes Hox están alineados a lo largo del eje rostrocaudal de la médula espinal con la posición donde se generan los subtipos neuronales. La expresión de los genes Hox es controlada por numerosas señales que incluyen a FGFs, retinoides, y miembros de la subfamilia TGFβ. Gradientes de señales FGF son importantes para la inducción inicial de la expresión de genes Hox a nivel braquial, torácico, y lumbar de la médula espinal, siendo los genes del extremo 3´ (rostral) inducidos por bajos niveles de FGF mientras los situados en el extremo 5´ (caudal) son inducidos por niveles más elevados. Otras señales que participan en la regulación de subgrupos de genes Hox, comprenden señales del ácido retinoico, a nivel braquial, y del miembro GDF1 de la familia TGFβ, a niveles torácico y lumbar (Figura 35). La expresión de las proteínas Hox coincide con la posición donde se generan los subtipos neuronales. Así, la proteína Hox6 es expresada en neuronas motoras LMC braquiales, la proteína Hox9 en neuronas PMC torácicas, y la proteína Hox10 en neuronas LMC lumbares. Esta disposición de las proteínas Hox es conERRNVPHGLFRVRUJ 56 Neurogénesis trolada por el gradiente de señales FGF. Cambios en la concentración de FGF inducen modificaciones en la expresión de las proteínas Hox. Así, el aumento de la concentración a nivel braquial induce la expresión de un patrón Hox9, normalmente restringido a niveles torácicos. Este cambio de la expresión del patrón Hox se acompaña de pérdida de neuronas LMC braquiales y la conversión de neuronas LMC en PMC. Las proteínas Hox pueden reprimir la expresión de las otras. Así, la expresión de Hox9 puede ser reprimida por Hox6 y Hox10 mientras que Hox9 puede reprimir la expresión de Hox6. Las interacciones represivas entre Hox6 y Hox9 perfeccina los límites las neuronas en las columnas LMC y PMC (Figura 36). Las agrupaciones de neuronas motoras En la columna LMC las neuronas motoras pueden subdividirse en grupos cada uno destinado a inervar un determinado músculo de los miembros. Cada grupo ocupa una particular posición establecida por un tipo de proteínas Hox. A nivel de la columna LMC braquial las neuronas, definidas por la expresión de Hox6, pueden subdividirse en grupos cuyos límites se esblecen por interacciones represivas entre las proteínas Hox5 y Hox8. Las proteínas Hox5 se necesitan para generar el grupo de neuronas motoras que expresan el factor de transcripción Runx1 en las neuronas LMC anteriores mientra que Hox8 se requiere en neuronas LMC caudales para generar los grupos neuronales que expresan los factores de transcripción Pea3 y Scip. A su vez, a nivel de cada uno de estos segmentos se generan grupos de neuronas intrasegmentales que proyectan a diferentes músculos. Ref. 12, 35, 36, 106 Organización de las neuronas dorsales La parte dorsal de la médula espinal da lugar a neuronas que - Hox6 LMC Hox9 PMC Hox10 LMC Figura 36. Interacciones represivas entre proteínas Hox ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 57 Figura 37. Tipos de células progenitoras e interneuronas en la médula espinal dorsal y factores que expresan. se originan de distintas poblaciones de células progenitoras. Estas neuronas procesan y transmiten información sensorial. En la médula espinal dorsal en desarrollo se encuentran varios tipos de progenitores proliferantes en la VZ del tubo neural que se organizan, por señales de la placa dorsal, en dominios progenitores. Estos dominios se definen por la expresión de factores de transcripción de las familias bHLH y por homeodominios. De los dominios progenitores (dP1-dP6) se generan neuronas en dos ondas neurogénicas. La primera onda produce las interneuronas dI1-dI6 que pueden dividirse en clase A (dI1-dI3) y clase B (dI4-dI6). La segunda onda produce dos tipos de interneuronas (dILA y dILB) de la clase B (Figura 37). Las interneuronas clase A y clase B se diferencian por la dependencia de las señales de la placa dorsal para su formación. Las interneuronas clase A son dependientes de señales de la placa dorsal mientras que las interneuronas clase B son independientes de señales de la placa dorsal. Los progenitores que dan origen a las neuronas clase A se agrupan, por señales de la placa dorsal, en dominios que expresan Math1 y Ngn1/2. Los dominios de expresión de los genes Math1 y Ngn1/2 se reprimen mutuamente regulando el tamaño de cada dominio y el número de interneuronas que de ellos se originan. Progenitores que expresan el factor de transcripción Math1 dan origen a interneuronas dI1. Ngn1/2 son expresados en progenitores que dan origen a interneuronas dI2. Los progenitores que expresan Mash1 originarían las interneuronas dI3-5. Los progenitores que dan origen a las interneuronas dI3 también ERRNVPHGLFRVRUJ 58 Neurogénesis expresan Gsh2 y su supresión da lugar a la reducción de las neuronas dI3 con un concomitante aumento de dI2. El gen Olig3 es expresado en progenitores dorsales que generan neuronas de la clase A (Figura 37). En ratones con mutaciones Olig3 las neuronas dI1 se forman pero en número reducido mientras que las neuronas dI2 y dI3 no se forman y las neuronas clase B aparecen más dorsalmente. Las interneuronas clase A dI1 pueden identificarse por expresar marcadores que incluyen los factores de transcripción homeodominio Lh2a/b y Bm3a. Estas neuronas se sitúan en la parte profunda de los cuernos dorsales y algunos de sus axones cruzan la línea media (neuronas comisurales). Las interneuronas dI2 expresan los genes Lim1/2 y Bm3a y las interneuronas dl3 expresan los genes Isl1/2 y Bm3a (Figura 37). Al igual que las neuronas dI1 se sitúan en la parte profunda de los cuernos dorsales y proyectan contralateralmente. Reciben información propioceptiva que envían a regiones superiores del cerebro. Los progenitores que generan las neuronas clase B pueden dividirse de acuerdo a los factores que expresan en: dP4, formado por progenitores Mash1 y bajos niveles de Pax7; dP5, formado por progenitores Mash1 y altos niveles de Pax7; y pP6 que expresan Dbx2 y altos niveles de Pax7 (Figura 37). Los factores de transcripción homeodominio Irx3, Pax3 y Pax7 se expresan en células progenitoras dorsales. Mutaciones Pax3 y Pax7 reducen las comisuras ventrales sugiriendo que dI1 y dI2 no se han desarrollado adecuadamente. Las interneuronas clase B expresan el factor homeodominio Lbx1. Lbx1 es importante para la determinación de las neuronas clase B. Lbx1 reprime las neuronas clase A y su función es a su vez suprimida por Olig3 y consecuentemente el surgimiento de las neuronas clase B (Figura 38). Las interneuronas dI4 expresan Lim1/2 y Pax2, dI5 expresan Lmx1b y Brn3.a, y dI6 expresan los mismos factores homeodomino que las neuronas dl4. (Figura 37). La mayoría de estas interneuronas maduran para formar las capas superiores de los cuernos dorsales. Las neuronas dILA y dILB se originan de progenitores que expresan Mash1, son Lbx1+, expresan Lim1/2 y Lmx1b respectivamente y migran a las láminas más superficiales de los cuernos dorsales. Reciben aferencias de neuronas sensoriales cuyos somas se encuentran en los ganglios dorsales de la médula proyectando ipsilateralmente. Ref. 25, 30, 31, 68, 99, 100, 142, 143, 225, 141 ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 59 Figura 38. Determinación de neuronas en la médula espinal dorsal durante el desarrollo por Olig3 y Lbx1. Señales de la placa dorsal Los mecanismos que determinan la organización de los diferentes tipos celulares a nivel de la médula espinal dorsal en desarrollo dependen de señales de la placa dorsal. La eliminación de las células de la placa dorsal da lugar a la pérdida de las interneuronas dl1-dl3 y de las células progenitoras dorsales que expresan Math1, Ngn1 y Ngn2. Hay un aumento compensador en progenitores que expresan Mash1 y Pax7 con un subsecuente incremento de las interneuronas dl4-dl6. Estos resultados indicarían que las interneuronas dl1-dl3 son dependientes de señales de la placa dorsal mientras que las interneuronas dl4-dl6 se inhibirían normalmente por estas señales. Ratones dreher, con mutantes espontáneas que presentan falta de la placa dorsal, tienen reducido número de interneuronas dI1-dI3 en la médula espinal. Los factores secretados de la placa dorsal implicados en el destino de las células dorsales comprenden al menos dos clases de moléculas: unas son miembros de la familia TGFβ (transforming growth factor) como activina, BMP4, BMP6, BMP7, dorsalina1 y GDF7 (growth differentiation factor), y otras pertenecen a las proteínas Wnts (Wnt1 y Wnt3a). Las moléculas BMPs La actividad de las moléculas BMPs (Apartado 6), producidas ERRNVPHGLFRVRUJ 60 Neurogénesis por la placa dorsal y el ectodermo situado por encima, es importante en el control de la organización de la médula espinal dorsal y la proliferación celular y diferenciación neuronal. Las señales BMP afectan la capacidad proliferativa de las células progenitoras de la médula espinal dorsal y controlan su número. Las concentraciones elevadas de BMP incrementan los progenitores dP1 y las interneuronas dI1 a expensas de otras clases. Las interneuronas dI1-dI3 dependen de las señales BMP para su formación pero mientras BMP induce las internueronas dI1 a través de la activación de Math1 requiere la cooperación con Wnt para inducir las interneuronas dI2 y dI3. Wnt inducida por BMP actuaría mediada por Olig3 (Figura 39). Así como la proteína SHH intervienen en la determinación neuronal y organización del tubo neural ventral, gradientes de Apartado 6 BMPs son miembros de la familia de proteínas del factor-β transformador del crecimiento (TGF-β) que incluye dos subfamilias: TGF-β y activina. Los ligandos BMPs (más de 10 proteínas) tienen siete residuos cisteína en su C-terminal, seis de los cuales forman uniones disulfuro y el séptimo está implicado en la formación de complejos homoméricos o heteroméricos vía uniones disulfuro. La conformacion de complejos diméricos es un requerimiento para la acción biológica de BMPs. Los ligandos se unen a dos tipos de receptores serinatreonina quinasa de transmembrana, los receptores tipo I (BMPR-IA y BMPR-IB) y tipo II (BMPRII y BMPRIIB) dando lugar a la formación de complejos tetraméricos. Una vez que el ligando se une a sus receptores, BMPRII fosforila a BMPR-I en residuos serina y treonina con lo que su proteína quinasa se activa. BMPR-I subsecuentemente fosforila y activa las proteínas Smad (Smad 1, 5, y 8) (R-Smad) que se disocian del receptor asociándose a Smad4 (Co-Smad). El complejo RSmad-Co-Smad transloca al núcleo donde regula la transcripción de genes interactuando con co-activadores o co-represores (Figura 8). Las señales BMP pueden bloquearse por antagonistas extracelulares, Así como la proteína SHHsimil, interviene en la determinación como noggin, cordín, cordín follistatín, FSRP, la familia de neu proteínas DAN/Cerberus, y sclerostín, que se unen a los ligandos BMPs y previenen sus uniones a los receptores, o por proteínas intracelulares, como Smad inhibidoras (I-Smad: Smad 6 y Smad 7). Smad 6 se une al BMPR-I previniendo que Smad 1, 5, y 8 sean activadas. Tob interactúa con las proteínas Smad activadas inhibiendo sus señales. Smurf1 interactúa con Smad 1 y 5 degradándolas. BAMBI/Nma es un pseudoreceptor que antagoniza los efectos de BMPs previniendo la formación de complejos receptores activos. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 61 Figura 39. Interacción de las señales BMP y Wnt en la determinación de neuronas dorsales de la médula espinal. señales BMP son importantes para la organización dorsal del tubo neural. Uno de los indicadores más precoces de la organización dorsoventral en el tubo neural es la expresión de los genes de las familias Pax y Nkx en las células progenitoras. La expresión de los genes Pax7 y Pax3 en embriones está restringida a las células progenitoras dorsales, la de Pax6 a la región intermedia mientras que Nkx2.2 a células progenitoras ventrales. Las señales BMP establecen límites entre los genes Pax. Los genes Pax3/7 se activan por señales BMP en células dorsales mientras que en células ventrales su actividad está limitada por los bajos niveles de BMP y por la represión por SHH. La expresión de los genes Pax6, por el contrario, se detecta en la porción ventral del tubo neural en respuesta a los niveles de SHH mientras que dorsalmente, los genes se expresan a bajos niveles reprimidos por BMP. BMP reprimiría la expresión de Dbx2 actuando a través de Msx1 estableciendo un límite dorsal a la expresión de Dbx2. Por el contrario, la pérdida de las señales BMP produce pérdida de las interneuronas dI1 y expansión hacia la placa dorsal de las poblaciones dI2-4. Las señales BMP son también importantes para la organización de la médula espinal ventral. El incremento de las señales BMP altera la respuesta a SHH aumentando las células dorsales a expensas de las ventrales mientras que antagonizando las señales BMP el efecto de SHH se incrementa y las células adoptan una organización más ventral. Ref. 105, 146, 158, 208, 227, 235 Las moléculas Wnt Las proteínas Wnt (Apartado 7) constituyen una gran familia de moléculas componentes de las señales de la placa dorsal de la médula espinal en desarrollo donde son expresados los genes ERRNVPHGLFRVRUJ 62 Neurogénesis Apartado 7 La vía Wnt Las proteínas Wnt tienen una secuencia señal Nterminal seguida por una región rica en cisteínas. Se unen a dos receptores, Frizzled (Fz) y Lrp (low density lipoprotein-related receptor protein). Fzs son receptores con siete segmentos de transmembrana, un segmento extracelular N-terminal rico en cisteína, el dominio CRD, que es el sitio de unión de Wnt, y una cola citoplasmática C-terminal. Lrp son una familia de varias proteínas, relacionadas al receptor de lipoproteínas de baja densidad, que contienen un dominio extracelular seguido por una región de transmembrana y un dominio citoplasmático carente de motivos catalíticos. Las moléculas Wnt se unen a Lrp y se asocia a Fz formando un complejo trimérico. La formación del complejo Wnt/Fz/Lrp produce la fosforilación de varias prolinas en motivos presentes en la cola citoplasmática de Lrp permitiendo que Axina se les una. Axina es una proteína de soporte pudiendo interactuar con la proteína citoplasmática Dsh (Dishevelled) activándola. A partir de Dsh tres diferentes vías moleculares transducen las señales Wnts: corriente, PCP (planar cell polarity), y vía calcio. En la vía corriente la proteína Dsh activada es capaz de alterar un complejo citoplasmático formado por las proteínas GSK-3 (glycogen synthase kinase-3), axina, y APC (adenomatous polyposis coli). En ausencia de Dsh activada estas tres proteínas normalmente permiten la fosforilación de la proteína β-catenina por GSK-3 con lo cual se vuelve apta para su degradación por vía ubicuitina-proteasoma evitando su acumulación en el citoplasma. La activación de la señalización por Wnt inhibe la fosforilación de β-catenina y en consecuencia su degradación con lo que sus niveles aumentan en el citoplasma pudiendo ser transportada al núcleo donde se une al factor de transcripción TCF/Lef desplazando a Groucho. β−catenina/TCF se une al coactivador CBP, que induce la remodelación de la cromatina por su actividad de histona acetilasa favoreciendo la transcripción de genes (Figura 40). En ausencia de señales Wnt, la proteína TCF forma un complejo con Groucho que interactúa con histona deacetilasas (HDAC) que actúa como represor de los genes Wnt dependientes. En la vía PCP, Dsh, activada a través de proteínas G, a su vez activa a las Rho GTPasas Rho y Rac1. Rho y Rac, vía JNK afectan la actividad de la actina del citoesqueleto y microtúbulos. En la vía Wnt/calcio, la activación de Dsh induce la liberación intracelular de Ca2+. El aumento de la concentración de Ca2+ induce la defosforilación de NFAT, vía la fosfatasa calcineurina, que transloca al núcleo activando la expresión de genes. Otro receptor de ligandos Wnt es Ryk, un miembro de la familia de receptores tirosina quinasa (RTK). Ryk, una proteína que atraviesa la membrana una sola vez, posee un dominio extracelular de unión a ligandos y un dominio quinasa intracelular que carece de actividad tirosina quinasa. La unión de Wnt a Ryk induce la fractura de su dominio intracelular que transloca al núcleo para promover la respuesta. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 63 Figura 40. La unión de Wnt a sus receptores activa una vía que induce la transcripción de genes mediada por β-catenina. Wnt1 y Wnt3a. Tienen importantes papeles en la regulación de la proliferación celular y organización del tubo neural durante el desarrollo embrionario. Wnt1 y Wnt3a inducen proliferación de las células progenitoras del tubo neural dorsal. Doble mutaciones Wnt1 y Wnt3a en embriones de ratones producen una severa reducción de las interneuronas dI1-dI3 acompañada de un incremento del número de interneuronas más ventrales mientras que la sobreexpresión de Wnt1 y Wnt3a promueve el incremento de la producción de neuronas dI2 y dI3, vía aumento de la expresión de Olig3, y una disminución del número de neuronas dI4-dI6. Las señales Wnt, mediadas por β-catenina, también regulan el balance entre proliferación y diferenciación. Deficiencias en βcatenina resultan en disminución de la proliferación de progenitores e incremento de su diferenciación y respuestas opuestas se observan por su activación. Wnts también están implicados en la organización dorsoventral del tubo neural. La activación de Wnts, activa genes dorsales, como Pax7 o Pax6, y reprime genes ventrales como Olig2 o Nkx2.2. La actividad organizadora de Wnt antagoniza la actividad de Shh incrementando la extensión de los dominios dorsales. Wnt actuaría induciendo la expresión de Gli3, un potente anERRNVPHGLFRVRUJ 64 Neurogénesis tagonista de la vía Shh. Del balance entre las señales de Shh y Wnt resultaría la extensión de los dominios dorsales y ventrales. Ref. 3, 15, 33, 71, 91, 141, 215, 234 NEUROGÉNESIS CORTICAL En los periodos tempranos del desarrollo embrionario de mamíferos el tubo neural se expande en tres vesículas: el cerebro anterior, medio, y posterior. La más anterior de las tres vesículas, el procencéfalo, se subdivide posteriormente en telencéfalo y diencéfalo que juntos forman el cerebro anterior (forebrain) (Figura 41). El telencéfalo, la estructura embrionaria más anterior que se transforma en un par de vesículas, comprende el telencéfalo dorsal o palio, que dará origen a estructuras corticales, y el telencéfalo ventral o subpalio, que dará origen principalmente a los ganglios basales. El neuroepitelio del telencéfalo dorsal puede dividirse en los componentes medial, que contiene el hem cortical y el hipocampo, el palio dorsal, que dará origen al neocortex, el palio lateral, que dará origen a la corteza piriforme, y el palio ventral que junto con el palio lateral contribuye a los componentes del complejo amigdalino. A su vez, el telencéfalo ventral puede dividirse en la eminencia ganglionar lateral (LGE), la eminencia ganglionar medial (MGE), el Septum, y la eminencia ganglionar caudal (CGE). La LGE comprende una región dorsal, que da lugar a interneuronas que migran a los bulbos olfatorios, y una región más ventral que provee neuronas inhibidoras para el estriado y estructuras límbicas. MGE y CGE proveen interneuronas para la corteza (Figura 42). En esas regiones se expresan genes en forma graduada. Los genes Emx1, Emx2, Lhx2 y Gli3 se expresan a altos niveles en el palio medial mientras que Pax6 tiene su más alta expresión en el palio ventral y lateral. En el subpalio, la LGE se caracteriza por la expresión de los genes Dix1/2, Gsh2 y la falta de Nkx2.1. La MGE se caracteriza por la fuerte expresión de Nkx2.1 y Lhx6 (Figura 42). Organización dorsoventral del telencéfalo Antes del comienzo de la neurogénesis los genes del neuroepitelio cortical funcionan para formar una regionalización del telencéfalo, estableciendo distinciones y límites entre los dominios ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 65 Figura 41. Formación de las vesículas del tubo neural en los periodos tempranos del desarrollo embrionario. proliferativos dorsales y ventrales. Esta división es regulada por el balance en la expresión de genes con efectos dorsalizantes y de influencias ventralizantes. La organización del telencéfalo dorsal durante el desarrollo involucra señales BMP y Wnt. Las señales BMP (Apartado 6) y Wnt (Apartado 7) regularían la expresión de Emx2. Los genes Emx2 intervienen junto con los genes Pax6 en el establecimiento de los subdominios corticales. Para establecer la organización del telencéfalo ventral son fundamentales las señales SHH (Apartado 3). SHH actúa inhibiendo la actividad del gen gli3 por lo cual previene la dorsalización del telencéfalo mientras que la actividad del represor Gli3 reprime al gen Shh (Figura 43). El balance entre la función de los genes Shh y Gli3 es fundamental para el establecimiento de la organización dorsoventral del telencéfalo. Embriones en los que falta la proteína SHH pierden las células ventrales que expresan Dlx2, Gsh2 y Nkx2.1 a expensas de tipos de células dorsales que expresan Pax6 y Emx2, mientras que la expresión ectópica de Shh induce la expresión de marcadores telencefálicos ventrales. Por el contrario, en ausencia del gen gli3 el telencéfalo ventral se expande dorsalmente y el desarrollo del telencéfalo dorsal se altera, el plexo coroideo, el hem cortical, y el hipocampo no se forman y el desarrollo del neocortex está comprometido. Gli3 coopera con Pax6 en el desarrollo de las áreas corticales. En ausencia del gen Pax6 los progenitores corticales no expresan algunos de sus marcadores expresando, en cambio, marcadores de progenitores del subpalio como Mash1, Gsh2 y Dix1/2. Por otra parte, los genes Gsh2, que se expresan en el telencéfalo ventral, interaccionan con los genes Pax6, que se expresan en el telencéfalo dorsal, reprimiéndose mutuamente y contribuyendo a establecer el límite entre palio y subpalio. La pérdida de la función gsh2 da lugar a la expansión de la expresión de Pax6 ERRNVPHGLFRVRUJ 66 Neurogénesis Figura 42. Organización del telencéfalo en los dominios proliferativos dorsal y ventral. en el subpalio y por el contrario la pérdida de Pax6 produce la expansión de gsh2 en sus dominios. Pax6 también contribuye a establecer el límite entre palio y subpalio activando Ngn2 que reprime la expresión del factor Mash1 en el subpalio. Mutaciones de Ngn2 presentan pérdida de marcadores dorsales y aumento de marcadores ventrales (Figura 43). Los factores Sox6 y Sox5 también son importantes en la división del neuroepitelio a nivel del borde palio-subpalio. Sox6 y Sox5, expresados exclusivamente en los progenitores del palio y subpalio respectivamente, funcionan reprimiéndose mutuamente de modo tal que la supresión de uno resulta en la expansión en los territorios de expresión del otro. Sox6 actúa de manera similar a Ngn2 reprimiendo la expresión de Mash1 en los progenitores del telencéfalo aunque ambas vías son independientes (Figura 43). Las señales FGF también participan en la formación del telencéfalo ventral. La placa comisural expresa los genes Fgf8, 4, 5, 17, y 18 y las células precursoras neurales expresan receptores FGF. La falta de señales FGF lleva a la pérdida de la expresión de los genes Lhx6, Lhx7 y Nkx2.1, necesarios para la diferenciación de precursores MGE, y de los genes Gsh2, necesarios para la diferenciación de los precursores LGE. Por el contrario, el incre- Figura 43. Vías involucradas en la organización dorsoventral del telencéfalo ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 67 mento de señaless FGF induce la expresión de marcadores ventrales en áreas dorsales. La expresión de los genes FGF es promovida indirectamente por SHH actuando vía la regulación negativa de la función del represor Gli3. El gen Foxg1 también está implicado en mantener el telencéfalo ventral y la alteración de su expresión resulta en pérdida de las células ventrales. FGF8 induce la expresión de Foxg1 y FOXG1 induce la expresión del gen Fgf8 formando un circuito de feedback positivo (Figura 44). Organización del telencéfalo dorsal El telencéfalo dorsal comprende el dominio de la corteza cerebral, que da lugar al neocortex y el hipocampo, el dominio medial que da lugar al plexo coroideo y al hem cortical, y el dominio lateral del antihem. La configuración y diferenciación de las áreas del telencéfalo dorsal es controlada por la interacción de genes intrínsecos y señales derivadas de centros organizadores. El hem cortical es una estructura situada en la parte posteromedial del telencéfalo dorsal que expresa moléculas de las familias Wnt y BMP. Actúa como un centro organizador del hipocampo, en su ausencia el hipocampo falta. El hem cortical también produce células Cajal-Retzius. El límite rostrocaudal de hem se define por la molécula Lhx2, que se expresa en las células precursoras corticales del telencéfalo pero no en el hem cortical y el plexo coroideo. El factor de transcripción Lhx2 configura las células como corticales más que como células de la línea media. Lhx2 reprime a hem y en su ausencia la corteza cerebral se pierde a expensas de la expansión del plexo coroideo y el hem cortical. Lhx2 actuaría como un selecionador de genes que establecen un destino cortical e inhiben un destino hem. El límite entre el hem cortical y el plexo coroideo se establece por el incremento de los genes Hes y la disminución de la expre- Figura 44. El gen fgf8 involucrado en la organización del telencéfalo ventral. ERRNVPHGLFRVRUJ 68 Neurogénesis sión de los genes Ngn en los plexos coroideos cuya expresión continúa manteniéndose en el hem cortical. Las señales BMPs, inducidas en células de la línea media, incrementan la actividad de Hes en los plexos coroideos y son necesarias para la formación de los plexos coroideos. La activación del receptor BMP en el neuroepitelio cortical produce la expansión de las células de la línea media a expensas de las corticales mientras que en ratones con mutantes de receptores BMP falta la formación de plexos coroideos y del hem cortical. El antihem es un centro organizador situado en el neuroepitelio cerca del límite entre el neocortex ventrolateral y la LGE del telencéfalo ventral. El antihem expresa miembros de la familia EGF, Fgf7, los ligandos Tgfα, Nrg1 y Ngr3, y Sfrp2, un inhibidor de las señales Wnt. Para configurar el antihem se requiere Pax6 mientras que Lhx2 suprime al antihem y en su ausencia el antihem se expande. Los genes Pax6 y Tlx cooperan para establecer el límite palio-subpalio y su falta da lugar al desplazamiento dorsal de ciertos genes que se encuentran cerca del límite. El antihem da origen a células Cajal-Retzius y contribuye a la producción de células del complejo amigdalino. Ref . 