1 Desarrollo y Evaluación de un Biofertilizante Microbiano para el Cultivo de Alfalfa Laura Sofia Torres Vásquez- 20231180034 Universidad Distrital Francisco José de Caldas – Facultad de Medio ambiente y Recursos Naturales Microbiología- Grupo 545 Doc. Lena Carolina Echeverry 04 de junio de 2024 2 INDICE Resumen ............................................................................................................................................. 3 Introducción....................................................................................................................................... 4 Objetivos e hipótesis .......................................................................................................................... 6 Objetivo General ........................................................................................................................... 6 Objetivos Específicos .................................................................................................................... 6 Hipótesis ......................................................................................................................................... 6 Marco teórico ..................................................................................................................................... 7 Cultivo de alfalfa ........................................................................................................................... 7 Sustratos en cultivo de alfalfa ...................................................................................................... 7 Acción biológica ............................................................................................................................. 8 Bioinsumos ..................................................................................................................................... 9 Agricultura Ecológica ................................................................................................................. 10 Metodología ..................................................................................................................................... 11 Diseño experimental .................................................................................................................... 11 Variables experimentales ........................................................................................................ 11 Grupos experimentales y de control ...................................................................................... 12 Procedimiento .............................................................................................................................. 12 Resultados y Discusión .................................................................................................................... 15 Procesos de purificación y mantenimiento................................................................................ 15 Identificación de género y especie .............................................................................................. 17 Evaluación del proceso de fijación biológica por microrganismos simbiontes obligados en un modelo biológico..................................................................................................................... 17 Conclusiones .................................................................................................................................... 18 Referencias ....................................................................................................................................... 19 3 3 Resumen En el siguiente proyecto se evalúa la efectividad del biofertilizante hecho a partir del microrganismo Bacillus Sutilus en los cultivos alfalfa, biofertilizantes que han demostrado ser útiles en el crecimiento de las plantas, mediante sustratos como la arena gruesa que favorece a la aeración y el compostaje que es de bajo costo y mejora la fertilidad del suelo. El estudio utilizó como variable modificadora el biofertilizante y como variables sin modificar aquellas que pertenecen al ambiente, además se incluyeron dos grupos controles; uno con compostaje y otro con arena gruesa. Durante el semestre académico se realizaron diferentes procesos como la obtención, desinfección, purificación y caracterización del microorganismo para evaluar su efectividad como significativa entre el grupo control y el grupo de tratamiento. Abstract The following project evaluates the effectiveness of the biofertilizer made from the microorganism Bacillus Sutilus in alfalfa crops, biofertilizers that have proven to be useful in plant growth, using substrates such as coarse sand, which favors aeration, and compost, which is low cost and improves soil fertility. The study used as modifying variable the biofertilizer and as unmodified variables those that belong to the environment, in addition, two control groups were included; one with compost and the other with coarse sand. During the academic semester, different processes were carried out such as obtaining, disinfection, purification and characterization of the microorganism to evaluate its effectiveness as significant between the control group and the treatment group. 