Criopreservación de espermatozoides de Mesodesma donacium

UNIVERSIDAD CATOLICA DEL NORTE
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
DEPTO. BIOLOGIA MARINA
PROYECTO DE TESIS
CRIOPRESERVACIÓN DE ESPERMATOZOIDES DE Mesodesma donacium (LAMARCK, 1818).
INTRODUCCION
Para producir y explotar especies comercialmente valiosas, es necesario tener un abastecimiento permanente
de gametos y de esta manera mantener un stock constante de larvas. Este abastecimiento de gametos puede ser
generado por medio de la mantención de un stock de reproductores, por medio de captación natural de larvas
o por medio del almacenamiento de gametos por largos períodos de tiempo, mediante la criopreservación.
La criopreservación de espermatozoides es una técnica que permite un mayor aprovechamiento de dichos
gametos, al poder utilizarlos en la inseminación artificial en cualquier período del año, y sobre todo en
aquellas especies que presentan desfases en la maduración gonadal entre machos y hembras. También
posibilita la creación de bancos de gametos, haciendo posible el establecimiento de programas de selección
genética. Desde el punto de vista de la acuacultura la disponibilidad de gametos congelados, posibilita la
disminución de los costos de producción, al disminuir los costos de mantención de reproductores y su
transporte de un centro de cultivo a otro; resulta más económico el transporte de un bidón de Nitrógeno
Líquido (NL) con los gametos que un grupo de reproductores, evitándose a la vez el estrés derivado del
transporte (Almendras, 1993).
La criopreservación está basada en la congelación en nitrógeno líquido de células, grupos celulares u
organismos completos a ser tratados, ayudada por la aplicación de ciertas soluciones químicas que protegen
con alta efectividad a las células del daño producido por la formación de cristales de hielo durante el proceso
de congelamiento y descongelamiento, evitando posibles daños a la membrana plasmática y disminuyendo el
punto de congelación. (Toyoda, 1986)
Los cristales de hielo dentro de una célula, órgano o cuerpo causan daño físico. Cuando se propagan por el
espacio extracelular, ellos pueden dividir las conexiones célula−célula y dañar los capilares o causar serias
consecuencias osmóticas para las células como: deshidratación y colapso celular. Dentro de la célula, el hielo
destruye las estructuras internas y microcompartimentación que son vitales para las funciones metabólicas
(Storey, 1990).
La eficiencia de las soluciones crioprotectantes va a depender de la permeabilidad de la membrana plasmática
y de cuán tóxica sea la solución para la célula a tratar. De esta manera cada grupo de células reacciona de
diferente forma frente a estas sustancias, por esto los diferentes organismos requieren crioprotectantes
específicos (Renard y Cochard, 1989).
El primer criopreservante encontrado fue el glicerol (Rostand, 1949 y Polge, 1949 en Chereguini, 1992). En
1959 Lovelock y Bishop encontraron que el Dimetilsulfoxido (DMSO) era un crioprotectante más efectivo
que el glicerol y el etilenglicol, que presentaba una tasa de penetración más rápida y eliminaba el tiempo de
equilibrio entre espermatozoides, diluyente y crioprotectante, necesario para los otros crioprotectantes
(Chereguini et al, 1992).Los agentes crioprotectantes se dividen en 2 grupos: Agentes penetrantes y no
penetrantes.
1
1.− Agentes penetrantes, los cuales están formados por moléculas pequeñas y que a concentraciones elevadas
protegen la célula viva contra daños provocados por el congelamiento lento. Estas son: Metanol,
Dimetilsulfóxido (DMSO), Etilenglicol y Glicerol.
2.− Agentes no−penetrantes, formadas por moléculas de mayor tamaño que las anteriores y que protegen a la
célula externamente a una concentración molar baja y que generalmente se requieren para tasas más rápidas
de congelamiento y descongelamiento. Estas son: Glucosa, Sacarosa, Polivinilpirrolidona (PVP), Almidón
hidreoxietilico (HES) y Proteínas (Meryman, 1971).
