Clase 11 AGBT 2015 Biocontrol de insectos.pdf

AGROBIOTECNOLOGIA
CURSO 2014
Biocontrol de insectos plaga de la agricultura
Marcelo Berretta
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario
Impacto de los insectos en la agricultura
Entomotoxinas de Bacillus thuringiensis
Plantas Bt
Estrategias para evitar el surgimiento
de resistencia
Otras proteínas con actividad insecticida
Silenciamiento
Agrobiotecnología
Biocontrol
de insectos
Control Microbiano
Referencias
Impacto de los insectos en la agricultura
Agrobiotecnología
Biocontrol
de insectos
Impacto de los insectos en la agricultura
Pérdidas globales atribuidas a insectos en los principales cultivos (datos año 1994)
Gastos en insecticidas para distintos
Gastos en insecticidas para distintos cultivos
cultivos (en milones de U$S)
(en millones de U$S)
Pérdidas causadas por insectos
Pérdidas causadas por insectos
(en milones de U$S)
(en millones de U$S)
Hortícolas
Total: U$S 8.110 M
•
Total: U$S 98.000 M
Tomado de Krattiger et al., ISAAA Briefs, 1997.
• Los insectos, ácaros y nematodos producen más del 20% de las pérdidas
total U$S
es producido
Total: agrícolas
U$S 8.110 a
M nivel mundial; 50 a 60% de esteTotal:
98.000 M por insectos, 40 a
50% producido por nemátodos y 10 a 20% por ácaros.
•En los trópicos, insectos y nematodos son responsables de un 40% de las
pérdidas totales. En los países en desarrollo, los insectos pueden producir hasta
30% de las pérdidas totales durante el almacenaje
• En USA, los insectos producen pérdidas por el 3% del total: estas pérdidas
equivalen al alimento de 2 millones de personas durante 20 años.
Eficacia promedio de las prácticas de control de plagas y
enfermedades para reducir las pérdidas agrícolas
Tomado de: Oerke, J Agr. Sci., 2006
Datos globales 2001-03
Evolución del mercado argentino de fitosanitarios por valor de los productos
Tomado de Masiá & Moltoni, CLADEIII/JHE XXIII, 2012.
Insectos plaga de la agricultura
Lepidoptera
orugas
Anticarsia gemmatalis - Oruga de las leguminosas
Diatraea saccharalis - Barrenador del tallo
Spodoptera frugiperda - Oruga militar tardía
Insectos plaga de la agricultura
Díptera - moscas y mosquitos
Coleóptera - escarabajos
Ceratitis capitata - Mosca de los frutos
Hemíptera – chinches y pulgones
Bemisia tabaci - Mosca blanca
Anthonomus grandis – Picudo del algodonero
http://inta.gob.ar/documentos/insectos-perjudiciales-de-la-soja-y-su-manejo-integrado-en-la-region-pampeana-central/
El uso de insecticidas juega un papel principal
en el combate de las plagas agrícolas
• Los insecticidas químicos
son poco selectivos y
afectan por igual a plagas
e insectos benéficos
• Su acumulación en el
medio ambiente no es
deseable para otras
especies
• Pueden afectar la salud
de los operarios agrarios
• Inciden en forma
desfavorable en los
costos de producción
Efectos no deseados de los insecticidas sobre las plagas
Resurgencia por supresión
de enemigos naturales
Emergencia de plagas
secundarias
Generación de resistencia
Tomado de: Hajek, 2004. Natural Enemies. Cambridge University Press
Insecticidas químicos, bioinsecticidas (insecticidas
microbianos) y cultivos GM resistentes a insectos
Ventajas y desventajas de los bioinsecticidas y cultivos GM
comparados con los insecticidas químicos
Bioinsecticidas
Cultivos GM
Reducción del uso de insecticidas químicos de amplio
espectro
Reducción de la contaminación ambiental y de la exposición a
tóxicos por parte de los operarios
Ahorros en costos de producción
Ventajas
Mayor velocidad de biodegradación
Mayor estabilidad ante factores
ambientales
Acción más efectiva sobre
insectos que se desarrollan
dentro de los tejidos vegetales
Especificidad demasiado estrecha
Desventajas
Gastos metabólicos de la
panta debido a la expresión
constitutiva del insecticida
Proteínas con actividad insecticida
•
Proteínas de origen microbiano
- -endotoxinas de Bacillus thuringiensis
•
Proteínas de origen vegetal
- Inhibidores de proteinasas
- Inhibidores de -amilasas
- Lectinas
- Quitinasas
•
Proteínas de origen animal
- Inhibidores de proteinasas
- Quitinasas
Entomotoxinas de Bacillus thuringiensis
Agrobiotecnología
Biocontrol
de insectos
Bacillus thuringiensis
- Es una bacteria Gram+ que forma esporas y se distingue de otros bacilos
porque produce cristales compuestos de una o más -endotoxinas.
- Existe una gran variedad de toxinas pertenecientes a esta familia y cada
una de ellas posee actividad específica contra insectos lepidópteros, coleópteros,
dípteros e himenópteros.
- Las -endotoxinas se agrupan teniendo en cuenta los ordenes de insectos
sobre los cuales actúan.
