Detección molecular de genes de resistencia a tetraciclina/s

Informes de los Laboratorios de
Referencia de la OIE
Actividades del año 2011
Enfermedad (o tema) para la(el) cual
es designado laboratorio de referencia
de la OIE:
Dirección del laboratorio:
Loque americana de las abejas
Unidad de Bacteriología CIDEFI (UB-CIDEFI) –
Facultad de Ciencias Agrarias Y Forestales –
Universidad Nacional de La Plata. Calle 60 y 119 S/N
c.c. 31. 1900 La Plata, Argentina
Tel.:
(+54-221) 423.67.58 int. 423
Fax:
(+54-221) 425.23.46
Dirección de correo electrónico:
alippi@biol.unlp.edu.ar
adrianaalippi@gmail.com
UB.CIDEFI@gmail.com
Sitio web:
Nombre (incluir título y puesto) del
Jefe de laboratorio (responsable
oficial):
Ing. Agr. Adriana M. Alippi
Investigadora Principal CIC
Experta OIE
Nombre (incluir título y puesto) del
experto de referencia
de la OIE:
Ing. Agr. Adriana M. Alippi
Investigadora Principal CIC
Experta OIE
Nombre (incluir título y puesto) del
redactor de este informe (si difiere del
anterior):
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
1
Loque Americana de las abejas
Parte I: Resumen de las actividades generales
relacionadas con la enfermedad
1.
Prueba(s) usada(s) o disponible(s) en su laboratorio para la enfermedad o tema especificados
Prueba
Técnica
Especificidad
Positivo
Detección de esporas de
Paenibacillus larvae en
restos larvales
Coloración - Microscopía
N/A
6
6
Detección de P. larvae
en restos larvales
PCR
específica
6
6
Aislamiento de P. larvae
de restos larvaes
Aislamiento en medios de
cultivo semi-selectivos y
confirmación por PCR
específica
6
6
Detección de esporas
viables de P. larvae en
miel
Aislamiento en medios de
cultivo semi-selectivos y
confirmación por PCR
específica
5
Detección de esporas de
P. larvae a partir de
abejas adultas
Aislamiento en medios de
cultivo semi-selectivos y
confirmación por PCR
específica
Totales
Negativo
23
Total
35
40
10
10
45
68
Prueba
Determinación
Técnica
Total
Test de susceptibilidad por
difusión en disco
Resistencia antimicrobiana frente a
tetraciclina, minociclina y
oxitetraciclina en cepas de P. larvae
Pruebas de susceptibilidad
/resistencia a antibióticos
23
Determinación de
concentración inhibitoria
mínima
Resistencia antimicrobiana frente a
tetraciclina, minociclina y
oxitetraciclina en cepas de P. larvae
Pruebas de susceptibilidad
/resistencia a antibióticos.
23
Detección molecular de genes
de resistencia a tetraciclina/s
por PCR
Especificidad para determinantes de
resistencia a tetraciclina y
oxitetraciclina
PCR
23
“Fingerprints” de ADN para
caracterizar cepas bacterianas
Tipificación genotípica de cepas de
P. larvae
Rep-PCR
23
Técnicas de diagnóstico empleadas:
1) Técnicas de coloración de restos larvales en colmenas con síntomatología clínica: Hanging drop modificada,
Tinción simple, Coloración negativa con nigrosina. (Ref. Alippi, A.M. A comparison of laboratory techniques
for the detection of significant bacteria of the honey bee Apis mellifera L. in Argentina. Journal of Apicultural
Research 30: 75-80, 1991; De Graaf, D.C. Alippi, A.M., Brown, M. , Evans, J.D.; Feldlaufer, M., Gregorc, A.,
Hornitzky, M., Pernal, S:F:, Schuch, D.M.T., Titĕra, D., Tomkies, V. and Ritter, W. Under the microscope.