Las primeras investigaciones se iniciaron en semen de bóvidos y posteriormente han abarcado diversas
especies de mamíferos tales como ratones, conejos y especialmente humanos (Chereguini et al, 1992). En
especies de vida acuática son los peces los que han sido ampliamente estudiados, mas aún, los primeros éxitos
de fecundación de huevos con espermatozoides criopreservados se realizaron en especies de agua dulce,
especialmente en salmónidos (Chereguini et al, 1992), Estos estudios se han extendido a la criopreservación
espermática de numerosas especies diferentes de peces (Hoyle y Idler, 1968; Graybill y Horton, 1969; Ott y
Horton, 1971; Harvey, 1983; Stoss y Holtz, 1983; Baynes y Scott, 1987; Piiromen, 1987; Steyn y Van Vuren,
1987; Yoo et al, 1987; Cloud et al, 1990; Chereguini et al, 1992; Thorogood y Blackshaw, 1992; Almendras,
1993; Ciereszko et al. , 1993; Hotz, 1993; Piiromen, 1993; Murali et al. , 1994; Pillai et al, 1994; Babiak et al,
1995; Conget et al. ,1996, Richardson et al.,1999; Ritar, 1999; Yao et al. , 2000), También han sido
criopreservadas las membranas de los cloroplastos de espinacas (Santarius y Geirsch, 1983), rotíferos (Toledo
y Kurokura, 1990; Toledo et al, 1991), cistos de artemia (Ramlov y Hvidt, 1992), eutardigrado Adorybiotus
coronifer (Ramlov y Westh, 1992), erizos de mar hemicentrotus pulcherrimus y Strongylocentrotus (Ashima
y Takahashi, 1978), ostras como Crassostrea gigas ( Bougrier y Rabenomanana,1986; Kurokura et al, 1990;
Renard, 1991; Yankson y Moyse, 1991; Chao et al, 1994; Chao et al. , 1997; Dupré ,1998), Crassoatrea
tulipa, C. Iredalei y Saccostrea cucullata (Yankson y Moyse, 1991), Crassostrea virginica ( Zell et al., 1979
), almeja Meretrix lusoria (Chao et al, 1997), ostión Argopectem purpuratus ( Dupré y Espinoza, 2000 ),
nauplios de cirripedio Balanus amphitrite (Anil et al., 1977) y crustáceos decápodos tales como
Macrobrachium rosenbergii (Chow et al, 1985) y Scyonia ingentis (Anchordoguy et al, 1988).
En este sentido los estudios en moluscos se concentran en ostras y ostiones en el ámbito mundial, siendo
prácticamente nulas las investigaciones referidas a otros tipos de moluscos y ninguna en la macha,
Mesodesma donacium. Este bivalvo de interés económico, presenta una distribución continua, pero no
uniforme, desde la bahía de Sechura en Perú hasta el extremo sur de la isla de Chiloé (43ºS) (Osorio y
Bahamondes, 1968). En estos últimos 10 años su extracción ha ido decreciendo, desde 1989 donde el
desembarque artesanal fue de 17.122 ton, hasta llegar a 1999 con 1.728 ton (Sernapesca, 1999).
Por la importancia económica que reviste este bivalvo para los pescadores artesanales; más aun por ser un
recurso sobreexplotado, cuya sustentabilidad actualmente se busca a través de áreas de manejo, favorecería de
manera importante la disponibilidad de gametos criopreservados, en especial de espermatozoides, para la
creación de un banco genético, almacenando espermatozoides de ejemplares valiosos seleccionados con
características de alto valor comercial o genéticamente mejoradas, como son el crecimiento en un menor
tiempo, tamaño mayor por sobre los de tamaño normal, mayor resistencia a enfermedades etc. También
posibilita el almacenamiento de espermatozoides de ejemplares de poblaciones silvestres para la
incorporación de nuevos genes a la población; posibilidad de realizar cruzamientos entre especies o cepas con
diferentes épocas de desove.
El presente proyecto propone criopreservar en nitrógeno líquido espermatozoides de macha, Mesodesma
donacium.