Subespecies
B.t. thuringiensis
B.t. kurstaki
Bt israelensis
B.t. tenebrionis
B.t. aizawai
B.t. kyushuensis
B.t. morrisoni
B.t. morrisoni
B.t. fukuensis
B.t. medellin
B.t. san diego
B.t. thompsoni
B.t. canadiensis
B. thurigiensis produce -endotoxinas durante la esporulación
Estadios del
ciclo de vida de
Bacillus
thuringiensis.
(6-7 horas)
Microscopía electrónica de células de Bacillus
thuringiensis durante la esporulación. Las endotoxinas se producen en forma de cristales de
forma regular, de allí el nombre Cry (crystal)
asignado a estas proteínas. El cristal se halla
adyacente a la espora (ES).
Cry
Cry
ES
ES
Gentileza Dr. D. H. Sauka
Los cristales de las toxinas Cry presentan morfologías
que pueden servir para establecer su clasificación
A
B
C
D
E
F
Gentileza de D. H. Sauka
Cristales paraesporales de B. thuringiensis. A: Cristales bipiramidales; B: Cristales ovoides; C: Cristales
cuadrados aplanados; D: Cristales bipiramidales y cúbicos; E: Cristales amorfos; F: Cristales bipiramidales
atípicos y en forma de barras. Barra en A, B, C, D y F: 1 m; barra en E: 0,5  m
Insecticidas basados en -endotoxinas de B. thuringiensis
• Las preparaciones de Bacillus thurigiensis se han empleado en forma
de sprays en distintos excipientes. Su uso no fue muy difundido por:
- Baja estabilidad de los cristales
- Baja penetrabilidad (no son insecticidas sistémicos)
- Especificidad demasiado estrecha
Microscopía
electrónica
de cristales de
proteínas Cry
• Actualmente su uso está restringido a ciertos tipos especiales de manejo
integrado como, por ejemplo, los de la agricultura orgánica.
-endotoxinas
• Toxinas Cry
- Se producen durante la esporulación como inclusiones citoplásmicas (cristales; ~20 %
de la proteína total).
- Son proteínas de 130-60 kDa. Sufren procesamientos N- y C-terminales. Se ha
dilucidado su estructura por cristalografía de rayos X.
- Actúan produciendo lisis osmótica en el epitelio intestinal.
- Se han caracterizado dos receptores: una proteína con similitud a cadherina y un
aminopeptidasa N.
• Toxinas Cyt
- Se producen durante la esporulación como inclusiones citoplásmicas (citolisinas).
- Son proteínas diméricas de ~70 kDa. Se ha dilucidado su estructura por cristalografía
de rayos X.
- Actúan produciendo lisis osmótica en el epitelio intestinal.
- No se conocen los receptores.
Proteínas VIP
• Vegetative Insecticidal Proteins (VIPs)
- Se producen durante el crecimiento vegetativo como proteínas de secreción.
Producen lisis en el epitelio intestinal.
- Son proteínas de 42-89 kDa. En el caso de VIP2 la proteína es un dímero con
subunidades de 29 y 12 kDa. VIP2 actuaría a nivel de membrana. Su estructura
se parece a la de una ADP-ribosilasa.
- VIP3a es una proteína de 88 kDa. Se une a una proteína similar a tenascina en
el epitelio intestinal y se postula que produce muerte celular por inducción
de un proceso apoptótico. Es activa contra varios lepidópteros.
• Otros factores de virulencia:
- Fosfolipasas, α-exotoxinas (termolábiles) β-exotoxinas (análogos de ATP),
metaloproteasas, quitinasas
Estructura de las proteínas Cry de Bacillus thuringiensis
Toxina activa
bp
Toxina activa
Tomado de: de Maagd et al., Trends in Plant Sci., 1999.
Dominio I: inserción en la membrana y formación de poros.
Dominio II y Dominio III: reconocimiento y unión al receptor.
Los dominios
funcionales
se hallan
extensamente
conservados
en las diferentes
clases de
-endotoxinas
Adaptado de: Maag et al., Trends in Genetics, 2001
Las
estructuras
moleculares
de muchas
proteínas
Cry son bien
conocidas
Estructuras
tridimensionales de
proteínas Cry
tóxicas para
lepidópteros,
coleópteros,
lepidópteros y
dípteros. Los
dominios I, II y III
se indican en
celeste, verde y
magenta,
respectivamente
Se reportaron cerca de
700 toxinas Cry
agrupadas en 282
holotipos. El rango
primario comprende
holotipos de 1-72.
45%
Rango
secundario
78%
Rango
terciario
95%
Tomado de: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/
Clasificación de
proteínas Cry
Rango
primario
Nomenclatura de proteínas Cry
Cry1A (Cry1Aa, Cry1Ab,…)
Nomenclatura
original
Cry1
lepidópteross
CryI
Cry4
dípteros
CryIV
Cry3
coleópteros
CryIII
Cry2
lepidópteros/dípteros
CryII
Se han descrito unas 35
entomotoxinas Cyt que se
agrupan en 11 holotipos.
El rango primario
comprende holotipos de 111, el secundario de A-D y
el terciario de a-b.
Rango primario
Rango secundario
Rango terciario
1-11
A-D
a-b
Tomado de: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/
Clasificación de
proteínas Cyt
Nomenclatura de toxinas VIP
1-3
• Se han descrito 96 toxinas VIP distribuidas
en 28 holotipos.
