Taboga-Baculovirus 2012.pdf
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Baculovirus como sistema de expresión El sistema de expresión Baculovirus-células de insecto Oscar Taboga Instituto de Biotecnología INTA Baculovirus como sistema de expresión Parte 1 – Introducción a los baculovirus Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas Parte 3 – Puesta en práctica Preguntas y discusión Baculovirus como sistema de expresión Parte 1 – Introducción a los baculovirus ¿Qué son los baculovirus? • Su ciclo de vida y cómo podemos hacer uso de él Baculovirus como sistema de expresión Los baculovirus son un grupo de virus encontrados mayormente en insectos (Baculoviridae). Tienen una estructura de varilla (baculum=bastón), un diámetro de entre 40-50 nm y una longitud de entre 200-400 nm. Su información genética está almacenada en una molécula de ADN doble cadena, circular, de aproximadamente 80-200 Kpb. Baculovirus como sistema de expresión Spodoptera frugiperda Baculovirus como sistema de expresión Trichoplusia ni Baculovirus como sistema de expresión En cultivos celulares o cuando se multiplican dentro de un insecto permisivo, los baculovirus forman dos tipos de viriones: virus ocluidos y virus brotados. peplómeros envoltura nucleocápside Baculovirus como sistema de expresión Para una sobrevida a largo plazo se forman los cuerpos de oclusión o poliedros que ocluyen los virus ocluidos. matriz nucleocápsides envoltura cálix Ciclo de replicación Liberación de viriones por lisis celular Poliedros Solubilización en el intestino de la larva Brotación Endocitosis Liberación del genoma Virus brotados Infección secundaria Fusión Infección primaria Virus derivados de cuerpos de oclusión ¡Película! Baculovirus como sistema de expresión Su ciclo de multiplicación La proteína poliedrina se acumula hasta alcanzar el 50% del total de proteínas celulares, pero el virus puede multiplicarese en cultivos celulares sin formar cuerpos de oclusión (virus pol -). ¿Qué significa en términos de expresión de proteínas? =>Pueden expresarse genes heterólogos bajo el control del promotor de poliedrina => La expresión ocurre en un estadío muy tardío de la infección => Los niveles de expresión serán probablemente muy altos Baculovirus como sistema de expresión Parte 1 – Introducción a los baculovirus Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas Seguridad Características generales del BVES Alternativas Modificaciones postraduccionales Parte 3 – Puesta en práctica Baculovirus como sistema de expresión Seguridad Riesgo personal o de contaminación de células de mamífero. Estudios mostraron que pueden entrar en células de mamífero, pero no alcanzan el núcleo ni transcriben genes Pueden considerarse entonces que no poseen riesgo de seguridad adicional y son clasificados como Clase I Contaminación de otras células de insecto Aunque su rango de hospedador es bastante limitado, pueden penetrar otras células de insecto pero no replican ni entran en estadíos tardíos De todas maneras, cuidado de no contaminar otros trabajos y como todo organismo recombinante, debe ser considerado potencialmente peligroso Baculovirus como sistema de expresión Características generales del BVES Producción de proteínas en un hospedador eucariota Siendo un sistema eucariota el BVES es capaz de: •Plegamiento apropiado •Modificaciones postraduccionales Estos requisitos son cruciales para proteínas con actividad biológica Baculovirus como sistema de expresión Características generales del BVES Altos niveles de expresión El BVES tiene el potencial de una muy fuerte expresión de genes heterólogos: se han alcanzado niveles de hasta 2550%de las proteínas totales (1g/l). Sin embargo, usualmente los niveles de expresión están en orden de: •1- 3 mg /l (proteínas intracelulares) •3-15 mg /l (proteínas secretadas) •Tan poco como 0.1 mg /l (algunas integrinas) •Hasta 50 mg /l (algunas kinasas) Baculovirus como sistema de expresión Características generales del BVES Expresión de proteínas tóxicas o termosensibles La mayor fase de producción de proteínas ocurre tardíamente en la infección. Esto significa que: •Pueden expresarse proteínas heterólogas tóxicas a pesar de posibles efectos sobre funciones celulares esenciales •Hay poca presión de selección contra el gen tóxico ya que este no interfiere con la producción de virus brotado La expresión ocurre a 27°C, lo que puede ser permisivo para proteínas termosensibles Baculovirus como sistema de expresión Características generales del BVES • Construcciones largas o múltiples Debido a que el genoma de los baculovirus puede acomodar grandes porciones de ADN, el sistema permite la expresión de largas construcciones o multiples genes simultáneos • Simplicidad de la tecnología Los vectores son accesibles para el clonado directo La construcción de un baculovirus recombinante es considerablemente más rápida que la de una línea celular eucariota (CHO, por ejemplo) Hay un rango muy amplio de vectores comerciales disponibles y kits para la construcción de virus recombinantes. Baculovirus como sistema de expresión Costos Los costos son significativamente más altos que los sistemas de expresión bacterianos y de levaduras, tanto en materiales como en equipamiento. Baculovirus como sistema de expresión Modificaciones postraduccionales Las células de insecto son capaces de lidiar con modificaciones postraduccionales como •Clivaje de péptido señal (incluidos los de mamífero •Fosforilación •N y O glicosilaciones •Miristilación •Plegamiento, formación de puentes S-S, oligomerización •Modificaciones lipídicas Baculovirus como sistema de expresión Modificaciones postraduccionales Limitaciones: •Clase y grado de modificación puede no ser idéntico al encontrado en la especie o tejido original •El muy alto nivel de expresión puede disminuir la capacidad de la célula de modificar correctamente el producto •Secreción, fosforilación y glicosilación pueden verse particularmente afectadas •Algunos de estos inconvenientes pueden resolverse usando promotores más tempranos Baculovirus como sistema de expresión Parte 1 – Introducción a los baculovirus Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas Parte 3 – Puesta en práctica Preguntas y discusión Baculovirus como sistema de expresión Sistemas de expresión • Vector • Hospedador • Metodología Baculovirus como sistema de expresión Baculovirus como sistema de expresión Baculovirus como sistema de expresión Características • Ambiente eucariota para la producción de proteínas • Expresión excepcionalmente alta • Expresión durante la fase de oclusión • Expresión a 27ºC • Capacidad de grandes inserciones • Expresión eficiente de genes no “spliceados” (cDNAs) • Simplicidad de la tecnología Crecer virus parental Preparar ADN viral Clonar gen en vector de transferencia Preparar ADN plasmídico Cotransfectar Screening de recombinantes Purificar recombinantes Amplificar recombinantes Confirmar identidad Caracterizar expresión génica Scaling-up Baculovirus como sistema de expresión Historia • Placas de lisis occ+ vs pacas occ- (1:1000) Baculovirus como sistema de expresión • Gen reportero (igual frecuencia) Baculovirus como sistema de expresión • Linealización del genoma (eficiencia 30%) Bsu361 Baculovirus como sistema de expresión • Deleción en orf letal y linealización (eficiencia 100%) Bsu361 Bsu361 Baculovirus como sistema de expresión Variaciones • Bácmidos como fuente de ADN viral • Generación de recombinantes por transposición Baculovirus como sistema de expresión • Bácmido bAcGOZA Ppol marker Mini F Pp10 poliedrina orf1629 Generación de baculovirus recombinantes por el sistema Bac to Bac Baculovirus como sistema de expresión Elección del virus y especie hospedadora • • • • 500 especies AcNPV y BmNPV 90% identidad rango de hospedador y líneas susceptibles muy diferentes y con distintas propiedades Baculovirus como sistema de expresión AcNPV vs BmNPV • Crecimiento y niveles de expresión de las líneas • Rango de plásmidos de transferencia • Expresión en larvas de insecto (tamaño, voumen de hemolinfa, canibalismo, bioseguridad, métodos de infección Baculovirus como sistema de expresión Cultivo de células vs larvas Células: • Igual sistema al usado en la caracterización inicial • Más “limpio” (medio libre de suero) • Más homogéneas purificaciónes postraduccionales • Caro • Equipamiento Baculovirus como sistema de expresión Cultivo de células vs larvas Larvas: • Más alta eficiencia de modificaciones postraduccionales • Bajo costo • Se necesita mantener insectos • Más difícil purificación Baculovirus como sistema de expresión Elección de células Propiedades • Tiempo de duplicación • Capacidad de crecimiento en monocapa o suspensión • Tamaño • Susceptibilidad • Modificaciones postraduccionales Baculovirus como sistema de expresión Elección del plásmido de transferencia • Método de producción (transposición vs. recombinación) • Proteína auténtica vs. fusión • Secretada vs citoplasmática • Complementación de la deleción letal en orf 1629 • Bajo la regulación de qué promotor • Una o más proteínas • Fenotipo occ + vs occ- Baculovirus como sistema de expresión Proteína auténtica • Acortar región 5’ no traducida entre promotor y ATG (hasta 100 pb) • Evaluar secuencias que rodean ATG • Consenso: A YAUG Y consenso TAAG 100 pb ATG UAA Baculovirus como sistema de expresión Proteínas secretadas • Señales propias • Señales probadas (gp64, melitina, etc) Baculovirus como sistema de expresión Promotores • Immediate early no usados • Early poco usados • Late durante y luego de S! de ADN, 39K, proteína básica • Very late P10, Pol Baculovirus como sistema de expresión Más de un gen simultaneamente • Heterodímeros • Necesidad de coexpresión de enzima modificante tejido o célula-específica • 1 p10 + 1 pol en locus poliedrina • 2 p10 + 1 pol en locus poliedrina • 1 p10 + 1 pol en locus p10 Baculovirus como sistema de expresión Fenotipo del virus • Mantener una copia de poliedrina bajo su promotor o el de p10 Baculovirus como sistema de expresión Conclusiones básicas • Usar genes sin intrones • Remover sec. heterólogas en región 5’ no codificante • Buen contexto para el codón ATG (A a -3) • No son necesarias secuencias para poliA • Secuencias TAAG o CTTA dentro de la secuencia del gen de interés pueden ser perjudiciales • El uso de codones parece tener poca influencia • Emplear secuencias de secreción comprobadas Baculovirus como sistema de expresión Baculovirus vs. otros sistemas de expresión de proteínas eucariotas Rapidez Trangénicos Bajo Costo Trangénicos Glicosidación Bacterias Plantas Células de mamiferos Levaduras Plegamiento Bacterias Levaduras Células de mamiferos Plantas Baculovirus Baculovirus Plantas Baculovirus Levaduras Levaduras Bacterias Bacterias Trangénicos Células de mamiferos Baculovirus Plantas Trangénicos Células de mamiferos Baculovirus como sistema de expresión Sistemas de expresión Baculovirus Display en cápside o superficie recombinantes Gene delivery Control biológico de plagas SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGOS PARA PROTEÍNAS Expresión de proteínas a partir de células infectadas con el baculovirus Ac3AB1pol+: clon 1 clon2 clon 1 clon 2 AcNPV MPM AcNPV MPM 47,5 Kda 47,5 Kda 32,5 kDa 32,5 kDa 25 kDa Tinción con azul de Coomassie poliedrina 3AB1 3AB1 25 kDa Western blot SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGOS PARA PROTEÍNAS Reconocimiento de la proteína no estructural 3AB1 por sueros de animales infectados con VFA Sueros bovinos infectados VFA Sueros bovinos VFA Sueros negativos negativos VFA Sueros positivos A C O Western blot de extractos de células infectadas Sueros Sueros bovinos vacunados vacunados contra VFA SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGOS PARA PROTEÍNAS Producción de VLPs en larvas de Rachiplusia ni Display en superficie (GP64) Display de la glicoproteína gD de BHV-1 en la superficie de baculovirus AcSup-gD • Exposición en sup. de gp64-gD • Competencia por el receptor celular: plegamiento similar a la proteína nativa • Inducción de Ac seroneutralizantes -X Microscopía electrónica y marcación (específica para gD) con oro Display en cápside (VP39) Display de OVA en cápside vp39 vp39-X Se agrega una copia extra de vp39 fusionada a la secuencia del antígeno X. Gene delivery (pCMV) BHK (uv) A11 moi180
