1/7 ANÁLISIS DE ALIMENTOS PRÁCTICA # 3 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO BÁSICO ANÁLISIS DE PROTEÍNAS DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO EN PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE KJELDAHL INTRODUCCIÓN El problema que representa proporcionar proteínas adecuadas a la población del mundo es un tanto secundario en el problema general de alimentación mundial. Además de su significado nutritivo las proteínas juegan un papel importante en las propiedades organolépticas de los alimentos. Las proteínas ejercen una influencia controladora en la textura de los alimentos provenientes de fuentes animales. El contenido protéico del trigo y su harina es considerado como uno de los mejores indicadores de la calidad de la panificación. El análisis para la determinación de proteínas, a pesar de no estar incluido generalmente como factor de clasificación en los estándares de granos se acepta como un factor comercial. Las proteínas existen en los alimentos en combinación física o química con carbohidratos o lípidos. Las glucoproteínas y las lipoproteínas afectan las propiedades reológicas de las soluciones alimenticias o poseen aplicaciones técnicas como emulsificantes comestibles. El "envejecimiento" de la carne está relacionado con cambios químicos en las proteínas. Las proteínas naturales puras poseen poco sabor. Durante el proceso de calentamiento (ebullición, panificación, asado) las cadenas laterales de aminoácidos se degradan o interactúan con otros componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con los azúcares reductores) para conferir sabores típicos. El calentamiento excesivo puede, por otro lado, reducir el valor nutritivo. El analista de alimentos comúnmente desea saber el contenido protéico total de los alimentos, aunque dicho contenido esté conformado por una mezcla compleja de proteínas. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido protéico total de los alimentos son de naturaleza empírica. El aislamiento y pesado directo de la proteína proporcionaría un método absoluto, 2/7 sin embargo, dicho método es llevado a cabo sólo a veces en investigaciones bioquímicas pero es completamente impráctico para el análisis de alimentos. En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el proceso básico del conocido método actual de análisis de proteínas por el método Kjeldahl, más propiamente, para analizar nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total es convertido en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así formado se titulan con HCl estandarizado, lo cual se convierte en el nitrógeno de la muestra. El resultado del análisis representa el contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no protéicos. Este método ha sufrido varias modificaciones. Así, Kjeldahl usó originalmente permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación, sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión con ácido sulfúrico añadiendo algunos catalizadores. Gunning en 1889 sugirió la adición de sulfato de potasio para elevar el punto de ebullición de la mezcla de la digestión para acortar la reacción. Por lo tanto, el procedimiento de esta técnica es más correctamente conocido como Método Kjeldahl-Wilforth-Gunning. FUENTES DE ERROR Constituyen fuentes de error en este método son: la inclusión de nitrógeno no protéico como parte de la proteína; la pérdida de nitrógeno durante la digestión, la digestión incompleta de la muestra. Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se añaden al ácido (para elevar el punto de ebullición) pueden resultar en una descomposición por calor y la consecuente pérdida de amoníaco. Generalmente se recomiendan temperaturas de digestión de 370-410°C. También puede ocurrir pérdida de nitrógeno si se utiliza demasiado selenio o la temperatura de la digestión no se controla cuidadosamente; las condiciones son aún más críticas que con el cobre o el mercurio cuando se usan como catalizadores. 