4 Introducción La sostenibilidad y sustentabilidad son metas que rigen el mundo actual, especialmente en el cultivo y siembra, donde se busca mantener la producción sin agotar los recursos naturales y producir productos que satisfagan las necesidades humanas y del medio ambiente sin dañar su equilibrio; para ello el ser humano trabaja constantemente en técnicas que incluyen estas metas, un ejemplo de que se está logrando este objetivo es mediante lo que se busca el cultivo de alimentos sostenibles sin mayores efectos negativos. En el presente documento se utilizan los conceptos previamente mencionados para demostrar la efectividad de los biofertilizantes aplicados en el cultivo alfalfa el cual cuenta con adaptabilidad ecológica y alto valor nutricional además de fijación biológica de nitrógeno. Para su optimización se usará el compostaje y la arena gruesa. Ahora bien, ¿Como será la construcción del biofertilizante?, esta se obtendrá a partir del microorganismo Bacillus Subtilis es cual cuenta con características como la gran adaptabilidad a condiciones del ambiente adversas y la facilidad del estudio de la división celular y la secreción de proteínas (Kovács, 2019). La adaptabilidad de este microorganismo se basa en que es predilecto para suprimir enfermedades causadas por patógenos y sintetizan antioxidantes que ayudan a la planta en su defensa, de igual manera mejora la fijación del nitrógeno y la producción de sideróforos que promuevan el crecimiento óptimo de la planta. Los efectos del biofertilizante se notarán a partir de la coloración de las hojas y el tamaño en comparación con el grupo control. Las variables del estudio determinarán los resultados a obtener, para ello se dividió el grupo control y de tratamiento en dos, teniendo en cuenta el uso de dos sustratos determinantes, el compostaje y la arena gruesa. Para llevar a cabo el estudio primero realizó 5 la obtención del material y su respectiva desinfección con alcohol, el siguiente paso resultó clave en la investigación pues fue el uso del medio de cultivo conocido como YMA-RC el cual fue divido en 4 secciones (correspondiendo a los grupos mencionados), el proceso tuvo una duración de 4 semanas. Posteriormente se caracterizó el microorganismo a partir de una lectura para determinar sus características morfológicas por medio de tinciones como la tinción de Gram o la tinción de tinta china. Para identificar el género y la especie la investigación se basó en el manual de Bergey, teniendo en cuenta los resultados que arrojaron las diferentes pruebas realizadas al microrganismo como lo fueros pruebas bioquímicas, enzimáticas y evaluación en diferentes tipos de medios. Posterior a ello mediante un caldo de YMA que contuviera colonias identificadas posiblemente como el microorganismo Bacillus Subtilis en las plantas utilizadas como tratamiento en el diseño experimental mediante la técnica de riego. Durante el estudio se identificaron errores técnicos que afectaron el procedimiento y el resultado final, pero a pesar de eso el biofertilizante logro aportar significativamente a las plantas de alfalfa de tratamiento. Para concluir se define la relación que pueda llegar a establecerse entre las variables que conforman el diseño experimental de la investigación, si en esta se alcanzó el objetivo planteado y un análisis de la hipótesis con las posibles situaciones que pudieran llegar a impedir la realización de esta. 6 Objetivos e hipótesis Objetivo General Evaluar la efectividad del biofertilizante desarrollado a lo largo del semestre académico en el cultivo de alfalfa, su capacidad de fijar nitrógeno y las variables que pueden influir en el resultado final. Objetivos Específicos • Recopilar y seleccionar información conceptual de alta calidad que abarque lo fundamental acerca de conceptos básicos del proyecto, como bioinsumos, bacterias fijadoras de nitrógeno y cultivo de alfalfa, que le den al proyecto una base teórica sólida. • Organizar toda la información recolectada a lo largo del desarrollo del biofertilizante, para facilitar su acceso y comprensión. • Contrastar la información teórica con los resultados experimentales obtenidos durante la evaluación del biofertilizante para llegar a conclusiones fundamentadas. Hipótesis El biofertilizante mejorará significativamente la fijación de nitrógeno y el crecimiento del cultivo de alfalfa en comparación a cultivos que no hacen uso de este u otro método tradicional. 7 Marco teórico Cultivo de alfalfa La alfalfa es una planta leguminosa, las cuales se caracterizan por su capacidad de establecer una interacción simbiótica con los rizobios y formar nódulos fijadores de nitrógeno puesto que dentro de los nódulos las bacterias pueden convertir el gas nitrógeno (N2) a iones de amoniaco que son utilizados por el huésped para sintetizar y liberar muchas moléculas y enzimas promotoras que estimulan directa o indirectamente el crecimiento de las plantas en diferentes condiciones ambientales. Se considera que la alfalfa es moderadamente tolerante a la salinidad, sin embargo, su crecimiento y productividad se ven muy reducidos bajo el estrés salino severo (Wang et al., 2022). La alfalfa se considera un excelente forraje para plantas leguminosas perennes por su amplia adaptabilidad ecológica, alto valor nutricional, palatabilidad, fijación biológica de nitrógeno y producción de biomasa. Se cultiva en todos los continentes pues juega un papel muy importante en la construcción ecológica, la ganadería y la agricultura (D. Wang et al., 2016). Sustratos en cultivo de alfalfa El compostaje es un método de biorremediación de suelos de bajo costo, efectivo y sencillo, mejora la fertilidad del suelo, las propiedades físicas y biológicas del suelo, y el rendimiento de cultivos, su utilización promueve a la disponibilidad de nutrientes, el crecimiento de las plantas estimula su respiración, fotosíntesis y el contenido de clorofila, además puede recuperar suelos afectados por la salinidad (Mbarki et al., 2018) 8 La arena gruesa es un sustrato que se puede encontrar en todos los ambientes La arena tiene partículas de diferente tamaño considerándose como un sustrato deseable, pues tiene propiedades físicas óptimas para el desarrollo de cultivos, tales como son porosidad y gran capacidad de retención de humedad, drenaje rápido y buena aireación, evitando que las plantes por exceso de agua promoviendo el crecimiento saludable de las raíces y previniendo enfermedades relacionadas con el encharcamiento (Ángel et al., s. f.) Acción biológica Bacillus subtilis es una especie del genero Bacillus que se caracteriza por su competencia natural para la captación de ADN extracelular y facilita la absorción de este. Las esporas latentes de esta bacteria pueden sobrevivir a sustancias adversas como altas temperaturas, desecación, radiación UV o γ, depredación por microorganismos o macroorganismos. B. subtilis puede aislarse en diversos ambientes, desde el suelo hasta habitad marinos y es utilizado en diversas aplicaciones desde el biocontrol de plantas hasta la producción de enzimas y fermentación de alimentos. Es un microorganismo modelo para estudiar la división celular, la secreción de proteínas, la motilidad superficial (nadar, enjambre y deslizarse), el desarrollo de biopelículas y adhesión a la raíz de la planta o hifas fúngicas (Kovács, 2019). Las especies Bacillus son un tipo importante de rizobacterias que forman esporas que pueden sobrevivir en el suelo durante un largo periodo de tiempo bajo condiciones adversas y además exhibe un mecanismo de biocontrol directo e indirecto. En el mecanismo directo se encarga de suprimir enfermedades causadas por patógenos al 9 sintetizar muchos metabolitos secundarios, hormonas, enzimas que degradan la pared celular y antioxidantes que ayudan a la planta en su defensa y en el mecanismo indirecto incluye la estimulación del crecimiento de las plantas y la inducción de la resistencia sistémica adquirida. Solubiliza el P del suelo, mejora la fijación del nitrógeno, produce sideróforos que promueven su crecimiento, mejora la tolerancia al estrés a sus plantas hospederas, al inducir la expresión de genes de respuesta al estrés, fitohormonas y metabolitos relacionados con el estrés (Hashem et al., 2019). Todos estos factores se identifican en la planta con detalles a simple vista como el color de las hojas, las que cuenten con un verde oscuro cuentan con suficiente nitrógeno, un color verde más intenso indica una buena disponibilidad de nitrógeno mientras que hojas amarillentas indican una deficiencia de este. Mayor altura y robustez en comparación con aquellas que no cuenten con suficiente nitrógeno, densidad de las hojas y presencia de nódulos en las raíces. Bioinsumos Son productos de origen biológico que hacen parte de las opciones más atractivas vinculadas a las soluciones sustentables en las industrias del sector agro-biotecnológico pues incorporan las buenas prácticas agrícolas ligadas a acciones amigables con el ambiente. La fertilización biológica en la que intervienen diferentes microorganismos es utilizada en la agricultura para mejorar la eficiencia en el uso de nutrientes con distintos efectos favorables como la promoción de su crecimiento vegetal, fijación de nitrógeno, solubilización de nutrientes, efectos de biocontrol y mejora de la tolerancia a patógenos 10 entre otros. La producción de estos influye en los diversos tipos de agricultura sostenible y ecológicamente más limpia para la evolución de la larga preocupación mundial con respecto a la conservación de los recursos naturales del ambiente (Lagler, 2017). Agricultura Ecológica El concepto de agricultura ecológica nace a partir de la conciencia que se toma de la importancia de consumir alimentos sostenibles y naturales, es un método de producción agrícola que se basa en el cultivo de alimentos a partir de elementos orgánicos sin utilizar productos químicos que dañen el medioambiente. Estas practicas de cultivo mantienen e incrementan la materia orgánica del suelo, refuerzan la estabilidad y biodiversidad edáficas para prevenir la compactación, la erosión del suelo, daños por plagas y/o malas hierbas con métodos naturales (Capital, 2022). La sustentabilidad puede ser entendida como la producción de bienes y servicios, donde se satisfagan las necesidades humanas y se garantice una mejor calidad de vida a la población en general, con tecnologías limpias no destructivas con la naturaleza, fortaleciendo las condiciones del medio ambiente y aprovechando los recursos naturales, dentro de los límites de la regeneración y el crecimiento natural (Ávila, 2018) La sostenibilidad se define como la capacidad de mantener una actividad o proceso sin agotar los recursos naturales o causar un impacto negativo en el medio ambiente. Se centra en la conservación y el equilibrio a largo plazo, asegurando que las necesidades actuales se satisfagan sin comprometer las necesidades futuras (Díaz, 2023) 11 Metodología La metodología utilizada es la explicativa, la cual se centra en identificar las relaciones de causa y efecto, para explicar el como y el porque ocurren ciertos eventos al comprender relaciones entre variables que no dependen ni pueden ser manipuladas por el investigador directamente. La hipótesis a través de esta metodología puede ser probada mediante la recopilación y el análisis de datos (Busayo.Longe, 2022). Por lo que esta metodología permite analizar como los resultados experimentales recogidos de experimentos controlados que buscaban evaluar la efectividad del biofertilizante, se ajustan a la teoría sobre la fijación de nitrógeno y el uso de biofertilizantes. Además de describir y correlacionar datos, permite profundizar en la compresión de las variables y mecanismos que determinan la efectividad del biofertilizante en el cultivo de alfalfa. Diseño experimental Para la evaluación del biofertilizante desarrollado en el laboratorio en el cultivo de alfalfa se consideraron variables modificadas y variables no modificadas y definidas las variables a estudiar el experimento se diseñó de la siguiente manera: Variables experimentales • Las variables modificadas fueron la aplicación del biofertilizante, pues se definieron unas plantas de control a las cuales no se les rego con este y plantas de tratamiento a las cuales sí. Y un sustrato que potenciara el crecimiento de la planta, con presencia o ausencia de arena gruesa, por lo cual plantas de control con sustrato de tierra y compost y plantas de tratamiento con compost y arena gruesa mezcladas con tierra como sustrato. 12 • Las variables no modificadas fueron las condiciones ambientales como la luz, temperatura y humedad que las determinaba el invernadero de la sede Vivero. Y de la frecuencia y cantidad de riego, todas las plantas utilizadas en el experimento recibieron estas variables de la misma manera. Grupos experimentales y de control Grupos de control • Un cultivo de alfalfa sin biofertilizante en sustrato de tierra con compost. • Un cultivo de alfalfa sin biofertilizante en sustrato de tierra con compost mezclado con arena gruesa. Grupos de tratamiento • Dos cultivos de alfalfa con biofertilizante en sustrato de tierra con compost. • Dos cultivos de alfalfa con biofertilizante en sustrato de tierra con compost mezclado con arena gruesa Procedimiento Obtención de material biológico vegetal. De tréboles o leguminosas con nódulos activos de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico se seleccionó el material vegetal con nodulaciones en la raíz, se lavó cuidadosamente las raíces para eliminar toda la tierra y cortar los nódulos a nivel de la raíz con una cuchilla estéril sin arrancarlos o cortarlos, para posteriormente desechar el resto del material vegetal. 13 Desinfección del material biológico. Las raíces noduladas fueron colocadas en alcohol al 70% durante cinco minutos, luego con pinzas se pasaron a un vaso de precipitado con agua, para agitar suavemente y retirar. Seguidamente, las raíces se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 2% por un minuto, y el proceso de transferencia y agitación en agua se repitió cinco veces para eliminar residuos de alcohol e hipoclorito de sodio. Procesos de purificación y mantenimiento. En un medio de cultivo YMA-RC que fue dividido en 4 secciones en las cuales a cada una se le colocaron dos nódulos previamente cortados por mitad para realizar una siembra directa, se ingresó a encubar a una temperatura de 37°C por 3 a 5 días. Semanalmente se fueron aislando las UFC obtenidas para garantizar una purificación y aislamiento adecuado del microrganismo, este proceso se realizó durante 4 semanas aproximadamente en el laboratorio, a partir de resiembra en el medio YMA-RC con diferentes métodos como el de rejilla y francés. Caracterización de microorganismo con interés de bioproducto. Semanalmente a cada una de las resiembras realizadas se les realizo una lectura macroscópica para determinar su forma, elevación, margen, color y mate. También se realizaron diferentes tinciones para caracterizarlo microscópicamente como lo fueron tinción de Gram para registrar su morfología microbiana e identificar si era un gran-positivo o un Gramnegativo, tinción de verde malaquita para identificar endo y exoesporas, tinción de tinta china para observar glicocálix y la tinción de Leifson para observar flagelos. Además, se realizaron pruebas bioquímicas y enzimáticas con el microorganismo. Identificación de género y especie. Con los resultados obtenidos a lo largo de la caracterización del microorganismo, se realizó primero la observación morfológica que 14 incluye la forma de las células, sus estructuras especiales y agrupaciones celulares; se identificaron las condiciones óptimas de crecimiento temperatura, pH, oxigeno,etc.., la apariencia de colonias, su capacidad para fermentar diferentes azucares, producción de enzimas y reacciones metabólicas especificas . Proceso de fermentación para obtener el cultivo microbiano. En un tubo con 10 ml de agua peptonada, con un asa redonda bacteriológica se depositaron las colonias identificadas de microorganismos fijadores de nitrógeno con capacidad de realizar nodulación. Se resuspendió y homogenizó la muestra, luego se transfirió los 10 ml al Erlenmeyer que contiene 90 ml de caldo YMA y finalmente se realizó el proceso de fermentación durante 24 horas. Evaluación del proceso de fijación biológica por microrganismos simbiontes obligados en un modelo biológico. Para evaluar el proceso de nodulación con los microorganismos aislados de los nódulos, se realizaron los controles de tratamiento y control especificados en el diseño experimental, modificando la forma de inoculación. Los montajes de tratamiento fueron inoculados mediante la técnica de riego. Se marcaron las materas como Tratamiento, se llenaron con el sustrato especifico luego se realizaron surcos de 2 cm de profundidad, fueron colocadas varias semillas de alfalfa anteriormente desinfectadas y cubiertas con el suelo sin presionarlo. Se regaron aproximadamente 20 ml de caldo fermentado a cada matera de tratamiento y 24 horas después de la siembra, se inició el riego con agua cada 3 días, a cada plata se le agregaba agua hasta que cubriera completamente la tierra y saliera por los orificios de la matera. 15 Resultados y Discusión Procesos de purificación y mantenimiento Se realizaron resiembras durante aproximadamente 4 semanas las cuales fueros registradas desde el 10/04/2024- 29/04/2024 como es evidente en los siguientes anexos: • Anexo 1. Siembra 10/04/2024 • Anexo 2. Siembra 16/04/2024 • Anexo 3. Siembra 24/04/2024 • Anexo 4. Siembra 29/04/2024 Como es posible identificar en los anexos las dos primeras siembras registran pocas UFC y biomasa escasa, situación que retraso e hizo mas complicado el proceso de caracterización por posibles errores técnicos en la siembra que impidieron generar UFC desde el inicio, esto también se le suma la poca práctica a la hora de realizar siembra, la cual fue mejorando con el trabajo en laboratorio como se demuestra en los últimos anexos Caracterización de microorganismo con interés de bioproducto. Lectura macroscópica de siembra final. Anexo.4 UFC FORMA BORDE ELEVACIÓN COLOR BRILLANTE MATE 1 Circular Entera Elevada SI Naranja SI 16 Pruebas bioquímicas PRUEBA BIOQUÍMICA RESULTADO Citrato Negativo TSI Positivo para producción de gas y ausencia de fermentación de azúcares. Gelatina licuefacción Positivo, cambia a estado líquido Rojo de metilo Negativo, se mantiene el color amarillo SIM Motilidad Voges‐ Proskaue Negativo, se mantiene el color amarillo Reducción de nitrato Negativo Urea Negativo Evaluación de condiciones extrínsecas. EVALUACIÓN Medio pH 3 Medio pH 7 Medio pH 10 NaCl 5% NaCl 10% Sacarosa 10% Sacarosa 20% Temperatura alta 15 min Temperatura alta 30 min Temperatura baja 60 min RESULTADO Sin crecimiento Crecimiento Crecimiento Crecimiento Sin crecimiento Crecimiento Crecimiento Crecimiento Sin crecimiento Crecimiento Pruebas enzimáticas PRUEBAS Medio Almidón Medio Carboximetil celulosa Medio Libre de nitrogeno Medio de Fosfatos Ácido- Indol- Acético RESULTADOS Positiva producción de amilasas Negativo para producción de celulosas Medio completamente incoloro Negativo Buena producción de indol 17 Identificación de género y especie Todas estas pruebas mencionadas anteriormente fueron utilizadas para identificar un microorganismo desconocido y los resultados sugieren que probablemente el microorganismo es Bacillus Subtilis. En las pruebas bioquímicas como la prueba de citrato, TSI y la gelatina licuefacción indican características típicas de este microorganismo. El cual no puede utilizar citrato como única fuente de carbono (Levine, 1975) y tiene la capacidad de producir gas a partir de la descomposición de azucares (Phillips, 1976) y produce enzimas capaces de descomponer la gelatina (Cappuccino & Sherman, 2014). El crecimiento en diferentes condiciones de pH, concentraciones de sal y sacarosa, así como la tolerancia al calor y al frío, son consistentes con las características de Bacillus subtilis (Berlanga, 2010b) Las pruebas enzimáticas nos permitieron identificar que este microorganismo es capaz de descomponer almidón y no produce celulosas características típicas de Bacillus subtilis (Cappuccino & Sherman, 2014). Además, este microorganismo también es capaz de producir indol en ciertas condiciones (Levine, 1975). Evaluación del proceso de fijación biológica por microrganismos simbiontes obligados en un modelo biológico Es evidente como el sustrato y el biofertilizante influyeron positivamente en el crecimiento de la alfalfa, las plantas de tratamiento tienen mayor altura, mejor color y densidad de hojas y mayor cantidad de forraje de alfalfa, en comparación con las de control 18 y las que solo tienen tierra con compost. Se esperaba un mayor crecimiento por parte de esta, pero se intuye que en el proceso de siembra la cantidad se semillas excedió a la recomendada por lo que impidió un mayor crecimiento. El proceso es evidente en los anexos 5- 16. Conclusiones En definitiva, las variables seleccionadas no cuentan con una correlación directa, las variables modificadas son acciones que se tomaron en conjunto para modificar el entorno de crecimiento de las plantas, que fueron la aplicación del biofertilizante y la elección del sustrato con presencia o ausencia de arena gruesa. Mientras que las variables no modificadas como las condiciones ambientales y la cantidad/ frecuencia de riego no fueron alteradas intencionalmente como parte del experimento, por lo que se mantuvieron constantes para todas las plantas, tanto para las de control como las de tratamiento. Por ello y todo lo encontrado en la investigación se concluye que, se logró evaluar la efectividad del biofertilizante desarrollado y su capacidad de fijar nitrógeno, al mejorar significativamente el crecimiento del cultivo de alfalfa y posiblemente su fijación de nitrógeno en comparación a cultivos que no hacen uso de este, además de mencionar y destacar situaciones específicas que dificultaron el cumplimiento del objetivo, como lo fue el exceso de uso de semillas a la hora de sembrar y una mala obtención de UFC al inicio del proyecto por falta de práctica en laboratorio. 19 Referencias • Ángel, S. C. M., Pablo, P. R., Guillermo, G. C., Ernesto, F. R. J., Guillermo, G. L., Arnaldo, O. V. 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