Diagnosis of American foulbrood disease in honeybees: A synthesis and proposed analytical protocols. Letters
in Applied Microbiology, 43: 583-590, 2006). 2) Aislamiento y cultivo de Paenibacillus larvae a partir de
larvas con síntomas clínicos mediante medios semi-selectivos (agar MYPGP adicionado con ác. nalidíxico)
(Ref. Alippi, A.M. A comparison of laboratory techniques for the detection of significant bacteria of the honey
bee Apis mellifera L. in Argentina. Journal of Apicultural Research 30: 75-80, 1991).3) Detección de esporas
2
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
Loque Americana de las abejas
de Paenibacillus larvae a partir de abejas adultas mediante aislamiento y cultivo en medios semi-selectivos
(agar MYPGP adicionado con ác. nalidíxico) (Ref. Hornitzky, M.A.Z. & Karlovskis, S. A culture technique for
the detection of Bacillus larvae in honeybees. Journal of Apicultural Research 28: 118-120, 1989); 4)
Aislamiento de Paenibacillus larvae a partir de mieles contaminadas mediante medios semi-selectivos (agar
MYPGP adicionado con ác. nalidíxico + ác. pipemídico; agar BL adicionado con ác. nalidíxico + ác.
pipemídico). (Ref. Alippi, A.M. Detection of Bacillus larvae spores in Argentinian honeys by using a semiselective medium. Microbiología SEM 11: 343-350, 1995); 5) Tipificación genotípica por PCR específica con
primers PL1/PL2 (Ref. Govan V.A.; Allsopp, M.H. & Davidson, S. A PCR detection method for rapid
identification of Paenibacillus larvae. Applied and Environmental Microbiology 65: 2243-2245, 1999); 6)
PCR para la detección directa de Paenibacillus larvae a partir de larvas con síntomas clínicos de la
enfermedad. (Ref. Alippi A.M., López, A.C., & Aguilar O.M. A PCR based method that permits specific
detection of Paenibacillus larvae subsp. larvae, the cause of American Foulbrood of honey bees, at the
subspecies level. Letters in Applied Microbiology 39: 25-33, 2004). 7) Tipificación genotípica de cepas de
Paenibacillus larvae por rep-PCR empleando primers BOX, ERIC y REP (Ref. Alippi, A.M. & Aguilar, O.M.
Characterization of isolates of Paenibacillus larvae subsp. larvae from diverse geographical origin by the
polymerase chain reaction and Box primers. Journal of Invertebrate Pathology, 72(1): 21-27, 1998; Alippi
A.M., Reynaldi, F.J., López, A.C., De Giusti, M.R. & Aguilar O.M. Molecular epidemiology of Paenibacillus
larvae larvae and incidence of American Foulbrood in Argentinean honeys from Buenos Aires Province.
Journal of Apicultural Research 43(3): 135-143, 2004). 5) Determinación de resistencia-susceptibilidad a
tetraciclinas por métodos microbiológicos clásicos en cepas de Paenibacillus larvae (pruebas de difusión en
disco y determinación de concentraciones inhibitorias mínimas). (Ref. Alippi, A.M., López A.C., Reynaldi F.J.,
Grasso, D.H., and Aguilar O.M. Evidence for plasmid-mediated tetracycline resistance in Paenibacillus larvae,
the causal agent of a honey bee larval disease. Veterinary Microbiology 125: 290-303, 2007). 6) Detección de
determinantes de resistencia a tetraciclina y oxitetraciclina en cepas de Paenibacillus larvae por PCR. (Ref.
Alippi, A.M., López A.C., Reynaldi F.J., Grasso, D.H., and Aguilar O.M. Evidence for plasmid-mediated
tetracycline resistance in Paenibacillus larvae, the causal agent of a honey bee larval disease. Veterinary
Microbiology 125: 290-303, 2007; Lopez, A.C., De Ortuzar R.V.M. & Alippi, A.M. Tetracycline and
Oxytetracycline resistance determinants detected in Bacillus cereus strains isolated from honey samples.
Revista Argentina de Microbiología, 40: 231-236, 2008).
Las pruebas respectivas se desarrollaron con la frecuencia detallada en la tabla anterior sobre el material
remitido al laboratorio para diagnóstico. Adicionalmente se analizaron muestras de mieles comerciales.
2.