3/7 ESTRATEGIA En la práctica comercial se tienen que analizar un gran número de muestras diariamente, así que se utilizan estrategias que ahorran tiempo de análisis. En el análisis del harina de trigo se digiere 1 gramo de muestra usando una cantidad conocida de ácido sulfúrico 0.1253N, y titulando (mediante una bureta de lectura invertida) con hidróxido de sodio 0.1253N, así se hace posible reportar el porcentaje de proteína directamente de la lectura de la bureta. REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL DIGESTIÓN (1) n - C -NH2 + mH2SO4 proteína catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 calor NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN (2) (NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O NH 4 + H2BO3- (3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) borato) (ión TITULACIÓN El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl estandarizado: (4) H2BO3- + H+ H3BO3 4/7 OBJETIVOS El estudiante conocerá el fundamento del análisis de proteínas por el método de Kjeldahl. El estudiante se familiarizará con los equipos y el procedimiento del análisis de proteínas por el método de Kjeldahl y la recuperación de amoníaco. El estudiante aprenderá a realizar los cálculos pertinentes para la determinación de nitrógeno en proteínas. MATERIAL 1 matraz de digestión Kjeldahl con capacidad de 125 ml. 1 matraz de Erlenmeyer de 10 ml. 1 matraz volumétrico de 100 ml. 1 mechero de Bunsen. 2 pinzas (nueces). 1 soporte universal 1 pipeta de 5 ml. 1 pipeta de 10 ml. 1 frasco gotero de 25 ml. 1 frasco lámbar con capacidad de 1 litro. 1 piseta grande con agua destilada. 1 microbureta. 3 cuerpos de ebullición. 1 par de guantes de asbesto. 1 pinzas largas. 1 embudo de cristal chico o mediano. EQUIPO Aparato digestor Kjeldahl (1 para todo el grupo). 1 aparato destilador micro Kjeldahl (1 por equipo). REACTIVOS Verde de bromocresol al 0.1% diluido en alcohol al 95%. Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%. Ácido bórico al 2%. Ácido clorhídrico 0.01N (solución valorada). Hidróxido de sodio al 30%. Ácido sulfúrico concentrado. Mezcla catalizadora para la digestión: 2.5 g de dióxido de selenio + 100 g de sulfato de potasio + 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (proporcionada por la coordinación de laboratorios). 5/7 MÉTODO ELABORACION DE REACTIVOS 1.- Mezcla Indicadora.- Prepare por separado los indicadores verde de bromocresol al 0.1% y el rojo de metilo al 0.1% diluidos en alcohol al 95%. Mezcle 10 ml. de verde de bromocresol con 2 ml. de la solución de rojo de metilo en un frasco gotero. 2.- Ácido Bórico al 2%.- Disuelva 10 g de ácido bórico (en cristales) en 500 ml. de agua destilada hirviendo. Después de que se enfríe transfiera la solución a un frasco tapado. Se conserva indefinidamente. 3.- Ácido Clorhídrico 0.01N.- Prepare un litro y valórela con una solución de NaOH de la misma normalidad. 4.- Hidróxido de Sodio al 30%.- Disuelva 150g de perlas de hidróxido de sodio en 350 ml. de agua destilada. Almacene la solución en un frasco ámbar con tapón de vidrio. 5.- H2SO4 concentrado. 6.- Catalizadores para la Digestión.- Mezcle 2.5g de dióxido de selenio (SeO2), 100g de sulfato de potasio (K2SO4) y 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 . 5H2O). PROCEDIMIENTO DIGESTIÓN 1.- Pese exactamente 0.15g de harina de trigo en un matraz de micro-Kjeldahl cuidando que la muestra no se adhiera a las parédes o al cuello del matraz. 2.- Añada 2.5 ml. de H2SO4, dos perlas de ebullición y aproximadamente 1.0 g de mezcla catalizadora. 3.- Someta a digestión la muestra en el aparato de microKjeldahl bajo una campana de extracción, con el matraz ligeramente inclinado usando baja temperatura al inicio y aumentando el calor a medida que procede la digestión, rotando los matraces de vez en cuando para asegurarse de que se digiera toda la muestra. La digestión terminará cuando el color de la muestra sea azúlverde claro. El proceso tomará aproximadamente 90 minutos. 4.- Enfríe el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca al solidificarse la muestra. 5.- Añada 7 ml. de H2O cuidadosamente, poco a poco, a la muestra digerida. Mezcle y permítale enfriarse. DESTILACIÓN 6/7 6.- Encienda la unidad destiladora. 7.- Si es posible ajuste la velocidad de destilación a aproximadamente 5 ml. por minuto 8.