•Se ha propuesto clasificarlas siguiendo el
mismo sistema adoptado para las toxinas
Cry. El rango primario comprende
holotipos de 1-3, el secundario de A-D y el
terciario de a-h.
• Desde los primeros reportes a mediados de
los 90, la tasa de descubrimiento de nuevas
toxinas VIP se ha incrementado en forma
parecida a la de las toxinas Cry en la década
anterior.
Rango secundario Rango terciario
A-D
a-h
Tomado de: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/
Rango primario
Modo de acción de las proteínas Cry
Etapas del ciclo de vida de B. thuringiensis en el tracto gastrointestinal de la larva de un insecto.
La condiciones de solubilización, el procesamiento por proteasas propias del insecto y el
reconocimiento de receptores específicos, determinan el rango de toxicidad de las proteínas Cry
Modo de acción de las proteínas Cry
III
I
II
Adaptado de: Maag et al., Trends in Genetics, 2001
a) Después de la ingestión, los cristales se disuelven en el jugo gástrico del insecto a pH 10. b) Las extremidades
C- y N-terminales (fragmentos púrpura y amarillo) son procesadas por proteasas específicas del insecto.
c) La toxina activa se une a receptores en las membranas de las células epiteliales mediante los dominios II y III.
d) Luego de un probable rearreglo del dominio I, una horquilla de forma helicoidal se inserta en la membrana plasmática
de las células intestinales. e) La toxina forma poros, posiblemente bajo la forma de oligómeros.
Posibles
receptores
de proteínas
Cry
cadherina
microdominio de membrana
Arriba: Modelo de mecanismo de acción mediado por cadherina. 1: unión a una
molécula similar a cadherina y clivaje de la hélice -1; 2: estructura oligomérica
pre-poro; 3: unión del oligómero a aminopepetidasa N (APN); 4: formación de
l poro. Abajo: Modelo de unión bifásica secuencial de Cry1Ac a APN de Lymantria
dispar. A: reconocimiento por parte del dominio III y unión al receptor por el sitio
glicosilado de APN (1). B: unión del dominio II a su sitio de reconocimiento (2). El
dominio I se insertaría luego en la membrana.
Efectos citotóxicos en el gusano de la raíz del maíz
Inmunohistoquímica
Planta control
Planta transgénica
MV
MV
GE
A
B
C
Tomado de: Moellenbeck et al., Nature Biotechnology, 2001.
A) Inmunohistoquímica mostrando la unión de la toxina a las
microvellosidades del epitelio intestinal.
B) Sección transversal del tracto digestivo de la larva a las 48 h
de alimentarse de una raíz de planta control no transgénica.
C) Sección transversal del tracto digestivo de la larva a las 48 h
de alimentarse de una raíz transgénica que expresa un gen cry.
MV: microvellosidades
GE: epitelio intestinal
Las -endotoxinas tienen actividades que afectan
específicamente a diferentes órdenes de insectos
Porcentaje de toxicidad relativa de diferentes -endotoxinas
del tipo Cry I contra distintos insectos lepidópteros
%
La diversidad de toxinas (y de sus especificidades) podría
haberse generado por permutación de dominios funcionales
Adaptado de: Maag et al., Trends in Genetics, 2001
La permutación de dominios es un mecanismo potencial para generar diversidad. Los
dominios con similaridad de secuencia entre toxinas Cry naturales, híbridas y quimeras
Los dominiosartificialmente
con similitud de se
secuencia
entre
indican
cómo para
podrían
habersecomo
originado
toxinashaberse
por
obtenidas
señalan
en toxinas
distintos
colores
mostrar
podrían
permutación
de
dominios
entre
diferentes
precursores.
Los
dominios
con
colores
idénticos
en
diferentes
toxinas
originado toxinas naturales por permutación de dominios (domain swapping) entre diferentes
identifican a los vecinos más próximos en los árboles filogenéticos de dominios separados. Las toxinas cuyas
precursores. Los dominios con colores idénticos identifican a los vecinos más próximos en
composiciones figuran entre paréntesis son híbridos obtenidos por recombinación in vivo o por intercambio de
los
árboles filogenéticos. Las toxinas cuyas composiciones figuran entre paréntesis son
fragmentos de restricción.
híbridos obtenidos por recombinación in vivo o por intercambio de fragmentos de restricción
Las bases de
datos de
selectividad de
las toxinas Cry
permiten una
selección
rápida de
genes
candidato
Las fichas de actividad de las toxinas Cry y los protocolos
utilizados para los ensayos con lepidópteros, coleópteros,
dípteros, himenópteros, otros ártrópodos y nemátodos pueden
consultarse en bases de datos establecidas a tal efecto
http://cfs.nrcan.gc.ca/subsite/glfc-bacillus-thuringiensis/summaries
Las proteínas Cry no son tóxicas para mamíferos
CryH14
Toxicidad oral comparada de la toxina CryH14 en animales de laboratorio
Plantas Bt
Agrobiotecnología
Biocontrol
de insectos
Primeras construcciones utilizadas en la transformación
Nicotiana tabacum con el gen cry1A
Adaptado de: Vaeck et al., Nature 1987.