HIPOTESIS
OBJETIVO GENERAL
2
1.− Criopreservar y determinar la viabilidad post−descongelamiento de espermatozoides de Mesodessma
donacium..
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.− Determinar el tiempo y tipo de motilidad de los espermatozoides en agua de mar microfiltrada y
esterilizada (AMME) antes de criopresservar.
2.− Determinar la toxicidad de cada crioprotectante, concentraciones y tiempos de exposición en el porcentaje
de motilidad espermática.
3.− Determinar porcentaje de espermatozoides móviles después de ser congelados−descongelados.
4.− Determinar la viabilidad de espermatozoides criopreservados a través del porcentaje de fecundación de
ovocitos inseminados con espermatozoides post descongelación.
MATERIAL Y METODOS
1.− Obtención del material biológico.
Ejemplares machos y hembras de adultos maduros de la especie Mesodesma donacium serán obtenidos por
pescadores artesanales, mediante buceo autónomo, desde el área de manejo de la playa grande de Tongoy
(Bahía de Tongoy). La recolección de los individuos se llevará a cabo entre los meses de enero y febrero del
2001. Dichos ejemplares serán mantenidos en el laboratorio de tesistas de la Universidad Católica del Norte,
en un estanque de 100 lts con agua de mar y aireación constante. Los ejemplares serán alimentados cada 2
días con microalgas de la especie Chaetoceros gracilis e Isochrysis galvana.
2.−Obtención de gametos
Dado que la macha es una especie dioica, que no posee dimorfismo sexual (Fuentes, 1988), la determinación
del sexo será realizada a través de la obtención de gametos desde la gónada mediante un corte lateral,
permitiendo que los gametos extruyan al exterior, los cuales serán puestos en un portaobjetos y observados
bajo un microscopío de luz, con un aumento de 40x. La madurez de los gametos estará dada por la fluidez
rápida y limpia de éstos al realizar el corte en la gónada, a diferencia de los adultos inmaduros, de los cuales
sólo se obtiene un escaso fluido. Inmediatamente después de la salida de los gametos, serán extraídos
suavemente con una pipeta Pasteur esterilizada, para ser empleados en las siguientes experiencias.
• Tiempo de motilidad de los espermatozoides en agua de mar microfiltrada y esterilizada (AMMFE)
• Tolerancia a diferentes crioprotectantes, concentraciones y tiempos de exposición.
• Congelamiento y descongelamiento en nitrógeno liquido (NL).
• Determinación de la viabilidad de los espermatozoides post−descongelación, mediante movilidad y
fecundación de ovocitos maduros frescos.
3.− Motilidad espermática en agua de mar.
Con el propósito de determinar el tiempo que los espermatozoides permanecen móviles después de diluirlos
en Agua de Mar se pondrá una gota de espermatozoides (0,002 L), en cápsulas de Petri con 50 ml de
AMMFE. Se determinará la concentración espermática en dichas cápsulas mediante hematocitómetro. Se
evaluará la motilidad extrayendo cada 5 minutos una gota de espermatozoides, por un período de 90 min. La
motilidad será clasificada en 3 categorías:
Motilidad 1: Espermatozoides sin movimiento
3
Motilidad 2: Espermatozoides con movimiento de flagelo lento y movimiento zigzagueante.
Motilidad 3: Espermatozoides con movimiento de flagelo rápido y desplazamiento efectivo hacia adelante.
Para contabilizar el número de espermatozoide en las diferentes categorías se empleará un hematocitómetro.
4.− Toxicidad de los crioprotectante, concentración y tiempo de exposición
Los espermatozoides recién extraídos (0,002 L) serán depositados en una cápsula de Petri y luego se les
adicionará 1 ml de AMMFE Posteriormente se les adicionará 1 ml de los siguientes crioprotectantes: DMSO y
Metanol (Romol Chemical) y Propilenglicol (Sigma), en concentraciones de 0,5 M; 1,0 M y 1,5 M. El período
de exposición al crioprotectante corresponderá a 5, 10 y 15 minutos, a una temperatura ambiental de 16−17.
