Desarrollo de embriones somáticos de alcornoque en biorreactores de inmersión temporal Jesús Jiménez, Inmaculada Hernández, Dolores López-Vela, Mariano Toribio y Jesús Alegre Instituto Madrileño de Investigación y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario (IMIDRA) Finca “El Encín”. Apartado 127, 28800 Alcalá de Henares (Madrid). e-mail: jesus.jimenezga@madrid.org imidra INTRODUCCIÓN El sistema de inmersión temporal (SIT) se basa en el empleo de medio líquido y el establecimiento de ciclos de aporte y retirada del medio. Esto permite aprovechar las ventajas del medio líquido (favorece la absorción de nutrientes, el crecimiento del material vegetal y la dilución de los metabolitos excretados), al tiempo que reduce sus inconvenientes (suprime el contacto continuo de los explantos con el medio de cultivo, evitando los problemas de asfixia y vitrificación). Por otra parte el SIT facilita el control y el estudio de la nutrición en el cultivo in vitro y puede contribuir al desarrollo óptimo de los explantos. En este trabajo presentamos la puesta a punto de un SIT aplicado a la obtención de embriones somáticos de alcornoque. PREPARACIÓN DEL INÓCULO MATERIALES Y MÉTODOS - MATERIAL VEGETAL: Zonas de necrosis -- Células somáticas desprendidas de zonas de necrosis de embriones somáticos en proliferación. - EQUIPO Y DISPOSITIVO SIT: El equipo utilizado consta de dos recipientes conectados entre sí con tubos de silicona que se acoplan a una bomba de presión. El sistema es gobernado por un programador, que abre y cierra una serie de electroválvulas para permitir el paso del medio en uno u otro sentido. 1. Se seleccionaron masas de embriones somáticos de Q.s. en proliferación. 2. Se cultivaron en 500 ml. de medio SH en agitador orbital (110 r.p.m.) en cámara de cultivo a 25 ºC, durante 7 días. 3. y 4. Se procede al filtrado del líquido con discos de papel estéril (0,2 ). Las células de necrosis desprendidas se retuvieron en el disco y éste fue introducido en los recipientes. 1 2 3 4 Inoculo inicial BOMBA AIRE PRESIÓN PROGRAMADOR 2 Inmersiones/día RESULTADOS 4 Inmersiones/día 1 Inmersión/día GRÁFICO 2: COMPARACIÓN TRATAMIENTOS TIS-ESTA CONSUMOS ACUMULADOS NO3- GRÁFICO 1: COMPARACIÓN TRATAMIENTOS TIS-ESTA CONSUMOS ACUMULADOS NH4+ 6 Inmersiones/día ELECTROVALVULA 70,00 20,00 CONDUCCIÓN DE AIRE 60,00 RECIPIENTES 15,00 Esquema del SIT 50,00 TIS 10,00 ESTA mg/l Vista del Sistema de Inmersión Temporal (SIT) mg/l CONDUCCIÓN DE ELECTRICIDAD ESTACIONARIO 0,00 30 45 - TRATAMIENTOS UTILIZADOS: 60 75 90 105 pH 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 - PARÁMETROS ESTUDIADOS: NH4+ Espectrofotómetro - colorimetría NO3- Ionómetro – Electrodos selectivos H2PO4- Espectrofotómetro - colorimetría Ntotal Suma NH4+, NO3- pH pH - metro CE Conductivímetro Pesadas Peso Fresco final de los embriones 60 75 90 105 120 G R ÁFIC O 4: PESO FR ESC O FIN AL D E LO S EM B R IO N ES PO R T R AT AM IEN T O S T IS-EST A TIS 12 10 ESTA 8 gr 6 4,09 TIS E S TA 4 30 45 60 75 90 105 o El gráfico 1, señala diferencias entre los tratamientos SIT y ESTA, siendo éstas más acusadas en los últimos periodos de cultivo (a partir de 90 días). El consumo de amonio fue más elevado en el tratamiento SIT, lo que pudiera estar en relación con el hecho de que se formaran embriones más desarrollados, al contrario que en el ESTA que fueron en estado globular. o Las diferencias en el consumo de NO3- (gráfico 2) fueron más marcadas en la comparación de las frecuencias de SIT que en el de los tratamientos SIT-ESTA. El mayor consumo fue en el del tratamiento de 6 inmersiones. Pesadas Se valoró el aspecto Y tipos de estructuras (morfología) 45 10,16 MUESTREOS Medio de cultivo líquido MS (Murashige & Skoog, 1962) con macronutrientes SH (Schenk & Hildebrant, 1972) 30 Días de cultivo GRÁFICO 3: COMPARACIÓN TRATAMIENTOS TIS-ESTA pH 15 INMERSIÓN PERMANENTE EN AGITADOR ORBITAL A (110 r.p.m.) 15 120 Días de cultivo SISTEMA ESTACIONARIO (ESTA) SISTEMA DE INMERSIÓN TEMPORAL (SIT) Desarrollo de los embriones 30,00 10,00 15 Evaporación TIS 20,00 5,00 0,00 1 Y 6 INMERSIONES /DÍA 40,00 Proyecto RTA 03-050 120 2 0 En la gráfica 3, se observa una tendencia a elevarse en todos los tratamientos, pero es mucho más lineal y regular en el caso del SIT que en el ESTA que produce el necrosamiento de los embriones, coincidiendo además con una mayor captación de NO3- en las etapas finales del cultivo. En la comparación de los pesos frescos obtenidos (gráfica 4) podemos observar diferencias entre los tratamientos SITESTA, siendo mucho mayores en el ESTA. Esto fue posiblemente debido a que la preparación del inóculo inicial del SIT no fue lo suficientemente homogénea.