Dirección General de Epidemiología lineamientos para la vigilancia epidemiológica de leishmaniasis por laboratorio Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos “Dr. Manuel Martínez Báez” LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LEISHMANIASIS POR LABORATORIO DGE-InDRE–RNLSP 2015 Fotografía de la portada propiedad de HKS Arquitectos P á g i n a 1 | 61 PRIMERA EDICIÓN, 2015 LEISHMANIASIS–RNLSP ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY © INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LEISHMANIASIS POR LABORATORIO” VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2015. COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ. FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO OBREGÓN, C. P. 01480, MÉXICO, D. F. WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX TEL. (55)53-42-75-50 LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DEL DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO P á g i n a 2 | 61 SECRETARÍA DE SALUD DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ SECRETARIA DE SALUD DR. EDUARDO GONZÁLEZ PIER SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS DR. GABRIEL O´SHEA CUEVAS COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIÓN SOCIAL EN SALUD LIC. MIKEL ARRIOLA PEÑALOZA COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS DR. JOSÉ MELJEM MOCTEZUMA COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MÉDICO DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD LIC. RODRIGO REINA LICEAGA TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIÓN Y PARTICIPACIÓN SOCIAL DR. NELLY AGUILERA ABURTO TITULAR DE LA UNIDAD DE ANÁLISIS ECONÓMICO LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIÓN SOCIAL DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDAN DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL DE ENFERMEDADES DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIÓN DE LA SALUD DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA P á g i n a 3 | 61 LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIÓN EN SALUD P á g i n a 4 | 61 INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO LIC. ADRIANA CASRTRO CABRERA SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN BIOL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY ASESORA TÉCNICA DE LA DIRECCIÓN M. EN C. BÉLEN TORRES LONGORIA JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS M. EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA P á g i n a 5 | 61 QFB. OCTAVIO CÉSAR RIVERA HERNÁNDEZ JEFE DEL LABORATORIO DE LEISHMANIA COORDINADOR DE LA RED DE DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA P á g i n a 6 | 61 GRUPO DE TRABAJO QFB. OCTAVIO CÉSAR RIVERA HERNÁNDEZ JEFE DEL LABORATORIO DE LEISHMANIA COORDINADOR DE LA RED DE DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA QFB. ROCIO ROBLEDO CARREÓN QFB. CRISTHIAN ZUÑIGA ORTEGA TEC. BEATRIZ ORNELAS PÉREZ ADSCRITOS AL LABORATORIO DE LEISHMANIA IBT. SUSANA CHÁVEZ LÓPEZ DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO P á g i n a 7 | 61 LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LEISHMANIASIS POR LABORATORIO DGE-INDRE–RNLSP 2015 P á g i n a 8 | 61 ÍNDICE INTRODUCCIÓN 10 ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIASIS 11 MARCO LEGAL 12 DEFINICIONES OPERATIVAS 13 OBJETIVOS 14 RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA LEISHMANIASIS 15 ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE LEISHMANIASIS 15 FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE LEISHMANIASIS 16 DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS POR LABORATORIO 20 TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS CLÍNICAS ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE LA LEISHMANIASIS ESTÁNDAR DE CALIDAD CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO 20 22 25 26 28 28 31 BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO 32 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 33 BIBLIOGRAFÍA 34 ANEXOS 36 ANEXO I. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS 37 ANEXO II. PREPARACIÓN DE REACTIVOS 53 P á g i n a 9 | 61 INTRODUCCIÓN Panorama epidemiológico En México la leishmaniasis es una enfermedad parasitaria causada por un protozoario perteneciente al género Leishmania, transmitida por un vector (Lutzomia), conocido en algunas zonas del país como jején, papalotilla, palomilla, quemador. La enfermedad en el ser humano se presenta de 4 formas clínicas: cutánea localizada (LCL), cutánea diseminada (LCD), mucocutánea (LMC) y visceral (LV) siendo esta última la forma clínica más grave, se presenta en niños menores de 5 años y puede ser mortal. La enfermedad es endémica en muchas regiones tropicales y subtropicales del mundo y está considerada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como una de las Enfermedades Tropicales desatendidas. En nuestro país, la mayoría de los casos de leishmaniasis corresponden a LCL, principalmente en el sureste del país en los estados de Veracruz, Tabasco, Oaxaca, Chiapas, Yucatán, Quintana Roo y Campeche, lo que constituye el foco sur, de igual manera se han reportado casos en Coahuila, Nuevo León, Tamaulipas, Hidalgo, San Luis Potosí (foco norte), aunque también en Nayarit en el Noroeste se ha presentado casos. La leishmaniasis cutánea diseminada se ha reportado con menor frecuencia y se localizan en ambos focos (sur y norte), con excepción de Yucatán y Quintana Roo. Los casos de LMC se han detectado en los estados de Veracruz, Tabasco, Chiapas y Oaxaca. En cuanto a la LV existe un foco en la cuenca del río Balsas, entre los estados de Guerrero, Puebla, Morelos y otro foco en Chiapas. Las leishmaniasis son parasitosis consideradas como zoonosis, donde pequeños mamíferos silvestres y cánidos domésticos son reservorios importantes. Las acciones de vigilancia epidemiológica se apoyan en el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SiNaVE), el cual cuenta con el laboratorio de leishmaniasis del Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) para llevar a cabo las actividades para el diagnóstico, control de calidad y referencia de esta enfermedad de manera oportuna y uniforme. El presente documento establece los lineamientos de operación para la vigilancia basada en el laboratorio de leishmaniasis incluyendo las funciones por niveles; la toma, manejo y envío de muestras; la metodología para el análisis de muestras, la evaluación del desempeño así como los estándares de calidad. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de laboratorios para la vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de recursos P á g i n a 10 | 61 humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de laboratorio en muestras biológicas. La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) su órgano rector en el área de vigilancia epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial Mexicana NOM-017SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está conformada por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32 entidades federativas del país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE). El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en 16 redes de vigilancia específica. ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIASIS La Leishmaniasis cutánea fue descrita por vez primera en la Península de Yucatán por Seidelin en 1992, quien la denominó “úlcera de los chicleros”, el primer estudio epidemiológico sobre la leishmaniasis en México fue realizado por Beltrán y Bustamante en el Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales (ISET), hoy Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos Dr. Manuel Martínez Báez (InDRE), en el año de 1942, de los campamentos de chicleros de la península de Yucatán. En 1950, se logró aislar el primer caso de leismaniasis visceral en México, que es la forma más grave de la enfermedad, conocida como Kala-azar. En 1983 inició el estudio de tripanosomátidos (Tripanosoma cruzi y Leishmania sp) en México. Un año después se crearon los ceparios de Leishmania sp y T. cruzi, así como el montaje de técnicas de diagnóstico serológico preparado con antígenos propios. La técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) fue la primera en ser estandarizada como metodología de referencia para el diagnóstico de Leishmania. En 1994, se crea el laboratorio de Leishmaniasis. A partir del 2005 el laboratorio se incorpora al programa de Evaluación Externa del Desempeño para los Microscopistas de la Red de Parasitosis Transmitidas por Vector. El Laboratorio de Leishmania apoya a los programas de Vigilancia Epidemiológica de La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) mediante un diagnóstico que se basa en el cuadro clínico y antecedentes de residencia o procedencia de áreas endémicas con transmisión de la enfermedad, demostración directa al microscopio e indirectamente por inmunología, serología y PCR (NOM-032-SSA2-2010). Uno de los objetivos del InDRE en los que el laboratorio de leishmaniasis participa de forma permanente es la formación de recursos humanos, impartiendo anualmente un curso de “Actualización de Enfermedades Transmitidas por Vector”, tanto para la RNLSP como para todo el sector salud. Así mismo, se imparten cursos P á g i n a 11 | 61 dirigidos al personal técnico de la RNLSP sobre las diferentes técnicas diagnósticas que se encuentran instauradas en el InDRE. La vigilancia epidemiológica es esencial para establecer el impacto de la enfermedad y evaluar los esfuerzos de control de la transmisión y detección de epidemias. Como parte del Programa de Acción para la Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas por Vector, se recomienda aplicar insecticidas de acción residual en viviendas, erradicar las hojarascas y maleza creciente alrededor de las viviendas, promover el uso de pabellones, mosquiteros o telas metálicas, en especial en exteriores, uso de repelente para insectos y vestimenta que cubra extremidades superiores e inferiores. En enero del 2012 el laboratorio de leishmaniasis se certifica bajo los requerimientos de la norma ISO 9001:2008. Sistema de Gestión de la Calidad. MARCO LEGAL 1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF 05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012. 2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012. 3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012. Para la vigilancia epidemiológica. (DOF: 19/02/2013) 4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo. (DOF: 17/02/2003). 5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos. (DOF: 23/06/2006). 6. Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010. Para la vigilancia epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por vector. (DOF: 01/06/2011). 7. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011. Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos. (DOF: 27/03/2012). 8. Lineamientos para los programas de evaluación externa del desempeño de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2014. 9. Criterios de Operación para la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2014. 10. Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicado en el Diario Oficial de la Federación el 19 de enero del 2004. 11. Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial de la Federación DOF: 12/12/2013. P á g i n a 12 | 61 12. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación, DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx 13. Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014. DEFINICIONES OPERATIVAS Leishmaniasis, se denomina así a la enfermedad zoonótica con afectaciones dérmicas cutáneas o visceral causada por protozoarios del género Leishmania, de las especies L. mexicana, L. brasiliensis, y L. chagasi, los cuales son transmitidos de una persona infectada a una sana mediante la picadura de insectos hematófagos del género Lutzomyia. (Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010). Caso sospechoso: Toda persona con cuadro inespecífico de Leishmaniasis que refiera antecedentes de residencia o visista a zona endémica de este padecimiento. Caso probable: Todo caso sospechoso que presente alguno o varios de los siguientes signos y síntomas. a. Caso probable de Leishmania Cutánea Localizada (LCL): aparición de una o más lesiones nodulares o úlceras de bordes indurados, fondo limpio e indoloro, o bien reacción positiva a la reacción de Montenegro. b. Caso probable de Leishmania Mucocutánea (LMC): obstrucción o perforación de membranas nasales. c. Caso probable de Leishmania Visceral (LV): presencia de fiebre irregular y prolongada, hepatoesplenomegalia indolora, linfadenopatía y pérdida de peso. d. Caso probable de Leishmaniasis Cutánea Difusa (LCD): presencia de múltiples nódulos que se diseminan a lo largo de casi todo el cuerpo con anergia a la reacción de Montenegro. Caso confirmado de Leishmaniasis: Todo caso en que se demuestre la presencia del parásito mediante pruebas parasitológicas y serológicas específicas, o bien sea clínicamente compatible con Leishmaniasis. Caso desacartado: Todo caso probable cuyo resultado de laboratorio no corresponden a infección por Leishmania. P á g i n a 13 | 61 OBJETIVOS Objetivo general o Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de laboratorio para el diagnóstico de leishmaniasis y establecer el manejo adecuado de la información generada por laboratorio, a través de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en apoyo a la vigilancia epidemiológica de esta enfermedad. Objetivos específicos o o o o o o o o Dar respuesta a las solicitudes de exámenes de laboratorio de las enfermedades parasitarias ocasionadas por Leishmania sp. Emitir de manera oportuna la información relacionada con las actividades de apoyo a los programas sustantivos del área de su competencia. Capacitación técnica al personal de los Laboratorios Estatales de Salud Pública y otras instituciones. Elaborar propuestas para abordar las áreas de oportunidad sobre las necesidades técnicas y desarrollo de habilidades, para el fortalecimiento del marco analítico del laboratorio. Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio. Desarrollar, evaluar e implementar técnicas de vanguardia para el diagnóstico de Leishmaniasis en apoyo a los programas sustantivos que le competen. Mantener el control de existencias de materiales y reactivos con los que se apoya a los LESP, para la oportuna respuesta de solicitud de insumos. Participar en la evaluación del desempeño de los LESP, a través del Boletín Caminando a la Excelencia. P á g i n a 14 | 61 RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA LEISHMANIASIS 2007-2011 CAMPECHE 64.27% CHIAPAS JALISCO OAXACA 0.15% PUEBLA QUINTANA ROO 16.28% SINALOA TABASCO VERACRUZ 7.95% 0.62% 0.04% 6.60% 4.01% YUCATÁN 0.08% Programa establecido (búsqueda activa) Capacitados, en proceso de búsqueda activa Capacitados y/o en proceso de capacitación En el gráfico de pastel se observa el porcentaje de muestras recibidas para el control de calidad en los últimos 5 años Figura. 1. Conformación de la red para el diagnóstico de leishmaniasis en México ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE LEISHMANIASIS La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública para el diagnóstico de leishmaniasis (RNLSP-LEIS) la encabeza el Laboratorio de Leishmania, adscrito al Departamento de Parasitología del InDRE y está integrada por los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) a través del componente Leishmania y los laboratorios de diagnóstico locales. P á g i n a 15 | 61 Figura. 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios para el diagnóstico de enfermedades parasitarias transmitidas por vector FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE LEISHMANIASIS FUNCIONES DEL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA El laboratorio de Leishmania es el Laboratorio Nacional de Referencia y el órgano normativo para el diagnóstico, las funciones que competen al área de microscopía de la Red de Laboratorios son: o Efectuar diagnóstico Parasitoscópico de la leishmaniasis. o Consolidar algoritmos de referencia y criterios de interpretación de resultados. o Realizar control de calidad en el diagnóstico parasitológico, apoyado a nivel estatal por los LESP. El control de calidad se realizará con el 100% de las muestras biológicas positivas y el 10% de las negativas. o Transmitir tecnología estandarizada a los laboratorios integrantes de la Red, Técnicas Serológicas (Inmunofluorescencia Indirecta ver anexo II técnica diagnósticas). P á g i n a 16 | 61 o Brindar material biológico como antígeno de Montenegro, antígeno IFI y sueros control. o Capacitar en servicio para la formación de recursos humanos en la prestación de un servicio eficiente. o Implementar y adecuar nuevas técnicas de diagnóstico en apoyo al algoritmo de referencia. o Desarrollar investigación aplicada en apoyo a la vigilancia epidemiológica. o Generar información de orden nacional, integrando y siendo el rector de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, en materia de diagnóstico, investigación y desarrollo tecnológico para la vigilancia epidemiológica para la toma de decisiones en el control de la enfermedad que incidan en la formulación y orientación del programa nacional de salud. FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES Para el diagnóstico: Vigilar los procesos analíticos para la investigación de la presencia o no, de amastigotes en material biológico. Asegurar la calidad del diagnóstico en el laboratorio de Leishmania. Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio. Referir muestras al InDRE para control de calidad y conformación del banco de láminas o en caso de duda diagnóstica. Generar evidencia y notificar al órgano normativo estatal correspondiente los casos confirmados. Participar como mecanismo de apoyo técnico, proporcionando la información relacionada y requerida por el programa sustantivo del área de su competencia. Para la evaluación del desempeño: Evaluar que se lleven a cabo los procedimientos, métodos y técnicas estandarizadas. Seleccionar las muestras para control de calidad positiva y negativa del área de influencia del LESP. Compilar las muestras de las jurisdicciones y redes de apoyo. Reportar inmediatamente las incongruencias encontradas en la reobservación. Análisis de la información generada. Capacitar en los diferentes temas concernientes a leishmaniasis en apoyo a la vigilancia epidemiológica, al personal de los laboratorios locales del P á g i n a 17 | 61 programa y demás instituciones del Sector Salud que lo requieran (o se ha detectado que lo requieren a través del monitoreo del desempeño en el área de influencia). Recabar, analizar y evaluar la información sobre la prestación de servicios de diagnóstico de Leishmania de los laboratorios locales para el aseguramiento de la calidad de la red. Supervisar que no existan muestras de diagnóstico pendientes en los laboratorios. Supervisar el manejo del equipo asignado conforme a lo establecido en los documentos autorizados y manuales de operación correspondiente para el aseguramiento de la calidad en la red estatal. Proporcionar información relevante detectada en el laboratorio mediante informes, notas informativas y reportes de Leishmania, a la Dirección del LESP para que sea difundida a las instancias estatales correspondientes contribuyendo a la vigilancia epidemiológica estatal y nacional de manera veraz y oportuna. Para el PEEDMiVec Participar en el Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED) del InDRE, a través de los programas oficiales correspondientes. Aplicar el PEED a los laboratorios locales de la red. Generar la evidencia de la evaluación para la red, enviar copia de resultados al microscopista y al InDRE. Organizar la información de estas actividades y proporcionarla cuando sea requerida por las instancias evaluadoras. Para capacitación Organizar el curso anual de capacitación estatal a los laboratorios locales de acuerdo a las necesidades detectadas a través del PEED o del monitoreo. Mantener en niveles óptimos la capacidad diagnóstica de los integrantes de la red. Capacitar a los microscopistas en el manejo del equipo nuevo. Brindar apoyo técnico a los elementos de la red que lo soliciten. Proporcionar el curso de inducción al puesto del personal de nuevo ingreso y generar evidencia. P á g i n a 18 | 61 Apoyo técnico Participar en las urgencias epidemiológicas en el área de su competencia. El laboratorio podrá colaborar y/o elaborar trabajos de investigación operativa que proporcione información prioritaria estatal, una vez que los protocolos sean aceptados por los comités de investigación ad hoc. Apoyar con la preparación y/o evaluación de los reactivos que utilizan los integrantes de la red. Apoyar en la selección para la adquisición y en el suministro de materiales y reactivos requeridos por los laboratorios de la red estatal de acuerdo a la evaluación proporcionada por el InDRE. Participar en la elaboración y actualización de los manuales técnicos referentes a diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos, etc.) para uso en el ámbito estatal y local. FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS A NIVEL LOCAL Realizar la recepción e identificación de las muestras recibidas. Procesar las muestras de acuerdo a los procedimientos pre-establecidos. Seleccionar de las muestras que se van a analizar de acuerdo a la prioridad del material biológico y número de muestras recibidas. Observar microscopio las muestras de acuerdo a los procedimientos preestablecidos. Referir muestras al LESP de su entidad para control de calidad y para la realización de las pruebas generales y especializadas o de referencia que no realicen. Notificar al órgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos de Leishmaniasis confirmados: LCL, LCD, LMC y LV. Recibir capacitación y asesoría del nivel estatal. Proporcionar el curso de inducción al puesto a todos los microscopistas de nuevo ingreso. Colaborar en el ámbito de su competencia en actividades prioritarias señaladas por su jefe inmediato. Aplicar las recomendaciones del nivel estatal. Cumplir con el programa de control de calidad que establece el nivel estatal. P á g i n a 19 | 61 DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS POR LABORATORIO TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS CLÍNICAS Tipo Nº de muestras y cantidad Momento de recolección Contenedor Conservación Transporte Observación Cuadro 1. Métodos directos parasitológicos Métodos directos parasitológicos Improntas de lesión o extendidos de médula ósea Para diagnóstico: Mínimo: 3 impresiones en 1 portaobjetos sin teñir. Óptimo: 3 laminillas con 3 impresiones cada una sin teñir. Laminillas para control de calidad: debe enviar la totalidad de las improntas positivas y 10% de las negativas, teñidas por Giemsa. *Para el caso de médula ósea debe remitir 2 extendidos sin teñir Al momento de la sospecha y antes de iniciar tratamiento Portaobjetos nuevos desengrasados y limpios Las improntas y extendidos de médula ósea que son remitidos para diagnóstico deben ser fijados con metanol y enviados a temperatura ambiente, son estables hasta el momento de su análisis. Para el caso de las improntas que son remitidas para control de calidad únicamente deben conservarse a temperatura ambiente hasta su recepción en el InDRE Enviar a temperatura ambiente, envueltos en cartón, de acuerdo a su calendario de envío de cada uno de los LESP Nivel Local→LESP→InDRE Cuadro 2. Métodos indirectos parasitológicos Métodos indirectos parasitoscópicos Tipo Microbiopsias y biopsias Nº de muestras y Una muestra de aspirado del borde indurado de la cantidad lesión (microbiopsias) y/o 1.0 cm3 de biopsia Momento de Al momento de la sospecha y antes de iniciar recolección tratamiento. Biopsia: Tubo de plástico herméticamente cerrado y rotulado; en solución salina o en formalina al 10% Contenedor Microbiopsia: Se deposita el aspirado en tubos N´N´N´(previa solicitud de insumo al Laboratorio del InDRE) Conservación Biopsias Temperatura 4 °C P á g i n a 20 | 61 Transporte Observación Microbiopsias (Tubos N´N´N´, a temperatura ambiente) Biopsias: Debe depositarse en un recipiente hermético a prueba de filtraciones a 4 °C Microbiopsias: Debe depositarse en un recipiente hermético a prueba de filtraciones y a temperatura ambiente Nivel Local→LESP→InDRE Cuadro 3. Métodos inmunológicos Métodos inmunológicos Tipo Sangre sin anticoagulante o suero Nº de muestras y cantidad Momento de recolección Como mínimo 1.0 mL de suero o 3.0 mL de sangre sin anticoagulante Al momento de la sospecha, en ayuno de 12 h y antes de iniciar tratamiento. Contenedor Tubo de plástico herméticamente cerrado y rotulado Conservación Temperatura 4-8 °C Transporte Enviar con refrigerantes, manteniendo temperatura de conservación Observación Nivel Local→LESP→InDRE Para su correcta identificación es imprescindible que cada muestra esté debidamente rotulada con nombre completo y/o No. de identificación, fecha de toma de muestra. ENVÍO Y RECEPCIÓN DE MUESTRAS El envío de muestras debe realizarse lo más pronto posible según sea el caso. El tubo con la muestra de suero se empaqueta bien y se envía utilizando el Sistema Básico de Triple Embalaje [1], se debe proteger de la luz solar y del calor excesivo conservando la temperatura adecuada de transporte entre 4 a 8 °C. 1 El sistema básico de triple embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, P á g i n a 21 | 61 La muestra de biopsias (piel, hígado y bazo) deberán ser recibidas en un lapso no mayor de 24 h. Las muestras deberán estar bien selladas y rotuladas con el nombre del paciente, el tipo de muestra y fecha de la toma de la misma, deberán estar a una temperatura de 2 a 4 °C, si no cumple con lo anterior, la biopsia será rechazada y se notificará al usuario o responsable del envío, vía fax. En el caso de la Secretaría de Salud la muestra se envía al Laboratorio Estatal de Salud Pública correspondiente. Para otras instituciones el envío se realizará de acuerdo con los procedimientos que se determine en el nivel estatal o federal. A. InDRE/Instructivo para la Toma y Envío de Muestras Biológicas para Diagnóstico y Control de Calidad: http://www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html B. Instructivo para Toma y Recepción de muestras en el InDRE: http://www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE LA LEISHMANIASIS El diagnóstico etiológico de la leishmaniasis se obtiene con base en los resultados de las pruebas de laboratorio, en conjunto con los datos clínicos y epidemiológicos. Sin embargo, el diagnóstico definitivo de la enfermedad requiere de la demostración del parásito. En los casos crónicos de LCL y LMC, el diagnóstico definitivo es difícil, a veces, por la escasez de parásitos en la lesión. El diagnóstico de la LV es complicado por el hecho de que los signos clínicos y los síntomas de la enfermedad son parecidos a los de otras enfermedades infecciosas. La naturaleza insidiosa e inespecífica de la LV, así como la reactividad cruzada, pueden confundir el diagnóstico. Por lo tanto, un diagnóstico definitivo de LV depende también de la detección de parásitos por examen de extendidos de médula ósea, ganglio linfático o aspirados de bazo. Aunque los resultados de los procedimientos de diagnóstico no invasivos, como el ELISA o suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 °C. Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío (caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete. P á g i n a 22 | 61 la prueba de aglutinación directa (DAT) se comparan favorablemente con la detección directa del parásito, estas pruebas serológicas no pueden diferenciar entre una LV activa y una infección pasada o subclínica, cuando se determina IgG contra el parásito. Figura 3. Algoritmo de laboratorio para el diagnóstico de leishmaniasis. Clave tabulador 2012 1D2613000 Leishmania spp. P á g i n a 23 | 61 Cuadro 4. Utilidad de los métodos diagnósticos Método Utilidad Observación al microscopio en Este método es de utilidad busca de amastigotes a partir de para todas las formas impresiones en portaobjetos de clínicas. El diagnóstico material obtenido de lesiones definitivo de LV se realiza Parasitoscópico cutáneas, aspiración del borde de con extendidos de médula las lesiones o biopsias de tejidos y ósea, ganglio linfático o cultivo de inoculaciones en aspirados de bazo animales Se evalúa la respuesta celular a la Es útil en casos de LCL y aplicación intradérmica del LMC. La antígeno de Montenegro intradermorreacción no se Inmunológico (Leishmania) emplea en casos de LCD debido a la condición anérgica de esta forma clínica Se emplean las siguientes técnicas: La serología es de utilidad hemaglutinación, para todas las formas inmunofluorescencia indirectas, clínicas de la enfermedad Serológico ELISA. La tipificación de en especial para LCD y complejos y especies se realiza LMC mediante PCR e hibridación con sondas específicas Cuadro 5. Técnicas diagnósticas Método diagnóstico LCL LCD Impronta Biopsia Extendido de médula ósea Aislamiento en animales y medios de cultivo Serología Intradermoreacción LMC LV ++ ++ NR ++++ ++++ NR ++ ++ NR NR ++++ +++ +++ ++++ ++ ++ ++ ++++ ++ ++++ ++++ Negativo +++ Negativo P á g i n a 24 | 61 ESTÁNDAR DE CALIDAD La funcionalidad de una red de diagnóstico para la vigilancia epidemiológica de Leishmaniasis por laboratorio debe evaluarse en las tres fases: 1) Pre-analítica, 2) Analítica, y 3) Post-analítica, de acuerdo a los algoritmos diagnósticos. Caso Probable IMPRONTA TEJIDO RASPADO FROTIS Encuesta individual Historia clínica Encuesta de reservorios FROTIS ASPIRADO Paciente con sospecha de leishmaniasis Cultivo In vivo (RATÓN) e invitro (NNNRPMI) Toma de Muestra LCL, LCD, LM, LV BIOPSIA HISTOPATOLOGIA IDR IFI SUERO Figura. 4 Diagrama de flujo del diagnóstico de leishmaniasis. Clave tabulador: 1D2613000 El tiempo máximo para el reporte de resultados hasta finalizar con el algoritmo depende del servicio solicitado. P á g i n a 25 | 61 IHQ Cuadro 6. Emisión de resultados para diagnóstico Diagnóstico Tiempo de entrega Visceral 24 horas Serológico Localizada, Diseminada, 2 a 5 días Mucocutánea Improntas 2 días Biopsias (IHQ) 15 a 20 días Parasitoscópico Cultivo in vitro 21 días Cultivo in vivo 1 a 6 meses Inmunológico Leishmania IDR 2 días Cuadro 7. Emisión de resultados para control de calidad y referencia Tiempo de entrega Control de calidad improntas o laminillas 10 días Referencia(*) serología y laminillas 2 días (*)Referencia: Resolución de discordancias CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO La muestra de impronta como mínimo, será de 0.5 mm x 0.5 mm, el extendido de muestra no debe ser grueso. La muestra de suero humano en volumen debe ser de al menos 1.0 mL. Biopsia piel (epidermis), hígado y bazo. El tejido obtenido se enviará en recipiente estéril con solución salina isotónica en un volumen de 3 veces el tamaño de la biopsia. La biopsia como mínimo será de 1.0 cm3. Para el cultivo in vitro depositar el tejido macerado o el contenido de la microbiopsia en el interior del tubo con medio de cultivo, manteniendo estrictas condiciones de esterilidad y enviar el tubo a temperatura ambiente. La muestra deberá acompañarse del formato único de recepción de muestras del InDRE, del resumen de historia clínica y de la solicitud del estudio. La falta de alguno de los documentos anteriores causará rechazo y la muestra quedará en resguardo. Se notificará al usuario y contará con un periodo de siete días naturales para enviar la documentación complementaria, de no hacerlo se rechazará definitivamente la muestra y se notificará al usuario o responsable del envío vía fax. La muestra no deberá estar contaminada, si sucede, la muestra será rechazada de manera definitiva y se notificará al usuario o responsable del envío vía fax. La laminilla deberá venir rotulada y no deberá estar rota, si sucede, será rechazada y se notificará al usuario o responsable del envío, vía fax. P á g i n a 26 | 61 En casos especiales, si la muestra no cumple con los criterios de calidad biológica pero el usuario considera que la muestra es de alto valor, deberá notificarlo al Laboratorio de Leishmania por escrito en la solicitud o formato y aceptar que el resultado debe ser interpretado con cautela, quedando el laboratorio del InDRE libre de toda responsabilidad legal. Cuadro 8. Causas de rechazo de muestras clínicas Causa de rechazo 1.0 Calidad de las 3.0 Clínico muestra 2.0 Administrativas epidemiológicas 3.1 Cuadro clínico 1.1 Envase inadecuado 2.1 Sin solicitud original de estudio (definición de caso) 2.2 Solicitud original de estudio 3.2 Tiempo de 1.2 Envase roto incompleta evolución 3.3 Factores de 1.3 Laminilla rota 2.3 Sin formato único del InDRE riesgo (especifique) 1.4 Temperatura 2.4 Formato único del InDRE 3.4 Días de inadecuada incompleto tránsito (especifique) 1.5 Suero-Plasma 3.5 Otra 2.5 Sin fecha de depósito y/o pago lipémico (especifique) 1.6 Suero-Plasma 2.6 Sin historia clínica hemolizado 1.7 Cantidad 2.7 Historia clínica incompleta insuficiente 1.8 Muestra contaminada 2.8 Sin formato de encuesta (especifique) 1.9 Muestra 2.9 No concuerda número de Ver manual de inadecuada muestra con oficio recepción de (especifique) muestras del 1.10 Muestra en estado 2.10 No concuerdan datos del InDRE putrefacto oficio con la muestra (nombres) 1.11 Muestra 2.11 Falta convenio institucional derramada 1.12 Muestra sin 2.12 Otra (especifique) identificación 1.13 Otra (especifique) P á g i n a 27 | 61 CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS Captura de resultados INFOLAB Impresión de resultados e impresión de hoja de entrega de resultados REMU Firma de resultados por el Jefe del Laboratorio (previa revisión con el químico) Entrega de resultados al área de Recepción de Muestras InDRE Figura 5. Emisión y entrega de resultados Anotar los resultados obtenidos de la prueba, en la bitácora de trabajo correspondiente. Verificar que los datos contenidos en el formato de reporte sean compatibles con la forma de solicitud, especialmente en lo que se refiere a: tipo de muestra, procedencia, número de oficio, número de registro del InDRE y del laboratorio, fecha y tipo de prueba solicitada (diagnóstico, control de calidad o referencia). Anotar el resultado de la prueba en la base de datos del lNFOLAB. (La clave de acceso a las bases de datos es de uso confidencial, y es otorgada a cada laboratorio por el área de informática). Entregar al jefe de laboratorio el formato del reporte. Verificar de los datos del formato de reporte versus los anotados en la (s) libreta (s) de trabajo del analista por el jefe de laboratorio, quien verifica que coincidan. Revisar documentación correspondiente a cada muestra (o lote). Verificar que las pruebas realizadas corresponden a lo solicitado por el cliente. Comprobar los resultados con base en el diagnóstico solicitado. Rubricar el resultado y entregar al área técnica. El personal técnico o asignado entregará al área de recepción de muestras el resultado junto con la documentación correspondiente para su trámite posterior. Guardar una copia autorizada del resultado en el archivo del laboratorio. PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) El Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED) de La Red Nacional de Microscopistas de Laboratorios de Salud Pública para el diagnóstico de Leishmania, se encuentra incluido en el Panel de evaluación de Enfermedades Transmitidas por Vector bajo la coordinación del Laboratorio de Paludismo. Cuadro 9. Actividades del Programa de Evaluación Externa del Desempeño P á g i n a 28 | 61 Objetivos: Evaluar la competencia técnica y desempeño de los microscopistas de la red nacional de enfermedades parasitarias transmitidas por vector Alcance: Marco analítico a evaluar, por prueba o algoritmo Periodicidad: Anual Matriz: Envío del panel: Extendido de sangre periférica (enfermedad chagas y paludismo) e impresiones de lesiones causadas por el parásito (Leishmania) Instructivo del panel y documentos anexos para emisión de resultados Tiempo de respuesta: Tercer trimestre del boletín caminando a la excelencia ¿Qué se evalua? Concordancia entre formas parasitarias y parasitemia Formato de resultados: Resultados cualitativos y cuantitativos Informe general: Se envian resultados por estado e informe general a la dirección general adjunta Informe individual: Se entrega en el informe del tercer trimestre del boletín caminando a la excelencia (BCE) Acciones de mejora: Exclusivamente al personal de los LESP El laboratorio de leishmaniasis prepara el material biológico correspondiente con base en su algoritmo, y entrega el material para la creación de los paneles de evaluación, al área correspondiente. P á g i n a 29 | 61 ALGORITMO DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS CON COSTOS PARA LA PREPARACION DE LAMINILLAS PARA PANELES DE DIAGNOSTICO POR MICROSCOPIA PANEL LAMINILLAS ENSAYOS DE APTITUD EN EL DIAGNÓSTICO MICROSCÓPICO DE PARASITOSIS TRANSMITIDAS POR VECTOR (1D2614003) CEPARIO PRODUCCION DE MASA PARASITARIA 5 mL RPMI + 2mL de N`N`N` con paràsitos 5-8 DIAS Aumenta el vol. de producciòn 10 mL RPMI 5-8 DIAS Crecimiento de masa parasitaria Cosecha de la masa parasitaria Conteo de masa parasitaria Ajuste Inoculación en ratones Balb/C 1 a 3 meses Sacrificio y preparación de improntas Tinción de Giemsa y montaje Conteo de masa parasitaria Conteo de masa parasitaria PANELES DE EVALUACIÓN RLSP MATERIAL DE CAPACITACIÓN Banco de material de apoyo Figura. 