PTR (1’ y 2’): promotor bifuncional de manopina sintetasa del plásmido pTiAc de Agrobacterium 3’t7:
señal de poliadenilación. neo: gen de resistencia a kanamicina. 3’OCS: terminador de octopina sintetasa
Viabilidad de larvas de Manduca sexta alimentadas
con hojas de Nicotiana tabacum transgénica
Plantas de Nicotiana tabacum transformadas con la fusión bt:neo860.
A
B
Adaptado de: Vaeck et al., Nature 1987.
Manduca sexta
El nivel de expresión de las proteínas Cry es crítico para lograr
una protección efectiva
Los niveles de expresión de los genes cry resultaban demasiado bajos
para controlar a la mayoría de los insectos de interés agronómico
• Los niveles de expresión alcanzados utilizando el gen nativo eran del orden de 1
ng de proteína Cry por mg de tejido.
• Los genes bacterianos poseen un contenido de AT de 60-70%, mientras que los
genes de plantas poseen un 40-50%.
• Para “vegetalizar” los genes cry deben introducirse una serie de modificaciones en
la secuencia nucleotídica.
- Utilizar sólo la región amino terminal (toxina activa).
- Adaptar el gen al uso de codones de la planta.
- Eliminar los sitios de terminación (AATAAA).
- Eliminar los sitios potenciales de splicing.
- Eliminar los sitios de inestabilidad de ARNm (ATTTA).
• Mediante estas modificaciones, se consigue aumentar los niveles de expresión
entre 100 a 500 veces en comparación con el nivel de expresión del gen original.
Cantidad de proteína Cry sintetizada en los principales
maíces Bt comerciales
Product namea
Event
Syngenta Agrisure®
BT 111
CB
Monsanto YieldGard®
MON 8102
Corn Borer
Monsanto YieldGard®
MON 8633
Rootworm
Monsanto YieldGard
MON 880174
VT™ Rootworm
Monsanto Genuity™ VT
MON 890345
Double PRO™
DowAgrosciences
Pioneer Hi-Bred
Herculex® I
Dow AgroSciences
Pioneer Hi-Bred
Herculex® RW
TC15076
Cry
Protein
f
Cry/Shoot Cry/Rootc Cry/Plantd
e Cry/ha
Plants/ha
b
(g dw)
(g dw)
(ug)
(kg/ha)
Cry1Ab
Cry1Ab
Cry3Bb1
4321
65.500
0,283
2594
79.040
0,205
20410
4216
24626
79.040
1,946
Cry1A.105
Cry2Ab2
6280
2826
4553
1550
620
496
7830
3446
5049
79.040
79.040
79.040
0,619
0,272
0,399
0,671
Cry1F
1207
165
1372
79.040
0,108
26376
2647
29023
79.040
2,294
5825
567
6392
79.040
7536
2983
4553
1413
24649
5275
2015
651
558
185
2623
586
9551
3634
5111
1598
27272
5861
79.040
79.040
79.040
79.040
79.040
79.040
0,505
2,799
0,755
0,287
0,404
0,126
2,156
0,463
4,191
Cry3Bb1
Cry34Ab1
DAS 5912277
Cr35Ab1
MON 880174 Cry3Bb1
Cry1A.105
Monsanto
MON 890345
Cry2Ab2
Genuity™SmartStax™,
6
DowAgrosciences
TC 1507
Cry1F
SmartStax™
DAS 59122- Cry34Ab1
77
Cr35Ab1
Tomado de: Benbrook, Environ. Sci. Europe, 2012
Resumen de las modificaciones realizadas en tres versiones del gen
cry9Aa2 (G7, G10 y G14) en comparación con el gen cry9Aa2 nativo
Cry9Aa2
G7
G10
G14
Cambios de nucleótidos
0
52
68
85
Región modificada
-
1-693
1-1124
1-1752
% de contenido AT
63,4
61,6
60,9
60,2
Señales de poliadenilación
13
7
6
0
Regiones 5` de splicing
2
0
0
0
Secuencia de terminación
1
0
0
0
Motivos ATTTA
13
10
10
8
Codones modificados
-
47
62
79
Codones poco frecuentes
4
1
0
0
Tomado de: Gleave et al., Mol. Breed., 1998.
Bioensayo con larvas de Phthorimaea operculella
en plantas transgénicas de Nicotiana tabacum
A
278
Control no Bt
9Aa2
G7
Control Bt
G10
G14
Versiones modificadas
C
B
Tomado de: Gleave et al.,
Mol. Breed., 1998.
9Aa2
G14
9Aa2
G14
Transformación de Solanum tuberosum con el gen cry3A
Ensayos de infestación de papa en cámaras
de crecimiento con Leptinotarsa decemlineata
Colorado
potato beetle
Tomado de: Perlak et al., Plant Mol. Biol., 1993.
Plantas de Solanum tuberosum transformadas con el gen cry3A expresado bajo un promotor 35S de
CaMV. Las modificaciones en el uso de codones permitieron aumentar la acumulación de la endotoxina
unas 300 veces respecto de la versión no modificada. La infestación se realizó exponiendo a las plantas
50-100 neonatos del coleóptero. La fotografía fue tomada a los 7 día de comenzado el ensayo
Transformación
de Solanum
tuberosum con
el gen cry3A
Ensayos de campo de Solanum tuberosum Bt
infestadas con Leptinotarsa decemlineata
Adaptado de: Perlak et al., Plant Mol. Biol. 1993.