24, 61, 66, 116, 170, 185, 198, 200, 207, 226 Organización de las áreas corticales El neocortex está organizado en áreas que se diferencian por su localización, cito y quimioarquitectura, conexiones aferentes y eferentes, y por las organizaciones de la expresión de genes. Se distinguen cuatro áreas primarias tres de las cuales, situadas en regiones caudales, procesan información sensorial visual (V1), somatosensorial (S1) y auditora (A1), la cuarta es un área motora (M1) situada en regiones rostrales (Figura 45, A). El desarrollo de las áreas corticales, un proceso llamado arealización, es controlado por la interacción de factores genéticos intrínsecos al neocortex y de influencias extrínsecas determinadas por aferencias sensoriales tálamocorticales. Los mecanismos intrínsecos ocurren en una fase temprana antes que los axones del tálamo lleguen a la corteza mientras que los mecanismos extrínsecos actúan en una segunda fase después de la llegada de las aferencias sensoriales. Mecanismos de control de las àreas corticales Los mecanismos intrínsecos comienzan con dos clases de moléculas: ligandos secretados en los centros reguladores y factores ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 69 de transcripción gradualmente expresados en progenitores corticales. Los ligandos, secretados por los centros organizadores, difunden a través de la corteza actuando en un gradiente de concentración para regular la expresión de genes. Los dos centros más directamente implicados son la placa comisural, en el polo rostromedial del telencéfalo, que expresa FGFs, y el hem cortical, que expresa BMPs y Wnts. Un tercer centro es el antihem, que forma el lado lateral de la corteza en el límite entre palio y subpalio. Un cuarto centro situado en el telencéfalo ventral secreta SHH. La placa comisural es un centro organizador en el margen anterior del telencéfalo caracterizado por la expresión de FGFs. La expresión del gen Fgf8 es inicialmente inducida en la placa comisural por Hes y subsecuentemente mantenida por la supresión de las señales BMP. Las señales BMP, que inhiben la expresión de Fgf8, deben ser inhibidas para mantener la expresión de Fgf8. La actividad de BMP puede inhibirse por Noggin y Condrin. Las señales SHH participan en mantener la expresión de Fgf8 actuando posiblemente a través de la supresión de señales BMP. La expresión de Fgf8 también es mantenida por FGF actuando por un feedback positivo (Figura 44). Otra vía es a través de Sp8, un factor de transcripción activado por la expresión de Fgf8, que recíprocamente induce la expresión de Fgf8 (Figura 46). Fgf8, inducido en la placa comisural, promueve programas de áreas anteriores en oposición a áreas caudales. FGF8 actúa en forma concentración dependiente de modo tal que una alta concentración establece las estructuras de la corteza motora más anteriores mientras que las concentraciones más bajas actúan en la predisposición de la corteza somatosensorial y visual. El au- Figura 45. En A se ilustra la distribución anatómica de las diferentes áreas del neocortex. En B se esquematizan los gradientes de concentración de los diferentes factores de transcripción. ERRNVPHGLFRVRUJ 70 Neurogénesis mento de FGF8 en la parte anterior lleva a la expansión de las áreas corticales rostrales a expensas de las áreas caudales mientras que la disminución produce su retracción. Las señales FGF actúan en la formación de áreas corticales rostrales a través de la expresión de factores de transcripción Pax6 y Sp8 y la represión de los factores Emx2 y COUP-TF1 (Figura 47). La expresión de los factores Pax6, Emx2, COUP-TF1, y Sp8 está limitada a progenitores VZ. Pax6 se expresa en un gradiente A-L alto a P-M bajo y Emx2 se expresa en un patrón opuesto, alto en P-M y bajo en A-L. COUP-TF1 tiene un gradiente de expresión P-L alto y A-M bajo. Sp8 es expresado en un gradiente AM alto a P-L bajo (Figura 45, B). El factor de transcripción COUP-TFI es fundamental en promover las características caudales del neocortex reprimiendo la predisposición dorsal. Su supresión en ratones cambia el balance de distribución de las áreas de modo tal que la mayor parte de la corteza se transforma en corteza motora y las áreas somatosensorial y visual se reducen en su tamaño quedando limitadas al polo caudal. Alterando la expresión de Emx2 disminuye el tamaño del área somatosensorial y aumenta el de las áreas visual y motoras. Por su parte, Pax6 y Sp8 determinan características asociadas a áreas motoras de la corteza frontal. En mutantes de Sp8 la expresión del dominio Coup-TF1 se expande rostralmente y Emx2 se incrementa. Los factores de transcripción también se regulan entre ellos. Fgf8 reprime la expresión de Emx2 y COUP-TF1 en su distribución frontal y promueve un alto gradiente de expresión anterior de Sp8 que a su vez activa la expresión de Fgf8. La activación de la transcripción de Fgf8 por Sp8 es reprimida por Emx2 proporcionando un mecanismo para limitar la expresión de Fgf8 en la placa comisural. Además, Emx2 y COUP-TF1 reprimen a Pax6 y Pax6 reprime a Emx2. COUP-TF1 incrementa la expresión de Emx2 y Sp8 la suprime. Señales de las moléculas BMPs y Wnts, Figura 46. Moléculas involucradas en la regulación de la expresión del gen Fgf8 en la placa comisural. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 71 secretadas por el hem cortical, regulan positivamente el gradiente caudal de expresión de Emx2 (Figura 47). Ref. 28, 115, 125, 152, 153, 165, 168, 179, 203 Corticogénesis La corteza cerebral comprende neuronas de proyección e interneuronas. Las neuronas de proyección se originan exclusivamente en el telencéfalo dorsal, migran radialmente durante la corticogénesis y usan glutamato como neurotransmisor excitador. Las interneuronas, en cambio, se originan principalmente de precursores situados en el telencéfalo ventral, migran tangencialmente para invadir la corteza ocupando diferentes capas corticales donde integran circuitos inhibidores que modulan la actividad de las neuronas de proyección. Utilizan GABA como neurotransmisor. Estos dos territorios poblacionales del telencéfalo se caracterizan por expresar marcadores específicos y cuya organización es regulada por factores de transcripción. Las células progenitoras Las células progenitoras dan origen a los distintos tipos de neuronas postmitóticas del neocortex. Las células progenitoras proliferan antes de diferenciarse. Proliferación y diferenciación son fuerzas opuestas, mientras que la proliferación expande o mantiene la población de progenitores la diferenciación la extingue. El balance entre proliferación y diferenciación es regulado por un conjunto de factores de transcripción de los cuales las moléculas bHLH son las más importantes. Las células progenitoras son mantenidas en un estado proliferativo por moléculas bHLH de la subfamilia Hes. Hes1 y Hes5 junto con la proteína Id antagonizan a los genes proneurales manteniendo el estado proliferativo suprimiendo la diferenciación (ver página 29). Figura 47. Interacción entre los factores de transcripción involucrados en establecer las características de las áreas corticales. ERRNVPHGLFRVRUJ 72 Neurogénesis Otros factores de transcripción regulan la proliferación (Figura 48). El gen Emx2, expresado en células progenitoras de la VZ, está implicado en regular el número de divisiones celulares de las células progenitoras favoreciendo la división simétrica. Ratones con mutantes de Emx2 presentan disminución del tamaño de los hemisferios corticales debido a la disminución del número de células progenitoras. Pax6 se expresa en progenitores de la VZ pero se pierde progresivamente a medida que los progenitores migran a la SVZ. Pax6 controla la cinética de la división celular de progenitores de la VZ y la decisión de dividirse simétrica o asimétricamente con lo que regula la formación y expansión de la SVZ y el número de neuronas piramidales de las capas superficiales. En su ausencia los progenitores proliferan menos y se diferencian prematuramente con la consecuente reducción de los progenitores intermedios de la SVZ. La producción de neuronas de las capas profundas aumenta mientras que las neuronas de las capas superficiales se pierden por agotamiento de las células progenitoras disponibles para la neurogénesis tardía. Genes Tlx, en paralelo con Pax6, también controlan la decisión de las células progenitoras a proliferar o diferenciarse y en su ausencia los progenitores de la VZ se diferencian prematuramente y las células SVZ y las neuronas de las capas superficiales disminuyen. Lhx2 es expresado en progenitores de la VZ y SVZ y en neuronas de las capas superficiales. En su ausencia faltan las neuronas de todas las capas lo que sugiere que Lhx2 es necesario durante el desarrollo inicial para establecer las características de progenitores de todas las capas para después controlar la diferenciación de las capas superficiales. De igual manera, en ausencia de Foxg1 se eliminan los progenitores neocorticales. Trb2 es un factor de transcripción expresado en progenitores neuronales intermedios de la VZ y la SVZ concomitantemente con la reducción progresiva de Pax6. La expresión de Trb2 disminuye a niveles no detectables en neuronas postmitóticas que en cambio expresan Tbr1. Animales que carecen de la expresión de Tbr2 en el CNS presentan reducción de la corteza. El espesor de las capas superficiales está reducido. La pérdida de Tbr2 da lugar a la disminución de la proliferación de las células en la SVZ. Brn-1 y Brn-2 inician su expresión tardíamente en progenitores de la VZ adquiriendo su máximo en la SVZ. Activan la proliferación de las células progenitoras en particular los de la SVZ. Ratones con mutantes Brn-1/Brn-2 presentan severa reducción del espesor del neocortex en paticular de las capas IV-II y desorganización de la estratificación de las neuronas corticales. Estas ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 73 alteraciones dependen de la reducción de la proliferación de las células precursoras de la VZ y la SVZ. Otx1 es un factor de transcripción expresado en progenitores de la VZ. En su ausencia disminuye la proliferación de los progenitores neuronales y se reduce el espesor de la corteza. Ref. 1, 5, 27, 32, 34, 43, 59, 70, 116, 139, 156, 159, 167, 175, 185, 201, 207, 212. Formación de las capas neuronales Una vez que las células progenitoras han proliferado suficientemente comienzan a diferenciarse en los diferentes tipos neuronales destinados a las distintas capas. Este proceso comienza en progenitores aún antes de su último ciclo mitótico y se continúa en las neuronas postmitóticas que migran. Las primeras neuronas generadas migran fuera de la VZ y junto con las células Cajal-Retzius forman una estructura laminar debajo de la superficie pial, la preplaca (PP). La preplaca es una estructura dinámica transitoria que comprende varios tipos celulares la mayoría de los cuales está destinada a desaparecer. Después, un conjunto de neuronas migra de la VZ a la parte media de la preplaca, formando una capa media llamada placa cortical (CP), que divide esta capa en una zona marginal superficial (MZ) y una más profunda, la subplaca (SP). La MZ es escasa en células, uno de cuyos constituyentes más destacados son las células de Cajal-Retzius que expresan Reelin. La MZ se vuelve la capa I de la corteza madura. La SP es una zona transitoria en la que transcurren axones de neuronas aferentes. La CP, que se expande por el agregado de nuevas neuronas, será el sitio de las Figura 48. Expresión de genes en células progenitoras que dan origen a los distintos tipos de neuronas del neocortex. ERRNVPHGLFRVRUJ 74 Neurogénesis neuronas de proyección de la corteza cerebral. Las neuronas nacidas primero se ubicarán en las capas profundas VI y V de la corteza madura y las nacidas posteriormente migran radialmente, pasan la capa de neuronas profundas y se vuelven las capas superiores (IV, III y II). Entre las SVZ y la CP se encuentra la zona intermedia (IZ), un compartimiento atravesado por axones y conteniendo pocas células. La sustancia blanca de la corteza se forma en esta zona y eventualmente la reemplaza. Ulteriormente las neuronas de la SP y la VZ desaparecen (Figura 49). Las diferentes capas neuronales expresan genes específicos entre los cuales Cux1, Cux2 y Lhx2 son marcadores de las capas II, III y IV, Brn2 es un marcador de las capas II/III y V, en su ausencia las neuronas de estas capas no migran y se posicionan debajo de la SP. Rorβ es un marcador de la capa IV, encefalopsin un marcador de la capa V, y Foxp2, un marcador de la capa VI. Ref. 37, 127, 165 , 179 Migración neuronal Las neuronas postmitóticas, que se forman a partir de las células progenitoras durante el desarrollo, migran a los sitios de residencia en las diferentes capas de la corteza cerebral. Dos tipos de migración neuronal tienen lugar en el telencéfalo, la migración radial y la migración tangencial. En la migración radial las células migran desde la capa de células progenitoras en dirección a la superficie del cerebro siguiendo la organización radial del tubo neural. En la migración tangencial interneuronas originadas en el subpalio se mueven en trayectos paralelos a la superficie ventricular, perpendicularmente a la dirección de la migración radial. La migración radial puede hacerse por translocación somal o por locomoción. En la translocación somal las neuronas primero extienden un largo proceso basal desde la zona ventricular a la superficie pial a la que se adhieren. Por acortamiento de este proceso el cuerpo celular es traccionado progresivamente. En la migración por locomoción las neuronas se mueven a lo largo de las fibras gliales, a las que usan como soporte, formando adherencias con el cuerpo celular y extendiendo un proceso conductor en cuyo extremo hay una estructura similar a la de un cono de crecimiento que se extiende y retrae a medida que explora el medio ambiente. Después el núcleo transloca en el proceso con ductor (nucleoquinesis) seguido por la retracción del proceso posterior (Figura 50). ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 75 Figura 49. Representación esquemática de las distintas capas celulares en la formación de la corteza cerebral de ratón durante el desarrollo. Mecanismos moleculares reguladores La migración radial de las neuronas de la VZ a la placa cortical implica cuatro procesos consecutivos que se superponen parcialmente: comienzo del movimiento, adherencia a las fibras glía radiales, locomoción incluyendo nucleoquinesis, y desprendimiento de las fibras radiales y posicionamiento laminar. El comienzo de la migración de neuronas corticales es promovido por señales extracelulares que a través de receptores activan una cascada de señales intracelulares. Las señales extracelulares comprenden factores de crecimiento, factores neurotróficos y moléculas de adherencia. Los factores neurotróficos BDNF y NT4 activan receptores TrkB expresados en neuronas migratorias. La infusión de estos factores en los ventrículos laterales incrementa la migración neuronal mientras que la alteración de los receptores en el cerebro en desarrollo afecta la migración. La activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y las moléculas de adherencia celular como N-CAM, la familia de cadherinas, y proteínas de la matriz extracelular, particularmente laminina y proteoglicanos condroitin-sulfato, así como varios neurotransmisores, GABA entre ellos, también están implicadas en la migración radial en el telencéfalo. Otras moléculas señales incluyen a las familias netrinas, semaforinas, efrinas, y slits. Las señales ambientales activan receptores de superficie iniciando una cascada de señales citoplasmáticas que involucran a proteínas de la familia Rho GTPasas y al Ca 2+ intracelular que ERRNVPHGLFRVRUJ 76 Neurogénesis Figura 50. Modos de migración radial de neuronas en la corteza cerebral durante el desarrollo. finalmente convergen en el citoesqueleto para regular la movilidad de la célula. Los microtúbulos y los microfilamentos de actina actúan sinergicamente mediando la migración. Alteraciones de la actina y mutaciones que desestabilizan a la red de actina inhiben la migración. Los miembros de la familia Rho GTPasas, RhoA, Rac1, y Cdc42, cuya actividad es regulada por las proteínas GEF y GAP, están involucrados en la organización de los filamentos de actina. La polimerización de los extremos barbados de los filamentos de actina crea una fuerza que impulsa al borde conductor hacia la perifería. Otra proteína asociada a actina que regula la migración neuronal es miosina II que se acumula en la parte posterior del núcleo a medida que la célula migra. La contracción de miosina II crea una fuerza que ayuda al movimiento del núcleo y permite que la célula se desprenda de su ambiente exterior para retraer su proceso posterior. Cdk5 (cyclin-dependent kinase 5) y su activador p35 se localizan en los filamentos de actina en conos de crecimiento y son necesarios para la migración neuronal. Entre los sustratos de Cdk5 se encuentran varias proteínas que actúan como reguladoras de la organización de actina como PAK1 y WAVE1 promoviendo la migración. En ratones la falta de Cdk5 o de p35 produce defectos en la posición de las capas corticales del neocortex, mientras que las neuronas nacidas inicialmente se posicionan normalmente la neuronas nacidas tardíamente no pueden migrar a las capas supeficiales y quedan retenidas por debajo de las neuronas preexistentes dando lugar a una corteza invertida. Por su parte, la regulación de la dinámica de microtúbulos es necesaria para la migración neuronal. Numerosas proteínas como MAP1A, MAP1B, MAP2, tau, Lis, y DCX entre otras, regulan ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 77 la dinámica de microtúbulos estabilizándolos. Ratones con mutantes de estas proteínas presentan alteraciones en la migración de neuronas. En humanos, la supresión de LIS da lugar a lisencefalia, una alteración del desarrollo del cerebro que se manifiesta por superficie cerebral lisa y alteraciones de las capas corticales. Deficiencias de DCX en machos resultan en defectos de migración similares a los de licencefalia mientras que en hembras se manifiesta por la formación de una segunda CP. Las proteínas G heterotriméricas Gα12 y Gα13 se necesitan para una adecuada terminación de la migración pudiendo estar involucradas en mediar una señal de detención. Su supresión en ratones durante el desarrollo da lugar a un exceso de migración de las neuronas corticales que invaden la MZ Las señales Reelin son uno de los mecanismos mejor conocidos involucrados en la organización de la corteza cerebral. La proteína Reelin de 3461 aminoácidos, producto del gen Reln, es un glicopéptido secretado por las células Cajal-Retzius. Las moléculas Reelin forman homodímeros que se unen a los receptores ApoER2 (apolipoprotein E receptor-2) y VLDLR (very-low-density lipoprotein receptor). Las moléculas receptoras son proteínas de superficie que contienen una región extracelular, un solo segmento de transmembrana y una corta cola citoplasmática. La unión de Reelin a los receptores VLDLR y ApoER2 produce la activación de la proteína adaptadora Dad1 que interactúa con los motivos NPxY de las colas de ambos receptores. Dab1 (Disabled-1) es una proteína citoplasmática adaptadora de 555 aminoácidos presente en grandes cantidades en el CNS en desarrollo. Cerca de su N-terminal se encuentra el dominio PI/PTB (protein interaction/phosphotyrosine binding domain) que se une a los motivos NPxY. En dirección al C-terminal se encuentra un conjunto de residuos tirosina (Y) cuya fosforilación activa a Dab1 y sirve de sitios de anclaje para proteínas que contienen el dominio SH2 como Src, Fyn, y Abl. La activación de Dab1 recluta a la familia Src de tirosina quinasas (SFKs) que fosforila aún más a Dab1 reclutando tirosina quinasas adicionales. La alta concentración local de SKFs, activadas a su vez, activa una cascada citosólica de quinasas comenzando con la activación de fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) y la proteína Akt/PKB que fosforila a GSK3β inhibiendo su actividad. Como resultado se reduce la fosforilación de la proteína tau de microtúbulos promoviendo su estabilidad. Reelin también puede aumentar la actividad de GSK3β que en sinergia con Cdk5 induce la fosforilación de MAP1B favoreciendo la estabilidad de microtúbulos y la migra ción neuronal (Figura 51). Reelin funciona como una señal de detención de la migración neuronal pero el mecanismo íntimo de ERRNVPHGLFRVRUJ 78 Neurogénesis . Figura 51. Cascada de eventos inducida por la unión de Reelin a sus receptores promoviendo la migración neuronal. esta función no se conoce Ratones con mutantes del gen Reln presentan alteraciones de la posición de neuronas en la corteza cerebral. La formación de la CP por las neuronas generadas inicialmente es normal pero neuronas generadas después son incapaces de pasar la SP quedando retenidas debejo de esta capa. Como resultado, las neuronas generadas inicialmente se localizan superficialmente mientras que las generadas después forman las capas profundas. La mutación de Vldlr resulta en un aumento en la migración de gran número de neuronas de las capas II-IV que ocupan la MZ. Por el contrario, en mutaciones de ApoER2 sólo un reducido número de neuronas de las capas II-IV alcanzan su normal destino en la placa cortical mientras que la mayoría se disponen por debajo de las capas V y VI que se encuentran desplazadas hacia arriba. Estos resultados sugieren que Vldlr puede inducir una señal de parada para la migración de neuronas mientras que ApoER2 promueve la migración de neuronas corticales nacidas tardíamente. Netrinas, una familia de proteínas que se unen a las familias de receptores UNC5 y DCC, pueden estimular la migración celular regulando la dinámica de microtúbulos y de actina fosforilando MAP1B vía GSK3β y CDK5. Las proteínas Slit por intermedio de sus receptores Robo activan una cascada de señales intracelulares que puede regular la ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 79 migración neuronal. Slit estimula la unión de Rho GTPasa GAP al dominio intracelular de Robo activándola, llevando a inactivar a Cdk42 e induciendo repulsión de axones. Semaforina 3ª, uniéndose a sus receptores neuropilinas y plexinas, regula la dinámica de actina induciendo respuestas repulsivas. Ref. 7, 14, 40, 64, 69, 74, 75, 118, 133, 169, 237 Neuronas de proyección La formación de neuronas de proyección para las diferentes capas de la corteza durante el desarrollo embrionario progresa, en una secuencia temporal, a partir de células progenitoras. Las neuronas generadas de las células glía radiales y las células progenitoras intermedias residentes en la VZ, que son las más precoces en nacer, se sitúan en las capas profundas (V, VI, y SP) mientras que las IPCs residentes en la SVZ generarían las neuronas de las capas superiores aunque se cree que fundamentalmente contribuyen a la gliogénesis. Las evidencias de que la neurogénesis en la SVZ contribuye a la generación de las neuronas de las capas superiores derivan del hecho que los genes Svet1 y Cux2, que se expresan en un grupo de células de la SVZ se expresan también en neuronas de las capas II-IV. Las neuronas de proyección comprenden neuronas intracorticales, que proyectan a la corteza, y neuronas corticofugales, que proyectan a regiones subcorticales y subcerebrales. Las neuronas de proyección intracortical comprenden neuronas de asociación, que residen en la capa Va y extienden axones a la corteza del mismo hemisferio, y neuronas comisurales, que conectan con el hemisferio opuesto vía el cuerpo calloso o la comisura anterior, integrando información entre ambos hemisferios. Sus cuerpos celulares residen en las capas corticales II y III (un 80%), en la capa V (un 20%), y en menor proporción en la capa VI. Las neuronas de corticoestriatales son otro subtipo residente en la capa Va que proyecta axones a través de la línea media al hemisferio contralateral y envía colaterales al estriado ipsi y contralateral. Las neuronas de proyección corticofugales comprenden neuronas de proyección corticotalámicas, situadas en las capas VI y SP que proyectan a los núcleos del tálamo, y neuronas de proyección subcerebral residentes en la capa V profunda (Vb). Las neuronas de proyección subcerebral comprenden neuronas motoras corticoespinales, que envían axones primariamente a la médula espinal, neuronas corticopontinas, con axones primarios dirigidos al bulbo raquídeo, y neuronas corticotectales, que resiERRNVPHGLFRVRUJ 80 Neurogénesis den en la capa V de la corteza visual y extienden axones primariamente al collículo superior. Los distintos tipos de neuronas corticofugales se generan en forma sucesiva en los primeros días del desarrollo cortical en ratones. Las neuronas residentes en la SP se generan primero y envían axones al tálamo seguidas por neuronas residentes en la capa VI que también envían axones al tálamo. Las neuronas nacidas después son las neuronas de proyección subcerebral que se posicionan en la capa Vb. En último término se originan las neuronas de proyección intracortical. Formación de las neuronas de proyección La configuración y desarrollo de los diferentes tipos de neuronas de proyección está determinada por la expresión de un conjunto de genes y factores de transcripción. Muchos genes son comunes a todas las neuronas de proyección y otros están más relacionados a un determinado tipo neuronal. Así, las neuronas corticofugales comparten programas genéticos comunes que determinan su posición laminar y el crecimiento inicial a sus destinos subcerebrares. Por el contrario, neuronas que proyectan al cuerpo calloso expresan LMO4 que no se encuentra en neuronas motoras corticoespinales. Las neuronas de las capas profundas y superiores dependen de distintos mecanismos para su producción. La configuración de las neuronas corticales de proyección, nacidas inicialmente y que migran a las capas profundas, es determinada por los genes Ngn1/2. Mutaciones de Ngn2 en periodos tempranos de la corticogénesis dan lugar a defectos en las neuronas de las capas VI y V pero no de las capas IV, III, y II, indicando que la regulación de neuronas nacidas temprana y tardíamente depende de distintos factores. Ngn2 activa una cascada de factores de diferenciación neuronal que involucran a NeuroD, NeuroD2 y Math2 (ver página 33). Ngn1 también puede inducir la diferenciación neuronal secuestrando Smad1 (Figura 13). Por el contrario, para activar programas de diferenciación de neuronas nacidas en periodos medio y tardío de la corticogénesis y que migran a las capas superficiales se necesitan Pax6 y Tlx, funcionando tanto independientemente como sinérgicamente. Emx2 también funciona durante estos periodos principalmente en la corteza caudal. En ausencia de las funciones de Pax6 las capas superficiales se forman defectuosamente y la expresión de Svet1 y Cux2 en la SVZ y en las capas superficiales está severamente disminuida mientras que las capas profundas y la expresión de Otx1, limitadas a ellas y a los progenitores de la VZ, no se afectan. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 81 Las neuronas de proyección subcerebral Las neuronas de proyección subcerebral son una población neuronal localizada en la capa Vb (capa V profunda) de la corteza. Las neuronas de proyección subcerebral extienden axones primarios que proyectan a la médula espinal, al bulbo raquídeo y a núcleos del mesencéfalo para después emitir colaterales secundarios que son posteriormente eliminados para dejar la organización de las diferentes neuronas de proyección subcerebral con conexiones específicas. De este conjunto de neuronas, el subtipo mejor estudiado es el de las neuronas motoras corticoespinales (CSMNs). La estructura y diferenciación de las neuronas de proyección subcerebral y de las CSMNs en particular son controladas por un conjunto de genes compartidos. Algunos de estos genes como Fezf2, Ctip2, Sox5, Clim1, Cadherin13, y Cntn6 son expresados en los estadios tempranos del desarrollo de CSMNs y en neuronas subcerebrales sugiriendo la posible participación en el control de su nacimiento. Fezf2 es un factor de transcripción expresado en progenitores de la VZ y en neuronas de proyección subcerebral y en menor grado en otras neuronas corticofugales. Fezf2 regula la diferenciación y la formación de las proyecciones de las neuronas de la capa V favoreciendo las proyecciones subcorticales en vez de proyecciones comisurales. En ausencia de su función las neuronas de proyección subcerebral no se configuran y el tracto corticoespinal no se forma. Por el contrario, aumenta el número de neuronas comisurales de las capas profundas. Sin Fezf2 los progenitores neocorticales producen un número normal de neuronas de la capa V pero estas adquieren características de neuronas comisurales. De modo que Fezf2 no afecta la capacidad de los progenitores a generar neuronas glutamatérgicas sino que actúa en los pasos posteriores en programas que establecen las características de las proyecciones subcerebrales. La expresión ectópica de Fezf2 en las capas II/III hace que las células proyecten axones subcorticales. El gen Ctip2 (COUP-TF interacting protein 2) también se expresa en CSMNs y en otras neuronas subcerebrales. La proteína Ctip2 es necesaria para el desarrollo del tracto corticoespinal y en su ausencia los axones corticofugales no pueden extenderse más alla del mesencéfalo para llegar a la médula espinal. Fezf y Ctip2 podrían actuar en una vía común actuando Ctip2 en la corriente descendente de Fezl para el control de la diferenciación de las neuronas de la capa profunda. En ausencia de la función de Fezf se suprime la expresión de Ctip2 en la corteza cerebral. ERRNVPHGLFRVRUJ 82 Neurogénesis Otx1 es un factor de transcripción expresado por progenitoresde la VZ y en neuronas de las capas V y VI. Otx1 es necesario para el desarrollo de las últimas etapas de los axones subcorticales en las cuales las conexiones exuberantes con proyecciones a destinos inapropiados son eliminandas. En su ausencia las conexiones exuberantes son retenidas manteniendo una desmedida inervación en ratones adultos. El factor IGF-1 (insulina-like growth factor-1) está implicado en el desarrollo de las CSMNs y especialmente en el crecimiento de axones. Ratones con Igf1 -/- presentan defectos en el tracto piramidal y disminución del número de axones. Sox5 es expresado en neuronas corticofugales en desarrollo pero no en neuronas comisurales. SOX5 controla la generación sucesiva de distintos subtipos corticofugales previniendo la aparición prematura de neuronas corticofugales de nacimiento tardío. En su ausencia la generación sucesiva de los distintos subtipos de neuronas corticofugales se acelera y se diferencian prematuramente deteniendo su migración antes de posicionarse en la capa V. COUP-TF1 regula el balance entre neuronas corticotalámicas y CSMNs. COUP-TF1 es un regulador negativo de un programa genético que induce la diferenciación de CSMNs. En ausencia de su función en ratones las CSMNs nacen prematuramente, la capa V se expande a expensas de la capa VI, y aumenta el número de neuronas Fezf2 y CTIP2 positivas. La generación de distintos tipos de neuronas a través del tiempo puede depender de la expresión sucesiva de una serie de factores de transcripción que actuando en las células progenitoras determinan la organización laminar y el particular tipo de proyección. Neuronas de proyección intracortical Las neuronas de proyección intracortical comprenden neuronas de asociación, que envían axones al mismo hemisferio, y neuronas comisurales (CPN) que establecen conexiones entre ambos hemisferios vía el cuerpo calloso. Además subpoblaciones de neuronas de proyección intracortical envían proyecciones dobles a estructuras ipsi y contralaterales. Estas neuronas de doble proyección residen preferentemente en las capas profundas de la corteza. La mayoría de las neuronas de proyección intracortical residen en las capas superficiales (II y III) mientras que una menor población reside en las capas profundas (V y VI). La población CPN es heterogenea, compuesta por subtipos neuronales controlados por un conjunto interactivo de genes. Un ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 83 grupo de genes (Lpl, Hspb3, y Cited2) está presente en todas las CPN diferenciandolas de otras neuronas de proyección. Estos genes están expresados en alto grado en las capas II/III y menor en las CPN de las capas V y VI. Otros genes están restringidos a CPN residentes en las capas superficiales o en las capas profundas. Los genes Cux2, Inhba, Brg1, Cpne4, y Tmtc4 se encuentran solo en las capas superficiales. Por su parte, las CPN de la capa Va expresan Plexin-D1 y Gfra2 mientras que las situadas más profundamente en la capa V pueden ser definidas por la expresión de Gfra2, Tcrβ , y Dkk3 y por la ausencia de Plexin-D1. Las CPN situadas en la capa VI expresan Gfra2, Tcrβ , y Dkk3 pero no Plexin-D1. También es posible identificar subpoblaciones de CPN que expresan combinaciones de genes que gobiernan su desarrollo. Un grupo de genes controlan la generación y el desarrollo de las neuronas residentes en las capas superficiales. Brn1 y Brn2, expresados en neuronas de las capas II-V, están implicados en dirigir la diferenciación y migración de las neuronas de estas capas. En su ausencia el número de neuronas en las capas II-V disminuye y las neuronas que han nacido presentan anormalidades en su migración. Cux1 y Cux2 son factores de transcripción que se expresan en células progenitoras de la SVZ y en neuronas de las capas IV-II que regulan las ramificaciones dendríticas y la formación de sinapsis de las CPN de las capas II/III. Satb2 es un factor de transcripción, expresado en neuronas de las capas V-II durante el desarrollo, que regula la expresión de genes que promueven la organización de la cromatina. En su ausencia los axones del cuerpo calloso faltan y por el contrario adoptan las características de las neuronas de proyección subcortical descendiendo a lo largo del tracto corticoespinal. En condiciones normales Satb2 actúa reprimiendo la expresión de Ctip2 por lo que permite la formación de conexiones corticocorticales en oposición de axones de proyección subcortical. Lmo4, inicialmente expresada junto con Clim1 por neuronas comisurales y de proyección subcerebral en la capa V, adopta un patrón de expresión en neuronas comisurales durante la posterior diferenciación. Ref. 1, 2, 4, 28, 29, 43, 45, 51, 59, 67, 70, 83, 90, 121, 134, 138, 139, 153, 157, 184, 191, 210, 220, 236 Las interneuronas Las interneuronas de la corteza cerebral, que representan el 20% de su población neuronal, desempeñan un rol fundamental ERRNVPHGLFRVRUJ 84 Neurogénesis en modular la descarga y plasticidad corticales. También han sido implicadas en regular la proliferación y migración durante la corticogénesis. Las interneuronas son neuronas GABAérgicas que se originan en el telencéfalo ventral. La MGE y la CGE son las principales estructuras donde se originan las interneuronas corticales aunque la LGE, que provee interneuronas a los bulbos olfatorios y neuronas al estriado, también provee en menor escala interneuronas a la corteza. Las interneuronas derivadas de la MGE contienen parvalbúmina (PV) o somatostatina (SST) pero no calretinina (CR) definiendo dos subgrupos que que tienen distintas caracteríasticas y conexiones y que en conjunto reperesentan alrededor del 60% de las interneuronas en ratones. Las interneuronas derivadas de la CGE contienen PV o SST y algunas son también CR positivas. Interneuronas conteniendo neuropéptido Y (NPY) también derivan de la MGE y CGE. En humanos se originarían interneuronas que contienen CR y calbindina (CB) en la corteza misma a partir de progenitores de la zona subventricular. Progenitores de interneuronas que derivan de la MGE expresan Nkx2.1 en respuesta a señales SHH. Nkx2.1 se necesita para la configuración inicial de los progenitores MGE, dando origen a los fenotipos que contienen PV, SST, y NPY; en su ausencia en ratones la MGE no se forma y SST y NPY están ausentes en interneuronas corticales. Por el contrario, las interneuronas CR positivas no se afectan. La mayoría de las interneuronas derivadas de la MGE también expresan Dlx1/2 y a medida que salen del ciclo celular (postmitosis) Dlx5/6 y los factores de transcripción Lhx6 y Lhx7 son intensamente expresados mientras que la expresión de Nkx2.1 y Dlx1 disminuyen. Lhx6 promueve la migración y diferenciación de interneuronas MGE. Progenitores de la CGE CR positivo también expresan Dlx1/2 pero no Nkx2.1 (Figura 52). Figura 52. Regulación de la configuración y diferenciación de interneuronas corticales ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 85 Figura 53. Las interneuronas originadas en las MGE y CGE migran tangencialmente a la corteza por una vía superficial y otra profunda. Modificado de Marín, Rubenstein, 2003. Las interneuronas migran tangencialmente a través de dos rutas migratorias, una superficial y otra profunda para integrarse a la corteza cerebral (Figura 53). La migración tangencial de las neuronas depende de su interacción con la matriz extracelular o con la superficie de otras células. Las neuronas también pueden usar los axones de otras neuronas para migrar a sus destinos. Numerosas moléculas responsables de dirigir las neuronas derivadas de la MGE a la corteza actúan integrando señales quimio-atrayentes y quimio-repelentes. Estas moléculas incluyen factores como Netrinas, Semaforinas, Slits, factores de crecimiento como BDNF y NT4 y proteínas morfogenéticas. Neuregulina-1 (Nrg1) a través de receptores ErbB4 actúa como agente quimio-atrayente de células derivadas de la MGE. Las interneuronas migratorias responden a gradientes de Nrg1 generando procesos conductores de nuevas ramas para después seleccionar las ramas que continuarán su migración. Mutantes de Nrg1 o de ErbB4 muestran retardo de la migración de la MGE. Las interneuronas también son guiadas en su migración por agentes quimio-repelentes evitando que tomen caminos inapropiados. En estos mecanismos estan implicados Sema3A y Sema3F y sus receptores Nrp1 y Nrp2 respectivamente. Después de un periodo de migración tangencial las interneuronas cambian a un modo de migración radial cuando entran en la corteza. El cambio de modo de migración estaría regulado por quemoquinas como Cxcl12 expresada por meninges y células piramidales y por los receptores Cxcr4 expresados en interneuronas. En su ausencia las interneuronas invaden prematuramente la corteza y presentan una distribución laminar anormal. Ref. 10, 49, 75, 102, 118, 119, 218, 228 ERRNVPHGLFRVRUJ 86 Neurogénesis FORMACIÓN DEL HIPOCAMPO El hipocampo se origina del área más medial del palio, adyacente a la región que forma el neocortex, originándose el girus dentado de su porción más caudal. Una pequeña zona del neuroepitelio contigua a la región donde se origina el girus dentado es ocupada por el hem cortical (Figura 54). Las primeras neuronas granulares y los precursores granulares se expanden en una región especializada de la zona subventricular que se hace aparente adyacente a la hendidura dentada en la mitad de la gestación. Después nacen las primeras células granulares del dentado que migran radialmente de la hendidura del dentado al girus dentado en formación para formar la capa granular primitiva. Al mismo tiempo, las células precursoras se dividen y migran para asentarse en el futuro hilio donde continúan dividiéndose constituyendo un sitio de masiva producción de neuronas granulares de las cuales gran número se originan después del nacimiento. Este sitio también da origen a células glía radiales. Finalmente las células granulares se condensan en una capa en cuya zona subgranular se encuentran células precursoras que se dividen. El hem cortical actúa como centro organizador del hipocampo y su desarrollo es controlado por Lhx5 y p73 que se expresan selectivamente en el hem y en células Cajal-Retzius. Ratones con mutantes Lhx5 carecen del desarrollo de hem y tienen defectos secundarios del hipocampo derivados de la falta de señales hem. Un efecto similar se observa por falta del factor de transcripción p73. El hem cortical secreta miembros de las familias Wnt y BMP y factores de transcripción que regulan el desarrollo del girus dentado y el hipocampo. La supresión del hem cortical en ratones produce pérdida del hipocampo y del volumen de la corteza. El gen Wnt es expresado en el hem cortical y Wnt-3a se necesita para promover la proliferación de progenitores de la corteza caudomedial que generan el hipocampo. En ausencia de Wnt-3a el conjunto de progenitores disminuye y el hipocampo experimenta una severa reducción de su desarrollo. Las señales Wnt controlan el desarrollo del hipocampo a través de los factores nucleares Lef/Tcf. Lef1, expresado en el hipocampo en desarrollo, regula la diferenciación de células granulares del girus dentado y su falta da lugar a la pérdida de esas neuronas. Las señales BMP son importantes en el desarrollo temprano del palio medial y hipocampo. La formación del hipocampo y del girus dentado comparte muchos aspectos con el desarrollo de la corteza. El neuroepitelio ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogéneisis en el embrión 87 Figura 54. Área medial del palio adyacente al neocortex donde se origina el hipocampo y el girus dentado. A derecha moléculas y factores de transcripción involucrados en la formación del hipocampo. del girus dentado y del hipocampo es regulado por varios factores de transcripción tales como Emx2, Foxg1 y Lhx2. Ratones con mutaciones Emx2 tienen estructuras corticales caudales, como el hipocampo y la corteza visual, reducidas en tamaño además de falta del girus dentado. Los factores de transcripción Foxg1 y Lhx2, que se expresan en progenitores corticales, reprimen al hem. En sus ausencias el hem cortical se expande a expensas de las estructuras corticales mediales y se desarrollan estructuras del hipocampo y del girus dentado en el lugar de la placa neocortical ausente. Una vez que el neuroepitelio del girus dentado ha sido configurado el paso siguiente es la migración de un conjunto de NSCs y progenitores de su localización en el neuroepitelio al girus dentado en desarrollo. La migración de estas células o su organización en redes glía radiales es controlada directamente por genes. Ratones con mutantes FGFR1 presentan disminución de la proliferación de precursores y defectos en la proyección al dentado de células glía radiales. SDF1 actúa como un quimio-atrayente para células migratorias y su falta da lugar a la disminución de precursores del girus dentado. Defectos en receptores integrinas también afectan la migración. Un paso final en el desarrollo del girus dentado es la diferenciación en neuronas granulares que expresan el marcador Prox1. Este proceso depende de factores de transcripción como la cascada NeuroD, Math2, NeuroD2 aunque otros genes reguladores también pueden esta involucrados. La organización de la neuronas granulares en el girus dentado en una capa compacta de células es afectada por Reelin. En ausencia de Reelin la capa de células granulares se dispersa. En ERRNVPHGLFRVRUJ 88 Neurogénesis pacientes con epilepsia y en modelos animales de epilepsia la dispersión de la capa de células granulares se asocia con pérdida de la expresión de Reelin. Ref. 103, 144, 153, 199 Bibliografía consultada 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Acampora D, Gulisano M, Broccoli V, Simeone A. Otx genes in brain morphogenesis. Prog Neurobiol 64:69-95, 2001. Alcamo EA, Chirivella L, Dautzenberg M, et al. Satb2 regulates callosal projection neuron identity in the developing cerebral cortex. 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LA ZONA SUBVENTRICULAR (SVZ) La SVZ, que se desarolla como residuo de progenitores de la eminencia ganglionar lateral del telencéfalo, es una fina capa de células que se extiende a lo largo de la pared lateral de los ventrículos laterales separada de los ventrículos por una capa de células ependimales multiciliadas. Contiene tres tipos de células que se diferencian por su morfología, ultraestructura, y sus marcadores. Las células B son los progenitores primarios de nuevas neuronas y tienen características ultraestructurales e inmunocitoquímicas típicas de astrocitos. Son células de contorno irregular que llenan el espacio entre las células vecinas y en ocasiones presentan un proceso que se extiende entre las células ependimales haciendo contacto con el ventrículo. Su citoplasma es claro, contiene pocos ribosomas y se caracteriza por abundantes filamentos intermedios. Expresan las proteína GFAP (glial fibrillary acidic protein), vimentina, y Nestina. Actúan como NSCs (neural stem cells) y en cultivos dan lugar a la formación de neuroesferas. Son células caracterizadas por su potencialidad para producir numerosos tipos celulares y por su capacidad de autorenovarse. Las células B se dividen lenta y asimétricamente, que además de mantenerse a sí mismas generan nuevos astrocitos que son precursores inmaduros (células C) de nuevas neuronas. También pueden dividirse simétricamente para generar dos ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 102 NSCs. Las células B forman un tubo que rodea las cadenas de células A aislándolas del parénquima circundante (Figura 1). NSCs se encuentran no solo en la pared lateral del ventrículo lateral sino también en la pared media opuesta al Septum y en la pared dorsal opuesta al cuerpo calloso. Las células C son células precursoras que se dividen rápidamente, son las células de la SVZ con más actividad proliferativa. Tienen bordes lisos y citoplasma indiferenciado y carecen de grandes manojos de filamentos intermedios. Son células que expresan los factores de transcripción Dlx2 y Mash1 y negativas tanto a GFAP y vimentina como a β-tubulina y PSA-NCAM lo que las diferencia de las células B y A. Las células C son una población heterogénea de células intermedias entres células B y A, organizada en diversas poblaciones de progenitores que dan lugar a particulares subtipos de interneuronas del bulbo olfatorio. La mayor parte de estas células produce neuroblastos (células A) aunque también algunas expresan Olig2 y producen oligodendrocitos. Las células A tienen un cuerpo alargado con uno o dos procesos y abundante cromatina laxa. Su citoplasma oscuro contiene muchos ribosomas libres, cortas cisternas de retículo endoplásmico rugoso, un pequeño aparato de Golgi y microtúbulos Están unidas a otras células A por pequeños procesos de asociación formando cadenas neuronales que migran desde la SVZ al bulbo olfatorio vía la corriente migratoria rostral (RMS). Expresan las proteínas PSA-NCAM, DCX (doublecortin), y TuJ1, un marcador de βtubulina que reconoce neuronas jóvenes (Figuras 1 y 2). Las células ependimales (E) forman una monocapa que separala SVZ de la cavidad ventricular. La superficie expuesta al ventrículo contiene microvellosidades que con frecuencia son ciliadas. Son células diferenciadas que expresan los más altos niveles de nestina y secretan Notch. Expresan el marcador CD133 y se dividen raramente pero después de lesiones pueden activarse transformándose en células similares a glía radiales sirviendo como una población suplementaria de NSCs y producir neuronas destinadas al bulbo olfatorio. Los vasos sanguíneos son frecuentes en la SVZ y las células endoteliales que los limitan son fuentes de señales para la neurogénesis. Una lámina basal que rodea los vasos se extiende por la SVZ y termina en pequeños bulbos yuxtapuestos a las células ependimales. La SVZ del cerebro humano presenta una banda de células con características de astrocitos separadas del epéndimo por un espacio lleno de procesos GFAP positivo. Los astrocitos de estas bandas se dividen in vivo y generan neuroesferas in vitro. La presencia de una RMS en humanos no es aparente y la organizaERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 103 Figura 1. Organización estructural de la SVZ en una sección transversal (superior) (modificado de Alvarez-Buyla, García-Verdugo) y horizontal (inferior) ción de una corriente migartoria parece ser más una extensión anterior de la zona proliferativa que una vía migratoria presente en otras especies. La zona subcallosa (SCZ) Un gran número de células en activa proliferación también se encuentra en el cerebro de roedores adultos en la extensión caudal y media del cuerno posterior del ventrículo lateral, entre el hipocampo y el cuerpo calloso. Estas células, a diferencia de las Figura 2. Diferentes células de la organizaciónb SVZ/bulbo olfatorio y sus marcadores ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 104 células de la SVZ, no están asociadas a una cavidad ventricular abierta sino a cavidades aisladas, llenas de líquido cefalorraquídeo, o colapsadas, que pueden estar conectadas a los componetes de los ventrículos laterales. Las células tienen características similares a las células de la SVZ pero también poseen propiedades especiales. Pueden crecer in vitro como neuroesferas y generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos lo que sugiere que la SCZ posee células que se comportan como NSCs. Sin embargo, in vivo, no generan neuronas sino oligodendrocitos que migran radialmente para madurar y mielinizar los principales tractos de sustancia blanca del cuerpo calloso. Células progenitoras de la SCZ también pueden migrar a regiones isquémicas del hipocampo y reemplazar las neuronas dañadas en CA1. Ref. 1, 4, 17, 25, 35, 38, 45, 46, 138, 153, 154, 203, 211, 218, 243. LA ZONA SUBGRANULAR DEL HIPOCAMPO (SGZ) Girus dentado El girus dentado (DG) está compuesto por la capa molecular que contiene las dendritas de las células granulares, la capa de células granulares que contiene los cuerpos de las células granulares, y la zona subgranular (SGZ), situada entre la capa de células granulares y el hilio del girus dentado. Las células granulares son las principales neuronas excitadoras del DG. Reciben aferencias de la corteza entorrinal, por intermedio de la vía perforante, y envían sus axones de proyección a través de tractos de fibras musgosas al área CA3 donde hacen sinapsis (Figura 3). Neurogénesis en el hipocampo adulto La neurogénesis en el hipocampo progresa a partir de células precursoras glía radiales a través de células progenitoras hacia una fase de maduración postmitótica para finalmente terminar en la formación de nuevas células granulares. Nuevas neuronas continúan formándose en la SGZ de mamíferos adultos, incluso primates y humanos, las que son incorporadas al girus dentado. Hasta el 6% del número total de neuronas se incorporan mensual mente en el girus dentado de roedores. Células precursoras La neurogénesis en el girus dentado adulto se origina a partir ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 105 de una población de células precursoras glía radiales que se encuentra en la SGZ. Las células precursoras (células B o tipo 1) tienen características de astrocitos radiales. Los astrocitos radiales tienen grandes cuerpos celulares en la SGZ con procesos radiales que penetran en la capa granular y se extienden a la capa molecular. Los procesos radiales tienen filamentos intermedios ricos en GFAP y pueden contactar con vasos sanguíneos. Intercalada entre estas células y las neuronas granulares se encuentran delgadas láminas basales orientadas tangencialmente. Las células precursoras glía radiales expresan los marcadores GFAP y Nestina. En cultivos muestran actividad de auto-renovación y pluripotencialidad originando neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Los astrocitos precursores pueden dividirse asimétricamente generando una células hija que permanece como un astrocito y otra célula hija que progresa, a través de células progenitoras asociadas a alta actividad proliferativa, hacia una fase de maduración postmitótica y finalmente hacia una nueva neurona granular. Células progenitoras Los astrocitos radiales se dividen y dan origen a células progenitoras intermedias llamadas células D (tipo 2 y tipo 3) de los que se diferencian por sus características estructurales. Grupos de células D se encuentran en un nido, situado entre la SGZ y el hilio, formado por los procesos de astrocitos que envuelven a las células D aislándolas del hilio. Esta organización previene la migración de nuevas neuronas fuera de la capa de células granulares o aislan el nicho neurogénico de factores del hilio. Las células D son progenitores transitorios, con alta capacidad proliferativa para la formación de nuevas neuronas y representan una transición entre las células con un fenotipo glial a células con características de linaje neuronal. Son células de Figura 3. Organización del girus dentado ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 106 Figura 4. Corte transversal del cerebro de ratón adulto mostrando la organización celular de la SGZ del hipocampo. Modificado de Riquelme. forma irregular, con densa cromatina. Se subdividen en tres subtipos que representan diferentes estadios de maduración. Las células D1 o tipo 2a carecen de procesos y proliferan rápidamente dando origen a las células D2 o tipo 2b, cuyos procesos crecen para atravesar el espesor de la capa granular, para transformarse en células D3 o tipo 3, que marcan la salida del ciclo celular. Las células tipo 2a todavía expresan marcadores gliales (GFAP y nestina) pero carecen de las características morfológicas de los astrocitos radiales. En las células tipo 2b se encuentran marcadores nestina y DCX (doublecortin) y las primeras señales de diferenciación neuronal como NeuroD y Prox1. Las células tipo 2b responden a las aferencias GABAérgicas y a estímulos como el ejercicio o la estimulación farmacológica con aumento de la proliferación (Figuras 4 y 5). Las células tipo 3 son células de lenta