Producción y distribución de reactivos de diagnóstico
Cantidad suministrada a nivel nacional
(incluso para uso propio)
Cantidad suministrada a
otros países
Cepas de Paenibacillus larvae
caracterizadas genotípica y
fenotípicamente
60 cepas
2
ADN genómico total de
Paenibacillus larvae
500 µl (a una concentración de 50 ng/µl)
2
ADN plasmídico de
Paenibacillus larvae
300 µl (a concentraciones variables de acuerdo
con la extracción, en promedio 40 ng/µl)
–
Cepas de especies de Bacillus,
Paenibacillus y Brevibacillus
aisladas de miel
160
1
ADN genómico total de otras
especies aisladas de miel
1.000 µl (a una concentración de 50 ng/µl en
promedio)
–
Tipo de reactivo
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
3
Loque Americana de las abejas
Parte II: Actividades específicamente relacionadas con el mandato
de los Laboratorios de Referencia de la OIE
3.
Armonización y normalización internacional de los métodos para las pruebas de diagnóstico
o la producción y evaluación de vacunas
a)
Creación y mantenimiento de una red de contactos con otros laboratorios de referencia
de la OIE designados para el mismo patógeno o enfermedad y organización de
evaluaciones de calidad regulares interlaboratoriales para asegurar la comparabilidad de
resultados
Participación en el Sub-Regional Training Seminar on Diseases of honey-bees for OIE National Focal
Points. 14-17 de junio de 2011, Ezulwini, Swaziland.
b)
Organización de evaluaciones de calidad interlaboratoriales con otros laboratorios que
no sean de referencia de la OIE que usen pruebas para los mismos patógenos y
enfermedades para asegurar la equivalencia de resultados.
Ninguna en 2011
4.
Preparación y suministro de estándares internacionales de referencia para las pruebas de
diagnóstico o las vacunas
Se proveyeron los siguientes materiales:
4.1.
4.2.
4.3.
5.
Provisión de muestras de ADN de cepas tipificadas de P. larvae, junio 2011 al Laboratorio de
Microbiología de Alimentos, Universidad de Concepción, Chile.
Provisión de cepas de referencia de Paenibacillus larvae, Septiembre de 2011 al Veterinary Institute
RS, Branka Radicevica 18, 78000 Banja Luka, Bosnia and Herzegovina.
Provisión de cepas de referencia de Paenibacillus larvae, agosto de 2011 al Departamento de
Secuenciación Genómica, Departamento de Secuenciación Genómica, Centro de Servicios de
Constatación en Salud Animal (CENAPA), Carr. Fed. Cuernavaca, Cuautla No. 8534, Col Progreso,
Jiutepec, Morelos, México.
Investigación y desarrollo de nuevos procedimientos de diagnóstico y control
Se continuó con el desarrollo de los siguientes objetivos planteados en períodos anteriores:
 Investigar las bases genéticas de la resistencia a tetraciclina en las poblaciones de P. larvae y otras
especie de Paenibacillus y Bacillus comúnmente presentes en miel.
La enfermedad más grave de la etapa larval de las abejas melíferas es la loque americana, causada por la
bacteria esporulada Gram-positiva Paenibacillus larvae. Está difundida a nivel mundial y, en algunos países,
se controla mediante aplicaciones del antibiótico oxitetraciclina (OTC) como alternativa a la quema de
colmenas afectadas. No obstante, el empleo continuado de tetraciclina (Tc) trajo como consecuencia la
aparición de cepas bacterianas resistentes en poblaciones del patógeno provenientes de Argentina, Estados
Unidos y Canadá. Los dos mecanismos de resistencia a Tc más frecuentes en las bacterias son eflujo de
tetraciclina y protección ribosómica y, los genes de resistencia correspondientes se asocian frecuentemente con
elementos móviles como plásmidos y/o transposones. La transferencia horizontal de información genética entre
bacterias es un factor integral de variabilidad y evolución.
Los dos mecanismos de resistencia a Tc más frecuentes en las bacterias son eflujo de tetraciclina y protección
ribosómica y, los genes de resistencia correspondientes se asocian frecuentemente con elementos móviles
como plásmidos y/o transposones. La transferencia horizontal de información genética entre bacterias es un
factor integral de variabilidad y evolución.