Fotografía satelital de un ensayo de
infestación de Solanum tuberosum
transformadas con el gen cry3A. Las
parcelas claras corresponden a
plantas control no transgénicas. La
ausencia de color denota una severa
infestación. Las parcelas sembradas
con plantas transgénicas no han sido
afectadas y exhiben una coloración
roja que corresponde a la clorofila
Optimización de la expresión del gen cry1Ab
en tabaco y maíz
Promotor/gen
Tabaco
Maíz
Estable
(hojas)
Transitoria
(células en
suspensión)
Transitoria
(mesófilo)
Estable
(hojas)
35S/Cry nativo
50
ND
NT
ND
171
35S/Cry sintético
364
5100
6500
160
176
PEPC-polen/Cry sintético
NT
560
3700
370
Los datos están expresados como ng de proteína Cry por mg de proteína total.
ND: No detectado. NT: No ensayado
PEPC: Promotor del gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa de maíz.
35S: Promotor del transcripto 35S del Cauliflower mosaic virus.
Polen: promotor específico de polen obtenido de maíz
Tomado de: http://www.extension.umn.edu/distribution/cropsystems/DC7055.html#ch4
Los genes optimizados se utilizaron para transformar plantas de maíz.
Se obtuvieron los eventos registrados comercialmente como 171
(promotor 35S) y 176 (promotor PEPC y promotor específico de polen).
Longitud del túnel en cm
Indice del daño
Ensayos de campo con maíz resistente a lepidópteros.
Tasa de daño promedio ocasionado por Ostrinia nubilalis
Adaptado de: Koziel et al., BioTechnology, 1993.
El rango de daño foliar se establece según una escala arbitraria de los síntomas observados
(1-7). En el caso de los tallos, se mide el daño como largo (cm) del túnel producido por la
larva. Las plantas fueron infestadas con 300 larvas/planta/semana durante 8 semanas
Ensayos de campo en U.S.A.
con maíz Bt infestado con Ostrinia nubilalis
Ostrinia nubilalis
Maíz Bt
Maíz no transgénico
Bioensayos con Helicoverpa zea en algodón Bt
Izquierda:
capullo de una
planta
de algodón
control
Derecha:
capullo de una
planta de
algodón que
expresa el gen
Btk (B.t.
kurstaki)
Tomado de: Dempsey et al., Trends in Microbiology,1998.
La expresión
combinada
de toxinas Cry
provee
una resistencia
incrementada
Apilamiento de genes cry1Ac y cry2Ab
en plantas transgénicas de algodón
Tomado de: Perlak et al., The Plant Journal, 2001.
Transformación
de plantas
ornamentales
con genes el
gen cry1C
Plantas de crisantemo transformadas con un gen
sintético cry1C. Los ensayos de infestación se
realizaron con Helicoverpa armígena
Tomado de: de Maagd et al., Trends in Plant Sci., 1999.
Transgénica
Control
Algunos cultivos transformados con genes
de -endotoxinas de Bacillus thuringiensis
Proteínas Bt
Insectos diana
Especies transformadas
Cry1Aa
Lepidóptera
Alamo, arándano, nabo
Cry1Ab
Lepidóptera
Alamo, abeto blanco, algodón, arroz, maíz,
manzano, papa, tabaco, tomate, trébol blanco
Cry1Ac
Lepidóptera
Algodonero, arroz, colza, brocoli, maní, manzano,
repollo, soja, tabaco, tomate, vid, nogal
Cry1Ba
Lepidóptera
Trébol blanco
Cry1Ca
Lepidóptera
Alfalfa, Arabidopis, tabaco
Cry1H
Lepidóptera
Maíz
Cry2Aa
Lepidóptera
Algodonero
Cry3A
Coleóptera
Berenjena, papa, tabaco
Cry6A
Coleóptera
Alfalfa
Cry9C
Lepidóptera
Maíz
Fuente: Schuler et al., Trends in Biotechnology 16:168-175, 1998.
Técnicas de manejo agronómico para
impedir el desarrollo de resistencia
en los insectos blanco
Agrobiotecnología
Biocontrol
de insectos
El manejo
agronómico
apropiado
permite retrasar
la aparición
de resistencia
en los insectos
• Resistencia de los insectos a los bioinsecticidas
- Los genes de resistencia están presentes
en el pool genético de las poblaciones afectadas;
se ha reportado aparición localizada de resistencia
al uso de Bt como insecticida convencional.
- El mecanismo de resistencia actúa a través
de la pérdida o modificación de los receptores Bt
en la membrana intestinal; generalmente se expresa
en forma de mutaciones recesivas o semidominantes.
• Estrategias para el manejo de resistencia a Bt
- Uso de combinaciones múltiples de genes cry
- Combinaciones de genes cry con otros genes insecticidas
- Uso de promotores inducibles o tejido-específicos
- Uso de refugios espaciales o temporales
- Combinación altos nivel de expresión de proteínas
Cry con refugios espaciales
Modelo propuesto para la unión de toxinas Cry a sitios de
unión del intestino de Plutella xylostella
A
Insectos susceptibles
B
Insectos resistentes (cepa
PHI, Filipinas)
C
Insectos resistentes (Hawai
y Pensilvania)
Tomado de: Ballester et al., Appl. Environ. Microbiol, 1999.