proliferación de transición de neuroblastos a neuronas inmaduras postmitóticas Expresan marcadores del linaje neuronal como DCX, NeuroD, Prox1, y PSA-NCAM y son nestina negativas. A medida que las células progenitoras maduran las dendritas se hacen más complejas y se extienden más profundamente en la capa de células granulares. La salida del ciclo celular tiene lugar principalmente en este estadio celular. Las células tipo 3 presentan poca actividad proliferativa pero la incrementan en condiciones patológicas como epilepsia. Células postmitóticas Las células progenitoras son producidas en exceso y muchas son eliminadas por apoptosis después que han salido del ciclo celular. Las que sobreviven se diferencian en neuronas inmaduras (células G). Las neuronas inmaduras están localizadas en el borde de la capa granular y a medida que maduran se desplazan ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 107 Figura 5. Diferentes tipos celulares de la SGZ y sus marcadores más profundamente. Tienen un cuerpo redondeado, y desarrollan un árbol dendrítico que se distribuye en la capa molecular del girus dentado y un axón que proyecta a las células piramidales de la región CA3. Las neuronas inmaduras todavía son DCX y PSA-CAM y NeuroD positivas y expresan marcadores postmitóticos como NueN y calretinina. Con la maduración las nuevas neuronas cambian la expresión de calretinina a calbindina (Figuras 4 y 5). Ref. 1, 50, 57, 107, 119, 128, 169, 197, 204, 210, 218, 219, 220, 235, 236, 247. NEUROGÉNESIS EN ÁREAS NO-NEUROGÉNICAS Además de las regiones neurogénicas, también se encuentran astrocitos ampliamente distribuidos en el sistema nervioso central los que se dividen in situ para generar células gliales pero no neuronas. Los astrocitos de las regiones no neurogénicas pueden reproducirse en cultivos dando lugar a la formación neuroesferas indicador de que las células originarias son NSCs y pueden diferenciarse in vitro en astrocitos, oligodendrocitos, y neuronas. La potencial capacidad neurogénica de estos astrocitos, aparentemente dormida o suprimida por señales inhibidoras, también ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 108 ha sido demostrada en transplantes a regiones neurogénicas de fetos y de adultos. En efecto SCs de la médula espinal del adulto transplantadas al girus dentado adulto se diferencian en células que expresan la morfología de neuronas maduras y marcadores similares a las neuronas granulares del hipocampo. Por el contrario, células primarias de áreas neurogénicas transplantadas a regiones no neurogénicas se diferencian sólo en células gliales. Estas respuestas señalan que la ausencia de neurogénesis constitutiva en diversas áreas del sistema nervioso no depende de factores intrínsecos de las células precursoras sino más bien de la falta de señales apropiadas del microambiente (nichos celulares) que permitan la diferenciación de las células progenitoras a neuronas. La formación de nuevas neuronas fuera de las áreas neurogénicas ha sido señalada en condiciones normales en regiones del CNS adulto particularmente en la corteza cerebral, aunque estos hallazgos han sido objeto de controversia y si ello ocurre tiene lugar sólo a muy baja frecuencia. Sin embargo, la formación de nuevas neuronas en regiones consideradas como no neurogénicas ha sido demostrada después de lesiones cerebrales en diferentes especies animales. La fuente de las células progenitoras que dan origen a las nuevas neuronas puede provenir de la SVZ, cuyos neuroblastos migran a la zona lesionada, o de la activación de progenitores endógenos. No se sabe, sin embargo, si la formación de nuevas neuronas inducida por lesión depende del incremento de un bajo nivel de neurogénesis o del despertar de una potencialidad latente que requiere de señales adecuadas o ser liberada de una inhibición. Estas respuestas sugieren que el medio ambiente de las áreas no neurogénicas no es inalterable y que estímulos adecuados pueden activar precursores para generar nuevas neuronas. En varias regiones de la corteza cerebral de monos adultos, incluyendo las cortezas prefrontal, temporal, y parietal, se han observado neuronas neoformadas inducidas por lesiones de la corteza cerebral. La formación de neuronas corticales se originaría a partir de precursores de la SVZ que migrarían a través de la sustancia blanca a su destino en la corteza pero también podrían provenir de progenitores de la misma corteza. Las nuevas neuronas extienden cortos axones que pueden incorporarse a los circuitos locales (Figura 6). El número de nuevas neuronas disminuye después de 2 a 3 meses pero otras sobreviven. También en ratones puede inducirse la formación de neuronas corticales por lesiones de la corteza cerebral. Neurogénesis también ha sido señalada en áreas motoras de la corteza cerebral a partir de precursores endógenos. La inducERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 109 Figura 6. Migración de células de la SVZ marcadas con BrdU a la corteza frontal a través de la sustancia blanca. ción de lesiones específicas de neuronas de proyección de la corteza de ratones adultos promueven la neurogénesis en esta población neuronal. Las neuronas motoras corticoespinales neogeneradas pueden ser producidas a partir de precursores endógenos que maduran en neuronas con morfología de neuronas piramidales. Un grupo de estas neuronas sobreviven y extienden axones de proyección hacia la médula espinal En la médula espinal se encuentran progenitores neurales las áreas periventriculares y en el parénquima que pueden proliferar in vitro como neuroesferas y generar neuronas cuando se transplantan al girus dentado adulto. En lesiones de la médula espinal las células progenitoras neurales de la zona periventricular aumentan su proliferación, migran a la zona de lesión y se diferencian en neuronas. En monos las células que se dividen darían origen a oligodendrocitos y astrocitos pero no a neuronas. En el núcleo estriado de conejos adultos se ha detectado la presencia de nuevas neuronas en condiciones normales aunque su número es muy bajo. Parte de estas se diferencia en interneuronas estriatales. Las nuevas neuronas se originan de una población de células precursoras que migrarían de la SVZ al estriado organizadas como cadenas cuyos elementos individuales se diferencian en neuronas maduras aunque a un nivel mucho menor que en la SVZ. Es importante destacar que estas cadenas forman una población separada de las cadenas de la SVZ. Las nuevas neuronas del estriado se originarían también a partir de células precursoras locales. Neurogénesis en el estriado también ha sido demostrado en monos adultos aunque el número de neuronas es muy bajo en condiciones normales pero puede incrementarse por la inyección de BDNF en los ventrículos laterales. Las nuevasneuronas maduran y expresan marcadores de neuronas estriatales. Lesiones del núcleo estriado producidas en ratones por isERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 110 Figura 7. Lesiones del núcleo estriado inducen aumento de proliferación de progenitores de la SVZ que migran a la zona lesiona quemia (oclusión de la arteria cerebral media) inducen un aumento transitorio de la proliferación de las células progenitoras de la SVZ. Los neuroblastos generados migran a la zona lesionada del estriado, en un intento de reparación de las lesiones, donde se diferencian en neuronas estriatales maduras (Figura 7). En la corteza piriforme de rata adulta se ha identificado la formación de nuevas neuronas la mayoría de las cuales se en cuentran en los bordes de las capas II y III. La mayor parte de las neuronas neoformadas sobreviven por poco tiempo. El complejo vagal dorsal (DVC) situado en la parte dorsal del bulbo raquídeo comprende un órgano cincunventricular, el área postrema (AP), el núcleo del tracto solitario (NTS), principal receptor de aferencias vagales, y el núcleo motor dorsal del nervio vago (DMX) que contiene pericarios de neuronas vagales preganglionares eferentes (Figura 8). En condiciones basales se generan en el DVC nuevas neuronas, concentradas principalmente en el NTS, a partir de NSCs presentes en el borde entre AP y NTS, un Figura 8. Componentes del complejo vagal dorsal ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 111 CC CA1 SCZ lesión Figura 9.Lesiones del área CA1 del hipocampo estimulan la producción de neuronas en la SCZ que migran al área dañada. CC = cuerpo calloso. efecto que se incrementa por vagotomía. En el hipocampo, la producción de nuevas neuronas fuera de la SGZ es muy limitada en el adulto. Lesiones isquémicas del área CA1 pueden estimular la formación de nuevas neuronas para reemplazar las neuronas piramidales dañadas. Estas neuronas se originan de progenitores presentes en el parénquima así como de la zona subcallosa que migran al hipocampo. Las neuronas regeneradas se integran a los circuitos neuronales y contribuyen a la disminución del déficit neurológico (Figura 9). En la substancia nigra de ratones el número de neuronas dopaminérgicas se mantiene constante durante gran parte de la vida a pesar de que muchas mueren por apoptosis. Esto sugiere que las neuronas que mueren son reemplazadas por otras nuevas. Las nuevas neuronas dopaminérgicas se originan a partir de células madre que circundan el sistema ventricular del mesencefalo. La formación in situ de nuevas neuronas a partir de células progenitoras residentes en la sustancia nigra no ha podido ser Figura 10. Neurogénesis en la amigdala y corteza temporal de cerebros de monos ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 112 demostrada. Sin embargo, progenitores transplantados al hipocampo adulto tienen la potencialidad de generar neuronas lo que sugiere que su potencialidad neurogénica está vinculada a señales apropiadas de su medio ambiente. La neurogénesis en la substancia nigra puede incrementarse por lesiones parciales del núcleo. En la amigdala y la corteza temporal que la rodea se ha detectado la presencia de nuevas neuronas en cerebros de monos. Estas neuronas, que se encuentran principalmente en el complejo basolateral de la amigdala, se originarían de la SVZ extendiéndose a lo largo de una vía que va desde la punta anterior de la porción ventral del cuerno lateral del ventrículo lateral a la amigdala y corteza piriforme, denominada la vía temporal (Figura 10) Muchas células en esta vía corresponden también a oligodendrocitos. También es posible que las nuevas neuronas generadas resulten de células progenitoras locales. En ratas, convulsiones inducidas por antagonistas de receptores GABAA producen lesiones y aumento de neurogénesis en la amigdala. En el hipotálamo de rata la administración intraventricular de BDNF y CNTF incrementó el número de nuevas neuronas en los núcleos arcuato, dorsomediano y ventromediano. Hamsters mantenidos en días de fotoperiodo corto presentaron mayor proliferación celular que los mantenidos en días de fotoperiodo largo. La administración de estrógeno puede incrementar el número de nuevas neuronas en algunos núcleos del hipotálamo en ciertas especies animales. Ref. 19, 21, 24, 32, 63, 64, 76, 77, 106, 117, 131, 141, 146, 148, 176, 187, 214, 226, 234, 244, 248. CONTROL MOLECULAR DE LA NEUROGÉNESIS La neurogénesis en la SVZ y la SGZ es un preceso que a partir de las NSCs progresa a través de células progenitoras para difenciarse en células de maduración postmitóticas e integrarse a los circuitos neuronales. Este proceso puede dividirse en varias fases que comprenden la auto-renovación, proliferación, diferenciación, supervivencia, migración, y maduración (Figura 11). La neurogénesis es un proceso controlado por el microambiente o nicho donde las células residen. Las células del nicho neurogénico proveen factores de crecimiento, hormonas, y ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 113 neurotransmisores que han sido implicados en el control de las distintas fases de la neurogénesis. NICHOS NEUROGENICOS La interacción de las SCs con su microambiente regula la producción de nuevas neuronas para satisfacer las demandas ambientales. La importancia del microambiente se evidencia cuando las SCs o los progenitores de la SVZ o de la SGZ transplantadas a otros sitios del cerebro forman células con características de astrocitos u oligodendrocitos pero no de neuronas mientras que los astrocitos de regiones no neurogénicas transplantadas a las áreas neurogénicas pueden generan neuronas carácterísticas de la región. A su vez, progenitores de la zona subgranular del hipocampo transplantados a la SVZ migran a lo largo de la RMS y se diferencian en interneuronas olfatorias. Esto señala que el destino de las NSCs y progenitores de diferentes regiones no está limitada por programas intrínsecos sino que depende de señales extrínsecas derivadas de ambientes locales. Los nichos neurogénicos albergan componentes funcionalmente coordinados para regular las distintas etapas de la neurogénesis. La organización de la estructura celular del nicho es fundamental para el control de esas funciones. Componentes de los nichos neurogénicos Numerosos tipos celulares forman parte de los nichos neurogénicos del cerebro adulto incluyendo astrocitos, células ependimales y del endotelio, progenie de NSCs, y neuronas locales. Otro componente es la matriz extracelular (ECM) que rodea las células del nicho proveyendo una organización estructural a través de la unión de ligandos de la ECM a los receptores integrina de las Figura 11. Distintas fases de la neurogénesis a partir de las NSCs ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 114 SCs. La conexión entre SCs y las células somáticas vecinas es necesaria para mantener las características germinales del nicho. Astrocitos Los astrocitos son una población celular heterogénea de las que algunos pueden servir como células del nicho neurogénico mientras que otros, GFAP+, funcionan como NSCs aunque no hay marcadores que las diferencien. Es posible que los astrocitos, aparte de su papel como SCs, actúen como sensores y reguladores del ambiente. Sus largos procesos hacen contacto con células y estructuras del nicho, incluyendo los vasos sanguíneos y la lámina basal, permitiendo la integración de señales de distintas fuentes. Además están unidos entre sí por uniones estrechas formando una red que posibilita la propagación de señales locales a todo el nicho. Los astrocitos promueven la neurogénesis aumentando la pro liferación y estableciendo el destino de NSCs. El mecanismo molecular por el cual los astrocitos regulan la neurogénesis en la SVZ implica a BMPs y Notch cuya activación puede contribuir a mantener el estado indiferenciado de las NSCs. En la RMS los astrocitos contribuyen a la migración de neuroblastos regulando la disponibilidad de GABA. Células ependimales Las células ependimales, por su proximidad a los ventrículos laterales, pueden captar del líquido cefalorraquídeo factores secretados por los plexos coroideos y transportarlos al parénquima. Entre estos factores se encuentran las proteínas Slit que actúan como repelentes que dirigen la migración neuronal en la RMS. Noggin es un factor secretado por las células ependimales de la SVZ que inhibe las señales BMP generando oligodendrocitos a expensas de la neurogénesis. Células endoteliales Los vasos sanguíneos son un importante componente del nicho. La estrecha proximidad de las SCs neurales del nicho con los capilares sanguíneos permite que se influencien recíprocamente. Las células endoteliales, que forman la capa interna de los vasos, son importantes reguladores en la SVZ. En cocultivos las células endoteliales estimulan la auto-renovación de NSCs inhibiendo su diferenciación. Este efecto es mediado por factores solubles liberados de las células endoteliales. Ligandos de Notch, ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 115 como Jagged1, liberados por las células endoteliales activan a Notch en las NSCs. Otro agente secretado por células endoteliales de la SVZ es PEDF (pigment epithelium-derived factor) que promueve la auto-renovación de NSCs. Este efecto de PEDF se acompaña de aumento de la expresión de Hes1 y Hes5. Las células endoteliales también segregan LIF, BDNF, y VEGF (vascular endotelial growth factor). VEGF estimula la proliferación de células precursoras y BDNF promueve la supervivencia de neuroblastos. Progenie de NSCs Estudios experimentales demostraron que la eliminación de las células progenitoras C y los neuroblastos A induce proliferación de las células B indicando que la progenie de las SCs puede liberar moléculas que regulan la auto-regeneración y el destino de NSCs. La liberación de GABA por los neuroblastos provee un mecanismo feedback que limita la auto-renovación de las células B activando receptores GABAA. La interacción de NSCs y su progenie puede proveer un mecanismo de homeostasis para la regulación de la neurogénesis de la SVZ. Neuronas Señales derivadas de neuronas maduras circundantes pueden activar la neurogénesis. GABA liberada por interneuronas puede facilitar la maduración de neuronas neoformadas. NMDA puede regular la supervivencia de nuevas neuronas. Otros neurotransmisores afectan la neurogénesis. La matriz extracelular La ECM y las moléculas asociadas son componentes del nicho celular que regulan las señales en el nicho almacenando y compartimentando factores de crecimiento y citoquinas requeridos para la proliferación y diferenciación. Un componente del nicho es una lámina basal. En la SVZ la lámina basal se extiende desde los macrófagos perivasculares como fractones. Cada fractón consiste en una base unida a los macrófagos perivasculares, un tallo que cruza la SVZ, y bulbos situados debajo de las células ependimales. La configuración arborizada de los fractones permite su interacción con todas las células de la SVZ. Los fractones pueden representar sitios donde factores de crecimiento y otras moléculas interactúan con SCs y progenitores para regular su proliferación, activación, y diferenciación. La lámina basal es rica en laminina y colágeno-1, concentra y/o modula citoquinas y ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 116 factores de crecimiento derivados de células locales. Otros componentes de la ECM que se encuentran en el nicho son proteoglicanos condroitín-sulfato y heparán-sulfato, tenascina-C, laminina y colágeno-1. Las SCs tienen receptores Integrinas que establecen asociaciones con ligandos de la ECM. LeX es un epitope que se encuentra en la superficie de SCs que capta factores de los vasos y otras células del nicho. LeX es producido por células neurales progenitoras y secretado en el nicho donde se une a factores como FGFs y Wnts. Señales aferentes a los nichos neurogénicos Señales extrínsecas originadas en el medio ambiente también regulan el mantenimiento y proliferación de la población de SCs y de progenitores locales hasta su final diferenciación. Señales originadas en el cerebro pueden alcanzar al nicho por distintas vías permitiendo a las células de la SVZ recibir información acerca del estado del organismo. Moléculas contenidas en el líquido céfalorraquídeo pueden entrar al nicho captadas por las células ependimales o por los procesos de las cálulas B. Los vasos sanguíneos son un componente importante del nicho SVZ y. moléculas circulantes en la sangre pueden ser acarreadas al nicho. Además, la lámina basal que cubre los vasos sanguíneos en la SVZ puede servir como una banda que conecta el cerebro con el nicho. Otra vía por la cual información periférica puede llegar a nicho es a través de la red de astrocitos unidos por uniones estrechas. Las aferencias nerviosas al nicho pueden afectar su actividad por medio de la secreción de neurotransmisores (Figura 12). Figura 12. Señales originadas en el cerebro son vehiculizadas al nicho neurogénico de la SVZ a través de varias vías. F=fantones. Modificado de Kazanis. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 117 Los componentes del nicho neurogénico que regulan las distintas etapas de la neurogénesis en el girus dentado son similares a los de la SVZ aunque con algunas diferencias. Mientras que las células de la SVZ se extienden a lo largo del ventrículo lateral, separadas del líquido céfalorraquideo por la capa de células ependimales, que aportan factores al nicho, las células de la SGZ, situadas entre el hilio y la capa de células granulares, no contienen células ependimales y no están en contacto con cavidades ventriculares. Ref. 5, 6, 16, 44, 98, 105, 143, 170, 182, 185, 197, 208, 221, 229. AUTO-RENOVACIÓN Y PROLIFERACIÓN Las NSCs se caracterizan por su auto-renovación y su potencialidad. La auto-renovación es el proceso por el cual las SCs se dividen para generar células hijas con potencialidades iguales a las de las células madre. La auto-renovación es necesaria para mantener la población de SCs lo que asegura que la neurogénesis continúe a través de la vida del organismo. Las NSCs tienen baja actividad proliferativa en las áreas neurogénicas dividiéndose una vez cada 2 semanas en la SVZ. Esta baja actividad proliferativa puede funcionar como mecanismo de protección para prevenir el agotamiento de las NSCs manteniendo los reservorios germinales y reduciendo el riesgo de acumular DNA dañado y mutaciones. Un aumento de la proliferación puede llevar a un prematuro agotamiento de las SCs. La división de las NSCs puede ocurrir en una división asimétrica generando dos diferentes células hijas o en una división simétrica. En la división asimétrica una de las células hijas retiene las propiedades de la célula madre y regresa a un estado de células de lenta división. La otra célula hija se diferencia en un precursor intermedio. La división simétrica puede generar dos células que se dividen lentamente o dos células de división rápida. La auto-renovación no se limita sólo a SCs ya que células precursoras también pueden auto-renovarse aunque el número de divisiones que pueden experimetar in vivo es más limitado. Auto-renovación no es lo mismo que proliferación. Proliferación es un proceso más general que comprende todo tipo de división celular mientras que la auto-renovación requiere que al menos una de sus células hija tenga una potencialidad de desarrollo similar al de la célula madre. La auto-renovación implica tanto la proliferación como el mantenimiento de un estado indiferenciado. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 118 Las células precursoras derivadas de la NSCs, también llamadas células amplificadoras transitorias, deben proliferar suficientemente antes que comience la diferenciación neuronal a fin de proveer al tejido neural de un número adecuado de células indiferenciadas antes de diferenciarse en progenitores restringidos a un sublinaje próximo a las células diferenciadas. Las células precursoras se dividen rápidamente pero el número de divisiones que pueden experimentar es limitado. La magnitud de su división permite regular el número de nuevas neuronas que se generan. Las células precursoras en la SVZ se dividen varias veces con un ciclo estimado en 12 horas mientras que en la SGZ se dividen pocas veces con un ciclo de unas 24 horas antes de diferenciarse en neuroblastos que luego de un limitado número de divisiones maduran en neuronas postmitóticas. La diferencia en la velocidad proliferativa también se refleja en el número de nuevas neuronas que se generan, estimándose en unas 30.000 por día en el bulbo olfatorio y de 9000 en el girus dentado del ratón adulto. Las células que se dividen son marcadas por BrdU cuando son expuestas a BrdU durante la fase S del ciclo celular. Las células marcadas por BrdU, que se identifican por inmunocitoquímica, pueden doble marcarse para varias proteínas para ser identificadas como células progenitoras, neuronas inmaduras o maduras, o glía. Control de la auto-renovación y proliferación Las NSCs interactúan con los nichos donde residen a través de programas intrínsecos y de señales extrínsecas. Los programas intrínsecos son un conjunto de factores expresados por SCs y progenitores que controlan las diferentes fases de la neurogénesis mientras que los factores extrínsecos son producidos por los tejidos circunvecinos que actúan sobre SCs y progenitores. Programas intrínsecos El mantenimiento de las NSCs en un estado indiferenciado y la generación de un precursor intermediario que puede progresar hacia una fase de diferenciación terminal dependen de un balance entre auto-renovación y diferenciación. La auto-renovación de las SCs puede ser regulada preferentemente por algunos mecanismos mientras que otros preferentemente regulan la proliferación de las células precursoras. Muchos de estos factores actúan a través las fases del ciclo celular. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 119 Entre los factores del ciclo celular que regulan la proliferación se encuentran Rb (retinoblastoma) y las proteínas relacionadas nectina y E2F. Rb y la familia de proteínas E2F se expresan a altos niveles en precursores neurales en la SGZ y la SVZ disminuyendo durante la diferenciación. Entre los factores reguladores del ciclo celular se encuentran p16INK4, p21 cip1 y p53 que inhiben la progresión de las SCs a través de la fase G 1 del ciclo celular y su supresión incrementa la auto-renovación de NCSs. Por el contrario la pérdida de p27 Kip1 aumenta la proliferación de progenitores sin afectar a las SCs (ver página 19). FGF-2 (fibroblast growth factor-2) y EGF (epidermal growth factor), producidos por astrocitos, inducen la proliferación de NSCs que expresan receptores para estos factores en la SVZ. La falta tanto de los ligandos como de los receptores da lugar a la reducción de la neurogénesis. La actividad proliferativa de las NSCs adultas puede ser controlada por señales derivadas de sus progenitores. Las SCs expresan receptores para TGF-β y TGF-β detiene la proliferación de las SCs y de las células progenitoras de la SVZ y la SGZ del adulto. Este efecto negativo de TGF-β es mediado por el aumento del inhibidor de CDK p21 cip1. TGF-β reduce la proliferación sin afectar a la diferenciación. Efrina-A2 y su receptor EphA7 se expresan en células de la SVZ del cerebro adulto y regulan negativamente la proliferación de progenitores neurales. Esta regulación negativa de la proliferación es mediada por señales bidireccionales a través de efrinaA2 en células tipo C y tipo A y del receptor EphA7 en células B y del epéndimo. Inhibiendo la interacción de efrina con su receptor se incrementa la proliferación celular de progenitores y la neurogénesis. También efrina B3 actúa como inhibidor de la proliferación y de la apoptosis. Por el contrario, la infusión de EphB2 o efrina-B2 en los ventrículos laterales aumentó la proliferación de células B en la SVZ del adulto. Efrina-B y sus receptores EphB son expresados por células de la SVZ y efrina-B se localiza en células B. Sonic hedgehog (SHH) es una glicoproteína que actúa a través del complejo receptor Patched1-Smoothened (ver Apartado 3). SHH regula la proliferación de las células tipo B y tipo C en la SVZ. También afecta la proliferación de células progenitoras en la SGZ las que expresan receptores SHH. La administración de SHH aumenta la auto-renovación de NSCs y la proliferación de células progenitoras y su inhibición las disminuye. SHH puede inducir la proliferación de células progenitoras activando varias vías intracelulares. Cilia es una proteína de los microtúbulos de las NSCs que desempeña un rol importante en las ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 120 señales SHH. Alteraciones de la estructura de cilia disminuyen la proliferación de NSCs en respuesta a SHH. El factor de transcripción Gli es un efector de SHH y su activación puede regular el ciclo celular estimulando la producción de ciclinas D y E. SHH también inhibe al inhibidor p21 liberando a la ciclina B y permitiendo la progresión del ciclo celular de la fase G2 a M. BMPs son reguladores negativos que reducen el número de células precursoras y su proliferación. BMP4 es uno de los principales miembros de la familia BMP en el nicho neurogénico adulto. En el hipocampo las NSCs tienen receptores BMPR-IA a los que se une BMP para disminuir su proliferación manteniéndolas en un estado indiferenciado. La inhibición de las señales BMP por el inhibidor Noggin incrementa la proliferación de las NSCs (Figura 13). En la SVZ, BMP reduce la proliferación de células precursoras y la producción de neuroblastos mientras que induce la diferenciación de células gliales. Noggin, secretado por las células ependimales, inhibe la acción de BMP manteniendo el conjunto de NSCs y el número de progenitores neurales en la SVZ. Las NSCs del hipocampo y de la SVZ del adulto se encuentran en la proximidad de vasos sanguíneos. Las células endoteliales de los vasos secretan factores solubles que estimulan la proliferación de las NSCs y de su progenie e inhiben su diferenciación. Las células endoteliales pueden incrementar la auto-renovación estimulando señales inducidas por PEDF (pigment epitheliumderived factor). PEDF es un factor secretado por células endoteliales y ependimales de la SVZ que estimula la auto-renovación de las células B manteniéndolas en un estado indiferenciado. Su infusión intraventricular in vivo incrementa la división simétrica de las células B aumentando su número. PEDF aumenta la expresión de Hes1 y Hes5 y del factor de transcripción Sox2 que inhiben la acción de los factores proneurales bHLH. VEGF (vascular endotelial growth factor) son una familia de glicoproteínas inducida por células en hipoxia. VEGF se une a receptores en la superficie de células incluido neuronas. Los receptores tienen una porción extracelular, que consiste en siete dominios Ig similes, una sola región de transmembrana y una porción intracelular que contiene un dominio tirosina quinasa. La unión del ligando produce la dimerización del receptor que se activa por transfosforilación. VEGF estimula el crecimiento de nuevos vasos y la proliferación de células precursoras de la SVZ y SGZ de roedores tanto in vitro como in vivo. El efecto neuroproliferativo de VEFG está asociado a un incremento de las ciclinas D y E y de los factores de transcripción E2F mediado por la vía Raf-Erk y la transcrición de genes. La molécula de adherencia NCAM es una de las moléculas de ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 121 Figura 13. Factores del nicho que inducen inhibición (caracteres normales) o activación (caracteres cursivos) de la auto-renovación de NSCs. la matriz extracelular. En cultivos de células progenitoras dehipocampo el agregado de NCAM reduce su proliferación e induce la diferenciación a un linaje neuronal en presencia de bFGF. Otra molécula de adherencia expresada en células progenitoras de la SVZ y SGZ es mCD24. mCD24 mantiene a las células progenitoras en reposo y su proliferación aumenta en ratones que carecen mCD24. Galectina-1, una lectinas de la ECM que se une a ciertas estructuras de carbohidratos, es un factor que estimula la proliferación de SCs y células progenitoras. Wnt3 es expresado por astrocitos en el hipocampo y sus receptores se encuentran en las NSCs. El aumento de la expresión de Wnt3 incrementa la neurogénesis en el hipocampo adulto y el bloqueo de su actividad la reduce. Su acción en la SVZ es menos conocida aunque puede promover la proliferación en cultivos de NSCs derivadas de la SVZ. Señales de grandes proteínas pueden regular la proliferación. En la SVZ la proteína precursora de amilode se une a las células progenitoras que expresan el receptor EGF. Tanto in vitro como in vivo la proteina precursora de amiloide aumenta la proliferación de células progenitoras que expresan el receptor EGF. Factores de transcripción El mantenimiento de las NSCs en un estado indiferenciado depende de factores reguladores de la transcripción entre los cuales Sox2 y Tlx tienen papeles relevantes. Reguladores de la estructura de la cromatina, que suprimen la expresión de genes de diferenciación, están igualmente involucrados. Tlx es un factor de transcripción, miembro de la superfamilia de receptores nucleares, expresado en NSCs en la SVZ y el girus ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 122 dentado del hipocampo. Tlx actúa a través de sus genes destinatarios p21 y pten que regulan la progresión del ciclo celular inhibiendo ciclinas. Recluta histona deacetilasas (HDACs) a los promotores de los genes p21 y pten para reprimir su expresión y mantener a las NSCs en un estado indiferenciado y auto-renovable (Figura 14). En animales deficientes en Tlx disminuye la auto-renovación de las NSCs de la SVZ. Tlx forma un circuito regulador negativo con miR-9. miR-9 suprime la expresión de Tlx en NSCs y Tlx reprime la expresión de miR-9. Pten es una proteína con actividad de fosfatasa implicada en la regulación del ciclo celular a través de la supresión de ciclinas previniendo el crecimiento y división celular. Pten es un regulador negativo de la auto-renovación y la neurogénesis y su supresión incrementa la auto-renovación de NSCs. Sox2 es un factor de transcripción expresado en NSCs de la SVZ y la SGZ implicado en la proliferación y mantenimiento de las características de NSCs inhibiendo la diferenciación. Su inhibición promueve una prematura diferenciación de precursores. En ratones con mutantes de Sox2 disminuye la proliferación de las células progenitoras y la capacidad de las progenies de diferenciarse en neuronas. Sox2 es regulado por señales SHH a través del efector Gli2. La sobreexpresión de Sox2 en progenitores neurales incrementa Notch1 y su efector Hes5 (Figura 15). Los componentes de la vía Notch son expresados en las zonas germinales y las señales Notch son activadas en las células B de la SVZ y las células tipo-1 de la SGZ. Notch se une a sus receptores Delta1 y Jagged1 activando una serie de eventos celulares que conducen a la expresión de los genes Hes1 y Hes5 (ver página 29). Hes1 y Hes5 son efectores de Notch que se expresan en NSCs a las que mantienen en estado indiferenciado y previenen su diferenciación. Los genes Hes regulan la auto-renovación de NSCs reprimiendo la activacion de los genes proneurales. En ratones con mutaciones de Hes1 y Hes5 se incrementa la proliferación y los progenitores neurales se diferencian prematuramente. Figura 14. TLX mantiene la proliferación de NSCs vía represión de los genes PTEN y p21 ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 123 Pax6 es un factor de transcripción expresado en la SGZ en células tipo-1 y que persiste en progenitores tipo2 pero su expresión disminuye drásticamente con la diferenciación y en neuronas maduras. Las células Pax6+ frecuentemente co-expresan GFAB y a veces PSA-NCAM y nestina. Pax6 estaría implicado en regular el desarrollo de las células tipo-1 y su falta en ratones disminuye las células GFAB+ y las que persisten presentan reducida proliferación. Las células C que expresan Mash1 en el sistema SVZ/bulbo olfatorio son Pax6 +. Después de la expresión de Pax6 por progenitores en una temprana onda disminuyen en los neuroblastos migratorios marcados por PSA-NCAM o DCX pero se mantienen en un grupo de estos. En el bulbo olfatorio sólo un grupo de neuronas maduras expresan Pax6, células Pax6 + se encuentran en la capa glomerular particularmente en neuronas dopaminérgicas periglomerulares. Pax6 sería necesario para la producción de neuronas de linaje dopaminérgico. Emx2 es un factor de transcripción expresado en progenitores neurales de regiones neurogénicas del cerebro adulto que actúa como regulador negativo de la proliferación de NSCs de la SVZ. Factores externos Señales provenientes del medio ambiente modulan la neurogénesis. Neurotransmisores. Las NSCs y las células progenitoras de la SVZ expresan receptores GABAA. Estos receptores son activados por GABA ambiental liberado por neuroblastos. La eliminación de los neuroblastos en la SVZ estimula la proliferación de las células B sugiriendo que los neuroblastos proveen una señal negativa para el control de la proliferación de células B. Los neuroblastos se comunican con las células B por medio de la liberación de GABA que activa receptores GABAA y limita su progresión a través del ciclo celular. Cuando el número de neuroblastos aumenta se genera más GABA que actúa como feedback negativo para disminuir la proliferación de células B y asegurar que se genere un número adecuado de nuevas NSCs y sus descendientes Las células progenitoras de la SGZ también expresan receptores AMPA y NMDA. La principal vía aferente glutamatérgica al girus dentado se origina en la corteza entorrinal y tiene una acción inhibidora de la proliferación celular. Este efecto se ejerce a través de receptores NMDA. Por el contrario, el bloqueo de los ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 124 NMDARs por un antagonista produjo un incremento del número de células nacidas en el girus dentado. Glutamato también inhibe la diferenciación de las células granulares. Por el contrario la activación de receptores AMPA incrementó la proliferación celular. La activación colinérgica y adrenérgica en el hipocampo facilita la neurogénesis. Serotonina incrementa la proliferación celular y la diferenciación de células progenitoras en la SVZ y la SGZ del adulto mediada por receptores 5HT1A. En el girus dentado axones serotoninérgicos del núcleo rafe dorsal terminan en la capa molecular mientras que las del rafe medial proyectan al hilio. Dopamina actuando a través de receptores D2 incrementa la proliferación aunque respuestas inhibidoras también han sido señaladas. Progenitores de la SVZ que expresan receptores D2 proliferan en respuesta a la estimulación de dopamina. La SVZ recibe inervacion dopaminérgica de la sustancia nigra y suprimiendo estas aferencias la proliferación disminuye. El incremento de la proliferación celular y neurogénesis en la SVZ inducido por dopamina es CNTF dependiente. El óxido nítrico incrementa la proliferación y migración en la SVZ y en el girus dentado aunque disminución de la proliferación también ha sido señalada. Factores de crecimiento . Las NSCs expresan los receptores p75 y TrkB para neurotrofinas. La supresión de receptores TrkB de las NScs y sus descendientes en la SGZ de ratones no alteró la neurogénesis pero estos ratones fueron incapaces de aumentar la neurogénesis en respuesta a la administración de antidepresores. Factores de crecimiento como BDNF o CNTF (ciliary neurotrophic factor) infundidos intraventricularmente aumentaron la proliferación en la SVZ. LIF (leucemia inhibiting factor), inyectado en los ventrículos laterales de ratones adultos, promueve la auto-renovación de NSCs expandiendo su población por división simétrica y reduce la proliferación y la neurogénesis en la SVZ. Otros factores como Figura 15. Cascada de moléculas implicada en la regulación de NSCs mediada por Sox2 ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 125 HB-EGF (heparin-binding EGF) aumentan la proliferación en la SGZ o la SVZ o en ambas cuando se administran en los ventrículos. Hormonas . Estrógeno ha sido implicado en la función del hipocampo. La proliferación en el hipocampo incrementa durante el proestro en roedores. La proliferación celular en la zona subgranular del girus dentado incrementa por la inyección de estrógenos y disminuye en animales ovariectomizados. Este efecto es mediado por serotonina. Estimulando la producción de serotonina por administración de 5-hidroxitriptofano se restablece la proliferación celular disminuida por ovariectomía mientras que estradiol es incapaz de revertir los cambios en ratas ovariectomizadas tratadas con inhibidores de la síntesis de serotonina. Sin embargo, la exposición crónica a estradiol (después de 48 horas) suprime la proliferación en el hipocampo de ratas hembras adultas. Este efecto es mediado en parte por esteroides adrenales. La administración prolongada de estradiol también suprime la supervivencia celular en ratas hembras. Testosterona aumenta la supervivencia pero no la proliferación de células del DG en ratas machos mientras que la castración la disminuye. Prolactina, a diferencia de estrógeno, estimula la proliferación de células progenitoras en la SVZ y este efecto es coincidente con el incremento de la neurogénesis durante el embarazo. Los glucocorticoides inhiben la neurogénesis suprimiendo la proliferación celular en la SGZ del hipocampo. La adrenalectomía aumenta la proliferación celular en la SGZ. La falta de receptores de esteroides adrenales en los precursores de células granulares en esta zona sugiere que el efecto de glucocorticoides es por vía indirecta. Dehidroxiepiandrosterona (DHEA) y pregnanolona infundidas icv incrementan la proliferación celular en la SGZ (Figura16). La proliferación en la SVZ requiere de hormona tiroidea y en su ausencia la población de NSCs disminuye. La hormona tiroidea actúa a través del receptor TRα1. Influencias ambientales . El embarazo produce incremento de la proliferación y neurogénesis en la SVZ mediado por el aumento de los niveles de prolactina. Una variedad de estímulos fisiológicos y patológicos regulan la proliferación celular en la SVZ y la SGZ. Un aumento de la proliferación en la SVZ se produce por convulsiones prolongadas. En accidentes cerebrovasculares los neuroblastos de la SVZ miERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 126 gran al área del infarto en asociación con vasos sanguíneos atraídos por la producción de factores vasculares. La actividad física y el tratamiento con antidepresivos aumentan la proliferación en la SGZ mientras que el stress es un inhibidor de la proliferación de progenitores en el girus dentado. Propiedades electrofisiológicas de las NSCs y progenitores Las NSCs expresan canales de K+ independientes de voltaje. Por el contrario carecen de canales de Na+ dependientes de voltaje por lo que no son eléctricamente excitables. Las células progenitoras, comienzan a a perder los canales K + y a expresar receptores GABAA. y son eléctricamente excitables Ref. 7, 20, 22, 29, 49, 56, 58, 61, 62, 69, 79, 82, 89, 92, 103, 115, 123, 130, 132, 136, 137, 138, 145, 155, 158, 174, 190, 192, 195, 212, 221, 224, 225, 246. Control epigenético La neurogénesis del adulto es también controlada, en varios de sus aspectos, por mecanismos moleculares que involucran la regulación epigenética de genes. Los mecanismos epigenéticos se refieren a cualquier influencia heredada que afecta la función de cromosomas o de genes no acompañada por cambios en la secuencia del DNA. Incluyen procesos como la metilación de DNA, modificación de histonas, y expresión de RNA no codificante. Estas modificaciones epigenéticas aseguran la activación de genes apropiados en cada etapa de la neurogénesis. Remodelación de la cromatina La remodelación de la cromatina es uno de los mecanismos Figura 16. Factores implicados en la proliferación celular en el girus dentado y en la SVZ. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 127 fundamentales que regula la expresión de genes durante la neurogénesis. La cromatina es una larga fibra empaquetada en el núcleo que consiste en repetidos nucleosomas. El nucleosoma es una estructura formada por un núcleo alrededor del cual se encuentra arrollada una fibra de DNA. El núcleo es un octámero que contiene dos copias de cada una de las histonas H2A, H2B, H3, y H4. El DNA, que está enrollado dos vuelta alrededor del núcleo, contiene unos 146 pares de bases. El DNA de cada nucleosoma está unido al DNA del nucleosoma siguiente por un segmento de 8 a 114 pares de bases. Cada proteína histona contiene terminales de unos 20-40 restos con varios grupos de lisinas con carga positiva, que se extienden desde sus dominios globulares. Estos terminales interactúan con los fosfatos del DNA del mismo nucleosoma, con el DNA de unión, o con nucleosomas vecinos. Los principales mecanismos de remodelación de la cromatina incluyen, acetilación y metilación de histonas, metilación de DNA y pequeñas moléculas RNAs no codificantes Acetilación y metilación de histonas Las histonas pueden ser modificadas posttraducción alterando la estructura de la cromatina. Las colas terminales de las histonas pueden ser modificadas por acetilación, metilación, o fosforilación. La acetilación o la metilación de los grupos amino libres de las lisinas neutraliza sus cargas positivas disminuyendo la afinidad por el DNA. La metilación también ocurre en arginina e histidina. La fosforilación tiene lugar en grupos hidroxilo de serina e histidina. La cromatina se activa por acetilación de la histona H3 en las lisinas 9 y 14, por metilación en la lisina 4, 36, y 79 y por fosforilación en la serina 10 y se inactiva por metilación en las lisinas 9 y 27. La histona H4 está acetilada en la lisina 9 y metilada en la lisina 3 en la cromatina activada y en la lisina 20 en la cromatina inactivada (Figura 17). A diferencia de la acetilación de histonas, que ocurre en forma reversible y dinámica, la regulación epigenética por metilación de histonas es más estable. Los niveles de acetilación están determinados por la actividad de las enzimas histona acetiltransferasas (HATs) e histona desacetilasas (HDACs). HATs convierten la cromatina en una estructura relajada de los nucleosomas (eucromatina), por la disminución de la afinidad de las histonas con el DNA, permitiendo el acceso de factores de transcripción al DNA y la activación de genes. Por el contrario, HDACs inducen la formación de formas compactas de nucleosomas (heterocromatina) que previenen el ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 128 acceso de los factores de transcripción dando lugar a la represión transcripcional (Figura 18). La represión de la transcripción de genes inducida por la HDAC es inhibida por el ácido valproico que estimula la diferenciación de células progenitoras en neuronas y suprime la diferenciación glial. La metilación se regula por histona metiltransferasas (HMTs) y demetilasas. La actividad de estas enzimas está asociada a coactivadores y co-represores formando complejos multiproteicos. La metilación de la histona 3 en las lisinas K4, K36, y K79 activa la transcripción mientras que la metilación de H3 en las lisinas K9 y K27 así como en la lisina K20 de H4 se asocia al silenciamiento de la transcrpción (Figura 17). El represor REST Para establecer las alteraciones epigenéticas, diferentes modificadores de la cromatina son reclutados a sitios específicos del genoma por proteínas de unión al DNA. REST/NRSF (RE1 silencing transcription factor) es una proteína requerida para coordinar diferentes mecanismos epigenéticos que inactivan genes neuronales. Tiene tres dominios, un dominio de unión a DNA (BD) que contiene ocho motivos dedos zinc y dos dominios represores (RD) situados en los N- y Cterminales. REST/NRSF se une por su BD a RE1 (repressor element 1) o NRSE (neuron-restrictive silencer element), un motivo conservado de 21-23 pares de bases del DNA contenido en la región reguladora de numerosos genes neuronales. REST/NRSF reprime la expresión de genes con la secuencia RE1 a través de la asociación por su dominio represor N-terminal con mSin3 Figura 17. Moléculas modificadoras de histonas. Las histonas H3 están metiladas (Me) en las lisinas (K) 4, 9, 27, 36, y 79, acetiladas (Ac) en las lisinas 9 y 14, y fosforiladas (P) en la serina (S)10. Las histonas H4 están metiladas en las lisinas 3 y 20 y acetiladas en la lisina 9. Estas moléculas activan (arriba) o reprimen (abajo) la transcripción ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 129 Figura18. Transformación de la estructura de la cromatina en una forma compacta por acción de la HDAC a una forma relajada por acción de la HAT. que recluta HDACs y por su dominio represor C-terminal con el corepresor CoREST haciendo complejo con HDACs (Figura 19). Co-REST puede asociar otras moléculas, como la proteína MeCP2, que participan en silenciar genes. REST/NRSF se expresa en neuronas indiferenciadas y disminuye con la diferenciación. Las proteínas policomb Las proteínas del grupo policomb (PcG) son una amplia familia de proteínas asociadas a cromatina que regulan epigenéticamente la pluripotencialidad y auto-renovación de SCs. Las proteínas PcG forman grandes complejos multiméricos, los complejos Policomb1 (PRC1) y 2 (PRC2). Estos complejos reprimen la transcripción de genes regulando la estructura de la cromatina a través de la modificación de las colas de histonas. El complejo PRC2 tiene actividad histona metiltransferasa y cataliza la trimetilación de la lisina 27 de la H3 (H3K27me3) a través de las unidades enzimáticas EZH1 y EZH2. H3K27me3 puede reclutar al complejo PRC1 que tiene una proteína que se une a H3K27me3. PRC1 es responsable de introducir una molécula de ubicuitina en la lisina 119 de la histona H2A vía las ligasas Figura 19. Representación esquemática de la proteína Rest y su represión de la expresión de genes por unión al motivo RE1 del DNA. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 130 RING1A y RING1B. Algunos complejos PRC1 pueden regular la expresión de genes compactando a la cromatina de manera independiente de su actividad enzimática (Figura 20). Por el contrario, la unión de la proteína Trithorax (TrxG), una metiltransferasa que trimetila la H3K4, contrarresta la represión de PcG y mantiene el balance entre la represión y la transcripción. La metilación inducida por PrG y TrxG puede ser removida por demetilasas. Metilación de DNA El par de bases G:C del DNA puede ser modificado por el agregado de un grupo metilo a la citosina en posición 5. La mayoría de las citosinas metiladas se encuentra en el par de bases con la estructura 5´ mC p G 3´ 3´ G p Cm 5´ La distribución del dinucléotido CpG es despareja, con numerosos segmentos de DNA que contienen mayores concentraciones. Estos segmentos, llamados islas CpG, se encuentran más cerca de los sitios de transcripción y su metilación suprime la expresión de genes. La metilación del DNA es catalizada por DNA metiltransferasas (Dnmts), que se encuentran en células precursoras, neuronas, y células gliales, de las que se conocen tres tipos (Dnmt1-3) en mamíferos. Dnmt3a y Dnmt3b están implicadas en la de novo metilación de DNA no metilada mientras que Dnmt1 preferentemente reconoce los DNA hemimetilados y metila la hebra no metilada. La principal función de la metilación del DNA es servir como represor de la transcripción manteniendo Figura 20. Complejos multiméricos formados por las proteínas Policomb y Tricothorax. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 131 silenciados los genes. El efecto represor de los dinucleótidos CpG metilados es mediado por la unión a una familia de proteínas específicas que contienen el dominio MBD (metil-binding domain) formando complejos de las cuales MeCP2 es el prototipo. Esta proteína consiste en dos dominios funcionales: el dominio MBD de unión a CpG metilado y el dominio TRD de represión de la transcripción que interactúa con varios complejos co-represores como HDAC y mSin3 (Figura 21). MeCP2 es expresada en neuronas maduras del cerebro adulto suprimiendo la expresión de genes de astrocitos. Su falta en ratones no afecta la proliferación y diferenciación de las NSCs en la SGZ pero compromete la maduración y sinaptogénesis de neuronas granulares neoformadas. Las pequeñas RNAs no codificantes (miRNA) A partir de un RNA largo de doble hebra (dsRNA, double strand RNA) se generan microRNA precursores de unos 70 nucleótidos llamados pre-miRNA. Esta reacción tiene lugar en el núcleo por la RNasaIII Drosha. Las pre-miRNA son translocadas al citoplasma donde son procesadas por la enzima RNasaIII Dicer, por un proceso ATP dependiente, generando siRNAs (small interfering RNAs). siRNAs son pequeñas moléculas de RNA de doble hebra de 20-21 nucleótidos. siRNAs se incorporan al complejo RISC (RNA-induced silenceing complex) formado por varias proteínas. El complejo RISC se activa a partir de una forma latente, por la separación de las dos hebras de los siRNAs. Las dos hebras de siRNA son separadas de una manera ATP dependiente formando microRNA (miRNA). miRNAs son pequeñas moléculas no codificantes de una sola hebra de RNA de 20-21 nucleótidos que funcionan como reguladores negativos de la expresión de genes. RISC activado utiliza la hebra antisentido de siRNA como guía para seleccionar el mRNA complementario de la hebra siRNA presente en el complejo. Un miRNA reconoce el mRNA complementario a través de un segmento de 6 nucleótidos en su Figura 21. DNA metilado reprime la transcripción de genes mediado por un complejo formado por la proteína MeCP2 y varios co-represores. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 132 extremo 5´ que se une a su equivalente en la región 3´ del mRNA. El complejo RISC contiene diferentes factores de los cuales el componente activo es una proteína de la familia de endonucleasas llamada Argonauta que corta la hebra del mRNA complementaria al siRNA asociado a RISC en dos mitades. Las dos mitades del mRNA son después degradadas por la maquinaria celular lo que conduce a la supresión de la expresión del gen (Figura 22). Otro mecanismo por el cual miRNA media la regulación de genes es a través de la represión de la traducción en proteínas. Las miRNAs se caracterizan por presentar la secuencia NRSE similar al sitio NRSE de unión a DNA. Esta secuencia es reconocida por la proteína REST/NRSF a la que se une desplazando las proteínas represoras HDACs, MBD1 y MeCP2 con lo que cambia la cromatina del estado de represión a un estado activado asociado a HATs. Mecanismos epigenéticos involucrados en la auto-renovación y el mantenimiento de NSCs La proteína Bmi1 del complejo policomb regula la autorenovación de las SCs y su mantenimiento en la SVZ. Este efecto es mediado por la represión de p16Ink4a y p19Arf, inhibidores de la proliferación celular (ver página 22). La supresión de Bmi1 en ratones disminuye las NSCs de la SVZ. El mantenimiento de la auto-renovación podría hacerse silenciando genes requeridos para la diferenciación neuronal a través de la metilación de H3K27 por el complejo PcG. En la SGZ la proteína MBD1 es un regulador específico de las SCs. MBD1, expresada en NSCs actuaría silenciando genes necesarios para la diferenciación neuronal, su falta en ratones reduce la neurogénesis en el hipocampo. MBD1 se une al promotor de genes que codifican a Fgf2, un regulador de la expresión de progenitores neurales en la SGZ. MeCP2 es también un regulador de la expresión de genes en el sistema nervioso. Su supresión en ratones resulta en déficit de la maduración neuronal y la formación de espinas en el girus dentado. Uno de los destinatarios de MeCP2 es BDNF. Mecanismos epigenéticos que regulan la diferenciación de NSCs Mll1 (mixed-lineage leukemia 1), una histona metiltransferasa miembro del complejo TrxG expresada específicamente en celulas de la SVZ, es necesaria para la diferenciación neuronal de ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 133 Figura 22. Vías involucradas en la formación y acción de miRNA. NSCs. En su ausencia las NSCs de la SVZ sobreviven, proliferan y se diferencian en células gliales pero la diferenciación neuronal se perturba. En células deficientes en Mll1 Mash1 y Olig están presentes pero Dlx2 no se manifiesta. El gen Dlx2 es un destinatario de Mll1 en células subventriculares. Uniéndose a su promotor promueve el reclutamiento de una H3K27 demetilasa para silenciar sitios de NSCs para la inducción de neurogénesis pero no de gliogénesis. En la SGZ la inactivación de HDAC induce a las células progenitoras a diferenciarse en neuronas un efecto mediado en parte por el factor NeuroD. En las NSCs de la SGZ HDAC silencia la expresión de factores de transcripción como NeuroD1 y de reguladores del ciclo celular como p21 y pten. Muchos miembros de la familia miRNA regulan la neurogénesis en adultos de los cuales miR-124 y miR-9 son los mejores estudiados. En la SVZ, miR-124 se encuentra en neuroblastos y neuronas maduras pero no en células B y C. miR-124 promueve la diferenciación neuronal, su supresión mantiene a las células de la SVZ como precursores disminuyendo el número de neuronas postmitóticas mientras que su expresión ectópica promueve precozmente la diferenciación neuronal. La acción de miR-124 se ejerce a través de la represión de Sox9 asegurando la progresión del linaje de SCs a neuronas. La expresión de miR-124 es supriERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 134 mida por REST-NRSF, que es expresada en progenitores neurales pero no en neuronas, permitiendo la expresión de genes no neurales en las células progenitoras. Cuando los progenitores se diferencian en neuronas REST se disocia de los genes miR-124 y miR-124 liberada induce la degradación de los genes no neurales. miR-9 desempeña un importante papel en la proliferacion y diferenciación de NSCs. Estos efectos de miR-9 se ejercen a través de la represión de la expresión de TLX. A su vez, TLX inhibe los genes miR-9 creando un circuito de regulación negativa entre ambos. TLX es expresado a altos niveles en las NSCs para disminuir durante la diferenciación mientras que miR-9 se acumula permitiendo la expresión de genes neuronales. Ref. 9, 12, 13, 28, 34, 60, 84, 90, 91, 135, 142, 164, 178, 180, 190, 198, 201, 206, 207, 213, 223, 224, 238, 242, 249. MIGRACIÓN Neuroblastos de la SVZ Más de 30.000 neuroblastos migran diariamente de la SVZ a los bulbos olfatorios por un complejo sistema de vías que convergen en una vía, conocida como corriente migratoria rostral (RMS, rostral migratory stream). Los neuroblastos forman cadenas que migran tangencialmente a través de una estructura tubular formada por astrocitos especializados que secretan factores que favorecen la migración y proveen soporte trófico a las células migratorias. Además, estos tubos pueden evitar que los neuroblastos escapen prematuramente de la ruta normal (Figura 23). Después de alcanzar la mitad del bulbo olfatorio los neuroblastos se desprenden de estas cadenas, migran radialmente integrándose a las células granulares, situadas en las capas más profundas del bulbo olfatorio, y a las neuronas periglomerulares, situadas en las capas más superficiales. Estas células hacen contacto con neuronas olfatorias del bulbo olfatorio modulando su información sensorial. Los vasos sanguíneos pueden servir de soporte para la migración radial en el bulbo olfatorio. Señales que guían la migración en la RMS La migración de los neuroblastos hacia los bulbos olfatorios es regulada por numerosos factores que influencian su velocidad y dirección. Estos factores comprenden agentes repulsivos y atrayentes, contacto entre células, adherencias a la matriz extracelular, e influencias del tubo envolvente y de los vasos sanguíneos. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 135 Figura 23. Neuroblastos originados en la SVZ migran tangencialmente a través de la corriente migratoria rostral (RMS) para integrarse a las células granulares y periglomerulares del bulbo olfatorio. La iniciación de la migración de los neuroblastos hacia losbulbos olfatorios depende del balance entre señales repelentes y atrayentes originadas en el nicho de la SVZ. Las proteínas SLIT, que actúan como señales repelentes, se expresan en los plexos coroideos de los ventrículos laterales y en el septum. Por su parte, las proteínas Robo, que son los receptores de SLIT, son expresadas por neuroblastos. Las células ependimales que bordean los ventrículos laterales pueden ser fundamentales en comunicar gradientes de SLIT del líquido céfalorraquideo con los neuroblastos. SLIT repele neuroblastos en las SVZ y la RMS. En su ausencia en ratones las cadenas de neuroblastos migratorios están presentes pero dirigidas al cuerpo calloso señalando que el sistema SLIT/Robo es necesario para determinar su orientación. La actividad de SLIT es modulada por el cofactor MIA (migration-inducing activity) que se expresa en células gliales. Además la interacción SLIT/Robo necesita de heparán-sultato para su estabilización. Netrina-1 secretada por los bulbos olfatorios, actuando a través de su receptor DDC expresado en neuroblastos, puede tener algún efecto atrayente aunque escaso. El receptor ErbB4 es expresado en neuroblastos en la RMS y activado por neuregulinas. La activación de ErbB4 es necesaria para la orientación de los neuroblastos hacia el bulbo olfatorio. En ausencia de ErbB4 los neuroblastos migran más lentamente y presentan déficit en su orientación. Los neuroblastos también tienen una capacidad intrínseca para migrar. Los neuroblastos sufren cambios morfológicos durante el proceso de migración que se inicia por la formación y estabilización de un proceso conductor en dirección a la migración seguido por el movimiento del centrosoma hacia el proceso conductor. Luego el núcleo se mueve hacia el centrosoma por acción de la red de microtúbulos asociados. La miosinaII que se acumula ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 136 en la parte posterior del cuerpo celular empuja al núcleo hacia delante. El último paso es la retracción del proceso posterior hacia la posición del cuerpo celular. La migración resulta de la repetición sucesiva de estos eventos. El mantenimiento de la migración de los neuroblastos requiere la interacción entre ellos. Los neuroblastos migran desplazándose a los largo de otros neuroblastos. Este desplazamiento depende de la presencia de PSA-NCAM en la superficie de los neuroblastos migratorios que establecen interacciones homofílicas entre proteínas NCAM y promueven la adherencia entre neuroblastos próximos. La pérdida de NCAM se traduce en alteraciones de las cadenas migratorias, disminución de la migración, y bulbos olfatorios más pequeños. Las proteínas de la matriz extracelular son importantes para la migración. Las metaloproteasas de la matriz, expresadas en la RMS, son necesarias para la migración y su actividad podría estar relacionada a la formación de cadenas. Los neuroblastos migratorios también expresan integrina-α6β1 que interacciona con laminina de la matriz extracelular para guiar la migración. Integrina-β1 y laminina promueven la formación de cadenas celulares. El bloqueo de las señales integrina altera las cadenas y promueve la dispersión de las células migratorias. ADAM2 es una proteína de membrana expresada en neuroblastos de la RMS. En su ausencia en ratones se inhibe la migración y los bulbos olfatorios son más chicos. La estructura tubular formada por astrocitos, que encapsula a las cadenas de neuroblastos, puede regular la velocidad migratoria a través de la regulación de los niveles GABA del ambiente. Los astrocitos captan GABA del ambiente regulando su concentración, un mecanismo por el cual la envoltura glial puede participar del control de la migración. Los neuroblastos expresan receptores GABAA y las señales GABA tienen un efecto negativo en la migración de neuroblastos. Los astrocitos son también fuentes de factores como Netrina y VEGF que modulan la migración. Deficiencias en las señales del receptor VEGFG-1 inducen alteraciones en la migración. Cuando los neuroblastos llegan al bulbo olfatorio se desprenden de las cadenas y migran radialmente a su posición final en la capa de células. Los neuroblastos que migran radialmente comienzan a expresar receptores NMDA. El receptor ErbB4 que interactúa con los ligandos neuregulinas está implicado en el cambio de la migración tangencial de los neuroblastos a la migración radial y su ausencia en ratones da lugar a la acumulación de células en la capa subependimal del bulbo olfatorio. Tenascina-R y Reelin son moléculas importantes en el cambio de la ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 137 migración tangencial a migración radial. Tenascina-R actúa como una señal atrayente de los neuroblastos al bulbo olfatorio. Reelin, expresada por células mitrales del bulbo olfatorio, se une a receptores ApoER2 expresados en neuroblastos y actúa como señal de desprendimiento de neuroblastos de las cadenas. Pax6 es un factor de transcripción que determina la decisión de las células para detenerse en la capa granular o proseguir hacia la capa glomerular. Neuronas del girus dentado En el girus dentado del hipocampo las neuronas neoformadas migran radialmente una corta distancia desde la SGZ a la capa de células granulares. La migración tiene lugar en estrecha asociación con los procesos glía radiales de las SCs que actúan como soporte. Además, las últimas neuronas generadas pueden actuar mecanicamente para desplazar a las neuronas generadas previamente. Las células neoformadas migran posicionándose en el tercio interno de la capa de células granulares aunque algunas pueden llegar a la capa media pero sin alcanzar a la capa externa que permanece sin modificarse. Como consecuencia, las regiones internas de la capa de células granulares son estructuralmente dinámicas mientras que las regiones externas permanecen estables conteniendo neuronas maduras generadas durante el desarrollo. La proteína DISC1 (Disrupted-in-schizophrenia) es necesaria para la migración de neuronas neogeneradas en la SGZ y su falta da lugar a la migración celular en la capa granular o aún en la capa molecular del girus dentado. La expresión de DISC1 es regulada por señales del receptor NMDA. El receptor NMDA es importante para la adecuada migración y posición de neuronas neoformadas en el girus dentado. Antagonistas del receptor NMDA reducen la expresión de DISC1 y extienden la migración neuronal a límites fuera de lo normal. La migración al hilio de las neuronas neogeneradas o a la capa granular puede estar regulada por Reelin. La falta de Reelin induce migración aberrante de neuroblastos. Ref. 8, 38, 39, 48, 52, 55, 72, 74, 75, 112, 115, 116, 163, 173, 177, 222, 232, 237, 241, 243. SUPERVIVENCIA El núnero de neuronas en el bulbo olfatorio permanece estable a pasar de la continua generación de nuevas neuronas lo que presupone que la neurogénesis está acompañada por una pérdida ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 138 celular. En efecto, se ha demostrado que la muerte celular programada es un mecanismo regulador del bulbo olfatorio. Después de un pulso de BrdU se observa muerte celular durante los primeros dos meses. Esta eliminación es mayor en el bulbo olfatorio que en la SVZ y la RMS. Se estima que la mitad de las células progenitoras marcadas que arriban al bulbo olfatorio mueren entre 15 y 45 días después de su nacimiento. La exposición a ambientes enriquecidos en olores aumenta la supervivencia de neuronas en los bulbos olfatorios mientras que la oclusión de las fosas nasales la disminuye. Estímulos olfatorios son importante en la supervivencia de neuronas que han alcanzado la capa de células granulares antes que hayan desarrollado espinas dendríticas. En la RMS los neuroblastos expresan receptores NMDA cuya actividad es regulada por glutamato liberada de los astrocitos. Glutamato promueve la supervivencia de los neuroblastos durante su migración por la RMS y por el contrario, el bloqueo de los receptores NMDA resulta en un aumento de la apoptosis de neuroblastos. Las aferencias colinérgicas aumentan la supervivencia de células neoformadas en los bulbos olfatorios. En el girus dentado adulto las neuronas neoformadas son generadas en exceso, gran parte de las cuales (50%) mueren 1 a 2 semanas después de su nacimiento. Las células muertas por apoptosis son removidas fagocitadas por microglía presente en el nicho de la SGZ. La cantidad de células que sobreviven en el girus dentado puede modularse por la exposición a ambientes enriquecidos o el aprendizaje. Aferencias excitadoras mediadas por GABA promueven la supervivencia de nuevas neuronas. GABA controlaría la fosforilación de CREB durante las dos primeras semanas después del naciminto neuronal y las señales CREB regularían la supervivencia mediadas por genes que la regulan. La activación del receptor NMDA por glutamato también promueve la supervivencia de neuronas neoformadas y su supresión en progenitores del hipocampo la reduce. La infusión intracerebroventricular de NGF promueve la supervivencia de neuronas en la capa granular del DG, una acción posiblemente mediada vía el sistema colinérgico. La supervivencia de células precursoras del hipocampo se incrementa por la inyección de melatonina. Prox1 es necesario para la supervivencia de progenitores intermedios La falta de Tbr aumenta la apoptosis de células Tbr + y DCX + . Ref. 41, 47, 48, 66, 94, 173, 194, 216, 228. DIFERENCIACIÓN Y MADURACIÓN Para que las células progenitoras se transformen en neuronas ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 139 se requiere que los factores que reprimen la diferenciación sean desactivados y que los programas de diferenciación neuronal se activen. La obtención del destino neuronal requiere la pérdida del estado indiferenciado y la expresión de determinantes del destino neurogénico. La generación de los distintos linajes neuronales depende de un balance entre el mantenimiento de las NSCs y su diferenciación neuronal. El mantenimiento incompleto y la diferenciación prematura llevarán a un agotamiento del conjunto de NSCs que se traducirá con el tiempo en disminución de la neurogénesis. Por el contrario, el aumento de las NSCs a expensas de la diferenciación neuronal alterará la capacidad de las NSCs para generar neuronas a un nivel necesario para una adecuada funcionalidad. Control molecular El control molecular de la diferenciación que genera los diversos tipos neuronales en el adulto es similar al observado durante el desarrollo. Este control implica a los factores proneurales bHLH. Los factores proneurales pueden dividirse en factores determinantes y factores de diferenciación. Los factores determinantes, como Mash1, Ngn2, y Math1, comienzan a expresarse en células precursoras e inician un programa neurogénico promoviendo el cambio de la fase de proliferación a la de diferenciación neuronal. Los genes proneurales Ngn2 y Mash1 son regulados por señales Notch mediadas por la expresión de los genes Hes1 y Hes5. Los factores Hes reprimen la expresión de los genes proneurales Ngn2 y Mash1 con lo que inhiben la diferenciación de los progenitores neurales manteniéndolos en un estado indiferenciado y proliferativo. La disminución de los niveles Hes permite la expresión de Ngn2 y Mash1. Los factores determinantes, a su vez, inducen una segunda onda de genes, que expresan los factores de diferenciación NeuroD1, NeuroD2, y Math2 en células postmitóticas. NeuroD1 se expresa en neuronas inmaduras y NeuroD2 y Math2 dirigen las neuronas a su diferenciación terminal. Control de la diferenciación celular en el girus dentado Mash1 es un importante regulador de la diferenciación neuronal desempeñando un papel en la configuración del subtipo neuronal. En el girus dentado Mash1 se expresa transitoriamente en células precursoras tipo-2a. La transición de las células progenitoras tipo-2a a 2b se caracteriza por la disminución de Mash1 y el incremento de Ngn2. Ngn2 comienza a manifestarse en progenitores tipo-2a tardios alcanza su máximo en progenitores tipo-2b y ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 140 disminuye en la transición a células tipo-3. Las células progenitoras que expresan Mash1 y Ngn2 maduran en células glutaminérgicas. Ngn2, expresado en células precursoras del girus dentado, puede inducir una cascada genética que comprende a NeuroD y Math2. Mientras Ngn2 es expresado al comienzo de la fase amplificadora de progenitores NeuroD1 señala su terminación cuando los neuroblastos comienzan a diferenciarse en neuronas granulares dirigiendo su diferenciación. NeuroD1 es expresado en células tipo 2b y tipo 3 así como en neuronas granulares inmaduras del girus dentado. Su falta se traduce en pérdida de neuronas granulares neoformadas. NeuroD2 comienza a expresarse inmediatamente después de NeuroD1 y continúa expresándose en neuronas maduras coincidiendo con la elongación de axones y la estabilidad sináptica. NeuroD2 es necesario para la maduración final de las neuronas (Figura 24). Factores de transcripción también regulan la neurogénesis en la SGZ. Pax6, expresado en células tipo-1, persiste en parte en progenitores tipo-2a y se desvanece en neuronas diferenciadas. Pax6 está implicado en regular la proliferación de progenitores del girus dentado. Altas concentraciones de Pax6 inducen la expresión de Ngn2. Tbr2 y Tbr1 son factores de transcripción expresados en el hipocampo adulto. Tbr2 es expresado específicamente en células tipo-2 de la SGZ, colocalizado con Pax6 y nestina, extendiéndose a algunas células tipo-3. La función de Tbr2 serviría para la producción y maduración de las nuevas neuronas en el girus dentado Figura 24. Moléculas que controlan la diferención generando los diferentes tipo celulares del girus dentado. En rectángulos marcadores, factores de transcripción, y factores proneurales en diferentes niveles. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 141 A medida que las células salen del ciclo celular y se diferencian en neuronas inmaduras la expresión de Tbr2 decrece mientras que aumenta la de Tbr1. Tbr formaría parte de una cascada formada por Pax6 Ngn2 Tbr2 NeuroD Tbr1 que regularía la transición de las células progenitoras proliferantes a neuronas glutamatérgicas diferenciadas. Prox1, expresado en células granulares del girus dentado (Figura 24), está implicado en la transición de las NSCs a la diferenciación neuronal. Su inactivación resulta en defectos en la maduración de las células granulares y en la ausencia de neurogénesis. El gen Prox1 es activado por genes proneurales y Prox1 suprime el gen Notch1, en ausencia de Notch1 se induce la diferenciación neuronal. La falta de Notch también suprime la acción inhibidora de Notch en la expresión de genes proneurales (Figura 25). Curso de la formación de nuevas neuronas La formación de nuevas neuronas funcionales a partir de las NSCs en el girus dentado adulto es un proceso que dura varias semanas y progresa a través de una cascada de eventos similares a los del hipocampo del recién nacido. Durante la primera semana después de la división celular las neuronas inmaduras, que presentan el marcador calretinina, migran hacia la capa de células granulares. Las dendritas comienzan a crecer desarrollando procesos que se extienden por la capa granular y expresan receptores GABAA y glutamato pero carecen de aferencias sinápticas. El axón se extiende hacia la región CA3. Estas células son activadas por GABA del ambiente. Durante la segunda semana las dendritas apicales alcanzan la capa molecular pero no presentan espinas dendríticas y el axón crece más en la región CA3. Al mismo tiempo se observan aferencias GABAérgicas, presumiblemente de interneuronas locales, que establecen contactos con dendritas. Las aferencias Figura 25. Prox1 inducida por genes proneurales activa la diferenciación neuronal vía inhibición de Notch1. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 142 GABAérgicas depolarizan las neuronas y son importante para la supervivencia y maduración de las nuevas neuronas. Durante la tercera semana de la maduración calretinina es cambiada por calbindina, se forman las primeras espinas dendríticas que aumentan rápidamente en cantidad para progresivamente adquirir forma de hongo, continuándose su formación por mucho tiempo. Axones glutamatérgicos de la vía perforante comienzan a establecer contactos funcionales excitadores y las aferencias GABAérgicas se vuelven inhibidoras. A su vez, los axones forman sinapsis con espinas dendríticas de las neuronas piramidales CA3. Después de cuatro semanas las dendritas cubiertas de espinas se extienden a la capa molecular y las nuevas neuronas maduran gradualmente presentando mayor plasticidad sináptica que las neuronas maduras, como lo señala su menor umbral para la inducción de potenciales de larga duración mediado por la subunidad NR2B del receptor NMDA. Las neuronas adquieren su completa maduración alrededor de las 8 semanas. Las aferencias excitadoras se completarían alrededor de los dos meses después de la división celular. Características de las nuevas neuronas Las nuevas neuronas presentan características similares a las neuronas adultas y se integran a los circuitos neuronales del hipocampo. Sin embargo, las neuronas jóvenes se diferencian de las adultas por las propiedades de sus membranas. Las NSCs y las células progenitoras tienen alta densidad de canales K+ independientes de voltaje, que se pierde en la fase final de la proliferación, por lo que presentan alta resistencia de la membrana a aferencias eléctricas la que disminuye con el avance de la maduración y el aumento de canales activados por voltaje. Con el aumento de los canales activados por voltaje las neuronas pueden activar, 2-3 semanas después de su nacimiento, potenciales de acción de gran amplitud en respuesta a estímulos de baja intensidad. Las neuronas jóvenes presentan, además, bajo umbral de activación de canales Ca 2+ tipo T que pueden generar potenciales de acción en respuesta aún a débiles aferencias excitadoras. Además las neuronas jóvenes se diferencian de las adultas por su bajao umbral para la inducción de potenciales de larga duración (LTP). El menor umbral para la inducción de LTP puede deberse a la falta de aferencias inhibidoras GABAérgicas en las neuronas jóvenes. GABA es importante para el desarrollo de neuronas jóvenes y su acción cambia durante el desarrollo. En las células proliferanERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 143 tes y en neuronas inmaduras el transporte neto de cloruros es hacia adentro de la célula dando lugar a altas concentraciones de Cl¯ intraneuronales las que son mantenidas por el cotransportador NKCC1, una proteína que se expresa en NSCs y en neuronas inmaduras. Debido a la alta concentración de [Cl¯] i, la activación de receptores GABAA por GABA depolariza las células por apertura de los canales cloro que conducen al cloro fuera de las células produciendo efectos excitadores. La depolarización de la membrana activa canales Ca 2+ dependientes de voltaje que inducen el influjo de Ca2+ aumentando su concentración intracelular en células tipo-2. El incremento de Ca2+ intracelular facilita su unión a la proteína calmodulina formando un complejo Ca 2+/calmodulina que activa las quinasas CaMKII y CaMKIV entre otras. Estas quinasas fosforilan CREB en la Ser133 activándola. CREB fosforilada se une al elemento CRE del DNA y activa la expresión de genes induciendo la expresión de NeuroD y promoviendo subsecuentemente la diferenciación neuronal. La acción excitadora GABAérgica en las dos primeras semanas estimula el crecimiento dendrítico y es importante para la maduración neuronal. Después de 2 semanas los niveles de cloro intracelular disminuyen como consecuencia de la disminuída expresión del cotransportador NKCC1 y el aumento del cotransportador KCC2 por lo que GABA se vuelve inhibidora. Las neuronas jóvenes forman contactos sinápticos glutamatérgicos después de dos semanas de su nacimiento y la activación de los receptores NMDA por estimulación de las fibras entorrinales evoca corrientes excitadoras contribuyendo a la supervivencia de las células granulares neoformadas. Por el contrario las células que carecen de estas conexiones sinápticas son eliminadas. La supresión de los receptores NMDA reduce la supervivencia de las neuronas jóvenes durante las dos primeras semanas después del nacimiento. Las neuronas neogeneradas pueden integrarse a los circuitos neuronales preexistentes o pueden reemplazar a neuronas viejas que mueren. En modelos de reemplazo las neuronas viejas del girus dentado son removidas y reemplazadas por nuevas. Por el contrario, otros modelos han considerado la posibilidad que la capa de células granulares continúe creciendo por el agregado de nuevas neuronas. Neurogénesis y aprendizaje La neurogénesis en el girus dentado ha sido relacionada con la capacidad de aprendizaje y memoria. La estimulación de la neurogénesis en el hipocampo, como en ratones expuestos a un amERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 144 biente enriquecido o corriendo en una rueda rodante, mejora la capacidad para aprender ciertas tareas. Por el contrario, la reducción de la neurogénesis en el hipocampo reduce la capacidad para aprender. La reducción del número de neuronas generadas por irradiación o administración de un agente antimitótico alteran el aprendizaje de tareas hipocampo dependientes. Sin embargo no se puede descartar la posibilidad que la neurogénesis y el aprendizaje sean regulados independientemente toda vez que las respuestas pueden deberse no solo a la neurogénesis sino también a la plasticidad neuronal en dendritas y espinas dendríticas. Por otra parte, el aprendizaje incrementa la neurogénesis en