INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA ANEXO PRÁCTICA NÚM. 1 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA METODO DE MICROKJELDAHL FUNDAMENTO DEL METODO La muestra se disuelve en ácido sulfúrico concentrado y se calienta con la finalidad de que la materia carbonosa se libere en forma de CO 2, los minerales se sulfaten y el nitrógeno se transforme en sulfato de amonio. Como catalizador se utiliza CuSO4, puede usarse sales de Hg, Zn, Se, pero estos dos últimos son muy caros y el Hg es tóxico. El K 2SO4 sirve como elevador de la temperatura de ebullición (no es catalizador), por cada 10o C de elevación de la temperatura, la velocidad del reacción se duplica. El ataque finaliza cuando la solución se torna de un color verde-esmeralda límpido. En este proceso de digestión o taque de la muestra, se libera en la digestión la grasa, fibra, carbohidratos presentes en la muestra en forma de CO 2; la parte oxigenada de la proteína también se libera, sólo queda la parte nitrogenada de la proteína. Al final del ataque, se tiene en la solución H 2SO4 sobrante, sales sulfatadas de los minerales disueltos y el sulfato de amonio. En el proceso de destilación, se añade al balón de Kjeldhal 500 ml de agua con la finalidad de diluir al ácido sulfúrico remanente, a la vez que el sulfato de potasio, sulfato de cobre y sulfato de amonio disueltos precipiten, dejando libre en la parte superior el H2SO4 sobrante es decir hay formación de dos fases. Luego se añaden algunas granallas de zinc con la finalidad de evitar la ebullición tumultuosa creando núcleos de vaporización. Inmediatamente después de este paso se adiciona la soda cáustica por los bordes del balón para evitar una reacción violenta con el ácido sulfúrico remanente y el (NH4)2SO4. La adición de la soda neutraliza la acción del ácido sulfúrico sobrante, favorece la liberación del amoníaco en forma de NH4OH que será recibido en el vaso erlenmeyer que contiene la solución de ácido bórico. Inicialmente al producirse el calentamiento desaparecen las dos fases, se forma una solución de color celeste-oscuro, luego al ebullir se torna color marrón debido a la presencia de un complejo cúprico, que desaparece a medida que se libera el amoníaco. El amoniaco es captado por la solución de H3BO3, que forma un complejo estable, esto se observa debido al cambio de color que experimenta la solución progresivamente, a medida que es captado por el ácido bórico; esto es visible gracias al indicador rojo de metilo, pudiéndose usar otro indicador según el rango de viraje. MANUAL DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN Posteriormente, se determina por titulación con HCL 0.1 N hasta cambio de color, en este caso, amarillo a rojo-grosella, el volumen gastado de ácido y se procede con los cálculos. Este método de análisis es aplicable a todo tipo de alimento en general, si el alimento ha sido enriquecido con urea, la expresión del resultado es engañosa. Material y Equipo Matraces de Kjeldahl de 30 ml Matraces de Erlenmeyer de 125 ml Pipetas serológicas de 1 y 10 ml Buretas Reactivos Ácido sulfúrico concentrado Oxido de mercurio Sulfato de potasio Solución de hidroxido-tiosulfato de sodio: disolver 60 g de hidroxido de sodio y 5 g de tiosulfato de sodio pentahidratado en agua y diluir a 100 ml. Ácido bórico al 4% (p/v) Ácido clorhídrico 0.1 N (estandarizado) Solución indicadora (1) ó (2): (1) Rojo de metilo-azul de metileno: Mezclar dos partes de una solución alcohólica de rojo de metilo 0.2% con una parte de una solución alcohólica de azul de metileno al 0.2%. (2) Rojo de metilo- verde de bromocresol. Mezcla una parte de una solución alcohólica de rojo de metilo 0.2% con 5 partes de una solución alcohólica de verde de bromocresol 0.2%. MANUAL DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN Determinación (1) Pesar la cantidad de muestra que consuma en la titulación de 3 a 10 ml de HCl 0.1N (10 a 100 mg de muestra seca), en papel libre de nitrógeno y transferir a un matraz de microkjeldahl. (2) Adicionar 1.9 + 0.1 g de K2SO4, 40 + 10 mg HgO, y 2.0 + 0.1 ml de H2SO4 (densidad especifica 1.84). Si la muestra es mayor a 15 mg, añadase 0.1 ml adicional de H2SO4 por cada 10 mg más de muestra. (3) Agregar perlas de ebullición que pasen por un tamiz número 10. (4) Si el tiempo de ebullición es de 2 a 2.5 min., debe digerirse por una hora después de que se halla destilado toda el agua y el ácido se encuentre en franca ebullición; si es tiempo de ebullición es de 2.5 a 3 min., se digiere entonces 1.5 h o bien hasta que la muestra se aclare. (5) Se enfría y se añade la mínima cantidad de agua destilada para disolver sólidos remanentes. Se engrasa ligeramente con vaselina el cuello de matraz. (6) Tanto la muestra digerida como las perlas de ebullición se transfieren al receptor del aparato destilador y se enjuaga el matraz 5 a 6 veces con porciones de 1 2 ml de agua destilada. (7) Se coloca debajo del condensador un matraz Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 5 ml de la solución de H3BO3 4% y de 2 a 4 gotas del indicador, procurando que el extremo del condensador quede sumergido en la solución. (8) A la muestra digerida se le adiciona de 8 a 10 ml de la solución de NaOHNa2S2O3. (9) Se colectan 15 ml de destilado y se diluye aproximadamente a 50 ml. (10) Esta solución se valora con el HCl 0.1N. Un color violeta indica el termino de la valoración. (11) Correr un blanco bajo las mismas condiciones. Cálculos %N= (ml HCl – ml blanco) * Normalidad del HCl * 14.008 * 100 mg de muestra % N proteico = %N * F MANUAL DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN Bibliografía AOAC 1990. Official Methods os Analysis, 15th. Ed., Association of Oficial Anlytical Chemists, Inc., USA, 342.