LANASEVE Rige a partir de: 02-06-10 Código: IA-RECAT-PT-005 VERIFICACIÓN DE ESPECIE POR INMUNODIFUSION EN AGAR Versión 03 Página - 1 - de 4 Elaborado por: Analista de Laboratorio Revisado por: Jefe de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 1. OBJETIVO Determinar la especie en músculo de animales de origen terrestre. 2. ALCANCE El ámbito de aplicación es en músculo fresco de bovino, porcino y equino. Este ensayo se realiza por prueba de inmunodifusión en gel de agar. 3. RESPONSABILIDAD Y AUTORIDAD Analistas Encargados(as) de esta técnica según lo indique el Registro de Distribución de Técnicas IA-RECAT-PE-004-RE-001. La supervisión la realiza el Jefe de Sección o quien delegue. 4. DEFINICIONES No Aplica 5. ABREVIATURAS Y/O SIGLAS IA: Inocuidad de Alimentos RECAT: Residuos y Contaminantes en Alimentos de Origen Terrestre PT: Procedimiento Técnico PE: Procedimiento Específico RE: Reportes 6. REFERENCIAS Y/O BIBLIOGRAFÍA IA-RECAT-PE-004-RE-001 Distribución de Técnicas IA-RECAT-PE-002-RE-001 Resultados de Análisis IA-RECAT-PT-005-RE-001 Hoja de Trabajo y Reporte de Resultados de Verificación de Especie IA-RECAT-PT-005-RE-002 Controles Intralaboratoriales de Verificación de Especie. Ingraham, J., C. Ingraham. 1999. Introducción a la microbiología. Primera edición, Editorial Reverté, Barcelona, España. 7 . DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO Fundamento Teórico El método consiste en la verificación de especie a partir de una muestra de músculo animal, empleando el método de inmunodifusión en agar noble. La prueba de inmunodifusión en agar es un tipo de precipitación que se realiza en una placa petri que contiene una determinada cantidad de agar noble, en la cual una vez solidificada se le hacen orificios (uno central y seis laterales). En los pocillos centrales se colocan las respectivas preparaciones de antisueros y en los laterales las de las muestras y controles. Las moléculas de proteína de los antisueros y las muestras difunden a través © Documento Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 02-06-10 Código: IA-RECAT-PT-005 VERIFICACIÓN DE ESPECIE POR INMUNODIFUSION EN AGAR Versión 03 Página - 2 - de 4 Elaborado por: Analista de Laboratorio Revisado por: Jefe de Sección Aprobado por: Jefe de Sección del agar hasta que entran en contacto y, si hay reacción, se producen los precipitados. Las zonas donde se produce el precipitado forman líneas blanquecinas denominadas líneas de precipitación, que destacan sobre el fondo del agar. Los antisueros son obtenidos del plasma de la sangre de las especies bovina, suina y equina, las cuales contienen proteínas de alta pureza que reaccionan con proteínas homólogas, es decir de la misma especie. Si la muestra posee proteínas homólogas a las del alguno de los antisueros, van a generar la línea de precipitación, por lo que se dice que son de la misma especie. En el caso contrario, no se formará la línea de color blanco. 7.1 Materiales, Reactivos y Equipos 7.1.1 Materiales - Micropipeta (con capacidad de 100 ul) Pipeta graduada de 25 ml Beaker de 100 ml Placas Petri de 10 x 100 ml Erlenmeyer 50 ml con tapa Embudos Troquel o molde para hacer los pocillos en las placas Filtros de papel (preferiblemente Whatman # 4) 7.1.2 Reactivos - Antisueros: Bovino (Bovine Whole serum, SIGMA, B8270) Equino (Horse Whole serum, SIGMA, H8890) Suino ( Pig Whole serum, SIGMA, P3164) Otros Nota: Los antisueros se almacenan en congelación. Agar noble NaCl Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) NaOH 1 M Disolución salina al 0,85 % Disolución salina amortiguadora ( NaCl al 0,85% y pH ~7,2) Disolución base amortiguadora con fosfatos y pH ~7,2 7.1.2.1 Preparación de disoluciones: - - Disolución salina 0,85 %: Disolver 8,5 g de NaCl en 1000 ml de agua destilada. o Disolución base amortiguadora de fosfato: Disolver 34 g de KH2PO4 en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,2 aproximadamente con NaOH 1M. Diluir con agua destilada a 1 L y guardar en refrigeración. Disolución salina amortiguadora: Ajustar el pH de la disolución salina 0,85 % a 7,2 © Documento Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 02-06-10 Código: IA-RECAT-PT-005 VERIFICACIÓN DE ESPECIE POR INMUNODIFUSION EN AGAR Versión 03 Página - 3 - de 4 Elaborado por: Analista de Laboratorio Revisado por: Jefe de Sección Aprobado por: Jefe de Sección aproximadamente con la disolución amortiguadora de fosfatos. Nota: todas las disoluciones anteriores se almacenan en refrigeración Agar noble al 1 %: Agregar 1 g de agar noble en 99 ml de disolución salina amortiguadora. Calentar y agitar la mezcla en plantilla hasta disolver el agar y esperar a que la disolución se vuelva transparente cuando da inicio la ebullición. Apartar del calor y utilizar de inmediato. - 7.1.3 Equipo - Procesador de muestras pHmetro Plantilla de calentamiento con agitación Balanza electrónica Recipiente metálico 7.2 Equipo de Protección - Gabacha Anteojos Guantes 7.3 Condiciones de Almacenamiento de Muestras El músculo debe mantenerse en refrigeración hasta que se analice; una vez analizado la contramuestra se mantiene en congelación durante 3 meses aproximadamente. 