El manejo
agronómico
apropiado
permite retrasar
la aparición
de resistencia
en los insectos
Evolución de la resistencia a los insecticidas
Posibles mecanismos de resistencia a toxinas Cry:
- Solubilización intestinal disminuida
- Activación proteolítica de la toxina disminuida
- Digestión proteolítica del fragmento activo aumentada
- Afinidad del sitio activo por la toxina disminuida
Estrategia combinada de alto nivel de producción
de proteína Cry con refugios espaciales
Refugio
ss
Cultivo Bt
Cultivo no Bt
El alto nivel de expresión del cultivo Bt
permite controlar a los insectos susceptibles
SS y a los heterocigotas Ss. La aparición de
fenotipos ss se “diluye” por cruzamiento con
individuos SS en los refugios espaciales
sembrados con semilla no transgénica
Ss
SS
El manejo
agronómico
apropiado
permite retrasar
la aparición
de resistencia
en los insectos
Simulación de una estrategia de manejo de
resistencia basada en refugios espaciales
Tomado de: Gould Nature Biotechnology, 2000.
La frecuencia de aparición de resistencia a la toxina Cry
es más alta en ausencia del refugio. El modelo teórico asume
que la toxina es expresada a un nivel capaz de eliminar el 99,9%
de los insectos homocigotas o heterocigotas susceptibles.
Casos reportados de resistencia
Tomado de: Tabashnik et al., Nat. Biotechnol., 2013.
Impacto sobre insectos benéficos: la mariposa Monarca
Mariposa Monarca
Oruga alimentándose de algodoncillo
tratado con polen de maíz Bt (evento 176)
Liberaciones
comerciales
de cultivos
transformados
con genes cry
Papa
Variedad New LeafTM (Monsanto, USA, 1995)
Expresa el gen de la -endotoxina Cry3A para protección contra
Leptinotarsa decemlineata. Fue liberada en Canadá, Japón, Georgia,
México y USA.
Algodonero
Variedad BollgardTM (Monsanto, USA, 1996)
Expresa -endotoxina Cry1Ac para protección contra Heliothis
virescens, Heliocoverpa zea y Pectinophora gossypiella
Liberado en Australia, China, México, Sudáfrica y USA.
Maíz
Variedades YieldGardTM, KnockoutTM, (Novartis, Suiza, 1996)
Variedad YieldGardTM (Monsanto, USA, 1996)
Variedad NatureGardTM (Micogen, USA, 1996)
Variedad Bt-XtraTM (Dekalb, USA, 1996)
Las variedades expresan -endotoxina Cry1Ab para protección contra
Ostrinia nubilata. Fueron liberadas en Argentina, Canadá, Japón, USA
y algunos países de la Unión Europea
Millones de Ha
Tomado de: http://www.isaaa.org/kc/Bin/gstats/index.htm
Evolución del
área sembrada
con cultivos Bt
(1996-2010)
Datos a nivel mundial
(millones de ha)
Tomado de: Clive James, ISAAA Brief #42, 2010.
Diferencia de insecticida
aplicado (millones de kg)
Reducción en la aplicación de insecticidas en el cultivo de
maíz en USA
-1
-2
-3
-4
Otras proteínas con actividad insecticida:
inhibidores de proteasas
Agrobiotecnología
Biocontrol
de insectos
Genes de inhibidores de proteasas de origen vegetal
introducidos en especies heterólogas
Inhibidores de proteasas
C-II (inhibidor de serin-proteasas de soja)
CMe (inhibidor de tripsina de cebada)
Insectos diana
Coleóptera, Lepidóptera
Lepidóptera
CMTI (inhibidor de tripsina de calabaza)
CpTI (inhibidor de tripsina de caupi)
Especies transformadas
Alamo, colza, papa, tabaco
Tabaco
Tabaco
Coleóptera, Lepidóptera
14K CI (inhibidor bifuncional de serinproteasas y -amilasas de cereales)
Arroz, batata, colza, frutilla, girasol,
lechuga, manzano, papa, tabaco,
tomate
Tabaco
MTI-2 (inhibidor de serin-proteasas
de mostaza)
Lepidóptera
Arabidopsis, tabaco
OC-1 (inhibidor de cisteín-proteasas
de arroz)
Coleóptera, Homóptera
Alamo, colza, tabaco
PI-IV (inhibidor de serin-proteasas de soja)
Lepidóptera
Papa, tabaco
Pot PI-I (inhibidor de proteasas I de papa)
Lepidóptera, Ortóptera
Petunia, tabaco
Pot-PI-II (inhibidor de proteasas II de papa)
Lepidóptera, Ortóptera
Abedul, arroz, lechuga, tabaco
Inhibidor de proteasa I (no especificado)
Lepidóptera
Colza
Kti3, SKTI (inhibidor de tripsina
de Kunitz de soja)
Lepidóptera
Papa, tabaco
Inhibidor de proteasas I de tomate
Lepidóptera
Alfalfa, tabaco, tomate
Inhibidor de proteasas II de tomate
Lepidóptera
Tabaco, tomate
Adaptado de: Schuler et al., Trends in Biotechnol., 1998.
Plantas de arroz que expresan el inhibidor de tripsina de
caupi desafiadas con Chilo supressalis y Sesamia inferens
Espigas blancas producidas por el barrenador del arroz. Se observan
espigas blancas y erectas ya que el tejido ha muerto y no contiene granos.
