Efecto de diferentes sustancias antimicrobianas sobre Paenibacillus

EFECTO DE DIFERENTES SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS, SOBRE
Paenibacillus larvae larvae, AGENTE CAUSAL DE LA LOQUE AMERICANA
Karina Antúnez*, Bruno D´Alessandro, Claudia Piccini y Pablo Zunino.
Laboratorio de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente
Estable. Avda. Italia 3318, Montevideo, Uruguay.
*karina@iibce.edu.uy
Introducción
La Loque Americana es una de las más serias enfermedades que
afectan a las larvas de las abejas Apis mellifera (Hansen y Brodsgaard, 1999).
El agente causal de esta enfermedad es la bacteria Paenibacillus larvae larvae
(P. l. larvae). Esta bacteria forma endosporas altamente resistentes al calor y a
la deshidratación, capaces de sobrevivir en los restos de larvas por muchos
años, lo que favorece su dispersión.
Debido a que esta enfermedad provoca la muerte larval, las colmenas
afectadas sufren un progresivo despoblamiento, lo que en general culmina con
la muerte de la colonia. El despoblamiento de las colmenas no sólo origina
grandes pérdidas económicas a los apicultores, sino que además los panales
infectados quedan expuestos al pillaje por abejas de otras colmenas del
apiario, favoreciendo la diseminación de la enfermedad.
Según un relevamiento realizado en durante 2002- 2003 en nuestro
laboratorio, referente a la presencia de esporas de P. l. larvae en mieles de
diferentes departamentos de Uruguay, la bacteria ésta ampliamente distribuida
en nuestro territorio, siendo Colonia, Soriano, San José y Paysandú los
departamentos más afectados. Este hallazgo no es sorprendente dado que
esta es la región de mayor producción apícola del Uruguay y de donde
proceden los primeros aislamientos el bacilo. Por otra parte, el número de
esporas detectadas disminuyó gradualmente hacia el resto del país, no
habiéndose encontrado esporas en las muestras de Rivera, Cerro Largo,
Artigas y Rocha. Este patrón de distribución sugiere que el agente causal de la
enfermedad ingresó a Uruguay desde el litoral oeste y que desde allí se está
dispersando al resto del territorio, afectando a casi todo el país (Antúnez y col.,
2004).
En diversos países se han propuesto varias estrategias para prevenir la
aparición de brotes de Loque Americana: el reemplazo regular de los panales
de la cámara de cría, el empleo de materiales desinfectados en forma
apropiada, el retiro de las colonias enfermas de los apiarios y, en caso extremo,
su destrucción total mediante fuego. Si bien la mayoría estos métodos no
erradican la bacteria, logran minimizar el número de esporas y mantienen la
enfermedad bajo control (Hansen y Brodsgaard, 1999).
Otro método utilizado con frecuencia con el fin de prevenir y tratar las
colonias afectadas es el uso de antibióticos (Hansen y Brodsgaard, 1999). El
empleo de estas drogas tiene una efectividad limitada frente a las esporas de
P. l. larvae, incrementa el riesgo de aparición de cepas resistentes y además
puede generar residuos en la miel, afectando su calidad. Esto plantea serios
problemas para el diseño de una terapia antimicrobiana adecuada. En los
últimos años se han incrementado los esfuerzos para investigar las
propiedades de diversas sustancias naturales para tratar las colmenas
infectadas, incluyendo propóleos. Si bien hasta el momento no existen estudios
sistemáticos que prueben su efectividad in situ, las propiedades antibacterianas
y antifúngicas in vitro del propóleos han sido ampliamente documentadas
(Drago, 2000; Tichy y col., 2000; Kartal y col., 2003; Santos y col., 2003).
El objetivo del presente trabajo fue analizar la sensibilidad in vitro de
células vegetativas de P. l. larvae a un grupo de antibióticos incluyendo algunos
que han sido empleados con frecuencia en apicultura. También se evaluó la
sensibilidad a diferentes concentraciones de propóleos, como forma de
aproximación a una alternativa natural de tratamiento.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas:
En el presente trabajo se utilizaron 50 aislamientos de P. l. larvae obtenidos a
partir de abejas, larvas y miel de diferentes zonas geográficas de Uruguay
entre 1999 y 2002.