Una vez que los espermatozoides completen el tiempo de exposición antes mencionado, serán diluidos en 50
ml de AMMFE y permanecerán por un periodo de 15 minutos, al final del cual se extraerá una alícuota de
dicha solución y se colocará en un hematocitómetro para determinar el número de espermatozoides con
diferente motilidades, bajo microscopia de luz, con un aumento de 40x.
5.− Procedimiento de congelación−descongelación
• Congelación
Para la congelación se utilizará un sistema de congelación manual fabricado en el laboratorio de
criopreservación de la Universidad Católica del Norte, el que comprende un soporte universal en el cual van
articuladas 2 poleas que sostienen una lámina de acrílico perforada, que cumple la función de porta muestras,
en cuyas perforaciones se ubican los tubos de eppendorf que contienen las muestras que luego serán
introducidas a diferentes velocidades en un termo, que contiene nitrógeno líquido en el fondo hasta
sumergirlas totalmente en él. Una de las poleas está graduada, lo cual permite determinar las velocidades de
descenso de las muestras en vapor de nítrogeno líquido. Tubos de Eppendorf conteniendo 0.5 ml de uno de los
crioprotectantes ensayados y a una temperatura de 5º, serán mantenidos por 15 min, despues de adicionarles
0.5 ml de solución espermática también mantenida a 5º C. Se ensayarán 4 tasas de congelamiento: las 3
primeras lentas, a velocidades de 5º 10 y 15ºC/min hasta llegar −80ªC, mantenidas a esa temperatura durante 5
min y luego serán sumergidas directamente. La cuarta velocidad de congelamiento (206ºC/min) que será
evaluada corresponderá al sumergimiento de las muestras directamente en nítrogeno líquido, desde la
temperatura de 5ºC.
• Descongelación
El procedimiento de descongelación consistirá en retirar los tubos de ependorff con las muestras desde el
nitrógeno líquido y agitarlos en el aire durante 5 seg. Y luego sumergidos en agua a diferentes temperaturas,
teniendo cuidado con las tapas de los tubos ya que pueden saltar bruscamente a causa del cambio de
temperatura.
Se utilizarán 2 velocidades de descongelación: Una rápida (312ºC/min) y la otra lenta (71ºC/min). La
velocidad rápida se conseguirá colocando los tubos de ependorff en un recipiente con agua a una temperatura
de 50º C, durante 30 seg, (después de sacarlos del nítrogeno liquido y agitarlos en el aire por 5 seg.), luego de
lo cual serán transferidos directamente en agua a una temperatura ambiental, hasta su completo
descongelamiento. Para obtener el descongelamiento lento se procede de igual manera que el
descongelamiento rápido excepto que los tubos con las muestras son sumergidos en agua a temperatura
ambiental, hasta que se produce el descongelamiento total de las muestras. Inmediatamente producida la
descongelación, las soluciones espermáticas, se trasladarán a cápsulas de Petri con 50 ml de AMMFE,
procediéndose a homogenizar la muestra y extraer una alícuota para eveluar el estado de motilidad de los
espermatozoides por medio de hematocitómetro y microscopía óptica.
4
6.− Viabilidad de los espermatozoides congelados
Con el propósito de determinar la viabilidad de los espermatozoides después del
congelamiento−descongelamiento, se procederá a realizar experimentos de fecundación con ovocitos maduros
y frescos extraídos de la forma descrita en el pto 1. Después de descongelados los espermatozoides se
colocarán en una cápsula Petri con 50 ml de AMMF, solución que será adicionada a un vaso precipitado de 50
ml que contiene los ovocitos frescos.. La evaluación será efectuada a las 3 horas post−inseminación, momento
en el cual ocurre la tercera segmentación del embrión (Fuentes, 1988 y Munizaga, 1995).