Con el objeto de comprobar la existencia de una transferencia horizontal de genes de resistencia a Tc y OTC
desde cepas resistentes a susceptibles, se puso a punto la técnica de Eckhardt para la detección de ADN
plasmídico en bacterias esporuladas Gram (+) y pruebas de conjugación en medio líquido. Se determinó la
presencia del gen Tet K en 2 cepas de Paenibacillus larvae de alta resistencia a Tc (PL373 y PL 374) y se
efectuaron pruebas de conjugación entre estas cepas y Bacillus subtilis con resultados positivos. Este es el
4
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
Loque Americana de las abejas
primer registro de correlación entre resistencia a Tc y presencia de plásmidos transferibles en este patógeno y
en todo el género Paenibacillus. Se puso a punto una técnica para la extracción de plásmidos de P. larvae
empleando el kit de extracción Puriprep-P con modificaciones, la misma, resultó satisfactoria en cuanto a
calidad y cantidad de ADN. Se obtuvieron preparaciones de los plásmidos pPL373, pPL374 y pPL395
provenientes de distintas cepas salvajes de P. larvae respectivamente, los cuales se transfirieron por
electroporación por separado a la cepa susceptible P. larvae NRRLB-14154. Los transformantes obtenidos
mantuvieron su fenotipo rojo original pero adquirieron resistencia a Tc y la perdieron luego del curado por un
tratamiento de calor combinado con naranja de acridina. Adicionalmente, se empleó BOX-PCR para confirmar
la identidad de la cepa receptora, los transformantes y los curados. Se secuenció totalmente el plásmido
pPL374 y parcialmente el pPL395. Se encontró el determinante tet(L) asociado al plásmido pPL395 y se
caracterizó el origen de replicación simple hebra (sso) involucrado en la replicación del plásmido por el
mecanismo del "círculo rodante", así como el origen de transferencia dónde se identificó el sitio de corte. Se
secuenció un segmento de los genes Mob que se traduciría en la porción funcional de las relaxasas
involucradas en la movilización del plásmido. Las comparaciones de las secuencias de ADN plasmídico
sugieren la presencia de un mismo origen de transferencia (OriT) y también de genes de movilización (mob)
muy similares a los citados para la superfamilia de plásmidos pMV158. Este es el primer registro de una
transferencia por electroporación de los plásmidos pPL373 y pPL374 conteniendo los determinantes tetL y
tetK y del plásmido pPl395 conteniendo el determinante tetL en una cepa susceptible de P. larvae.
Se evaluó el desempeño diagnóstico del Etest comparándolo con el método de dilución en agar para la
determinación cuantitativa de la susceptibilidad/resistencia de Paenibacillus larvae hacia Tc. Se probaron
cepas de P. larvae de distintos orígenes geográficos con distinta susceptibilidad a Tc utilizando como medios
de cultivo MYPGP y Oxoid Iso-Sensitest agar. No hubo discrepancias entre los valores de CIM obtenidos por
dilución en agar y los obtenidos con ETest en el caso del agar Iso-Sensitest, pero cuando se empleó MYPGP se
encontraron diferencias entre los valores de CIM obtenidos por E-test y los obtenidos por dilución en agar,
particularmente en el caso de las cepas resistentes por lo que se considera que el ETest resulta un método
satisfactorio y rápido para probar resistencia a Tc de P. larvae sólo si se emplea en combinación con el agar
Iso-Sensitest.
Se evaluó la potencialidad de una transferencia horizontal de genes de resistencia a Tc entre Bacillus cereus,
P. larvae y otras especies esporuladas de bacilos Gram-positivos que comparten el mismo nicho ecológico. Se
determinó la resistencia a Tc, OTC y minociclina (Mn) de 132 cepas de B. cereus aisladas de miel y, dentro del
grupo que presentó un fenotipo resistente por CIM y/o difusión en agar, se investigó la presencia de los
determinantes tetK, tetL, tetM, tetO, tetW, otrA y otrB por PCR. Estos resultados indican la existencia de un
alto porcentaje de cepas de B. cereus aisladas de miel conteniendo genes de resistencia a distintas tetraciclinas.
Este estudio constituye el primer registro de la presencia del determinante tetK en B. cereus como así también
de la presencia del determinante otrA dentro del género Bacillus.
 Investigar la diversidad fisiológica y quimiotaxonómica en las poblaciones de Paenibacillus larvae,
Bacillus cereus, Bacillus megaterium y especies relacionadas presentes en miel.