Evaluación de la sensibilidad bacteriana:
El análisis de sensibilidad se realizó mediante la técnica clásica de
antibiograma de Bauer y col. (1996). Los antibióticos empleados fueron
oxitetraciclina (5, 10, 15, 20 y 30 g), gentamicina (10 g), ampicilina (10 g),
nitrofurantoína (300 g) y sulfisoxazole (300 g). En el caso del propóleos se
utilizó una solución madre de propóleos (20 %) en etanol, y diluciones 1/10,
1/50 y 1/100 de la solución original. Como control también se empleó etanol sin
el agregado de propóleos, con el fin de descartar una posible actividad
inhibitoria del vehículo de la solución.
Resultados
Sensibilidad de P. l. larvae a antibióticos:
Todos los aislamientos resultaron sensibles a oxitetraciclina, gentamicina,
ampicilina y nitrofurantoína. Sin embargo, se encontraron 11 aislamientos
(22%) resistentes a derivados de sulfas. Dichos aislamientos fueron obtenidos
a partir de muestras de Colonia, Flores, San José, Durazno, Florida,
Maldonado, Paysandú, Lavalleja y Treinta y Tres (Fig. 1).
Sensibilidad de P. l. larvae a propóleos
Todos los aislamientos resultaron sensibles tanto a la solución concentrada de
propóleos (20% en etanol) como a las diluciones 1/10, 1/50 y 1/100. Además, el
halo de inhibición aumenta al aumentar la concentración de propóleos. El
control (solamente etanol) no mostró actividad inhibitoria frente a los
aislamientos (Fig. 2).
Discusión
El uso profiláctico o terapéutico de antibióticos en el tratamiento de la Loque
Americana presenta una limitada efectividad, debido principalmente a la
capacidad del patógeno de formar esporas altamente resistentes a agentes
químicos o físicos (Hansen y Brodsgaard, 1999). Existen reportes que indican
que las esporas de P. l. larvae pueden sobrevivir en las escamas por lo menos
35 años, manteniendo su capacidad de germinación (Haseman, 1961). Por otra
parte, el empleo de estas drogas acarrea un serio riesgo de generación de
residuos en la miel, lo que trae consecuencias no sólo en el terreno de la Salud
Pública, sino que constituye un grave problema para el sector exportador.
Además, el uso de antibióticos favorece la generación de cepas de P. l. larvae
resistentes. Ya existen informes sobre la aparición de cepas resistentes a
oxitetraciclina (OTC), tetraciclina y sulfatiazol en Argentina y Estados Unidos
(Alippi, 1996; Miyagi y col., 2000).
Si bien en el presente trabajo se utilizó un número limitado de aislamientos,
nuestros resultados indican que la generación de cepas resistentes a
antimicrobianos es un problema emergente incluso en nuestro país, y que ya
presenta una importante dispersión geográfica. La situación actual hace
primordial la necesidad de intensificar la investigación relacionada con
estrategias alternativas para el control efectivo de la enfermedad.
El análisis de sensibilidad al propóleos in vitro, indicó que todos los
aislamientos son sensibles, tanto a la solución concentrada como a las
diluciones ensayadas. Estos resultados podrían contribuir al diseño de una
estrategia natural de tratamiento de la Loque Americana con el fin de evitar los
problemas asociados al uso de antibióticos.
Como etapas siguientes del presente trabajo sería importante investigar el
efecto del propóleos en ensayos de campo sobre colmenas infectadas
naturalmente con P. l. larvae. Esto permitiría evaluar la potencial capacidad del
producto como agente terapéutico en el control de la enfermedad.
Aislamiento 83
Aislamiento 87
Figura 1.- Sensibilidad a diferentes antibióticos de los aislamientos: a- 83; b-87.
Ambos aislamientos son sensibles a oxitetraciclina (30 g), gentamicina (10
g), ampicilina (10 g) y nitrofurantoína (300 g). El aisalmiento 83 es sensible
al sulfisoxale (300 g), mientras que el aislamiento 87 es resistente. (Se
observa una zona opaca correspondiente a crecimiento bacteriano y zonas
traslúcidas donde el crecimiento fue inhibido por la sustancia presente en el
disco).
Figura 2.- Sensibilidad a diferentes concentraciones de propóleos (sol. madre
(1), diluciones 1/10, 1/50, 1/100 y control etanol) del aislamiento 86. Se puede
observar que hay crecimiento bacteriano alrededor del disco que contiene
solamente etanol, el vehículo de la solución de propóleos, mientras que hay
inhibición alrededor de los discos con diferentes concentraciones de propóleos.
Referencias
- Alippi A. 1996. Caracterización de aislamientos de Paenibacillus larvae
mediante tipo bioquímico y resistencia a oxitetraciclina. Rev. Arg. Microbiol. 28:
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- Antúnez K., D´Alessandro B., Piccini C., Corbella E., Zunino P. 2004.
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