6. Algoritmo de procedimientos técnicos para la preparación de laminillas para paneles de diagnóstico por microscopia. Clave tabulador: 1D2614003 P á g i n a 30 | 61 Cuadro 10. Características a evaluar para control de calidad Características Estado de la tinción Calidad de la toma Presencia del parásito Densidad parasitaria Forma parasitaria Observación microscópica Reporte Alcalina y/o ácida Alcalina y/o ácida Adecuada o correcta Inadecuada o incorrecta Sin contaminación Contaminada por bacterias y hongos, muestra barrida Se encontraron parásitos No se encontraron parásitos Positivo Negativo Menos de 10 parásitos por campo Más de 10 parásitos por campo -10 +10 Amastigotes intracelulares AIn (Amastigotes intracelulares) Amastigotes extracelulares AEx (Amastigotes extracelulares) CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO Adquiere la liberación del diagnóstico el LESP que cumpla lo siguiente: Establecer un algoritmo diagnóstico (improntas). Participar en el PEEDMIVEC por tres ciclos seguidos con una calificación mayor o igual al 95%. Tener concordancia (C) en el Boletin Caminando a la Excelencia (BCE) mayor o igual 90% durante dos años continuos. Participar y acreditar el curso anual de Actualización de Enfermedades Transmitidas por Vector. Tener una calificación (C+PEED)/2 mayor o igual 95%. Aprobar la visita de verificación (procesos técnicos y administrativos) que realizan el personal experto del Laboratorio de Leishmania del InDRE. Mantiene su liberación diagnóstica el LESP que cumpla lo siguiente: Cumplir con todo lo descrito en los criterios para la liberación diagnóstica. Envío del 100% de muestras positivas y 10% de negativas. Pierden su liberación diagnóstica los LESP que no cumplen lo siguiente: El incumplimiento de algún punto de lo señalado anteriormente tanto para la liberación como para el mantenimiento del diagnóstico. Si el LESP requiere confirmar su desempeño técnico, debe solicitar un panel nuevo, cuyo costo es de acuerdo al tabulador vigente. El panel deberá ser P á g i n a 31 | 61 solicitado dentro de los siguientes 10 días hábiles, después de haber recibido el informe final. Cabe menionar que la calificación obtenida en este panel no será tomada en cuenta para el Boletín Caminando a la Excelencia. Concordancias no aceptables (menor al 95%) en el segundo panel, requerirán de capacitación y establecer nuevamente el envío de muestras para realizar diagnóstico en el InDRE. BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO Para fortalecer y complementar a la RNLSP se cuenta con un Banco de Material Biológico el cual consta de un Banco de Sueros y un Banco de Improntas, los cuales están dirigidos hacia los programas de validación de cada técnica empleada en el diagnóstico de la leishmaniasis en instituciones o servicios particulares de los sectores de salud, control de calidad, referencia o pertenecientes a protocolos de investigación. BANCO DE SUEROS El Área de Serodiagnóstico será la encargada de seleccionar los sueros positivos y negativos que formarán parte del Banco de Sueros. Todos los sueros seleccionados se entregarán al personal del área de Banco de Sueros, quienes deberán registrar en la bitácora correspondiente cada uno de ellos. Procedimiento: Dividir cada muestra en alícuotas en criotubos estériles de 2.0 mL. Etiquetar los criotubos con el número de registro del laboratorio, nombre del paciente y fecha de ingreso al banco. Almacenar cada una de las alícuotas de cada suero a 4 °C en el refrigerador para utilizarse en capacitación y como control de calidad interno y externo (un criotubo por muestra). Colocar las alícuotas restantes de las muestras en orden de registro en cajas para criotubos. Congelar las alícuotas restantes a –60 °C para uso posterior. El encargado del banco se registrará en la bitácora correspondiente. Solo se podrá disponer del material del banco de sueros con la autorización del jefe del laboratorio o del departamento quienes deberán asentar su rúbrica en la libreta correspondiente. BANCO DE IMPRONTAS Procedimiento 1. Guardar las improntas en una caja de porta preparaciones. P á g i n a 32 | 61 2. Identificar cada impronta con el número de registro del laboratorio, nombre del paciente, resultado y fecha de almacenamiento. 3. Colocar las muestras en orden de registro. 4. El encargado del banco las registrará en la bitácora correspondiente. Figura.7. Caja porta preparaciones para banco de improntas. Curso teórico Curso teóricopráctico Envío del primer panel a los XX laboratorios estatales de la red Recepción de resultados del panel en el InDRE Envío de resultados preliminares a la RNLSP Envío de resultados finales del monitoreo XX del desempeño a la RNLSP DIC NOV OCT SEP AGO JUL JUN MAY ABR MAR FEB ACTIVIDAD ENE CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES XX XX XX XX XX XX XX XX XX XX XX XX XX * Si alguna fecha corresponde a un día no hábil o festivo, la actividad programada para ese día, se recorre al día hábil siguiente. P á g i n a 33 | 61 BIBLIOGRAFÍA 1. Berman JD. Human leishmaniosis: clinical, diagnostic, and chemotherapeutic developments in the last 10 years. Clin. Infect. Dis. 24:684-703, 1997. 2. Carreira PF, Maingon R, Ward RD, Noyes H, Ponce C, Belli A, Arana B, Zeledon R, Sousa OE. Molecular techniques in the characterization of Leishmania isolates from Central America. Ann. Trop. Med. Parasitol. 89 (Suppl. 1):31-36, 1995. 3. Desjeux P. Human leishmaniases: epidemiology and public health aspects. World Health Stat. Q. 45:267-275, 1992. 4. Grimaldi GJr, Tesh RB, McMahon-Prat D. A review of the geographic distribution and epidemiology of leishmaniosis in the New World. Am. J. Trop. Med. Hyg. 41:687-725, 1989. 5. Grimaldi GJr, Tesh RB. Leishmaniases of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol Rev. 6:230-250, 1993. 6. Lugo de Yarbuh A. Studies of the leishmanin skin test positivity in cases with treatment anti-Leishmania. Parasitol al Día. 21:76-80, 1997. 7. Pearson RD, de Queiroz-Sousa A. Clinical spectrum of leishmaniosis. Clin. Infect. Dis. 22:1-13, 1996. 8. Peters W, Killik-Kendrick R, Eds. The leishmaniases in biology and medicine. London. Academic Press, 1987. 9. Reiner SL, Locksley RM. The regulation of immunity to Leishmania major. Annu. Rev. Immunol. 13:151-177, 1995. 10. Rodríguez N, Guzman B, Rodas A, Takiff H, Bloom BR, Convit J. Diagnosis of cutaneous leishmaniosis and species discrimination of parasites by PCR and hybridization. J. Clin. Microbiol. 32:2246-2252, 1994. 11. Scott P. Differentiation, regulation and death of T helper cell subsets during infection with Leishmania major. Immunol. Res. 17:229-238, 1998. 12. Singh S, Gilman-Sachs A, Chang K-P, Reed SG. Diagnostic and pronostic value of K39 recombinant antigen in Indian leishmaniosis. J. Parasitol. 81:1000-1003, 1995. 13. Singh B. Molecular methods for diagnosis and epidemiological studies for parasitic infections. Int. J. Parasitol. 27:1135-1145, 1997. 14. Velasco-Castrejón O. Las leishmaniosis en México. Rev. Latinoam. Microbiol. 29:119-126, 1987. 15. Velasco-Castrejón O, Guzmán-Bracho C, Ibañez-Bernal S, Rivas-Sánchez B. Leishmaniosis. Valdespino-Gómez JL, Castrejón o, Escobar-Gutiérrez A. eds. Enfermedades tropicales en México. México, D. F. Secretaría de Salud, INDRE/SSA, 293-308, 1994. 16. Velasco-Castrejón O, Walton BC, Rivas-Sánchez B, García MF, Lázaro GJ, Hobart O, Roldán S, Floriani-Verdugo J, Munguía-Saldaña A, Berezaluce R. P á g i n a 34 | 61 Treatment of cutaneous leishmaniosis with localized current field (radio frequency) in Tabasco, Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57:309-312, 1997. 17. Manual para Evaluación del desempeño “Caminando a la excelencia”, 2007. InDRE. 18. Leishmaniasis: estudio epidemiológico preliminar en una localidad de la zona endémica del estado de Tabasco, Salud Pública Méx 1993; Vol. 35(4):345-350. 19. José Luís Jheman. Leishmaniasis cutánea en el estado de Quintana Roo, México. Rev Mex Derm. 2008; 52(1):3-9. 20. OMS, Manual de lucha contra la Leishmaniasis visceral, División de Lucha Contra las Enfermedades Tropicales, Ginebra,1996.WHO/LEISH/9.40. pp13, 58. 21. Norma Oficial Mexicana NOM -032-SSA2-2010, Para la vigilancia epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por vector. 22. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, tercera edición, OMS http://whqlibdoc.who.int/publications/2005/9243546503_spa.pdf. 23. Pardo F.J. Anatomía Patológica, Primera edición, Mosby; 1997. 24. Jorge P. Alvar Ezquerra. Las Leishmaniasis: de la Biología al control. Laboratorio de Referencia para la Leishmaniasis (OMS, 1983), Instituto de Salud Carlos III, Junta De Castilla y León, Madrid, 1997.pp111-117. 25. Manual para la Toma, Envío y Recepción de Muestras para Diagnóstico. www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html 26. Manual para evaluación del desempeño “Caminando a la Excelencia” www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html 27. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. MMWR Surveill Summ. 6; 61:1-102; 2012. 28. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement / Vol. 60; 2011. 29. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012. 30. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories – 5th ed. CDC-NIH; 2009. 31. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk management standard. Brussels: CEN; 2011. 32. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual – 3rd ed. Geneva: WHO Press; 2004. P á g i n a 35 | 61 ANEXOS P á g i n a 36 | 61 ANEXO I. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS 1. MÉTODOS DIRECTOS PARASITOLÓGICOS GUIA PARA LA IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DEL AGENTE EN MUESTRAS CLÍNICAS (IMPRONTAS). TINCION DE GIEMSA 1. Principio del método La tinción de Giemsa emplea como colorante fundamental, una mezcla de tiácinicos catódicos, como el azul A, B y azul de metileno, que colorean el núcleo, mientras que la eosina para coloración citoplasmática, estas sustancias están disueltas en alcohol metílico. Su fundamento está en la disociación controlada de las sales de eosianato, que ocurre por la mezcla de Giemsa con agua destilada. La cromatina nuclear adopta la tinción azul violácea algo distinta a la habitual para los colorantes tiacínicos y que recibe la denominación de efecto Giemsa. 2. Sistema de muestra primaria Improntas: son impresiones de la lesión que se toman con un portaobjetos perfectamente limpio y desengrasado. Extendido de médula ósea: La toma de esta muestra debe llevarse a cabo en un hospital por personal capacitado, quien realiza una punción a cielo abierto. El extendido se coloca en un portaobjetos perfectamente limpio y desengrasado, no debe ser grueso. 3. Tipo de contenedor y aditivos Envolver las laminillas en forma individual con varias capas de papel absorbente. No hay que refrigerar el paquete, pero si protegerlo de la humedad, la luz solar o del calor excesivo. 4. ObjetivoEstablecer un proceso para la identificación rápida del parásito. 5. Especificación del desempeño La sensibilidad de los métodos directos de demostración del parásito varía entre 60 a 95% en cultivos y frotis respectivamente en pacientes con Leishmaniasis Cutánea Localizada (LCL) y 100% en los pacientes con Leishmaniasis Cutánea Difusa (LCD). 6. Método improntas Lavar la lesión con agua y jabón. Desinfectar la lesión y la piel circundante con una torunda embebida en alcohol al 70%. P á g i n a 37 | 61 Raspar cuidadosamente el borde indurado de la lesión o la piel que cubre la lesión con uno de los lados de un portaobjetos, si se produce sangrado limpiar la lesión con una gasa estéril, esperar a que se produzca un exudado seroso. Aplicar la superficie de un portaobjetos desengrasado sobre el exudado. Tomar 3 a 4 impresiones en cada portaobjetos. Repetir la operación con 5 portaobjetos. Secar a temperatura ambiente, identificar la lámina (con lápiz diamante u otro medio) con los datos correspondientes.Fijar con metanol absoluto y teñir con Giemsa. 6a. Tinción de Giemsa Método tradicional 1. Depositar el colorante de Giemsa en la superficie de la muestra, cuidar que la preparación no se seque. Pueden ser utilizadas canastillas de tinción o utilizar el método de la jeringa. 2. Realizar iluminación Köhler previamente, observar a inmersión. 6b. Método de la jeringa: si se coloca el portaobjetos con la cara hacia bajo de la bandeja, se reduce la precipitación del colorante y el precipitado que se forme caerá en la bandeja. 1. Colocar la preparación boca abajo en una capa Petri con un angulo de diez grados 2. Utilizar una jeringa o pipeta Pasteur para instilar solución colorante 3. Dejar durante 20 a 30 min 4. Enjuagar y dejar secar P á g i n a 38 | 61 Observar a inmersión 100x Figura 8 Para la verificación estatal se enviarán el 100% de las láminas positivas y el 10% de las láminas negativas de acuerdo a la solicitud y selección del LESP (Manual para evaluación del desempeño “Caminando a la Excelencia”. 7. Interpretación por el laboratorio Para el reporte de los resultados se aplicarán los siguientes criterios: Características Estado de la tinción Calidad de la toma Presencia del parásito Densidad parasitaria Forma parasitaria Observación Microscópica Reporte Alcalina y/o ácida Alcalina y/o ácida Adecuada o correcta Sin contaminación inadecuada o incorrecta Contaminada por bacterias y hongos, muestra barrida Positivo Se encontraron parásitos No se encontraron parásitos Negativo -10 Menos de 10 parásitos por campo Más de 10 parásitos por campo Amastigotes íntracelulares +10 AIn (Amastigotes intracelulares) Amastigotes extracelulares AEx (Amastigotes extracelulares) NOTA: LAS MUESTRAS PARA CONTROL DE CALIDAD QUE SEAN ENVIADAS CON ALGUNA MARCA, DEBERÁN DE ESPECIFICAR QUE TIPO DE MARCAJE PRESENTAN , LÁPIZ DE DIAMANTE , LÁPIZ DE CERA, MARCADOR INDELEBLE U OBJETIVO MARCADOR . 8. Control de calidad La tinción debe ser ácida. La preparación no deberá venir contaminada (bacterias y hongos) rota y ni barrida. 9. Interferencias La impresión de la impronta no debe ser gruesa. La tinción no debe ser alcalina y estar sobreteñida. P á g i n a 39 | 61 10. Valores de alerta críticos Cuando son detectados amastigotes en una preparación de extendido de médula ósea con historia clínica de probable leishmaniasis visceral (LV) se realizará la notificación en no más de 24 horas. 11. Medidas de bioseguridad Nivel de Bioseguridad 2-laboratorio básico 12. Fuentes de variabilidad Cuando no se consiga la visualización del protozoario por esta técnica, se pueden utilizar los métodos serológicos. En caso de ser imposible la confirmación parasitológica, el diagnóstico debe ser establecido reuniendo varios criterios como: paciente procedente de área endémica, características clínicas altamente sugestiva de leishmaniasis, biopsia de piel que reporte la presencia de un granuloma por agente vivo. INMUNOHISTOQUÍMICA (IHQ) Las técnicas inmunohistoquímicas “corresponden a un grupo de técnicas de inmunotinción que permiten demostrar una variedad de antígenos presentes en las células o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas técnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos. Esta reacción es visible sólo si el anticuerpo está marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloración”. El material así estudiado puede archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción. Resultados Positivo: Se observa la presencia del parásito en coloración café. Negativo: Ausencia de amastigotes en el total de campos microscópicos de la preparación P á g i n a 40 | 61 Figura.9. Presencia del parásito en coloración café Fuente: Laboratorio de Leishmania. InDRE http://escuela.med.pue.el/publ/patologiageneral/Patol_125/html MICROBIOPSIA PARA INOCULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ANIMALES DE LABORATORIO Un medio de cultivo generalmente se considera como un medio que favorece el crecimiento de los organismos, por lo cual debe reunir las características apropiadas, de acuerdo al tipo de organismos de que se trate. Parte del inóculo de la biopsia o aspirado de médula ósea se puede cultivar en los casos que se desee aislar la cepa con fines taxonómicos, para realizar pruebas de susceptibilidad a medicamentos, para estudios epidemiológicos y con fines diagnósticos cuando hay una alta sospecha clínica y no ha sido detectado el parásito por otros métodos. Los medios de cultivo utilizados son axénicos mono o bifásicos, el más idóneo es un agar-sangre de conejo al 15%, conocido como NNN (Novy-Nicolle-McNeal). La inoculación en animales de experimentación se reserva a situaciones de campo cuando el aislamiento en medios de cultivo corre el riesgo de contaminarse, o cuando no hay disponibilidad de microscopía. El sacrificio del animal dos meses después de infectado permite aislar los parásitos del bazo o de la piel en el punto de inoculación. P á g i n a 41 | 61 Microbiopsia de lesión cutánea Procedimiento Figura. 10. Procedimiento para la toma de biopsia Se recomienda sembrar al menos 2 tubos con medio de cultivo N`N`N` y/o inocular 2 animales de experimentación que pueden ser hámsteres, ratones BALB/c o CD1, en el cojinete plantar de las patas traseras. Resultados: a. Medio de cultivo Positivo: Presencia de promastigotes. Negativo: Ausencia de promastigotes. No utilizar ratones de la cepa C 57 porque son resistentes a la infección por Leishmania. P á g i n a 42 | 61 Fuente: laboratorio de Leishmania. InDRE Figura. 11. Leishmania sp en fase de promastigotes b. Animales Positivo: Presencia de lesiones más presencia de amastigotes en la impronta de la lesión. Negativo: Ausencia de lesiones y amastigotes en tejido. Figura. 12 Lesiones causadas por Leishmania Fuente: Laboratorio de Leishmaniasis. InDRE BIOPSIA DE ÚLCERA Procedimiento Previo lavado con agua y jabón, aplicar un antiséptico (alcohol yodado o timerosal) sobre la lesión y piel circundante. Cubrir delimitando un campo estéril. Tomar la biopsia, ya sea con un equipo de “punch” o de la manera tradicional (escalpelo). Separar la biopsia. Conservar una cuarta parte en formalina al 10% para histopatología. Realizar improntas. P á g i n a 43 | 61 Conservar en solución salina isotónica una cuarta parte, macerar para sembrar en medio de cultivo y/o inocular animales. Área que será cortada Cortar sección a través de la piel Figura. 13. Biopsia de una lesión cutánea P á g i n a 44 | 61 Figura. 14. Biopsia de lesión cutánea Resultados a. Impronta Positivo: Presencia de amastigotes intra o extracelulares. Negativo: Ausencia de amastigotes en el total de campos microscópicos de la preparación. b. Medio de cultivo Positivo: Presencia de promastigotes. Negativo: Ausencia de promastigotes. c. Animales Positivo: Presencia de lesiones más amastigotes en la impronta de la lesión. Negativo: Ausencia de lesiones y amastigotes en tejido. P á g i n a 45 | 61 Figura.15. Presencia de promastigotes Figura. 16. Presencia de lesiones Fuente: Laboratorio de Leishmaniasis. InDRE BIOPSIA DE HÍGADO Y BAZO La toma de estas muestras debe llevarse a cabo en un hospital por personal capacitado, quien realiza una punción hepática o esplénica (a cielo abierto) y la biopsia se procesa como la de la úlcera o piel. La toma debe llevarse a cabo en un hospital por personal capacitado • Realizar una punción de médula ósea para obtener 0.5 mL de la muestra. • Sembrar 0.2 mL de médula ósea en medio de cultivo. • Inocular 0.2 mL de médula ósea en animales para el aislamiento de la cepa. Figura. 17. Obtencion de médula ósea P á g i n a 46 | 61 Cuadro 11. Resultados de la biopsia o punción de médula ósea Medio de cultivo Positivo: Presencia de promastigotes Negativo: Ausencia de promastigotes Animales Positivo: Presencia de lesiones y de amastigotes impronta de la lesión Negativo: Ausencia de lesiones y de amastigotes en tejido 2. MÉTODOS INDIRECTOS PARASITOSCÓPICOS MÉTODOS INDIRECTOS INMUNOLÓGICOS a. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Esta técnica es específica y práctica, no requiere de leishmanias vivas. Los parásitos se fijan y se ponen en presencia del suero del paciente y de un antisuero marcado con fluoresceína. Debido a que es factible conocer la clase de inmunoglobulinas, es decir IgM o IgG, también es posible determinar el estado de la infección, aguda o crónica. La detección de IgM ayuda para detectar la posibilidad de una infección reciente o activa. Algunos pacientes inmunodeficientes no montan una respuesta de IgM detectable, lo cual limita la prueba. P á g i n a 47 | 61 Procedimiento Preparación del antígeno •Crecer tres cepas de Leishmania, una causante de LCL, una de LCD y una de LV en medio RPMI completo a temperatura ambiente (23-25 °C). •Ajustar la concentración a 3 x 106 promastigotes/mL en PBS/formol 1% (Stock). •Hacer una dilución 1:5 del stock en PBS. (6 x 105 promastigotes/mL). •Sensibilizar las laminillas o almacenar en alícuotas a 4 °C hasta su uso (no congelar). Sensibilización de laminillas •Utilizar portaobjetos cubiertos de teflón, de 8 a 12 pozos. •Homogenizar y añadir 10 mL de antígeno a cada pozo (6,000 promastigotes/mL). •Almacenar a –20 °C hasta su uso. •Hacer diluciones seriadas dobles de los sueros problema: de 1:2 a 1:1024. •Añadir 10 mL de una dilución a cada pozo. •Incubar 30 min a 37 °C en cámara húmeda. •Preparar el conjugado IgG-isotiocianato de fluoresceína, diluido en PBS-azul de Evans 0.01%. •Incubar 30 min a 37 °C en cámara húmeda. •Montar con glicerina para fluorescencia al 50% en PBS. •Observar en el microscopio de epifluorescencia. • El conjugado que se usa es comercial y la dilución de trabajo debe estandarizarse cada vez que se abre un nuevo vial, tomando en cuenta la concentración del conjugado que contiene, lo que dependerá de la casa comercial de donde se obtenga. También se puede utilizar un conjugado anti-IgG humana-isotiocianato de fluoresceína. (por ejemplo: 5 mL de conjugado comercial + 995 mL de PBS-azul de Evans 0.01%, dil. 1:200) Figura 18. Procedimiento de IFI P á g i n a 48 | 61 http://www.scalibor.com.ar/leishmaniosis/diagnostico.asp Positivo: La superficie de los promastigotes se observan de color verde manzana brillante en el microscopio de epifluorescencia. El corte se toma cuando la fluorescencia disminuye en una de las diluciones, que se observa de color amarillento y en la siguiente dilución los promastigotes se observan de color rojo Negativo: Los promastigotes se ven de color rojo Figura.19. Se muestran los resultados de Inmunofluorescencia Indirecta Fuente: Laboratorio de Leishmaniasis. InDRE INTRADERMOREACCIÓN DE MONTENEGRO Guía para la aplicación de la intradermoreacción con leishmanina 1. Principio del método La prueba intradérmica (IDR) de Montenegro, mide la reacción de hipersensibilidad cutánea (RHC) de tipo retardada a antígenos homólogos o heterólogos de promastigotes de Leishmania y evidencia la presencia o contacto con el parásito. Es una prueba útil y complementaria en el estudio clínico y epidemiológico. 2. Sistema de muestra primaria Se sugiere utilizarla en los siguientes casos: Pacientes con signos clínicos de la enfermedad. Pacientes con lesiones diferentes o atípicas. Pacientes con incertidumbre diagnóstica. Pacientes con lesiones cicatrizadas que presenten características clínicas de leishmaniasis mucocutánea. P á g i n a 49 | 61 3. Materiales y reactivos: Leishmania sp. Jeringa insulínica o tububerculínica Alcohol al 70% Algodón Regla graduada Bolígrafo 4. Objetivo Revelar la hipersensibilidad celular, propia de las leishmaniasis cutáneas y mucocutáneas activas, asimismo conocer si el paciente ha estado en contacto con el parásito. 5. Especificación del desempeño La sensibilidad de la prueba es del 100 % y se considera a los pacientes de LCD como anérgicos. 6. Método a. Limpiar con alcohol al 70% la región de la cara anterior, tercio medio del brazo. b. Aplicar 0.1 mL de leishmanina en la cara anterior del antebrazo. c. d. e. f. g. h. Medir el diámetro de la induración después de 48 horas a 72 horas con la técnica de bolígrafo. Esta técnica permite visualizar los bordes de la induración cuyo diámetro se puede determinar exactamente midiendo la distancia entre las líneas opuestas. Ejerciendo presión moderada, se traza lentamente una línea con un bolígrafo desde un punto exterior distante de 1-2 cm del borde de la reacción cutánea hacia el centro de ésta. En cuanto se registra resistencia al seguir avanzando (lo que indica el borde de la reacción) se cierra, se alza el bolígrafo de la piel. Se repite la misma operación en el lado opuesto de la reacción cutánea. Se mide el diámetro de la induración. Tomar la lectura y reportarlo en el formato correspondiente. P á g i n a 50 | 61 NOTA: Recomendar al paciente no tocarse, rascarse, o frotarse, no aplicar fomentos, ni colocar cremas o alguna otra sustancia en la zona de la punción. 7. Interpretación por el laboratorio Reacción Observación Presenta edema, enrojecimiento e induración, el diámetro de la Reactivo induración debe ser igual o mayor a 5 mm La induración es menor de 5 mm o No reactivo no hay reacción Resultado Positivo Negativo 8. Control de calidad del biológico Prueba de esterilidad de la leishmanina: Incubar una muestra aleatoria a 37 °C durante 48 horas. Tomar muestras para tinción de Gram y Giemsa. Sembrar en gelosa sangre, caldo tioglicolato, agar chocolate y Sabouraud. Los tres primeros se observan a las 48 horas y el último, a los 5 días. Todos los resultados deben de ser negativos. 9. Interferencias Se invalida la prueba si la lectura es tomada antes de las 24 horas o después de las 72 horas. 10. Valores de alerta críticos P á g i n a 51 | 61 Se debe considerar la forma clínica de la leishmaniasis en el paciente debido a que en la LCD se presenta una respuesta inmunológica celular abatida o anérgica. 11. Medidas de bioseguridad Nivel de Bioseguridad 2-laboratorio básico) 12. Fuentes de variabilidad Los pacientes con LCD presentan altos títulos de anticuerpos contra el parásito y no hay respuesta a la intradermorreacción de Montenegro. La respuesta celular de estos individuos está inmunosuprimida específicamente a Leishmania ya que si presentan respuesta cutánea a otros antígenos, como la candidina y el PPD. P á g i n a 52 | 61 ANEXO II. PREPARACIÓN DE REACTIVOS 1. Determinación de anticuerpos séricos inmunofluorescencia indirecta de leishmania Equipo Pipetas automáticas: uso general y volumen variable para dispensar con exactitud volúmenes líquidos. Agitador magnético: Velocidad 150-3000 rpm, superficie de acero inoxidable tratado, peso máximo 1.0 kg(1000 g), placa de 11 x 11 cm, peso 2.8 kg, fuente de poder externa de 12V DC, 0.5 amp110/50-60HZ o 220/50-60HZ(especificar en la orden) Microscopio de fluorescencia: Este microscopio está diseñado para el uso de diferentes tipos de luz (blanca, ultravioleta, azul, verde, etc., dependiendo del filtro utilizado). Su utilidad va desde la observación de bacterias y virus a micro plancton (dimensiones de micrómetros o micras). Cronómetro: es un reloj o una función de reloj que sirve para medir fracciones de tiempo, normalmente cortos y con gran precisión. Refrigerador y congelador. Equipo para la conservación de reactivos y muestras biológicas. Termómetro: instrumento de medición de la temperatura, que usa el principio de la dilatación, por lo que se prefiere el uso de materiales con un coeficiente de dilatación alto de modo que, al aumentar la temperatura, la dilatación del material sea fácilmente visible. Estufa. Equipo para incubación. Materiales portaobjetos con impresión blanca de teflón: campos de reacción hidrófilos, bordes esmerilados 90o, aprox. 75x25x1 mm, con banda mate de 20 mm 2 caras, 12 o 24 pozos barra magnética: micro de 10x3 mm, color blanca, teflonada vasos Copling: cubeta de vidrio 105x85x70 mm, con tapa, cestillo y asa de alambre para cestillo pipetas Pasteur: es un tubo de vidrio hueco, para agregar pequeñas cantidades de líquido. cubreobjetos: 0.13-0.16 mm de espesor, 24 x 50 mm de vidrio cámara húmeda: caja de alto impacto para 25 laminillas, con papel filtro placa de dilución: para realizar diluciones de 96 pozos, de poliestileno papel kraft P á g i n a 53 | 61 guantes papel higiénico 2. Reactivos y materiales biológicos PBS 1X. Solución de fosfatos TWEEN 20 Conjugado: Anticuerpo anti IgG humana, molécula completa obtenido en carnero conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC), purificado por afinidad, ICN. Frasco con 2.0 mL Azul de Evans: colorante diazo de color azul muy soluble en agua, usado como medio de diagnóstico Fórmula: C34H24N6Na4O14S4, M.=960.82. Antígeno de Leishmania: mezcla (pull) de cepas de LV, LCL Y LCD. C 3 x106 parásitos/mL. Glicerina: 1, 2,3-Propanotriol, 1, 2,3-TrihidroxipropanoC3H8O3/CH2OHCHOH-CH2OH, Masa molecular: 92.09. 