la SGZ por aumento de la supervivencia de las nuevas neuronas. En ratas entrenadas en un laberinto acuoso se observa un incremento de la supervivencia celular pero no en animales que hacen el mismo esfuerzo físico sin una plataforma. El aprendizaje espacial también induce proliferación de células precursoras. La falta de neurogénesis en el hipocampo altera las respuestas emocionales en roedores destacando el papel del hipocampo en el humor y la ansiedad. Neuronas del sistema SVZ/bulbo olfatorio En la SVZ la actividad de los factores determinantes Mash1 y Ngn2 da lugar a la generación de progenitores restringidos a un linaje neuronal. Mash1 es expresado en células progenitoras B y C destinadas a transformarse en interneuronas GABAérgicas de los bulbos olfatorios mientras que Ngn2 se encuentra en células progenitoras que producen neuronas glutamatérgicas yuxtaglomerulares. La pérdida de actividad de los genes Ngn2 y Mash1 se traduce en la incapacidad de las células neuroepiteliales a generar progenitores comprometidos con un linaje neuronal dando lugar a la generación precoz de progenitores gliales. NeuroD1 se encuentra en células de la RMS pero no en la SVZ y puede estar implicado en la diferenciación de neuronas olfatorias (Figura 26). Otros factores de transcripción están de algún modo relacionados a la regulación de la neurogénesis en la SVZ. La progresión de las NSCs hacia neuroblastos en la SVZ es un proceso regulado por los factores Olig2 y Pax6. Los factores de transcripción Olig2 y Pax6 en los precursores neurales no se superponen, mientras Olig2 se expresa exclusivamente en células C el factor de transcripción Pax6 es expresado en un subgrupo de precursores SVZ y en neuroblastos en la RMS así como en las capas de células granulares y glomerulares del bulbo olfatorio. Olig2 promueve la generación de oligodendrocitos y su actividad debe ser ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 145 reprimida por BMP para permitir la progresión hacia un linaje neuronal (Figura 27). Pax6, por su parte, desempeña un importante papel en la configuración de subtipos de interneuronas olfatorias. El incremento de Pax6 en la RMS aumenta la generación de neuronas dopaminérgicas periglomerulares y granulares las que disminuyen por su inhibición. Por el contrario, otras neuronas nacen, migran y se diferencian normalmente en ausencia de Pax6. Las neuronas periglomerulares no dopaminérgicas resultan en parte establecidas por el factor de transcripción Sp8 que reprimiría a Pax6. Sp8 es un factor de transcripción que se expresa en neuroblastos migratorios y en interneuronas calretinina positivas y GABAérgicas no dopaminérgicas. Er81, un factor de transcripción que tiene un patrón de expresión similar a Sp8, está implicado en la generación de algunos subtipos de interneuronas que expresan GABA y calretinina. Emx1 es expresado en células calretinina positivas y GAD positivas. El factor de transcripción CREB, expresado en neuroblastos derivados de la SVZ, está involucrado en la maduración de precursores neuronales de la SVZ. Los neuroblastos migratorios detienen su migración y alcanzan su posición final en las capas de células granulares y glomerulares del bulbo olfatorio comenzando a extender dendritas para madurar en interneuronas olfatorias. Las nuevas neuronas reciben primero aferencias GABAérgicas y después glutamatérgicas. Estas señales ambientales influencian el desarrollo morfológico e incrementan la capacidad de generar potenciales de acción con la maduración. GABA es un importante regulador del crecimiento dendrítico en las neuronas olfatorias neoformadas. Figura 26. Moléculas involucradas en la proliferación y diferenciación celular en el sistema SVZ/bulbo olfatorio. Marcadores; factores de transcripción; y factores proneurales en diferentes tonos de grises ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 146 Distintos tipos neuronales se generan en el área neurogénica subventricular del adulto. La mayor parte de las nuevas neuronas en el bulbo olfatorio (95%) se diferencia en células granulares (GCs) mientras que las menos se diferencian en los distintos tipos de células periglomerulares (PGCs). La mayoría de las GCs son GABAérgicas de las cuales un 70% son también dopaminéricas que expresan tirosina hidroxilasa. Las PGCs comprenden células que expresa calbindina, calretinina o GAD (glutamic acid decarboxylase). Un 40% de estas células son GABAérgicas la mitad de las cuales son también dopaminérgicas. Las poblaciones de SCs de la SVZ disminuyen con la edad a juzgar por el hecho que están reducidas a la mitad en ratones adultos con relación a ratones jóvenes. La reducción de la neurogénesis en el adulto puede llevar a las alteraciones neurodegenerativas asociadas a la edad. La neurogénesis en la SVZ es regulada por olores, la supervivencia y la maduración de las nuevas neuronas se retardan por la falta de afrencias olfatorias mientras que un ambiente enriquecido en olores las incrementa. Sin embargo el incremento de la neurogénesis en la SVZ depende del apredizaje olfatorio y no de la simple exposición a olores. El aprendizaje de discriminar entre olores incrementa la neurogénesis disminuyendo el número de neuronas que son eliminadas por apoptosis. La disminución de la neurogénesis en la SVZ se acompaña de déficit en la discriminación de olores. Ref. 4, 17, 23, 30, 42, 50, 67, 68, 70, 71, 82, 87, 88, 101, 102, 111, 115, 128, 138, 145, 147, 156, 166, 181, 189, 200, 205, 209, 230, 231, 239, 245, 247. INFLUENCIAS AMBIENTALES Y NEUROGÉNESIS Los mecanismos que determinan la neurogénesis en las áreas neurogénicas cambian con el estado fisiológico del organismo así como en respuesta a distintas situaciones. Actividad física y ambiente enriquecido El ejercicio físico aumenta la proliferación de células precursoras en el hipocampo así como la supervivencia y maduración de neuronas neoformadas. En el bulbo olfatorio la neurogénesis no es afecada por el ejercicio. Uno de los modelos de ejercicio físico mejor estudiado en roedores es correr en rueda rodante. La acción aguda del ejercicio voluntario en rueda rodante afecta la proliferación de las células tipo 2/3 pero desaparece si el ejercico se continúa. Además el ejercicio puede producir efectos benéficos ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 147 para varias enfermedades degenerativas y lesiones isquémicas del cerebro. Pero mientras que el ejercicio moderado estimula la neurogénesis un ejercicio extenuante disminuye la proliferación de progenitores. Diversos factores han sido señalados como mediadores de la acción del ejercicio en la neurogénesis incluyendo el factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF), el factor-1 de crecimiento insulina simil (IGF-1), el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), el factor-2 de crecimiento de fibroblastos (FGF-2) y el receptor N-metil-D-aspartato-1 (NMDAR-1). Los genes que inducen estos factores incrementan su expresión con el ejercicio. Interrumpiendo la actividad de IGF-1 o de VEGF se previene el incremento de la neurogénesis en el hipocampo inducido por el ejercicio. El incremento de las células progenitoras por el ejercicio se haría vía el aumento de la actividad de Notch1. Los niveles de BMP disminuyen durante el ejercicio y el aprendizaje y el aumento de BMP4 previene la acción del ejercicio. Estímulos que se suponen más específicos para la función del hipocampo, tales como la exposición a un ambiente de acentuada complejidad (ambiente enriquecido), también pueden estimular la neurogénesis. El ambiente enriquecido es una situación compleja de exposición a estímulos de diferentes modalidades como estímulos visuales, olfatorios, táctiles, propioceptivos y sociales. La proliferación celular en el hipocampo disminuye en ratas mantenidas aisladas y se recupera en animales mantenidos en grupos. Dos componentes del ambiente enriquecido, la actividad física espontánea y el aprendizaje, independientemente incrementan la neurogénesis en el hipocampo. El ambiente enriquecido y la actividad física tienen efectos aditivos aunque afectan diferentes fases de la neurogénesis. Mientras que el ejercicio incrementa la proliferación celular el ambiente enriquecido sólo incrementa la supervivencia de nuevas neuronas sin afectar la proliferación. Estos estímulos afectarían las nuevas neuronas en un periodo del desarrollo, antes de su integración a los circuitos neuronales, durante el cual las espinas dendríticas aparecen y se establecen los contactos sinápticos. Desde el punto de vista funcional los estímulos no específicos determinarían una expansión transitoria de la población de células precursoras pero su supervivencia dependería de estímulos más relacionados a la función del hipocampo. Por otra parte, ratones mantenidos en un ambiente enriquecido con olores presentaron un incremento en la supervivencia de neuronas generadas en SVZ pero no en la SGZ. La proliferación de precursores no se modificó. Ref. 26, 27, 59, 73, 127, 139, 140,199. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 148 Aprendizaje El aprendizaje de diferentes tareas afecta distintas etapas de la neurogénesis en el hipocampo. El aprendizaje incrementa la supervivencia de neuronas en el hipocampo. Por ejemplo, las nuevas células que han sido producidas una semana antes del entrenamiento y se encuentran en la segunda semana de su desarrollo, cuando están aún inmaduras pero ya se han diferenciado en neuronas, sobreviven con el aprendizaje. La supervivencia celular tiene lugar en los animales que aprenden las tareas y no en los que sólo las ejecutan sin aprenderlas. El aprendizaje también incrementa la proliferación de células precursoras. Mientra que en la fase inicial del aprendizaje en un laberinto de agua la proliferación no se modifica, en la fase tardía se incrementa el número de células precursoras neoformadas las que se diferencian en neuronas. Además la fase tardía induce una disminución del número de células neoformadas producidas durante la fase temprana debido a un proceso de muerte celular. El aumento de la supervivencia celular durante la fase temprana del aprendizaje puede facilitar el establecimiento de conexiones entre el DG y la región CA3 y así la inducción de la memoria. El aumento de la proliferación celular durante la fase tardía del aprendizaje puede servir para la adquisición de nueva información y almacenar nuevas memorias. La muerte de células durante la fase tardía del aprendizaje puede constituir un mecanismo de supresión de neuronas que no han constituido conexiones relacionadas con el aprendizaje. El aprendizaje de tareas relacionadas a la discriminación de olores afecta la neurogénesis en el bulbo olfatorio promoviendo la supervivencia de neuronas neogeneradas inmaduras y la eliminación de neuronas más maduras. Ref. 1, 3, 40, 43, 125, 127, 171, 216, 217. Stress Stress es uno de los más potentes inhibidores de la neurogénesis en el hipocampo adulto pero no en la SVZ o el bulbo olfatorio. Stress disminuye la proliferación de células progenitoras del girus dentado y la formación de nuevas neuronas. La supervivencia de neuronas neogeneradas también está disminuída. Este fenómeno es independiente de la especie animal, del agente estresante, o de la edad. En la exposición a cortos periodos de stress (stress agudo) la reducción de la proliferación en el DG se iguala al aumento de la apoptosis. Este efecto es de corta duración y se normaliza en 24 horas. La disminución de la proliferaERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 149 ción puede ser seguida por un periodo de incremento de supervivencia celular. Stress repetido y prolongado (stress crónico) reduce la proliferación o la supervivencia. La disminución de la proliferación celular en el girus dentado inducida por stress crónico se hace vía de la detención del ciclo celular en la fase G1 mediada por el incremento del inhibidor de la CDK p27 Kip-1. El aumento de la concentración de glucocorticoides por stress crónico es el mecanismo por el cual se inhibe la neurogénesis y disminuye el número y largo de las dendritas de neuronas del hipocampo. En el hipocampo existen receptores para mineralocorticoides (MR) y para glucocorticoides (GR). En condiciones basales los MR están ocupados pero pocos GR lo están. Estos GR podrían mediar el efecto de stress. El aumento de la concentración de glucocorticoides por stress crónico regula la neurogénesis del hipocampo influenciando la proliferación, supervivencia y diferenciación celular. La administración de corticosterona reduce la neurogénesis y disminuye el número y largo de las dendritas de neuronas del hipocampo mientras que la supresión de los esteroides adrenales circulantes por adrenactomía las aumenta. Stress también aumenta la liberación de glutamato en el hipocampo. Glutamato reduce la proliferación celular mediado por receptores NMDA. El bloqueo de los receptores NMDA previene la reducción de la proliferación celular por administración de corticosterona. Stress incrementa los niveles de la citoquina IL1β en hipocampo y bloqueando su receptor se previene la reducción de la neurogénesis. Stress tanto agudo como crónico disminuye la expresión de BDNF en el hipocampo determinada en parte por el aumento de los niveles de corticosterona. A diferencia del stress adverso que inhibe la neurogénesis en el hipocampo asociada a elevados niveles de glucocorticoides otros tipos de stress, que también se acompañan de altos niveles de glucocorticoides, paradójicamente aumentan la neurogénesis en el hipocampo adulto. Tales respuestas, observadas en ratas en respuesta a actividad física o a actividad sexual, sugieren que cuando los estímulos estresantes se acompañan de aspectos placenteros pueden superar los efectos adversos de los elevados niveles de glucocorticoides. Además, stress en los primeros días de vida puede afectar la neurogénesis en el hipocampo en forma permanente. Crías separadas de su madre por 3 horas diarias en los días 1 a 14 después del nacimiento presentaron disminución de la proliferación de células precursoras. Este cambio persiste en el adulto posiblemente debido a un aumento de la sensibilidad a corticosteroides. Ref. 14, 86, 97, 124, 140, 150, 161. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 150 Envejecimiento La proliferación y supervivencia de células neoformadas en las áreas neurogénicas disminuye con el envejecimiento aunque las NSCs envejecidas tienen la capacidad de responder a estímulos exteriores en forma similar al de animales jóvenes. La actividad mitótica de las NSCs y de los neuroblastos disminuye en animales viejos en comparación con la de adultos. La migración de las células neoformadas se hace más lenta y la diferenciación neuronal se reduce con la edad. La reducción de la neurogénesis con el avance de la edad se acompaña de la reducción de la expresión de genes de varios marcadores de las NSCs y de factores de transcripción y neurogénicos. La declinación de la proliferación en la SVZ se acompaña de un aumento del inhibidor de ciclina p16INK4a. Muchos cambios relacionados con la edad pueden asociarse a una disminución de señales extrínsecas, a la reducción de respuesta de las células precursoras adultas, y a una acumulación de sustancias inhibidoras. El aumento de glucocorticoides en el suero con la edad puede ser una de las causas de la declinación de la neurogénesis un efecto que puede revertirse reduciendo sus niveles por adrenalectomía. Los niveles de serotonina y el receptor 5-HT1A disminuyen con la edad lo que posibilita un efecto negativo en la neurogénesis. También hay disminución de numerosos factores neurotróficos como IGF-1, VEGF, FGF-2, y BDNF que han sido asociados a la disminución de la neurogénesis en el DG y la SVZ con el avance de la edad. Varios de estos factores administrados en animales viejos estimularon la neurogénesis. Por el contrario, el factor-β1 transformador del crecimiento (TGF- β1) puede aumentar con la edad inhibiendo la proliferación de células precursoras. Ref. 2, 113, 126, 149, 157, 165, 168. Alteraciones del sueño El efecto de la supresión o interrupción del sueño en la neurogénesis ha sido estudiado en roedores. En general, la proliferación celular en la capa subgranular del girus dentado se suprime en animales privados de sueño por varios días. La privación del sueño no sólo afecta la proliferación celular sino que también altera la posterior supervivencia, diferenciación y maduración de estas células. La supresión de la proliferación celular después de 48 horas de privación del sueño no se recupera en el periodo inmediato pero una semana después, cuando los animales han reERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 151 asumido un parámetro de sueño normal, la formación de nuevas células es superior a la de los controles. Por el contrario, ratas privadas del sueño por 12 horas presentaron un incremento de la proliferación celular y de la supervivencia de células neogeneradas en el girus dentado. La privación del sueño no afectó la proliferación celular en la SVZ. Los mecanismos por los cuales las alteraciones del sueño afectan la neurogénesis pueden ser indirectos a través de otros sistemas. La disminución de la proliferación celular por privación prolongada de sueño se acompaña de aumento de los niveles circulantes de glucocorticoides y evitando ese aumento se previene la disminución de la proliferación. Otros factores pueden estar implicados, una disminución de la sensibilidad del receptor 5HT1A se observa en animales privados de sueño por largos periodos. IGF-1 y BDNF también disminuyen durante la privación del sueño mientras que TNF-α y la interleuquina IL-1 aumentan. Ref. 78, 81, 100, 151, 161, 233. ALTERACIONES DEL CNS Y NEUROGÉNESIS Alteraciones patológicas del sistema nervioso pueden afectar la neurogénesis en el adulto actuando no sólo en las regiones neurogénicas sino también en regiones no neurogénicas. Neuroinflamación La neuroinflamación es un proceso de respuesta a infecciones, lesiones traumáticas, o enfermedades del cerebro. Implica a células como microglía, linfocitos, monocitos, macrófagos, y astrocitos. La neuroinflamación en el CNS puede ser aguda o crónica. La inflamación aguda es la respuesta inmediata a una lesión del CNS, denominada gliosis reactiva, caracterizada por la acumulación de microglía y astrocitos. Las células microgliales residentes en el cerebro son los principales agentes de la neuroinflamación. En el cerebro normal, la microglía se encuentra en estado de reposo pero se activa rápidamente por pequeñas alteraciones del microambiente dando lugar a un cambio de su morfología y función. Inducida por condiciones patológicas la microglia residente en el parénquima prolifera y se activa. La capacidad exploratoria del ambiente de la microglía le permite moverse hacia los sitios de lesión. La microglía activada incrementa la secreción de citoquinas pro-inflamatorias incluyendo IL-6 y TNF-α. El aumento de la actividad de la microglía se acompaña de una disminución de células progenitoras en la SGZ. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 152 Además la neuroinflamación altera la barrera hematoencefálica permitiendo el ingreso de linfocitos, monocitos y macrófagos al área de lesión. Estas células responden a la lesión eliminando los desechos y sintetizando y liberando sustancias como complementos, citoquinas, quimoquinas, glutamato, interleuquinas, óxido nítrico, especies oxígeno reactivas, y factores transformadores de crecimiento. Estas respuestas pueden llevar a una lesión secundaria pero su papel es contener y demarcar el tejido lesionado del parénquima normal, limpiar los detritos, y estimular la regeneración de las células que sobreviven a la lesión. Los astrocitos también son activados y son necesarios para controlar la respuesta inmune, reparar la barrera hematoencefálica, y atenuar la muerte neuronal. La neuroinflamación puede inhibir la neurogénesis por mecanismos tales como aumento de glucocorticoides, alteración de las relaciones células progenitoras y células de la neurovasculatura, o efectos directos de la microglía activada en las células progenitoras. La respuesta inflamatoria puede ser dañina o beneficiosa de la neurogénesis. Ref. 18, 51, 110, 159, 167, 188, 228. Isquemia localizada en el cerebro La isquemia localizada en el cerebro, tal como se observa en accidentes cerebrovasculares, involucra a un área de necrosis rodeada por una zona de reducida perfusión conocida como penumbra isquémica. Estudios experimentales han señalado que lesiones isquémicas localizadas, inducidas por obstrucción de la arteria cerebral media en ratas, producen lesiones en neuronas del estriado y la corteza que estimulan la proliferación de células progenitoras y la neurogénesis en la SVZ y en la SGZ. La estimulación de células progenitoras y la neurogénesis inducidas por isquemia cerebral localizada es mediada por diversos factores incluyendo factores de crecimiento, ácido retinoico, BMF, TNF-α, y SHH. Señales activadas por Notch 1 aumentan en la SVZ por isquemia cerebral localizada e inhibiéndolas se bloquea parcialmente la proliferación celular en la SVZ inducida por isquemia. Notch1 y Hes1 son expresados en células DCX+ mientras que su ligando Jagged1 se expresa principalmente en células GFAB+. La respuesta neurogénica después de la lesión puede amplificarse por la administración de factores de crecimiento, incluyendo EGF, FGF-2, BDGF, eritropoyetina, SC factor, VEGF. Después de la isquemia focal muchos neuroblastos formados en la SVZ, en lugar de migrar al bulbo olfatorio, migran a la zoERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 153 na dañada del estriado donde se dividen, se diferencian y maduran, un proceso que continúa durante meses. Los neuroblastos también migran a la corteza a través de la sustancia blanca para acumularse en la corteza y en las áreas de la sustancia blanca subcortical que rodea el infarto donde están presentes en un área que bordea la lesión pero sin entrar en ella, por acción de inhibidores o porque no sobreviven. Este proceso se prolonga por mucho tiempo y promueve la expresión de genes. La administración de FGF2 por mucho tiempo en lesiones isquémicas de la corteza puede estimular el proceso regenerativo. Varios factores han sido implicados en la migración de neuroblastos a la zona de infarto como metaloproteinasas de la matriz, quimioquinas, y factores vasculares. La isquemia localizada aumenta la actividad de PI3K/Akt en la SVZ y esta incrementa la migración de neuroblastos. La estrecha asociación de los neuroblastos con vasos sanguíneos probablemente desempeña un papel en la migración como en la supervivencia de neuroblastos mediado por factores liberados por las células endoteliales. Entre los mecanismos implicados en dirigir los neuroblastos a la zona dañada se encuentra el factor SDF-1α, expresado en astrocitos reactivos y microglía activada, y su receptor CXCR4, expresado en neuroblastos. El factor MCP-1 (monocyte chemoattractant proteína-1) activado en microglía y astrocitos reactivos y su receptor CCR2 expresado en neuroblastos también participan en la migración de neuroblastos al estriado. La mayoría de las células que migran al estriado dañado mueren por su incapacidad de integrarse o por inflamación. El tratamiento con indometacina, para suprimir la inflamación, incrementa el número de neuroblastos en la zona de lesión. Muchas de las células que sobreviven se diferencian en neuronas aunque de distinta naturaleza. Muchas neuronas formadas en el estriado después de lesiones cerebrales isquémicas localizadas expresan DARPP-32, un marcador específico para neuronas puntiagudas del estriado, y calbindina mientras que otras se diferencian en interneuronas que expresan calretinina. No se sabe fehacientemente si las células que sobreviven reemplazan a las células que se han perdido, si mejoran la recuperación, o si establecen conexiones adecuadas. El cerebro humano tiene la capacidad de reaccionar a las lesiones isquémicas aumentando la generación de células progenitoras neurales en la SVZ Las células neoformadas en el girus dentado se incorporarían a la capa de células granulares sin migrar a las regiones isquémicas. Lesiones isquémicas más globales que lesionan el hipocampo producen marcado aumento de la proliferación celular en ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 154 un área de células situadas en la parte más caudal de la SVZ por debajo del cuerpo calloso que migran al área CA1 lesionada para generar nuevas neuronas que se integran a los circuitos existentes (Figura 9). Ref. 96, 104, 109, 122, 129, 144, 186, 240. Lesiones traumáticas del cerebro Las lesiones traumáticas del cerebro aumentan la proliferación de progenitores y la neurogénesis en el girus dentado y la SVZ ipsilateral y menor grado en el contralateral. La proliferación alcanza su máximo en la primera semana después de la lesión y vuelve a los niveles basales al mes. Después de un periodo de maduración muchos de los neuroblastos neogenerados dan lugar a neuronas maduras que se incorporan a los circuitos neurales. La proliferación de las células progenitoras en la SVZ inducida por lesiones traumáticas del cerebro genera neuroblastos que migran a las áreas lesionadas donde maduran presentando marcadores de neuronas maduras. Células con marcadores de neuronas se observan en la corteza, estriado, y cuerpo calloso aunque no está establecido si los neuroblastos que migran de la SVZ a las zonas dañadas pueden reemplazar a las neuronas que se pierden por las lesiones pero tienen la potencialidad para hacerlo. Las lesiones del cerebro liberan proteínas e iones que pueden regular la neurogénesis. KCl y glutamato incrementan la proliferación en células inmaduras y tienen efectos tóxicos en células más maduras. Además, las lesiones del cerebro activan astrocitos y microglía que segregan factores de crecimiento. Factores liberados por las células endoteliales de los vasos sanguíneos, que incrementan después de las lesiones, pueden afectar a las células progenitoras que están en directo contacto con los vasos. Aunque las células neogeneradas que se encuentran en las lesiones de la corteza cerebral provienen de la migración a partir de la SVZ, se ha sugerido la posibilidad que NSCs de la corteza misma pueden activarse con el trauma y diferenciarse en neuronas corticotalámicas. Ref. 109, 156, 183, 196. Epilepsia Estudios en modelos animales proveyeron evidencias de aumento de la neurogénesis en la capa subgranular del girus dentado y la porción caudal de la SVZ después de episodios de epiERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 155 lepsia aguda. La porción caudal de la SVZ da lugar a progenitores que migran para formar glía en el hipocampo. La proliferación celular en la zona subgranular incrementa después de un periodo de latencia de varios días y vuelve a los niveles