Se continuó con la caracterización de cepas de Bacillus megaterium aisladas de miel mediante el análisis de la
variabilidad genotípica por rep-PCR analizando los fingerprints de ADN generados por PCR y primers BOX,
ERIC y REP. Los resultados mostraron una alta variabilidad intra-especie y se detectaron características
propias de cepas tóxicas, como la capacidad para coagular el plasma y la actividad Beta-hemolítica,
características inéditas para esta especie. Para investigar la presencia de secuencias de ADN relacionadas con
genes de virulencia y su posible correlación con la actividad hemolítica y coagulasa se evaluaron las cepas de
B. cereus y de B. megaterium analizando por PCR secuencias de ADN de los genes nhe (A, B y C), HBL (A,
B, C, D), cytK y bceT. Mediante un análisis de componentes principales se encontró una correlación positiva
entre actividad coagulasa (coagulasa libre) y presencia de los genes del complejo HBL y bceT en B. cereus,
mientras que en B. megaterium se halló una alta correlación positiva entre actividad coagulasa (libre y fija) y
actividad hemolítica, pero no se observó relación significativa entre la presencia de genes de virulencia. Este
estudio constituye el primer registro de la presencia de los genes cytK y NHE en cepas de B. megaterium y el
primer registro de la relación entre la actividad coagulasa y la presencia de genes de virulencia en B. cereus y
B. megaterium. La presencia del gen cytK en ambas especies resultó totalmente independiente del resto de los
factores de virulencia analizados. Posteriormente, se estudió el efecto citopático de las cepas de B. megaterium
analizadas sobre enterocitos humanos en cultivo (línea Caco-2) determinando que 9 de ellas produjeron un
100% de desprendimiento total de la monocapa de células. Adicionalmente, se evaluó la interacción directa de
estas cepas y enterocitos humanos en cultivo determinando cuantitativamente la asociación e invasión. Estos
hallazgos sugieren que la miel podría vehiculizar enfermedades transmisibles por alimentos por su contenido
de bacterias potencialmente tóxicas.
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
5
Loque Americana de las abejas
 Evaluar alternativas no contaminantes para el control de loque americana
Los objetivos propuestos fueron investigar el antagonismo entre especies bacterianas productoras de sustancias
antagónicas y Paenibacillus larvae y su potencialidad como herramienta de control biológico, caracterizando
dichas sustancias. Se utilizaron 10 cepas bacterianas de diferentes especies de Bacillus y Brevibacillus
seleccionadas a partir de resultados previos del grupo de trabajo. Los sobrenadantes de las cepas provenientes
de cultivos de 16 h de crecimiento a 32° C en medio tripticasa soya, fueron esterilizados por filtración y
precipitados con sulfato de amonio 65 %. Se evaluó la actividad antimicrobiana mediante la técnica de spot test
utilizando la cepa P. larvae ATCC 9545 como indicador. Las muestras que mostraron halo de inhibición
fueron ultrafiltradas utilizando el sistema Amicon Ultra-15 PLBC Ultracel-PL con membrana de 3 kDa
(Millipore, USA) y extraídas en butanol (0,7 volúmenes), evaporándose el solvente en rotavapor a presión
reducida. El residuo se resuspendió en PBS y se evaluó la actividad antimicrobiana mediante la técnica de spot
test como se indicó previamente. Con esta metodología se obtuvieron sustancias antagónicas a partir de
cultivos de B. cereus (cepa m6c y m 387) y de B. licheniformis (cepa m 347). Los cultivos provenientes de
cepas de B. megaterium, B. pumilus, B. subtilis y Brevibacillus laterosporus no rindieron sustancias
inhibitorias mediante este procedimiento. Los componentes antagónicos se caracterizaron determinando el
efecto del pH, de la temperatura y de distintas enzimas. La actividad antibacteriana es sensible a pH entre 8 y
10 (1 h a 37°C) y a temperaturas superiores a 70°C (60 minutos entre 70°C y 121°C); en cambio se mantiene
luego del tratamiento con enzimas proteolíticas como tripsina, pepsina y proteinasa K (1 h a 37°C), en un
rango de pH entre 3 y 7 (1 h a 37°C) y cuando son mantenidos a 60 °C durante 1 h. El tratamiento con otras
enzimas como quimotripsina, papaína y lipasa disminuyó la actividad antimicrobiana dependiendo de la cepa
de origen de las muestras evaluadas. La utilización de electroforesis en geles de poliacrilamida con tricinaSDS permitieron estimar el peso molecular entre 3,4 y 16,9 kDa. Los valores obtenidos de Concentración
Inhibitoria Mínima y Concentración Bactericida Mínima permitieron concluir que los componentes
antibacterianos resultaron bactericidas. El residuo acuoso de la extracción de butanol evaporado bajo presión
reducida también posee efecto antagónico pero con un perfil de proteínas de entre 16,9 y 26,6 Kd. Los
resultados demostrarían que la actividad antagónica estaría relacionada con varios compuestos de diferente
naturaleza.
6.
Recopilación, análisis y difusión de datos epizootiológicos concernientes a la lucha
internacional contra las enfermedades
Se aislaron dos cepas de Paenibacillus larvae con resistencia a tetraciclina a partir de mieles comerciales
provenientes de USA y una cepa de P. larvae también con resistencia a tetraciclina a partir de una muestra de
miel comercial proveniente de Aruba. Las mismas se encuentran disponibles en el cepario del laboratorio.
Actualmente se cuenta con 444 cepas de P. larvae agente causal de la loque americana de distintos orígenes
geográficos, las mismas han sido caracterizadas genotipica y fenotípicamente y están depositadas en la
colección bacteriana de la UB.CIDEFI.
7.
Mantenimiento de un sistema de control de calidad, bioseguridad y seguridad biológica en
relación al patógeno y a la enfermedad
7.1.
7.2.
8.
Curso para la elaboración de un sistema de gestión de la calidad bajo norma ISO 17025/ IRAM 301, en
el marco del proyecto “Fortalecimiento de las capacidades científicas, técnicas y de gestión de los
laboratorios y las unidades de vinculación de la UNLP”. Octubre de 2008 – Mayo 2011. En este
momento la UB.CIDEFI está implementando el sistema.
Manual de Calidad de la UB-CIDEFI: Documentos desarrollados: Manual de Calidad de la UB.CIDEFI,
Procedimientos generales (12 en total con sus correspondientes anexos), Procedimientos de ensayo
(7 en total).
Suministro de asesoramiento experto a la OIE o a los Países Miembros de la OIE
Consultorías permanentes:


6
Editora Asociada del Journal of Apicultural Research, INGLATERRA. ISSN 0021-8839.
Miembro del IBRA Council
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
Loque Americana de las abejas


Miembro de la Comisión Asesora Honoraria de Agronomía, Comisión de Investigaciones Científicas de la
Prov. de Buenos Aires, Argentina.
Evaluadora externa de proyectos de Investigación nacionales e internacionales vinculados con el tema
Sanidad Apícola.
Durante 2011, la experta de la OIE, A.M. Alippi colaboró como evaluadora de las siguientes publicaciones
científicas:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
9.
Reviewer para Investigación Veterinaria (UBA). Artículo evaluado: “Loque americana: diferencias entre
el diagnóstico clínico y el de laboratorio en apiarios del distrito de Tandil, Argentina. 2003”. Ref. T192010, enero de 2011.
Reviewer para Journal of Apicultural Research. Artículo evaluado:”Determination of the status of the
etiological agent of American Foulbrood, Paenibacillus larvae, in Swaziland”. Ref. JAR 1010NC,
febrero de 2011
Reviewer para Journal of Apicultural Research. Artículo evaluado: “A new low cost method for detecting
nucleid acids in low-incidence samples: a case study of detecting spores of Paenibacillus larvae from bee
debris”. Ref. JAR 1118AA, marzo de 2011.
Reviewer para Apidologie. Artículo evaluado: “Impact of population levels on pharmacokinetic behavior
of tylosin after its administration in healthy beehives". Ref. APID36, abril de 2011.
Reviewer para Journal of Apicultural Research. Artículo evaluado: "Effect of honey bee extracts, honey
and inorganic chlorides on the in vitro germination of Paenibacillus larvae spores”. Ref. 1113NC, agosto
de 2011.
Reviewer para Veterinary Microbiology, VETMIC Artículo evaluado: “Antimicrobials in beekeeping”
Review Article, agosto 2011.
Reviewer para Journal of Invertebrate Pathology, Ref. JIP-11-252 “Paenibacillus larvae 16S-23S rDNA
intergenic transcribed spacer (ITS) regions, DNA fingerprinting and characterization, Diciembre de 2011.
Suministro de formación científica y técnica al personal de otros Países Miembros de la OIE








Consultoría dentro del marco del Laboratorio de referencia de la OIE: Dra. Sandra R. Quilodrán Vega,
Laboratorio de Microbiología de Alimentos, Universidad de Concepción, Chile. Asesoramiento en
técnicas de detección de P. larvae mediante PCR. Provisión de muestras de ADN, junio 2011.
Consultoría dentro del marco del Laboratorio de referencia de la OIE, Dr. Francisco. José Orantes
Bermejo, Director Técnico, Laboratorios Apinevada, Barrancos s/n, 18420 Lanjarón (Granada), España.
Evaluacion de actividad de aceites esenciales sobre diferentes genotipos de P. larvae, abril de 2011.
Consultoría dentro del marco del Laboratorio de referencia de la OIE, Dr.Gillian Ellis, Senior Veterinary
Specialist (Veterinary Epidemiology), Veterinary Epidemiology and Public Health Unit Veterinary
Services Division, Ministry of Agriculture and Fisheries, Kingston, Jamaica. Asesoramiento en
equipamiento y materiales de laboratorio. Junio de 2011.
Consultoría dentro del marco del Laboratorio de referencia de la OIE, Dr. Martin Ortiz Morera,
Laboratorio de Bacteriología, Unidad del Centro de Diagnóstico de Sanidad Animal, Servicio Nacional
de Sanidad Agraria-Senasa, Peru. Asesoramiento en técnicas de detección y diagnóstico de P. larvae en a
partir de distintos tipos de muestras. Provisión de protocolos de trabajo y bibliografía. Julio de 2011.
Consultoría dentro del marco del Laboratorio de referencia de la OIE, Dra. Violeta Santrac, Veterinary
Institute RS, Branka Radicevica 18, 78000 Banja Luka, Bosnia and Herzegovina. Asesoramiento en
técnicas de detección de P. larvae. Provisión de protocolos de trabajo, bibliografía y una cepa de
referencia de Paenibacillus larvae. Septiembre de 2011.
Consultoría dentro del marco del Laboratorio de referencia de la OIE, Dr. Wim Reybroeck, T&V-ILVO,
Institute for Agricultural and Fisheries Research, Technology & Food Science Unit, Brusselsesteenweg
370, 9090, MELLE, Belgium. Provisión de bibliografía. Agosto de 2011.
Consultoría dentro del marco del Laboratorio de referencia de la OIE, Dr.Juan Diego Perez de La Rosa,
Jefe de Departamento de Secuenciación Genómica, Departamento de Secuenciación Genómica, Centro de
Servicios de Constatación en Salud Animal (CENAPA), Carr. Fed. Cuernavaca, Cuautla No. 8534, Col
Progreso, Jiutepec, Morelos, México. Provisión de una cepa de referencia de Paenibacillus larvae, agosto
de 2011.
Consultoría dentro del marco del Laboratorio de referencia de la OIE, Dr. Wim Reybroeck, ILVO-T&V,
Institute for Agricultural and Fisheries Research, Technology & Food Science Unit, Brusselsesteenweg
370, 9090, MELLE, Belgium. Asesoramiento en productos aprobados para el control de loque americana
y europea, Diciembre de 2011.
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
7
Loque Americana de las abejas
10. Suministro de servicios para las pruebas de diagnóstico a otros Países Miembros de la OIE
Tipo de reactivo
Cantidad suministrada a otros países
Cepas de Paenibacillus larvae caracterizadas genotípica y
fenotípicamente
1 Bosnia and Herzegovina.
1 Mexico
ADN genómico total de Paenibacillus larvae
2 Chile
Cepas de especies de Bacillus, Paenibacillus y Brevibacillus
1 .Bosnia and Herzegovina.
11. Organización de reuniones científicas internacionales en nombre de la OIE o de otros
organismos internacionales
Ninguna en 2011
12. Participación en estudios científicos internacionales colaborativos
Ninguna en 2011
13. Publicación y difusión de información concerniente al trabajo de la OIE (incluidas una lista de
las publicaciones científicas, las actividades de publicación por internet, las presentaciones
en conferencias internacionales)


Presentaciones en conferencias y reuniones internacionales
Conferencias dictadas
Alippi, A.M. Sub-Regional Training Seminar on Diseases of honey-bees for OIE National Focal Points.