7.− Análisis estadístico
Para comprobar si existen diferencias significativas entre los distintos crioprotectantes, concentraciones y
tiempos de exposición los resultados obtenidos en porcentajes serán transformados a arcoseno, para aplicarles
análisis de ANOVA multifactorial, y luego el test de comparaciones multiples de Tukey para determinar entre
que tratamientos están las diferencias. Para comprobar si existen diferencias significativas en las motilidades y
fecundaciones de los espermatozoides sometidos a los distintos crioprotectantes, concentraciones, velocidades
de congelamiento y descongelamiento, los resultados serán analizados de la forma mencionada en el párrafo
anterior.
CRONOGRAMA DE TRABAJO
ACTIVIDAD
OBTENCION EJEMPLARES
DETERMINACION TIEMPO DE MOTILIDAD DE
ESPERMATOZOIDES EN AMMFE
DETERMINACION TOXICIDAD, TIEMPO DE
INCUBACION Y TIPO DE CRIOPROTECTANTE A
UTILIZAR
DETERMINACION VABILIDAD DE
ESPERMATOZOIDES DESCONGELADOS
ANALISIS DE DATOS Y CONFECCION DEL
ESCRITO
1
X
M
2
X
X
X
X
X
E
3
X
S
4
X
E
5
X
S
6
X
X
X
X
X
X
X
LUGAR DE REALIZACION
Esta investigación se realizará en el Laboratorio de tesistas y en el Laboratorio de Criopreservación, Facultad
de Ciencias del Mar, Universidad Católica del Norte.
FI NANCIAMIENTO
Esta Tesis será financiada con fondos provenientes del proyecto DGI Interacciones moleculares en la
fecundación del Camarón de roca Rhynchocinetes typus, a cargo del Profesor Enrique Dupré.
LITERATURA CITADA
1.− Almendras, F. 1993. Ensayo de un sistema de criopreservación de semen de salmonideos aplicado a la
trucha Arco Iris (Oncorhynchus mykiss). Tesis de grado para obtener el grado de Licenciado en Medicina
Veterinaria. Universidad Austral de Chile.47 pp.
5
2.− Anchordoguy, T.; Crowe, J.; Griffin, F. & Clark, W., 1988. Cryopreservation of sperm from the marine
shrimp Sicyonia ingentis. Cryobiology, 25: 238−243.
3.− Anil, A.; Tulaskar, D.; Khandeparkar, D. & Wagh, A. 1997. Cryopreservation of Balanus amphitrite
nauplii. Cryobiology, 34: 1131−140.
4.− Asahima, E. & Takahashi, T. 1978. Freezing tolerance in embryos and spermatozoa of the sea urchin.
Cryobiology, 15: 122−127.
5.− Babiak, I.; Glogowski, J.; Luczynski, M.; Kucharczyk, D. & Luczynski, M. 1995. Cryopreservation of the
milt of northern pike. Journal of Fish Biol. 46: 819−828.
6.− Baynes, S. & Scott, A. 1987. Cryopreservation of Rainbow trout spermatozoa: The influence of sperm
quality, egg quality and extender composition on post−thaw fertility. Aquaculture, 66: 53−67.
7.− Bougrier, S. & Rabenomanana, L. 1986. Cryopreservation of spermatozoa of the Japonese oyster,
Crassostrea gigas. Aquaculture, 58: 277−280.
8.− Chao, N. Chiang, Ch. ; Hsu, H.; Tsai, Ch. & Lin, T. 1994. Toxicity tolerance of oyster embryos to
selected cryoprotectants. Aquat. Living. Resour. , 7: 99−104.
9.− Chao, N−H. ; Lin, T−L. ; Chen, Y−J. ; Hsu, H−W. ; Liao & I−CH. 1997. Cryopreservation of late
embryos and early larvae in the oyster and hard Clam. Aquaculture, 155:31−44.
10.− Chereguini, O.; Fernández, P.C. & Rasines, I. 1992. Adaptación de la técnica de criopreservación de
esperma para el Rodaballo(Scohthalmus maximus) y Besugo (Pagellus bogaraveo). Instituto español de
Oceanografía, 117:1−11.
11.− Chow, S.; Taki, Y. & Ogasawara, Y., 1985. Cryopreservation of spermatophore of the fresh water
shrimp, Macrobbrachium rosenbergii. Biological Bulletin, 168:471−475.
