Antisueros para Salmonella

SSI®
ANTISUEROS PARA SALMONELLA
para uso diagnóstico in vitro
Aplicación
Los antisueros diagnósticos para Salmonella de Statens Serum Institut tienen
por objeto el serotipado completo o parcial mediante aglutinación en
portaobjetos y la inversión de fase para H.
Descripción
Los antisueros para Salmonella se obtienen de conejos y abarcan antisueros O y
H. El anticuerpo Vi es un anticuerpo monoclonal que se produce cultivando in vitro
una línea celular hibridoma y concentrando luego el anticuerpo del sobrenadante
del cultivo. Los antisueros pueden utilizarse en forma separada o en combinación,
según sea el propósito de la prueba. Los antisueros se suministran en frascos de
1 ó 3 mL (con azida de sodio como conservante).
Todos los antisueros para Salmonella son específicos, ya que se han eliminado por absorción
las reacciones cruzadas (con excepción de Poly A-E+Vi, Poly A-I+Vi, Poly A-S+Vi, Poly 42-67 y
Poly H).
Principio
Cuando se mezcla un cultivo bacteriano con un antisuero específico dirigido
contra componentes de la superficie bacteriana, las células se unen mediante
enlaces antígeno-anticuerpo para formar agregados (aglutinación). Esto
habitualmente puede verse a simple vista como grumos en la suspensión.
Mezclando antisueros específicos con un cultivo de Salmonella, se determinan los
antígenos O y H. En función del patrón de aglutinación observado, se determina el
serotipo utilizando el esquema de Kauffmann-White1.
Material necesario no incluido
Medio de agar no selectivo (por ejemplo, agar extracto de carne)
Asa bacteriológica o palillo
Portaobjetos de vidrio
Salino fisiológico, pH 7,4
Esquema Kauffmann-White
Material adicional para la inversión de fase
Placas de Petri estériles (diámetro 6 cm)
Horno de microondas o baño de agua (100°C)
Agar motilidad
Termómetro
Pipeta
Incubadora a 35 - 37°C
PROCEDIMIENTO Generales
El salino fisiológico se utiliza como control negativo, y debe ser negativo. Si el
control negativo es positivo (aglutinados), la cepa es autoaglutinante, es decir
O:rugosa.
Aglutinación en portaobjetos con antisueros O y H
La Salmonella se cultiva de un día para el otro en un medio de agar no selectivo. El
agar motilidad es el medio más apropiado para desarrollar cultivos para la
tipificación de H, pero se puede serotipar los antígenos H a partir de un medio de
agar no selectivo si los antígenos H están bien expresados.
1. Aplique una gota pequeña de antisuero (aproximadamente 20 μL) en el portaobjetos de
vidrio.
2. Transfiera cultivo de varias colonias a la gota de antisuero y mezcle bien.
La cantidad de cultivo deberá ser suficiente para dar una turbidez lechosa
distintiva. Utilice un asa bacteriológica o un palillo.
3. Incline el portaobjetos durante 5-10 segundos.
4. La reacción se observa a simple vista sosteniendo el portaobjetos frente a
una fuente de luz contra un fondo negro (iluminación indirecta).
5. Una reacción positiva se ve en forma de aglutinación visible. Una reacción
negativa es la persistencia de la turbidez lechosa homogénea. Una
aglutinación tardía o débil deberá considerarse negativa.
La ausencia de reacciones puede deberse a que la cepa expresa el antígeno
Vi (véase más adelante), a que la cepa no está cubierta por los antisueros
utilizados, o a que la cepa no es Salmonella.
Demostración del antígeno Vi
La presencia del antígeno Vi puede interferir o impedir la aglutinación en los
antisueros O. En consecuencia, se deben examinar los aislamientos negativos
para detectar la presencia de antígeno Vi. Dada la variación de formas en el
antígeno Vi, es importante seleccionar colonias individuales ya que las formas de
colonias que expresan el antígeno Vi son más opacas que las colonias Vi negativas.
Inversión de fase de H en placas de agar movilidad (método S. Gard)2
1. Funda el agar movilidad en un horno de microondas o en un baño de agua
(100°C) y enfríe a 45°C.
2. Ponga 100 μL de antisuero H para inversión de fase (correspondiente a la
fase que ya se ha identificado) en el centro de una placa de Petri pequeña,
estéril.
3. Vierta 10 mL del agar motilidad en el antisuero, hasta alcanzar una dilución
final de 1:100.
4. Deje solidificar la placa en el lugar de vertido, a temperatura ambiente
(22 - 25°C) durante 10-15 minutos.
5. Inocule la placa en el centro con un asa llena de cultivo bacteriano fresco
de una placa de agar o caldo de cultivo.
6. Incube entre 18 y 24 horas a 35 - 37°C.
7. Use material de cultivo del borde de la zona de crecimiento para la
aglutinación en portaobjetos. Seleccione los antisueros H pertinentes
utilizando el esquema de Kauffmann-White.
Si la fase H no se invierte, deberá aumentarse la cantidad de antisuero en la placa
de agar motilidad.
Almacenamiento y caducidad
Almacenar entre 2 y 8 ºC en un lugar oscuro. La fecha de caducidad está impresa
en el embalaje. Tras un almacenamiento prolongado, a veces se observa turbidez
provocada por la precipitación de lipoproteínas. La precipitación y/o
contaminación pueden eliminarse por centrifugación (10 000 g), seguida de
filtración estéril (0,22 μm).
Asistencia tipológica
Las cepas de Salmonella que no puedan tipificarse podrán ser enviadas a The
National Reference Laboratory for Enteropathogenic Bacteria (Laboratorio
Nacional de Referencia para Bacterias Enteropatógenas), 5, Ørestads
Boulevard, DK-2300 Copenhague S, Dinamarca, para hacer más exámenes.
Referencias
1. Grimont, P.A.D. and Weill, F.-X. Antigenic formulae of the Salmonella serovars,
9th ed., 2007. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on
Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France.
2. Gard, S. Das Schwärmphänomen in der Salmonella-gruppe und seine praktische Ausnützung. Zeit. f. Hyg. Inf. Krankh. 1938, 120;615-619.
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2a edición, julio 2011. 15983