3. Observación directa del parásito tinción de Giemsa Equipo Microscopio de Campo Claro, compuestos por: Fuente luminosa que ilumina la muestra. Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra. Platina sobre la cual se coloca la muestra. Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra. Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo. La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Materiales Cajas Petri de vidrio. Pipetas Pasteur: es un tubo de vidrio hueco, para dispensar pequeñas cantidades de líquidos. Bulbos: de hule látex para ayudar en la succión de líquidos con las pipetas. Lápiz de diamante: con el podrá grabar sobre el vidrio los datos necesarios de forma fácil y permanente. Porta preparaciones: caja de alto impacto para el resguardo de las laminillas. Frascos para colorante: Pueden ser transparentes u opacos, para proteger al colorante de las radiaciones solares. Hay dos modelos: con tetina y cuentagotas o sin tetina. Portaobjetos: se trata de una placa de vidrio sobre la que se colocan las preparaciones microscópicas. Puede ser rugoso o esmerilado. P á g i n a 54 | 61 Algodón en torundas. Reactivos y materiales biológicos Metanol (alcohol metílico). Carbinol Monohidroximetano CH3OH Masa molecular: 32.0, CAS: 67-56-1, RTECS: PC1400000, ICSC: 0057, NU: 1230, CE: 603-001-00-X. Colorante de Giemsa: Para frotis sanguíneo, frasco con 25 g, Hycel de México. Agua destilada de 5 partes por millón de Sólidos totales disueltos. Aceite de Inmersión: producto sanitario para el diagnostico in vitro. Análisis químico. Alcohol etílico al 70%. Colorante de Giemsa Preparación de la solución madre de Giemsa: Colorante de Giemsa Glicerina Metanol libre de acetona 3.8 g 250 mL 250 mL Pulverizar en un mortero el colorante. Añadir poco a poco la glicerina, vaciando el colorante ya disuelto en un frasco, sin dejar de mezclar. Colocar el frasco 2 h a 62 °C en baño maría. Dejar enfriar a temperatura ambiente y adicionar el metanol. Filtrar y almacenar en un frasco ámbar. Dejar madurar durante por lo menos dos semanas. Estandarizar el tiempo de tinción. Almacenar en un lugar obscuro y fresco. Solución de trabajo: Hacer una dilución 1:10 de la solución madre de Giemsa en PB 1X. 1. Cultivo de promastigotes: aislamiento in vivo e in vitro Materiales Tubos con tapón de rosca Caja de cultivo 75 y 250 mL. Pipetas desechables 1.0, 2.0, 5.0, 10 y 20 mL. Jeringas de 1.0, 3.0, 10 y 20 mL. Portaobjetos: se trata de una placa de vidrio sobre la que se colocan las preparaciones microscópicas. Puede ser rugoso o esmerilado. P á g i n a 55 | 61 Cubreobjetos: se trata de una placa de vidrio con la que se cubre las preparaciones microscópicas. Bulbo de seguridad Lámpara de alcohol Gasas Guantes Cubre bocas Reactivos Alcohol 96° SFT (suero fetal bovino) Benzal Senekjei BHI: Infusión Cerebro Corazón Antibiótico–Antimicótico RPMI Agua destilada Existen una serie de medios de cultivo para el aislamiento y conservación de Leishmania spp. Los más utilizados por un gran número de laboratorios son el medio Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) adicionado con 7.5 al 15% de sangre desfibrinada de conejo o de carnero y el medio RPMI-1640 adicionado con 10% de suero fetal de ternera (SFT). Medio NNN (Novy-Nicolle-MacNeal) Es un medio bifásico, con una fase sólida preparada con agar y sangre de conejo o carnero, desfibrinada y una fase líquida, que puede ser solución Ringer o Caldo infusión cerebro corazón (BHI). Fase sólida Agar NaCl H2 0 destilada Sangre estéril desfibrinada de conejo o carnero 8g 4g 450 mL 40 mL 1. 2. 3. 4. 5. Disolver el agar y el cloruro de sodio en el agua destilada. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. Dejar enfriar a una temperatura aproximada de 45 °C. Agregar la sangre desfibrinada y mezclar. Vaciar rápidamente en tubos 13X100 estériles (aproximadamente 3.0 mL en cada tubo). 6. Dejar enfriar los tubos sobre una superficie inclinada (30 grados). P á g i n a 56 | 61 Base de agar sangre La fase sólida del medio NNN puede preparase con base de agar sangre, cuya fórmula aproximada para 1.0 L es la siguiente: Infusión de músculo cardíaco 375 g Peptona de carne 10 g NaCl 5.0 g Agar-Agar 15 g El pH final aproximado es de 7.30.2 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Disolver 40 g del medio de cultivo en 1.0 L de agua destilada. Calentar agitando a punto de ebullición hasta disolver el medio. Vaciar 100 mL de medio en matraces Erlenmeyer con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. Enfriar el medio hasta aproximadamente 45 °C. Añadir 7.5-10.0 mL de sangre desfibrinada y mezclar. Vaciar rápidamente en tubos 13X100 estériles (aproximadamente 3.0 mL en cada tubo). 8. Dejar enfriar los tubos sobre una superficie inclinada (30 grados). Fase líquida: solución de Ringer NaCl 8.0 g NaHCO3 0.2 g KCl 0.2 g CaCI2 0.2 g 1. Disolver los reactivos en 1.0 L de agua destilada. 2. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. 3. Añadir 3.0 mL de esta solución a cada tubo. Infusión cerebro corazón (BHI) La fórmula del BHI típica para 1.0 L es la siguiente: Infusión de cerebro de ternera 12.5 g Infusión de corazón bovino 5.0 g Proteosa peptona 10.0 g Glucosa 2.0 g NaCl 5.0 g Na2HPO4 2.5 g El pH final aproximado es de 7.40.2 P á g i n a 57 | 61 1. 2. 3. 4. Disolver 37 g del medio de cultivo en 1.0 L de agua destilada. Mezclar bien y distribuir en frascos de vidrio de 100 mL. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. Añadir 3.0 mL de este medio a cada tubo estéril. Medio de Senekjie (bifásico) Fase sólida Extracto de carne Bacto-peptona Bacto-agar NaCl 2.5 g 2.0 g 3.0 g 0.5 g 1. Disolver el extracto de carne en 100 mL de agua destilada. 2. Hervir 5 min y dejar enfriar. 3. Filtrar en papel Whatman No. 42. 4. Aforar el volumen. 5. Añadir la bacto-peptona, el bacto-agar y el NaCl. 6. Ajustar a pH 7.2-7.4. 7. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. 8. Dejar enfriar hasta 45 °C. 9. Añadir 15 mL de sangre de conejo desfibrinada*. 10. Repartir 5.0 mL en frascos estériles de 50 mL. 11. Dejar solidificar colocando los frascos en posición inclinada. 12. Hacer prueba de esterilidad a 37 °C durante 24 h. * La sangre desfibrinada puede substituirse por paquete de eritrocitos humanos, libres de patógenos, que desechan los bancos de sangre por envejecimiento. Solución de Locke La solución de Locke es la fase líquida del medio de Senekjie. NaCl 0.9 g Glucosa 0.25 g KCl 0.04 g CaCl2 0.02 g NaHCO3 0.02 g 1. Disolver los reactivos en 100 mL de agua destilada. 2. Esterilizar en autoclave 15 min a 10 lbs de presión. 3. Dejar enfriar a temperatura ambiente. P á g i n a 58 | 61 4. Añadir 4.0 mL a cada frasco estéril. Medio RPMI 1640 1. Disolver 10.4 g de RPMI en 950 mL de agua destilada. 2. Añadir 2 g de NaHCO3. 3. Ajustar el pH a 7.0-7.2 (calcular 0.2-0.3 unidades por debajo del pH deseado, porque al filtrar por nitrocelulosa aumenta en esta proporción). 4. Aforar el volumen a 1,000 mL con agua destilada. 5. Esterilizar por filtración (0.22 mm). 6. Repartir en alícuotas de 80 mL en frascos de 100 mL estériles. 7. Hacer prueba de esterilidad a 37 °C, durante 48 h. Solución de antibióticos La fórmula por mL es la siguiente: Sulfato de estreptomicina 10 mg Penicilina G sódica 10,000 U Disolver el contenido del frasco en 20 mL de SSI. Hepes 1M 1. Disolver 23.8 g de Hepes en 70 mL de agua destilada. 2. Ajustar el pH a 7.2. 3. Aforar a 100 mL con agua destilada. 4. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. Glutamina 200 mM 1. Disolver 3.0 g de glutamina en 100 mL de agua destilada. 2. Esterilizar por filtración (0.22 mm). 3. Distribuir en alícuotas de 5.0 mL. 4. Almacenar a –20 °C hasta su uso. Suero fetal de ternera (SFT) 1. Descomplementar el suero 30 min a 56 °C en baño María. 2. Distribuir en alícuotas de 20 mL en condiciones de esterilidad. 3. Almacenar a –20 °C hasta su uso. Solución salina isotónica (SSI) 1. Disolver 8.5 g de NaCl en 1.0 L de agua destilada. 2. Filtrar con membrana de 0.45 mm. 3. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. P á g i n a 59 | 61 Hemoglobina bovina (Hb) La Hb se puede usar en vez del SFT. 1. Disolver 40 g de Hb en 1.0 L de SSI. 2. Esterilizar por filtración (0.22 mm). 3. Distribuir en alícuotas de 100 mL. 4. Almacenar a 4 °C hasta su uso. VCN (antimicóticos) La fórmula por mL es la siguiente: Vancomicina 330 mg Colistin 740 mg Nistatina 1,250 U Disolver el contenido del frasco en 10 mL de agua destilada. RPMI completo RPMI 1640 Solución de antibióticos Hepes 1M (pH 7.2) Glutamina 200 mM SFT inactivado VCNT 80.0 mL 1.0 mL 2.0 mL 1.0 mL 15.0 mL 1.0 mL Solución amortiguadora de fosfatos-salina (PBS) NaCl 8.0 g Na2HPO4 1.15 g KH2PO4 0.2 g KCl 0.2 g 1. 2. 3. 4. 5. 6. Disolver los reactivos en 800 mL de agua destilada. Ajustar a pH 7.0. Aforar a 1.0 L con agua destilada. Filtrar con membrana de 0.45 mm. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. Almacenar a temperatura ambiente. Solución amortiguadora de fosfatos (PB) 10X Na2HPO4 anhidro 5.54 g NaH2PO4. H2O 8.42 g P á g i n a 60 | 61 1. 2. 3. 4. 5. 6. Disolver los reactivos en 800 mL de agua destilada. Ajustar a pH 7.0. Aforar a 1.0 L con agua destilada. Filtrar con membrana de 0.45 mm. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. Almacenar a temperatura ambiente. Diluir 1:10 para preparar el PB 1X. Solución salina isotónica (SSI) 1. Disolver 8.5 g de NaCl en 1.0 L de agua destilada. 2. Filtrar con membrana de 0.45 mm. 3. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs. P á g i n a 61 | 61