12.− Ciereszko, A.; Ramseyer, L. & Dabrowski, K. 1993. Cryopreservation of perch semen. The Prog. Fish.
Cult. 55: 261−264.
13.− Cloud, J.; Miller, W. & Levanduski, M. 1990. Cryopreservation of sperm as a means to store salmonid
germ plasm and to transfer genes from wild fish to hatchery populations. The Prog. Fish. Cult. 52: 51−53.
14.− Conget, P.; Fernández, M; Herrera, G. & Minguell, J. 1996. Cryopreservation of Rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss) spermatozoa using programmable freezing. Aquaculture, 143:319−329.
15.− Dupré, E. 1998. Toxicidad de diferentes crioprotectantes sobre espermatozoides y larvas de ostras y
ostiones, Crassostrea gigas y Argopectem purpuratus. Informe de avance. Dirección general de Investigación
y Cooperación Técnica. Universidad Católica del Norte. (DGI−UCN)
16.− Dupré, E. & Espinoza, C. 2000. Determinación del porcentaje de fecundación del Ostion del Norte
Argopectem purpuratus, utilizando espermatozoides criopreservados. Informe Final Proyecto DGI−UCN.
17.− Fuentes, I., 1988. Desarrollo y morfología externa comparada de larvas y postlarvas de Mesodesma
donacium y Mulina sp (Bivalvia: Mactracea) cultivadas en laboratorio. Tesis de licenciatura. Universidad
Católica del Norte, Sede Coquimbo. 71 pp.
18.− Graybill, J. & Horton, H. 1969. Limited Fertilization of Steelhead trout eggs with Cryo−Perserved
6
sperm. Journal Fish. Res. Bd. Canada. 26 (5): 1400−1404.
19.− Harvey, B. 1983. Cryopreservation of Sarotherodon mossambicus spermatozoa. Aquaculture. 32:
313−320.
20.− Hotz, . 1993. Cryopreservation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) sperm: practical
recommendations. Aquaculture. 110: 97−100.
21.− Hoyle, R & Idler, D. 1968. Preliminary results in the fertilization of eggs with frozen sperm of atlantic
salmon (Salmo salar). J. Fish. BD. Canada. 25: 1295−1297.
22.− Kurokura, H.; Namba, K. & Ishikawa, T. 1990. Lesions of spermatozoa by cryopreservation in oyster
Crassostrea gigas. Nippom Suisan Gakkaishi. 56(11): 1803−1806.
23.− Lovelock, J. & Bishop, M 1959. Prevention of freezing damage to living cells dimethyl sulfoxide.
Nature, 183:1394−1395.
24.− Meryman, H.1971. Cryoprotective agents. Cryobiology, 8: 173−183.
25.− Munizaga, M. 1995. Morfología gamética y fecundación en Mesodesma donacium (Lamarck, 1818)
(Mollusca: Bivalvia: Mesodesmatidae). Tesis para obtener el Título profesional de Biólogo Marino,
Universidad Católica del Norte, Sede Coquimbo.
80 pp.
26.− Osorio, C. & Bahamonde, N., 1968. Los moluscos Bivalvos en las pesquerias nacionales Chilenas.
Biología Pesquera, Chile, 3:69−128.
27.− Ott, A. & Horton, H. 1971. Fertilization of chinook salmon eggs with cryo−preserved sperm. Journal
Fish. Res. Bd Canadá. 28: 745−748.
28.− Pillai, M; Yanagimachi, R. & Cherr, G., 1994. In vivo and in vitro initiationn of sperm motility using
fresh and cryopreserved gametes from the pacific herring, Clupea pallasi. The Journal of Experimental
Zoology, 269: 62−68.
29.− Piiromen, J. 1987. Factors affecting fertilization rate with cryopreserved sperm of withefish ( Coregonus
muksun Pallas). Elsevier Scien. Publ. B. V. 66: 347−357.
30.− Piiromen, J. Cryopreservation of sperm from brown trout (Salmo trutta m. lacustris L.) and artic charr
(Salvelinus alpinus L.)