basales unos 2 meses después del episodio agudo y aún puede reducirse posteriormente por agotamiento del conjunto de NSCs. La formación de nuevas neuronas en la SGZ tiene lugar en las primeras semanas después del episodio epiléptico por estimulación de la proliferación de NSCs. A diferencia de las células granulares normales, una parte de las células granulares generadas por epilepsia extienden una dendrita basal adicional hacia el hilio que persiste en el tiempo y tienen sinapsis inmaduras. Además la epilepsia parece acelerar el desarrollo de las nuevas células granulares haciendo que las dendritas se extiendan rápidamente a través de la capa molecular. Las dendritas apicales de las neuronas neoformadas tienen más bifurcaciones en la capa de células granulares y más terminaciones en la capa molecular. Las células neogeneradas migran normalmente para integrarse a la capa de células granulares mientras que otras lo hacen en forma aberrante hacia el hilio. Esta migración aberrante puede ser debida a la disminuciónn de la expresión de Reelin, un factor implicado en la dispersión las células subgranulares. Las células granulares que migran al hilio, además de las aferencias excitadoras polisinápticas de la vía perforante, reciben aferencias excitadoras de las neuronas piramidales CA3. A su vez, generan axones colaterales que se dirigen a la capa molecular para inervar otras células granulares e interneuronas. Esta población de células granulares ectópicas generada en el hipocampo por los episodios convulsivos puede contribuir a la hiperexcitabilidad fortaleciendo un circuito excitador entre las células piramidales CA3 y el girus dentado. La anormal neurogénesis inducida por los episodios convulsivos contribuye a la evolución de las convulsiones iniciales a la epilepsia crónica. Varios mecanismos han sido propuestos como posibles inductores del aumento de la neurogénesis en el hipocampo inducido por episodios convulsivos. Factores promotores de la proliferación de NSCs como NGF, BDNF, FGF-2, VEGF, y SHH han sido implicados. El aumento de los niveles de GABA y del factor NPY en el girus dentado por las convulsiones influencia la neurogénesis. En la fase crónica que sigue después del episodio epiléptico hay una declinación de la neurogénesis en el girus dentado. El grado de reducción de la formación de nuevas neuronas es proporcional a la frecuencia e intensidad de los episodios convulsivos. La disminución de la neurogénesis depende también de la ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 156 edad, los animales adultos presentan mayor pérdida de la neurogénesis en la epilepsia crónica que los más jóvenes. La disminución de la neurogénesis en el hipocampo en la fase crónica de la epilepsia no depende de la disminución de la producción de nuevas neuronas ni de su supervivencia sino que es la consecuencia de la declinación de la diferenciación neuronal de las células neoformadas. La gran mayoría de las células neoformadas en la SGZ se diferencian en células gliales en vez de diferenciarse en neuronas. La epilepsia crónica está asociada a la disminución en la concentración de los factores promotores de la neurogénesis. La disminución de la neurogénesis en el girus dentado en la epilepsia crónica puede contribuir a la persistencia de las convulsiones espontáneas, a las alteraciones del aprendizaje y la memoria, y a la depresión observada en pacientes epilépticos. Ref. 10, 14, 85, 95, 120, 184, 185. Depresión En pacientes deprimidos el volumen del hipocampo está disminuido. La disminución del volumen del hipocampo puede deberse a varios mecanismos incluyendo atrofia de los procesos neuronales, pérdida de neuronas y glía, y disminución de su proliferación. El tratamiento antidepresivo revierte la atrofia del hipocampo aumentando la proliferación y supervivencia de neuronas neogeneradas pero no afecta su diferenciación. Fluoxetina, una droga utilizada como tratamiento antidepresivo que inhibe la recaptación de serotonina, aumenta la divisón simétrica de células tipo-2a de la SGZ manifiestándose luego por un aumento de nuevas neuronas en el girus dentado sin afectar a la SVZ. El tratamiento crónico acelera la maduración de neuronas inmaduras neogeneradas. Los agentes antidepresivos también neutralizan el efecto de estímulos estresantes. El tratamiento antidepresivo actuaría a través del aumento de la expresión de BDNF, VEGF, IGF-1, NE, y 5-HT en el hipocampo. También incrementa la expresión del factor de transcripción CREB Ref. 14, 54, 202. Enfermedades neurológicas La neurogénesis es modulada en cerebros de pacientes con enfermedades neurológicas. En pacientes con enfermedad de Alzheimer se incrementa la neurogénesis en el hipocampo al igual que en modelos animales. Pacientes con enfermedad de Huntington (HD) presentan incremento de la proliferación y la neurogéERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 157 nesis en la SVZ. En modelos experimentales de HD, como lesiones del estriado por administración de ácido quinolínico, se incrementa la proliferación de células progenitoras y la neurogénesis en la SVZ. Con respecto a la enfermedad de Parkinson la respuesta neurogénica en la sustancia nigra es controvertida. Ref. 80, 228. NEUROGENESIS Y REPARACIÓN DE LESIONES DEL CNS El aumento de la proliferación celular observado en la SVZ y la SGZ en respuesta a lesiones del cerebro sugiere que las SCs endógenas pueden contribuir a la reparación de los circuitos neuronales lesionados. Las lesiones no sólo activan la proliferación de SCs en áreas neurogénicas sino también en regiones donde la neurogénesis no ocurre normalmente como la corteza cerebral entre otras. Las nuevas neuronas generadas en las áreas no neurogénicas pueden provenir de la activación de progenitores de las áreas neurogénicas que migran a la lesión o de progenitores endógenos. Sin embargo, el número de las nuevas neuronas generadas es muy bajo y sobreviven por lo general por poco tiempo como para reemplazar a las que han desaparecido y recuperar la pérdida funciónal. La baja actividad neurogénica inducida por lesiones en las áreas no neurogénicas puede deberse a la reducida capacidad proliferativa de las SCs o a limitaciones en la diferenciación, migración y supervivencia. El ambiente creado por la lesión también puede contribuir a limitar la generación de nuevas neuronas a través de la secreción de factores inhibidores por células gliales entre otras. La estrategia terapéutica para reemplazar a las células neurales dañadas por lesiones cerebrales por activación de SCs endógenas deberá basarse no sólo en estimular su crecimiento y supervivencia sino también en mantener un ambiente adecuado para esos fines. Una de las estrategias para reeplazar a las neuronas perdidas por las lesiones es el reclutamiento de progenitores endógenos de las áreas neurogénicas cuya proliferación puede estimularse por administración de factores tróficos como FGF2, BDNF o TGF-α. Un problema de la estrategia de reclutamiento es la distancia a recorrer para llegar al área de lesión y las señales necesarias requeridas para favorecer la migración y diferenciación neuronal específica. No menos importante es el nicho neurogénico donde las nuevas neuronas deben crecer, sobrevivir y diferenciarse. Otro problema es que muchas de las lesiones cerebrales tienen lugar en personas de edad avanzada. En roedores la neurogénesis disminuye a medida que el animal envejece y ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 158 esta declinación de la neurogénesis puede resultar de la disminución de factores tróficos o del incremento de corticoides circulantes. Una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que controlan la proliferación y diferenciación neuronal durante el desarrollo y en el individuo adulto servirá para la implimentación de terapéticas adecuadas para afrontar la restitución de las neuronas dañadas por lesiones. Ref. 53, 83, 108, 118, 132, 162. FORMACIÓN DE OLIGODENDROCITOS En la SVZ se originan no solo neuronas sino también, en un limitado número, oligodendrocitos. Los precursores de la SVZ progresan de las NSCs hacia neuroblastos, un proceso regulado por los factores Olig2 y Pax6. Los factores de transcripción Olig2 y Pax6 no ocupan los mismos dominios en los precursores neurales adultos. Mientras que Olig2 se expresa exclusivamente en células C la mayoría de las células Pax6 positivas son neuroblastos migratorios que expresan PSA-NCAM o DCX y no se superpone a Olig2 (Figura 26). Mientras que Olig2 es necesario para determinar el destino de las células precursoras amplificadoras transitorias (células C), Pax6 promueve la progresión de neuroblastos (células A) hacia un linaje neuronal (Figura 27). Los programas neurogénicos y oligodendrogliogénicos compiten entre si. Así la activación de Olig2 en precursores de la SVZ interfiere con la progresión hacia un linaje neurogénico mientras que la represión de su actividad promueve neurogénesis y suprime la oligodendrogliogénesis. De igual manera, la sobreexpresión de Pax6 determina un destino neurogénico e interfiere en la generación de oligodendrocitos. Un grupo de células C donde se expresa Olig2 sirve como precursores (OPCs) que desarrollan oligodendrocitos. Células Olig2 positivas dan lugar a oligodendrocitos jóvenes migratorios que migran radialmente de la SVZ al cuerpo calloso, al estriado próximo, y al fornix para diferenciarse en oligodendrocitos no milinizantes y mielinizantes. La migración de los oligodendrocitos progenitores se hace como células aisladas o en pequeños grupos pero no en cadenas o envueltas en tubos gliales como en la RMS. A diferencia del gran número de neuronas neogeneradas en la SVZ solo se producen normalmente en el cerebro adulto pocos oligodendrocitos pero se incrementan después de lesiones demielinizantes. El incremento de la expresión de Olig2 da lugar a un aumento de la oligodendrogénesis acompañado por la disERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el sistema nervioso central adulto 159 minución de los precursores neuronales así como de las neuronas que llegan al bulbo olfatorio mientras que su falta resulta en una completa pérdida de oligodendrocitos. Las células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) expresan marcadores como el glicolípido O4 y el receptor α del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-α). Además GFAB se expresa en el citoplasma y procesos de oligodendrocitos inmaduros. Las células precursoras de oligodendrocitos en el cuerpo calloso son PSA-NCAM positivas y también para el protoglicano condroitin-sulfato NG2. Rip (receptor interactin protein) se expresa en progenitores de oligodendrocitos no mielinizante y MOG (myelin/oligo-dendrocyte glycoprotein) es un marcador de oligodendrocitos maduros mielinizantes. Olig2 es un marcador de células C y de oligodendrocitos precursores migratorios. El mecanismo por el cual Pax6 y Olig2 promueven linajes neurogénicos u oligodendrogénicos implica a señales BMP. BMP es una de las señales más tempranas que permite la progresión hacia un linaje neurogénico inhibiendo la generación de oligodendocitos. BMP vía Smad4 inhibe a Olig2 y promueve la neurogénesis en la SVZ. Interfiriendo la actividad de BMP por la infusión intraventicular de Noggin se incrementa la actividad de Olig2 generando oligodendrocitos a expensas de la neurogénesis. Por otra parte, Olig2 y Pax6 se auto-reprimen contribuyendo a estabilizar el destino celular neuronal o glial (Figura 27). RBP-J promueve la neurogénesis inhibiendo la oligodendrogénesis a través de la regulación de la transcripción de Olig2. La pérdida de RBP-J disminuye las células granulares del bulbo olfatorio y aumenta las células progenitoras de oligodendrocitos. RBP-J es una proteína de unión a DNA formando un complejo con co-represores como SMRT, N-CoR y MINT para reprimir la transcripción de genes. Las células de la SVZ se activan en respuesta a señales patológicas como trauma, isquemia, neurodegeneración, inflamación, Figura 27. Los factores de transcripción Olig2 y Pax6 implicados en la formación de oligodendrocitos y neuronas a partir de progenitores de la SVZ ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis 160 y demielinización. Lesiones cerebrales originan un incremento de Olig2. Lesiones demielinizantes del cuerpo calloso producen incremento de células progenitoras en la SVZ seguido por células PSA-NCAM positivas que migran al área de lesión donde generan astrocitos y oligodendrocitos pero no neuronas. En pacientes con enfermedad de Huntington, Alzheimer, o epilepsia hay un aumento de la proliferación y neurogénesis en la SVZ. La elevada densidad celular se correlaciona con el incremento de Olig2. Ref. 11, 31, 33, 46, 82, 94, 99, 134, 147, 152, 175, 194. Bibliografía consultada 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Abrous DJ, Koehl M, Le Moal M. Adult neurogenesis: from precursors to network and physiology. Physiol Rev 85:523-569, 2005. Ahlenius H, Visan V, Kokaia M, et al. 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Debido a su posición no protegida pueden ser fácilmente dañadas pero por otra parte, tienen la capacidad de recuperación después de la lesión manteniendo la función sensorial. Las persistente capacidad de las células progenitoras en las capas basales del epitelio olfatorio de proliferar durante toda la vida y la formación de nuevas neuronas así como la generación de un solo tipo neuronal hacen del epitelio olfatorio un modelo idóneo para el estudio de la neurogénesis. La mucosa olfatoria La mucosa olfatoria es un epitelio seudoestratificado que reposa en una lámina propia. El epitelio está compuesto por células cuyos cuerpos están dispuestos en una organización laminar de tres capas. La capa basal, adyacente a la lámina basal, está compuesta por células basales horizontales (HBCs) y células basales globulosas (GBCs). La capa intermedia contiene neuronas que presentan un gradiente de maduración de apical a basal de modo tal que las neuronas maduras se encuentran más cerca de la capa apical. La capa apical también contiene los núcleos y la mayor parte del cuerpo de las células de soporte. Las células basales son una población de células madre del epitelio olfatorio caracterizadas por su auto-renovación y pluripotencialidad. Las células basales horizontales están situadas adyacentes a la lámina basal, son morfológicamente planas y expresan citoqueratinas mientras que las células basales globulosas están situadas inmediatamente por encima y son morfológicamente redondas. Las neuronas sensoriales olfatorias (OSNs) maduras tienen sus cuerpos celulares en la, capa intermedia y proyectan una sola dendrita a la superficie del neuroepitelio olfatorio y un solo axón al bulbo olfatorio. La dendrita tiene un engrosamiento terminal, conocido como vesícula o botón olfatorio, que se extiende a la superficie del epitelio y contiene cílias con receptores de membrana donde se unen las moléculas odoríferas. Los axones de las neuronas receptoras cruzan la membrana basal hacia la lámina propia donde se reúnen en fascículos y nervios, atraviesan la ERRNVPHGLFRVRUJ 174 Neurogénesis Figura 1. Representación esquemática de la estructura del epitelio olfatorio de ratón adulto. Modificado de Beites et al. placa cribiforme para hacer sinapsis en el bulbo olfatorio. Las OSNs maduras expresan la proteína marcadora olfatoria que sirve como su seña. En una posición más basal se encuentran OSNs inmaduras que expresan GAP-43 pero no la proteína marcadora olfatoria. La transición de neuronas inmaduras a maduras es aproximadamente de una semana. Las células de soporte son células no neuronales que rodean a las neuronas olfatorias. Tienen forma de botella con un proceso apical estrecho, extendiendo un manojo de microvellosidades en la mucosa olfatoria. Expresan citokeratinas y numerosos citocromo P450 y otras enzimas transformadoras sugiriendo que sirven como detoxicantes y para mantener un adecuado medio iónico a su alrededor. Poseen también capacidad para fagocitar neuronas muertas. Hay además células con microvellosidades (células microvellares) distintas a las células de soporte. La lámina propia contiene fascículos de axones cubiertos por células olfatorias envolventes, vasos sanguíneos, tejido conectivo, fibroblastos, y glándulas de Bowman que se extienden de la lámina propia a través del epitelio para descargar su contenido en la superficie apical (Figura 1). Neurogénesis Las neuronas olfatorias continúan regenerándose a través de toda la vida. Las neuronas receptoras olfatorias que se pierden constantemente son remplazadas por nuevas neuronas manteniendo constante la población neuronal. La disminución de las ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el epitelio olfatorio 175 neuronas olfatorias por lesión también estimula el incremento de la proliferación de las células progenitoras generando nuevas neuronas para reemplazar a las que se han perdido. El epitelio olfatorio adulto está, en consecuencia, en un equilibrio dinámico entre el nacimiento de células basales, la diferenciación neuronal, y la apoptosis de células basales y neuronales. La apoptosis tiene lugar en todos los periodos del desarrollo de las neuronas olfatorias. Este equilibrio es regulado por señales que estimulan o inhiben la proliferación. Las neuronas olfatorias en roedores adultos se originan a partir de las células basales que progresan a través de un linaje neuronal expresando sucesivamente factores de transcripción característicos de los diferentes tipos celulares. Las HBCs son células keratina positivas que experimentan una lenta división asimétrica que mantiene su población y genera un conjunto de progenitores amplificadores transitorios que se dividen más rápidamente destinados a un linaje neuronal. En condiciones normales, las células basales horizontales son una población relativamente inactiva que se dividen cada 60 días a diferencia de las GBCs que lo hacen una vez por día. Sin embargo, en condiciones experimentales, que producen severa pérdida de las neuronas receptoras olfatorias, las HBCs se estimulan para proliferar y diferenciarse para dar origen a las GBCs y subsecuentemente repoblar las células neuronales y no neuronales del epitelio olfatorio. Por su capacidad proliferativa representarían una población de células madre (SC, stem cells). También han sido consideradas como creadoras de un ambiente neurogénico para las capas adyacentes. Las GBCs son progenitores keratina negativos que se dividen rápidamente destinados a un linaje neuronal. Las células basales globulares serían una población intermedia de células progenitoras con menor capacidad de auto-renovación que las células madre pero con mayor probabilidad de iniciar la diferenciación terminal. Esta población generaría neuronas en condiciones normales o inducida por medianas degeneraciones. Las GBCs contienen dos poblaciones de progenitores, una de progenitores que expresan Mash1, son una población de células amplificadoras transitorias, y una segunda, hija del progenitor que expresa Mash1 conocida como precursor neuronal inmediato (INP), que expresa Neurogenina1 (Ngn1), que puede también experimentar una o dos divisiones celulares antes de diferenciarse en neuronas receptoras olfatorias (Figura 2). La acción de Mash1 se necesita para el desarrollo de neuronas receptoras olfatorias y en condiciones en que se induce neurogénesis. Mash1, que se expresa en los estadios tempranos del desarrollo de los progenitores, está implicado en seleccionar las ERRNVPHGLFRVRUJ 176 Neurogénesis células progenitoras que se volverán competentes para adquirir un determinado destino (determinación). En su ausencia las células progenitoras están presentes en gran número pero no se diferencian por lo que los INPs y las neuronas receptoras olfatorias no se desarrollan. A medida que los progenitores que expresan Mash1 progresan en su desarrollo pierden la expresión de Mash1 e incrementan la expresión de Ngn1. La expresión de Ngn1 define a un precursor neuronal destinado a diferenciarse en neuronas receptoras olfatorias. En su ausencia las neuronas receptoras olfatorias no se diferencian. En humanos no existe la diferencia en HBCs y GBCs, sólo se encuentran células globulosas adyacentes a la lámina basal y en la capa colindante superior expresando ambas citoqueratina. Después de una o varias divisiones los INPs se diferencian en neuronas olfatorias inmaduras. Las neuronas olfatorias inmaduras son células bipolares que expresan β-tubulina, GAP43, SCG10 y NCAM, cuyo desarrollo a neuronas olfatorias maduras implica el desarrollo de dendritas y axones que proyectan a las superficies apical y basal respectivamente (Figura 2). Los axones atraviesan la lámina cribiforme para terminar en los glomérulos de los bulbos olfatorios. Las neuronas olfatorias inmaduras expresan los factores de transcripción NeuroD y Runx1. NeuroD y Runx1 actúan cuando los INPs experimentan su diferenciación terminal en neuronas receptoras olfatorias. Runx1 previene la prematura diferenciación de células progenitoras y también regularía la expresión de NeuroD, en su ausencia disminuye el número de células que expresan NeuroD. La proteína homeodominio Lhx2 se requiere para el desarrollo de las neuronas senso- Figura 2. Secuencia de diferenciación de los diferentes tipos celulares del epitelio olfatorio. ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el epitelio olfatorio 177 riales olfatorias y en su ausencia las neuronas maduras no seproducen. El defecto del desarrollo de las neuronas olfatorias se situaría entre las neuronas inmaduras y las neuronas maduras. Regulación de los progenitores olfatorios Las SCs y las células progenitoras así como la lámina propia en el nicho del epitelio olfatorio secretan molécula señales que estimulan la proliferación y diferenciación. Las SCs y las células progenitoras expresan factores intrínsecos capaces de responder a esas señales. La proliferación de las HBCs en cultivos e in vivo se activa en respuesta a TGF-α y EGF que activan la familia de receptores ErbB. Las HBCs expresan los receptores ErbB-1 y ErbB-2 a los que se une TGF-α. El incremento de la actividad de TGF-α aumenta la proliferación de las HBCs. Sin embargo, la eliminación de TGF-α no suprime la baja proliferación en el epitelio olfatorio sugiriendo que otros factores pueden estar implicados. Las HBCs expresan el factor de transcripción p63 necesario para su generación durante el desarrollo y cuando se requiere la activación de sus reservas. p63 disminuye en HBCs activadas por lesión para generar GBCs (Figura3). Las GBCs, por su parte, responden a FGF2. En cultivos, FGF2 aumenta la proliferación de INP promoviendo varios ciclos de división. Las GBCs expresan receptores FGFR1 y FGFR2. En condiciones normales un pequeño número de neuronas receptoras olfatorias que mueren constantemente son remplazadas por un bajo nivel de neurogénesis. La renovación de las neuronas olfatorias es también estimulada por lesiones del epitelio olfatorio. Las lesiones del epitelio olfatorio pueden producirse por su exposición directa a distintos agentes tóxicos que lesionan diferentes tipos celulares o por degeneración selectiva de neuronas seccionando sus axones o removiendo el bulbo olfatorio. En respuesta a lesiones del epitelio olfatorio, cuando gran número de neuronas mueren, aumenta la proliferación de progenitores neuronales y la generación de nuevas neuronas. Se ha sugerido que el número de neuronas en el epitelio olfatorio podría ser regulado por señales inhibidoras producidas por las propias neuronas que inhibirían la proliferación de sus progenitores manteniendo un equilibrio dinámico entre producción y muerte neuronal. Miembros de la superfamilia TGF-β (transforming growth factor-β), particularmente BMPs y GDF11 (growth and differentiation factor 11), podrían ser los responsables de tales señales inhibidoras. BMPs actúa en la neurogénesis del epitelio olfatorio en forma concentración dependiente. En cultivos, altas concentraciones de ERRNVPHGLFRVRUJ 178 Neurogénesis BMP2, 4, y 7 inhiben la proliferación y la diferenciación de progenitores proliferantes actuando a través de la degradación proteolítica de Mash1. Por el contrario, bajas concentraciones de BMP4 pero no de BMP7 aumentan la neurogénesis promoviendo la supervivencia de neuronas olfatorias. Noggin es un antagonista BMPs que inhibe su acción antineurogénica. GDF11, expresado por neuronas receptoras olfatorias, impide la división de INPs deteniendo su ciclo celular por aumento de la expresión del inhibidor de la kinasa ciclina dependiente p27 Kip1. La falta de la función Gdf11 incrementa la proliferación INP y por el contrario, la falta del antagonista GDF11, follistatin, disminuye la neurogénesis del epitelio olfatorio. La acción inhibidora de DGF11 podría permitir a los INPs mantenerse en reposos hasta que sea necesario para remplazar a las neuronas olfatorias muertas. Las neuronas lesionadas también emiten señales que estimulan la producción de nuevas neuronas y contribuyen a mantener el epitelio olfatorio. Entre estas señales se encuentran factores de crecimiento y citoquinas. Las neuronas lesionadas segregan LIF e incrementan el mRNA de LIFR. Los receptores se localizan en las GBCs. LIF estimula la proliferación de GBCs después de remover los bulbos olfatorios y en su ausencia este efecto se anula. La proliferación es también estimulada por óxido nítrico liberado durante la muerte celular (Figura 3). Regulación de la diferenciación de neuronas receptoras olfatorias La diferenciación de las neuronas sensoriales olfatorias es inducida in vitro por TGFβ2, IGF1 y dopamina. TGFβ2 en cultivos induce la diferenciación de GBCs a neuronas inmaduras. Dopamina induce la diferenciación y maduración neuronal actuando vía receptores D2. IGF1 (insulin-like growth factor1) y sus re- Figura 3. Factores reguladores de la proliferación de células progenitoras y diferenciación de neuronas sensoriales olfatorias . ERRNVPHGLFRVRUJ Neurogénesis en el epitelio olfatorio 179 ceptores son expresados por GBCs y por neuronas olfatoria. IGF1 reduce el número de precursores neuronales proliferantes induciendo su diferenciación a neuronas. Dopamina e IGF1 se encuentran en el mucus que baña el epitelio olfatorio y pueden actuar en el desarrollo de las neuronas cuyas dendritas llegan a la superficie epitelial. Dopamina también podría actuar en los axones de las neuronas en el bulbo olfatorio provistas por las interneuronas periglomerulares. PDGF-AB (platelet-derived growth factor-AB) y BDNF promueven la supervivencia de neuronas diferenciadas en cultivo. Bibliografía consultada 1 Asan E, Drenckhahn D. Immunocytochemical characterization of two types of microvillar cells in rodent olfactory epithelium. Histochem Cell Biol 123: 157-168, 2005. 2 Bauer S, Rasika S, Han J et al. 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