Chilo supressalis
Sesamia inferens
Construcciones utilizadas
Ensayos con
plantas de arroz
que expresan
el inhibidor de
tripsina de caupi
con Chilo
supressalis y
Sesamia inferens
Niveles de expresión del inhibidor de tripsina de caupi (CpTI)
Resultados de ensayos de campo
Línea
Número de plantas Número de plantas Plantas con espigas
transgénica R1 R2 analizadas
con espigas blancas
blancas (%)
1
2
3
4
5
Total
Promedio
Control N.T.
26
34
29
15
24
128
42
15
27
6
6
17
71
42
58
79
21
40
71
55
100
Tomado de: Duan et. al. Nature Biotechnology, 1996.
Otros genes de resistencia a insectos
de origen vegetal transferidos a cultivos
Productos génicos
Insectos blanco
Especies transformadas
Inhibidores de -amilasa
Inhibidor de -amilasa de frijol (AIPv)
Coleóptera
Arveja, haba Azuki, tabaco
Inhibidor de -amilasa de cereales (WMAI-1)
Lepidóptera
Tabaco
Inhinidor bifuncional de -amilasa
y de serin-proteasas (14K-CI)
Tabaco
Lectinas
Lectina de campanilla blanca (GNA)
Homóptera, Lepidóptera
Arroz, batata, caña de azúcar,
colza, girasol, papa, tabaco,
tomate, vid
Lectina de arveja (p-lec)
Homóptera, Lepidóptera
Papa, tabaco
Aglutinina de germen de trigo (WGA)
Coleóptera, Lepidóptera
Maíz
Jacalina (Artocarpus heterophyllus)
Coleóptera, Lepidóptera
Maíz
Lectina de arroz
Coleóptera, Lepidóptera
Maíz
Quitinasa de haba (BCH)
Homóptera, Lepidóptera
Papa
Peroxidasa aniónica de tabaco
Coleóptera, Homóptera,
Lepidóptera
Ocozol, tabaco, tomate
(Galanthus nivalis)
Otros
Quitinasa de tomate
Triptofano decarboxilasa de Catharantus roseus (TDC)
Colza
Homóptera
Tabaco
Adaptado de: Schuler et al., Trends in Biotechnol., 1998.
Inhibidores
de -amilasa
Resistencia mediada por expresión de un
inhibidor de -amilasa de Phaseolus vulgaris
Semillas de arveja que expresan el inhibidor de -amilasa de Phaseolus
vulgaris (izquierda) y semillas control no transgénicas (derecha) infestadas con
Callosobruchus maculatus. Las cavidades en las semillas muestran el sitio por
el que los brúchidos adultos emergen de las mismas. El transgen fue puesto
bajo la dirección del promotor de fitohemaglutinina de Phaseolus.
Expresión de la
secuencia
codificante de la
lectina ASAL de
Allium sativum
en plantas de
tabaco
• Los áfidos (Homóptera) son insectos chupadores que causan
. pérdidas económicas importantes en muchos cultivos, ya sea
. por su propia actividad o como vectores de enfermedades
. virales.
• La lectina de hojas de Allium sativum (ASAL) es una proteína
. homodimérica de 25 Kda que se une a residuos de manosa. Se
. demostró que posee actividad tóxica para varios áfidos
• Se expreso la secuencia codificante de ASAL en plantas de
. tabaco bajo un promotor constitutivo mediante una
. construcción que también permite la expresión de los genes
. uidA (GUS) y hpt (resistencia a higromicina)
• Los áfidos alimentados en estas plantas se vieron afectados
. en supervivencia y fecundidad. Se observó que la lectina se
. une a tres glicoproteínas localizadas en las membranas de las
. células del tracto digestivo.
Tomado de: Dutta et al., Plant Biotechnology Journal, 2005.
Esquema de la construcción genética utilizada
Efectos de la
lectina ASAL de
Allium sativum
sobre la
supervivencia
de ninfas de
Myzus persicae
Supervivencia de
ninfas en plantas de
tabaco que producen
la lectina ASAL (AS11)
y plantas controles
(con). Se inocularon
30 ninfas por plantas.
Cada ensayo
comprende 5 plantas
de cada tipo
Supervivencia de
ninfas en dos plantas
de la progenie de
AS11, T1(2) y T1(3) y
en plantas controles.
Se inocularon 30
ninfas por plantas.
Cada ensayo
comprende 5 plantas
de cada tipo
Tomado de: Dutta et al., Plant Biotechnology Journal, 2005.
Plantas de papa que expresan el gen de concanavalina A
Desafío con Lacanobia oleareacea
(Lepidóptera)
Desafío con Myzus persicae
(Homóptera)
Tomado de: Gatehouse et al. Molecular Breeding, 1999.
Efecto
la ingesta
de plantas
transgénicas
de papa
Efecto
de de
la ingesta
de plantas
transgénicas
de papa
(ConA)
sobre
el el
desarrollo
de Lacanobia
Lacanobiaolearacea.
olearaceae.
sobre
desarrollode
delarvas
larvasde
EfectoEfecto
de la de
ingesta
de plantas
transgénicas
de papa
la ingesta
de plantas
transgénicas
sobresobre
la fecundidad
del áfido
Myzus
persicae
de papa
la fecundidad
del áfido
Myzus
persicae.