Conferencia dictada: Reference Laboratory for American Foulbrood, La Plata.14-17 de junio de 2011,
Ezulwini, Swaziland.
Alippi, A.M. Sub-Regional Training Seminar on Diseases of honey-bees for OIE National Focal Points.
Conferencia dictada: Bacterial brood diseases: European Foulbrood.14-17 de junio de 2011, Ezulwini,
Swaziland.
Alippi, A.M. Sub-Regional Training Seminar on Diseases of honey-bees for OIE National Focal Points.
Conferencia dictada: American Foulbrood: General Introduction. 14-17 de junio de 2011, Ezulwini,
Swaziland.
Alippi, A.M. Sub-Regional Training Seminar on Diseases of honey-bees for OIE National Focal Points.
Conferencia dictada: Control and erradication of American Foulbrood. 14-17 de junio de 2011, Ezulwini,
Swaziland.
Alippi, A.M. Symposium: American and European Foulbrood: prevention of residues and relapses.
American and European Foulbrood. Abstract pg. 156. Abstract Book. 42 nd International Apicultural
Congress, Apimondia 2011. Buenos Aires, Argentina.
Alippi, A.M. Symposium OIE. Diagnosis and Control of Bee Diseases. American and European
Foulbrood: Diagnosis and control. September 19th and 20th, 2011, Buenos Aires, Argentina.
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Presentaciones publicadas en Actas de Congresos:
Alippi, A.M., López A.C. & Reynaldi F.J. Evaluation of the Etest for detection of tetracycline resuistance
profiles in Paenibacillus larvae, the cause of American Foulbrood disease. Abstract H-2-32. 42nd
International Apicultural Congress, Apimondia 2011. Buenos Aires, Argentina.
León, I. E.; López, A.C. & Alippi, A.M. Transformation and characterization of tetracycline resistance
plasmids from Paenibacillus larvae the causal agent of AFB. Abstract H-2-41. 42nd International
Apicultural Congress, Apimondia 2011. Buenos Aires, Argentina.
Minnaard, J. & Alippi, A.M. Characterization of antagonistic compounds from Bacillus cereus against
the American Foulbrood pathogen. Abstract H-2-42. 42nd International Apicultural Congress, Apimondia
2011. Buenos Aires, Argentina.
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Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
Loque Americana de las abejas
López, A.C. & Alippi, A.M. Bacillus cereus isolates from honey carrying natural plasmids with
tetracycline resistance determinants. Abstract H-5-131. 42nd International Apicultural Congress,
Apimondia 2011. Buenos Aires, Argentina.
López, A.C.; Minnaard, J. Perez, P.F. & Alippi, A.M. Bacillus megaterium isolates from honey:
Cytotoxic effects on the human intestinal epithelial cell line caco-2. Abstract T-2-62. 42nd International
Apicultural Congress, Apimondia 2011. Buenos Aires, Argentina.
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Publicaciones científicas en revistas con examen por pares
Reynaldi, F.J., Lacunza J., Alippi A.M. & Rule R. Unión de los antibióticos tilosina, tilmicosina y
oxitetraciclina a proteínas presentes en abejas, larvas y productos de la colmena de Apis mellifera L.
Revista Argentina de Microbiología 42: 279-283, 2010. Argentina, ISSN 0325-7541.
Toledo, A.V.; Alippi, A.M. & Remes Lenicov, A.M.M. de. Inhibition of the growth of Beauveria
bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) by bacteria isolated from the cuticular surface of Dalbulus
maidis (Hemiptera: Cicadellidae) and of Delphacodes kuscheli (Hemiptera: Delphacidae), two important
vectors of maize pathogens. Journal of Insect Science, vol. 11, article 29; available on line:
http://insectscience.org/11.29 , 2011, ISSN 1536-2442.
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Otras comunicaciones
Alippi, A.M. Chapter 15. First Inspection in Laboratory. In. OIE Technical Series No. 12. The Vet and
the Bee. Editor: W. Ritter. (Enviado)
Alippi, A.M. Chapter 16. Bee Diseases (Pathogenesis, epidemiology, diagnosis, therapy and prophylaxis)
A. Bacterial diseases. In. OIE Technical Series No. 12. The Vet and the Bee. Editor: W. Ritter. (Enviado).
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Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
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