31.− Ramlov, H. & Hvidt, A., 1992. Artemia cists at subzero temperatures studied by differential scanning
calorimetry. Cryobiology, 29: 131−137.
32.− Ramlov, H. & Westh. P. 1992. Survival of the Cryobiotic Eutardigrade adorybiotus coronifer during
cooling to −196ºC: Effect of cooling rate, Trehalose level, and short−term acclimation. Cryobiology,
29:125−130.
33.− Renard, P. 1991. Cooling and freezing tolerances in embryos of the Pacific oyster Crassostrea gigas:
metanol and sucrose effects. Aquaculture, 92:43−57.
34.− Renard, P. & Cochard, J. 1989. Effect of various cryoprotectans on Pacific oyster Crassostrea gigas
7
Thumberg, Manila clam Ruditapes philippinarum. Reeve and King scallop Pecten maximus (L) embryos:
Influence of the biochemical and effects. Cryo− Letters, 10: 169−180.
35.− Richardson, G.F.; Wilson, C.; Crim, L. & Yao, Z. 1999. Cryopreservation of yellowtail flounder
(Pleuronectes Ferrugineus) semen in large straws. Aquaculture, 174 : 89−94.
36.− Ritar, A. 1999. Artificial insemination with cryopreserved semen from striped trumpeter (Latris lineata).
Aquaculture, 180:177−187.
37.− Santarius, K. & Giersch, C. 1991. Cryopreservation of spinach chloroplast membranes by
low−Molecular−Weight carbohydrates. Cryobiology, 20: 90−99.
38.− Sernapesca, 1999. Anuario estadístico de pesca. Servicio Nacional de Pesca. Ministerio de Economía,
Fomento y Reconstrucción. 291 pp.
39.− Steyn, G. & Van Vuren, J. 1987. The fertilizing capacity of cryopreserved sharptooth catfish (Clarias
gariepinus) sperm. Aquaculture. 63: 187−193.
40.− Storey, K. 1990. Life in a frozen state: adaptive strategies for natural freeze tolerance in amphibians and
reptiles. American Physiol. Soc., 559−568
41.− Stoss, J. & Holtz, W. Cryopreservation of rainbow trout (Salmo gairdneri) sperm. Aquaculture. 32:
321−330.
42.− Thorogood, J. & Blackshaw, A. Factors affecting the activation, motility and cryopreservation of the
spermatozoa of the yellowfin bream, Acanthopagrus australis (Günther). Aquaculture and Fish. Manag. 23:
337−344.
43.− Toledo, J. & Kurokura, H. 1990. Cryopreservation of the euryhaline rotifer Brachionus plicatilis
embryos. Aquaculture. 91: 385−394.
44.− Toledo, J.; Kurokura, H. & Nakagawa, H. 1991. Cryopreservation of different strains of he euryhaline
rotifer Brachionus plicatilis embryos. Aquaculture, 57(7): 1347−1350.
45.−Toyoda, Y. 1986. Principios de criopreservación de oocitos y embriones de mamíferos. Compendio del
curso de criopreservación de embriones de mamíferos 1986. Universidad Austral de Chile, Pp. 52−66.
46.− Yankson, K. & Moyse, J. 1991. Cryopreservation of the spoermatozoa of Crassostrea tulipa and three
other oysters. Aquaculture, 97: 259−267.
47.− Yao, Z.; Crim,L.; Richardson, G. & Emerson, C. 2000.Motility, fertility and ultrastructural changes of
ocean pout (Macrozoarces americanus L.) sperm after cryopreservation. Aquaculture, 181:361−375.
48.− Zell, S.; Bamford, M & Hidu, H. 1979. Cryopreservation of spermatozoa of the american oyster,
Crassostrea virginica Gmelin. Cryobiology. 16: 448−460.
49.− Yoo, B.; Ryan, M. & Wiggs, J. Loss of protein from spermatozoa of atlantic salmon (Salmo salar L.)
because of cryopreservation. Can. J. Zool. 65: 9−13.
8