Promotores usados con genes de resistencia a insectos
Origen del promotor
Sitio de expresión
Proteína insecticida
Planta
Manopina sintasa bacteriana TR
(mas)
Mayoría de los tejidos
Cry1Ab
Tabaco, papa
Semilla
-AI-Pv
Arveja, haba Azuki,
tabaco
Mayoría de los tejidos
Casi todas las proteínas
indicadas en tablas
anteriores
Casi todas las plantas
indicadas en tablas
anteriores
Floema
GNA
Tabaco
Preferentemente raíz
Cry1Ab
Maíz
Fosfoenolpiruvato-carboxilasa
de maíz (PEPC)
Tejidos verdes
Cry1Ab
Arroz, maíz
Promotor específico de polen
de maíz
Polen
Cry1Ab
Maíz
Preferentemente médula
Cry1Ab
Maíz
Todos los órganos
Cry1Ac
Arroz
Inducible por heridas
Pot PI-II, ipt
Arroz, tabaco, tomate
Cloroplastos
Cry1Ac
Tabaco
Inducible químicamente
Cry1Ac
Tabaco
Fitohemoaglutinina de haba (PHA-L )
35S de CaMV (CaMV 35S) y
derivados
Sacarosa sintasa de arroz (RSs1)
Metalotioneína de maíz
Subunidad a triptofano sintasa
de maíz (trp A)
Ubiquitina 1 de maíz (Ubi-1)
Inhibidor de proteasas II de papa
(Pot PT-IIK)
Operón RNA ribosomal (Prm)
Proteína relacionada a patogénesis
1A de tabaco (PR-1A)
Adaptado de: Schuler et al., Trends in Biotechnology, 1998.
Silenciamiento
Agrobiotecnología
Biocontrol
de insectos
Tomado de: Price &Gatehouse. Trends in Biotechnology, 2008.
Silenciamiento postranscripcional mediado por dsRNA
en animales inferiores
Figure 4. Drooping of control tobacco plants after whitefly infestation.
Thakur N, Upadhyay SK, Verma PC, Chandrashekar K, et al. (2014) Enhanced Whitefly Resistance in Transgenic Tobacco Plants
Expressing Double Stranded RNA of v-ATPase A Gene. PLoS ONE 9(3): e87235. doi:10.1371/journal.pone.0087235
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0087235
Control Microbiano
Agrobiotecnología
Biocontrol
de insectos
Familia Baculoviridae

Ácido nucleico: DNA de doble cadena, circular, 89 a 180 kpb

Morfología: Viriones envueltos conteniendo 1 ó más
nucleocápsides . Viriones ocluidos en una matriz proteica.
 Parásitos de invertebrados
ODV
ODV: viriones
derivados
de cuerpos
de oclusión
OB
BV: viriones
brotados
Ciclo de infección de baculovirus
Tomado de: Ferrelli et al, 2012. En: Viral genomes, InTech Open Access Publisher [http://www.intechweb.org]
Sintomatología
Anagrapha falcifera MNPV
Heliothis NPV
Anticarsia gemmatalis MNPV- Experiencia en Brasil
PRODUCCIÓN IN VIVO EN CAMPO
LARVAS
MUERTAS POR
AgMNPV
AGREGADO
DE AGUA
MACERADO
Y FILTRADO
MEZCLA EN
TANQUE DE
PULVERIZADORA
PRODUCCIÓN CONTROLADA - FORMULACIÓN
Transferencia tecnológica de la EMBRAPA
Productos comerciales
Baculovirus Nitral, Coopervirus, Baculo Soja,
Protege
APLICACIÓN EN MÁS DE 2.000.000 ha/año
ÉXITO DEL USO DE AgMNPV EN BRASIL

Plaga principal de soja

Apoyo oficial. Servicio de Extensión

Eficiente transmisión horizontal

El cultivo soporta defoliación sin daño económico
Soja tratada
con AgMNPV
Soja sin tratar
Fuente: Dr. F. Moscardi, EMBRAPA
Cydia pomonella GV
En Argentina: primer baculovirus
registrado (uso comercial)
Hongos entomopatógenos
Beauveria bassiana
Metarhizium anisopliae
Ciclo de vida de B. bassiana
10. Diseminación
4. Multiplicación
3. Penetración
5. Liberación de
toxinas
1. Adhesión
2. Germinación
6. Muerte del
insecto
9. Esporulación
8. Salida al exterior
7. Colonización total
Momificación del cadáver
Fase
levaduriforme
1d
2d
Fase micelial
5d
Penetración de la cutícula del insecto
No infectado
Infectado
Utilización de hongos entomopatógenos
Características distintivas con respecto a otros entomopatógenos:
- Amplio espectro potencial de aplicación
- Infección del hospedante a través del tegumento, no limitada a su ingestión
- Baja probabilidad de aparición de resistencia
Factores intervinientes en el desarrollo de productos:
- Selección de cepas en base a criterios de virulencia, rendimiento de
producción, compatibilidad con agroquímicos, mantenimiento de viabilidad en
el producto formulado
- Producción masiva a bajos costos
Referencias
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Agrobiotecnología
Biocontrol
de insectos