7.4 Preparación de las placas con agar neutro 7.4.1 7.4.2 Colocar las placas Petri en una superficie plana y adicionar aproximadamente 12 ml de la disolución de agar al 1% (caliente). Dejar las placas destapadas para que se solidifique el agar y guardarlas en una bolsa en refrigeración. No utilizar las placas si éstas están deshidratadas o con algún crecimiento microbiano. Los pocillos de las placas se pueden hacer antes de almacenarlas o cuando se va a realizar el ensayo. Solamente se deben sacar las placas necesarias según la cantidad de muestras. Con la ayuda de vacío se extraen los remanentes de agar de los pocillos marcados así como la humedad contenida en los mismos, dejando los orificios listos para utilizar. 7.5 Preparación de la muestra 7.5.1 Cortar porciones de las orillas y del centro de la muestra, tratando de retirar el tejido adiposo. Los trozos extraídos se cortan en trozos más pequeños que se homogenizan en un procesador de muestras. 7.5.2 Medir 10 g de muestra procesada en un beaker de 100 ml y agregar 40 ml de disolución salina al 0,85% y dejar reposar como mínimo 90 minutos. El homogenizado sobrante (contramuestra) se guarda en congelación por 3 meses. 7.5.3 Finalmente se decanta y filtra el líquido a través de un papel filtro (preferiblemente Whatman # 4) trasvasando el líquido a un erlenmeyer de 50 ml con tapa. © Documento Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 02-06-10 Código: IA-RECAT-PT-005 VERIFICACIÓN DE ESPECIE POR INMUNODIFUSION EN AGAR Versión 03 Página - 4 - de 4 Elaborado por: Analista de Laboratorio Revisado por: Jefe de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7.6 Preparación de las placas con los antisueros y las muestras 7.6.1 Una vez atemperados los antisueros se inicia el montaje de las muestras en las placas de Petri. 7.6.2 Con una micropipeta se llenan los pocitos centrales del troquel con los antisueros que corresponden.. 7.6.3 Alrededor de cada antisuero se debe colocar al menos un control positivo de las matrices conocidas. 7.6.4 Luego se llenan los demás orificios con las muestras a analizar por duplicado. 7.6.5 Una vez adicionadas todas las muestras, se tapa la placa, y se coloca un papel filtro ligeramente humedecido en el fondo del recipiente metálico, luego se guarda cuidadosamente (sin mover bruscamente la placa) dentro de éste. Debe dejarse ahí a temperatura ambiente por un lapso entre 18 a 24 horas. 7.6.6 Una vez transcurrido el tiempo se debe observar la placa en dirección a una fuente de luz. Se notará la formación de unas líneas de color blanco entre el orificio central y algunos extremos. Si se producen esas bandas o líneas continuas significa que el antígeno del antisuero y los antígenos de la muestra son homólogos, o sea son de la misma especie. Si las líneas se entrecruzan o no hay formación de línea, la especie de la muestra es diferente a la del antisuero. 7.6.7 Los controles intralaboratoriales se montan de la misma manera que se hace con las muestras, a excepción, que se utilizan solamente los controles positivos de las diferentes especies. 7.7 Resultados De formarse una línea de precipitación entre el antisuero y la muestra, se concluye que la muestra es positiva a la especie del antisuero, y se reporta como la matriz correspondiente (o sea, Bovino, Suino, Equino, etc). Si no se forma la línea, se concluye que la muestra es negativa, y se reporta como la matriz correspondiente. 7.8 Reporte de Resultados El reporte de los resultados se hace de acuerdo al formulario IA-RECAT-PT-005-RE-002 Hoja de Trabajo y Reporte de Resultados de Verificación de Especie. Finalmente, se reportan luego en el formulario IARECAT-PE-002-RE-001 Resultados de Análisis Los Controles intralaboratoriales se reportan en el formulario IA-RECAT-PT-005-RE-003 Controles Intralaboratoriales de Verificación de Especie. 8. ANEXOS: No Aplica. © Documento Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada