IV. CENTRIFUGACION Técnicas de separación de partículas. Base : distinta velocidad de desplazamiento de las partículas en un medio líquido al ser sometidas a un campo centrífugo. COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN: velocidad a la que se desplaza una partícula en el campo centrífugo unidad (1.g) d2 (p − m) s=.g 18. d2: volumen de la partícula p: densidad de la partícula m : densidad del medio g: fuerza centrifuga relativa : la viscosidad s: velocidad sedimentación Dimensiones: de tiempo a pesar de ser una vel, porque varia en f(x)del medio, el caso de macromoléculas :valores del orden de 10−13 segundos ! el Svedberg, símbolo S, 1S = 10−13 segundos. • Coeficiente de sedimentación : variable según condiciones experimentales ! s de la partícula en un medio estándar ! agua pura a 20ºC ! s 20,w Información obtenida con s : Caracterizar a la partícula y obtener información sobre su tamaño, densidad y forma. Conocer su comportamiento en centrifugación ! facilita el diseño de métodos para su aislamiento. INSTRUMENTACIÓN: centrifuga ,tipos en f(x) velocidad: 1.− De baja velocidad, de sobremesa o clínicas: pequeñas, sin refrigeración, máxima velocidad : 5.000 rpm. Útil : partículas grandes (células, precipitados de sales insolubles, etc.) Micrófugas : variante de las anteriores. Velocidades altas : > de 10.000 rpm y tubos muy cortos−>volúmenes muy peq.(eppendorf −>+ velocidad) Motor crea la fuerza centrífuga, está acoplado al rotor q tiene celdillas donde se coloca la muestra en tubos. 2.− De alta velocidad: velocidad máxima : 18.000 − 25.000 rpm, refrigeradas para evitar el calentamiento del rotor por rozamiento con el aire , algunas con sistemas de vacío, para controlar mejor la tº, porque evita el rozamiento. Útil : fracciones celulares. Insuficientes : ribosomas, virus, macromoléculas, pequeño tamaño. 3.− Ultracentrífugas: velocidad máxima : 50.000 − 80.000 rpm , sistemas auxiliares : sistema de refrigeración, sistema de alto vacío (obligatorio), los tubos tienen q estar perfectamente balanceados. Tipos : • Analíticas : obtención datos precisos propiedades de sedimentación (s, PM). 1 • Preparativas :aislamiento de partículas de bajo S (microsomas, virus, macromoléculas), estimaciones cuantitativas de S, datos obtenidos no tan precisos Rotores: la pieza q sufre el giro y sobre la cual colocamos la muestra. Tienen que ser materiales ligeros y resistentes a las altas velocidades. La mayoría son aleaciones de Al, problema q tiene una vida media corta, se corroe. Alternativa Titanio, problema es caro, o fibra de carbón, son ligeros, duraderos y caros. tipos: 1.−oscilantes, flotantes o basculantes: las celdillas no están ancladas de 2.−de ángulo fijo: celdillas con una inclinación. 3.−verticales: rotores macizos con celdillas esculpidas paralelas al eje. Tubos: condiciones : inertes, q no interaccionen con la muestra y resistentes para q no se deforme a altas velocidades. Elección depende : tipo de rotor, tipo de muestra, volumen y tipo de fraccionamiento. Materiales : Vidrio: ventaja es transparente. • Inerte, el AND se pega a sus paredes • Hasta 3000 g, a más se rompen • Vidrio Corex : hasta 25.000 g Soluciones solventes dietilpirocarbonato fenol alcalinas Policarbonato S S S S R R R S R R R R Plásticos, transparen Polisulfano No muy trasparente Polipropileno y polialomero eppendorf S: sensible R: resistente TIPOS DE CENTRIFUGACION: 1.−C. DIFERENCIAL: La muestra se distribuye homogénea− por todo el tubo. Separación de las partículas en función de su s. Capacidad de separación pobre, ya q como se distribuyen por todo el tubo en el pellet habrá de todas las partículas, abundaran las de mayor s −>no hay pureza. Útil : aislamiento de células y orgánulos subcelulares 2 Para evitar la baja resolución podemos colocar la muestra en una banda estrecha, así todas las partículas parten de un mismo pto−> fraccionamiento. Se pueden producir corrientes de convección , reorganización del líquido −> evita usando gradientes de densidad. 2.− C. EN GRADIENTE DE DENSIDAD: Muestra : parte superior como una fina banda. Función del gradiente : estabilizar el medio, va de la parte superior con la d min hasta el fondo con la d max −>variación gradual de la densidad en el medio. Separación de los componentes de la muestra en bandas o zonas 3.− C. ZONAL EN GRADIENTE DE DENSIDAD: El valor de densidad de las partículas, no está incluido en el gradiente de densidad empleado, la dmax es menor q la dmedia de las partículas. Separación en función del coeficiente de sedimentación (s). Tiempo parámetro a controlar, porque influye en la distancia q recorre. Útil : separación partículas con " s por " tamaño y forma, pero con densidades similares 4.− C. ISOPICNICA: Gradiente de densidad, max. y min. en el rango de las densidades de las partículas a separar. Método de equilibrio−> la partícula se detiene cuando p = m . No dependencia del tiempo .Velocidad de centrifugación mucho más alta que en la centrifugación zonal. Aplicación de la muestra : no es relevante. Utilidad : partícula de " densidades, aún con tamaños similares. 5.− C. COLCHON: busca diferencias en las d de el componente a separar y el contaminante. Centrífuga sobre una disolución homogénea más densa q la d de las cel a aislar, ahí se coloca la muestra. Útil para la separación de cél sanguíneas. GRADIENTES DE DENSIDAD: • Características necesarias : 1.No provocar modificaciones biológicas en la muestra 2.No interacción con el método de detección (visible −UV) 3.Valores mínimos de viscosidad 4.Fácilmente separable de la muestra 5.No difusible 6.Bajo coste. Sacarosa y glicerol 3 Ventajas: coste, pureza, inerte, carácter no iónico Desventajas: activos osmóticamente, alta viscosidad Util : fraccionamiento orgánulos celulares y virus Ficoll Sacarosa polimerizada (PM 400.000), densidad max. > densidad con sacarosa. Más estable Inconveniente : ! viscosidad, afecta al movimiento de la particula Útil : partículas grandes (células y orgánulos celulares) *Derivados iodados del ácido benzoico Derivados ácido triodobenzoico (sustituciones para ! solubilidad) Biológicamente inertes, iónicos : metrizoato, neutros : metrizamida y Nycodenz Densidad máxima : 1,4 g/cm3, gran estabilidad, fácil formación. Útil para estructuras sensibles a la fuerza iónica, mem ,cel, virus, .. Inconvenietes : coste, interferencia con UV afecta a la absorvancia Percoll suspensiones de partículas (5.15 nm) de ácido silícico con Revestimiento de polivinilpirrolidona (PVP) Útil : partículas grandes (tamaño de las partículas coloidales y sensibles osmóticamente) *Sales de metales alcalinos pesados : cesio y rubidio Altas concentraciones : 6 − 8 M, elevada fuerza iónica. Útil para macromoléculas resistentes a la fuerza iónica ! ácidos nucleicos, las otras precipitan. Muy corrosivas−>ojo rotores Sulfato de cesio (más usadas) densidad max. 2,01 g/cm3, Capaz de bandear RNA Cloruro de cesio (más usadas) densidad max : 1,91 g/cm3 , variación de densidad del ADN por % G+C. Útil : separación de ADN ! distamicina, bromuro de etidio *Otras sales : Trifluoracetato de cesio ! separar topoisómeros de ADN 4 Rubidio : similar al cesio, < densidad max. Inconvenientes : coste, corrosión. TIPO Y FORMACION DE GRADIENTES En f(x) de la variación de la densidad: • Discontinuos • Comenzando por la disolución más densa (overlaying) • Comenzando por la disolución menos densa (underlaying) B) Continuos • Por difusión • Utilizando formadores de gradientes • Por centrifugación : gradientes autogenerados FRACCIONAMIENTO Y ANALISIS DE LOS GRADIENTES. Condiciones : • Evitar turbulencias y distorsiones del gradiente • Recomendable mantener la temperatura del tubo = temp. de centrifugación • Evitar la inversión del gradiente Métodos : • Extracción directa del contenido del tubo • Perforación . Extracción directa de la banda • Por desplazamiento de abajo a arriba • Por desplazamiento de arriba a abajo • Por corte del tubo Detección de la muestra : • Espectofotométrica (ácidos nucleicos, proteínas) • Seguimiento actividad enzimática • Por marcaje radioactivo. • CI : necesario densidad! directamente con picnómetro o índice de refracción Manera fija al eje de la centrífuga−> móvil Inconveniente si la centrífuga no esta bien balanceadaa oscilación del tubo es incontrolada se puede perder la muestra. Obs. 2 casos: *centrifugación diferencial (verde): muestra distribuida homogénea−,tras cent. Hay sobrenadante y pellet. 5 *gradiente de densidad (rojo):muestra no homogénea, cambio de posición del, tubo provoca mov de las particulas x gradiente d, el contenido del tubo no sufre reorganización tubo vuelve su posición. El contenido es impulsado por la fuerza de la centrífuga y se dispone perpendicular a la dirección del eje de giro. Cuando la fuerza acaba el contenido recupera su posición. El pellet se coloca en el ext inferior del tubo + alejado del eje de giro, en el caso de centrifugación diferencial (1ºdibujo) En gradiente de densidad la muestra queda paralela al eje de giro (2º y 3º dibujo) Malos para sedimentar , lo q sufre un cambio de posición es el contenido del tubo. *C. diferencial: reorientación del líquido, el pellet se dispone en la superficie del tubo más alejada al eje de giro (1º dibujo) *C. gradiente de densidad: cuando comienza y acaba la fuerza centrífuga se reorganiza el líquido −> mecanismo para iniciar y acabar la centrifugación. 6