- Abra la llave del agua para tener H2O circulando por el refrigerante todo el tiempo. 9.- Añada la muestra a la cámara de ebullición por medio de un embudo (para recuperar las perlas de ebullición) y enjuague el matraz con aproximadamente 5ml. de H2O destilada. 10.- Coloque 1 frasco Erlenmeyer con 10 ml de ácido bórico y 2 gotas de indicador bajo la salida de destilación. 11.- Añada aproximadamente 10 ml. de la solución de NaOH a la cámara de ebullición LENTAMENTE. La mezcla digerida se tornará oscura (azúl-gris o café oscuro). Si no cambia de color añada más NaOH. 12.- Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador. 13.- Colecte aproximadamente 20 ml. del destilado (4-5 minutos). El destilado estará listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz receptor. 14.- Retire el matraz de Erlenmeyer y limpie la unidad destiladora enjuagando la cámara de ebullición varias veces con agua destilada. Cada vez que se añada agua destilada hasta llenar la copita superior de la unidad destiladora para el enjuague deje que ésta hierva primero. Luego abra la llave de la parte que permite salir las muestras hacia fuera de la unidad destiladora. Una vez vacía la parte en donde se procesa la muestra asegúrese de que esté bien vacía. Si queda todavía un poco de agua en el fondo permita que hierva para que se vaya toda hacia esa segunda parte de la unidad destiladora. El matraz estará listo para recibir la segunda cantidad de agua destilada para lavar la unidad destiladora. Esta operación se repite al menos unas 4 veces. NOTA: La llavecita de la segunda parte de la unidad destiladora (que conduce la muestra procesada hacia el vasito permanece cerrada (en posición horizontal) durante el procesamiento de la muestra. Sólo se abre cuando se enjuaga el destilador. TITULACIÓN 15.- Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto final de la titulación. Compárese este color con el del blanco. Cada equivalente del HCl usado corresponde a un equivalente de NH3 o a un equivalente de N en la muestra original. El peso del N en mg está dado por miliequivalentes del ácido X 14 (el peso equivalente del N). RECUPERACIÓN DEL AMONÍACO Una posible fuente de variación en este método es la pérdida del gas amoníaco o una falla en atrapar el amoníaco en el ácido bórico. Esto puede ocurrir en diferentes pasos del proceso. Una técnica para buscar la recuperación del amoníaco consiste en destilar cantidades conocidas de amoníaco líquido y titularlo con HCl. Se obtendrá otra vez el color púrpura en el ácido bórico. 7/7 Mientras se digieren las muestras, se puede destilar una solución de sulfato de amonio. Añada 5, 10 ó 15 ml (mediante una pipeta) de solución de sulfato de amonio a la cámara de ebullición de la unidad destiladora. Enjuáguela después con agua destilada y, si es posible, desionizada. Coloque inmediatamente la punta de la unidad destiladora en 10 ml de ácido bórico + indicador. Colecte aproximadamente 20 ml. de destilado. Titule la muestra con el HCl estandarizado, registre los ml. de HCl empleados y calcule el peso del nitrógeno en el (NH4)2SO4. Cálculos Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra % N = NHCl x Volumen de ácido corregido x 14 g N x 100 g de muestra mol en donde: NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml. Volumen del ácido corregido = (ml. del ácido estandarizado para la muestra) - (ml. de ácido estandarizado para el blanco). 14 = Peso atómico del nitrógeno. Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N a porciento de proteína cruda. El porcentaje de N en proteína para el harina de trigo es de 18% y su factor de conversión es de 5.70. BIBLIOGRAFÍA A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists. Methods of Analysis. Washington, D.C. Official Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed. Jones and Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212. Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products. Ed. McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi. Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and Practice. 2ª. Ed. AVI U.S.A. pp 753-758. 8/7